JP2002119280A - モノクローナル抗体、ハイブリドーマ、免疫学的測定法及び診断キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 被験者に苦痛を与えず、特別の装置を必要と
せずに、安価にヘリコバクター・ピロリの感染が診断で
き、また、単一の抗体を用いることにより、交差反応性
がなく特異性に優れ、ロット毎の変動がなく品質管理が
容易であり、更に、単一のモノクローナル抗体を用いた
場合でも優れた感度を有する診断方法を提供する。 【解決手段】 ヘリコバクター・ピロリのカタラーゼを
抗原とするモノクローナル抗体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術範囲】本発明は、ヘリコバクター・
ピロリのカタラーゼを抗原とするモノクローナル抗体、
そのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、免
疫学的測定法及び診断キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏ
ｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）はヒトの胃粘膜に見られ
る細菌である。ヘリコバクター・ピロリへの感染率は、
社会経済状態と密接に関連しており、発展途上国ほど感
染率が高く、先進国ほど感染率が低くなる傾向がある。
しかしながら、日本人の感染率は先進国の中でも際立っ
て高く、４０歳以上では８０％の人が感染しているとも
言われている。近年、ヘリコバクター・ピロリが胃潰
瘍、十二指腸潰瘍、慢性胃炎、更には胃癌等のさまざま
な胃、十二指腸疾患の原因となりうることが明らかにさ
れてきた。

【０００３】ヘリコバクター・ピロリを除菌することに
より、これらの疾患に罹患する可能性を低減できること
が明らかになったために、ヘリコバクター・ピロリの除
菌対象疾患について国際的な議論がなされ、現在では胃
潰瘍、十二指腸潰瘍、胃悪性リンパ腫、早期胃癌切除後
胃等が除菌の適応対象疾患として認知されている。

【０００４】ヘリコバクター・ピロリの除菌療法が胃、
十二指腸疾患の新しい治療法として認知されるのに伴
い、我が国でも日本消化器病学会により治験ガイドライ
ンが作成され、ヘリコバクター・ピロリ感染の存在診断
と除菌判定法が示された（日本消化器病学会雑誌、９６
巻、１９９−２０７、１９９９年）。上記治験ガイドラ
インでは、存在診断は侵襲的検査法である胃部生検組織
の培養、鏡検、ウレアーゼ試験にて行い、除菌判定は胃
部生検組織の培養と鏡検及び非侵襲的検査法である尿素
呼気試験を必須とすることが示されている。また、被験
者が小児である等の特殊な場合、血中抗ヘリコバクター
・ピロリ抗体検査と存在診断とを併用して判定を行うこ
とが示されている。

【０００５】しかし、これらのヘリコバクター・ピロリ
感染の検査法には以下の問題点がある。侵襲的検査法
は、胃内視鏡の挿入及び生検等により被験者が多大な苦
痛を強いられることとなる。非侵襲的検査法では、被験
者の苦痛は大幅に改善されるが、尿素呼気試験では、検
査前の絶食が必要である。また、尿素呼気試験は、マス
スペクトルや赤外分光高度計等の装置が必要であり、特
定の施設でしか実施できず、コストも高くなるという欠
点がある。抗体検査は、除菌後も血中抗体価が長期にわ
たり高値であるので、除菌判定には適さない。従ってこ
れらの検査に代わる、非侵襲的で且つヘリコバクター・
ピロリ感染を直接、特異的に精度良く検出できる検査方
法が望まれている。

【０００６】従来、消化管感染菌の直接検査法として消
化管排泄物、特に糞便からの感染菌の選択培地を用いた
分離培養が行われてきた。しかし、ヘリコバクター・ピ
ロリに関しては数多くの試みにも拘らず、糞便から分離
培養された報告はほとんどない。その理由として、ヘリ
コバクター・ピロリはｉｎ ｖｉｔｒｏで、低温、栄養
欠乏、酸素欠乏等のように環境条件が悪化すると、通常
のらせん状体から培養不能な球状体へ形態変化すること
から、下部消化管においても分離培養不能な球状体に変
化していることが考えられる。

【０００７】一方、抗原抗体反応に基づく免疫学的方法
による糞便からのヘリコバクター・ピロリの直接検出に
関して、ヘリコバクター・ピロリに対するポリクローナ
ル抗体を用いたイムノアッセイにより糞便等の排泄物検
体中のヘリコバクター・ピロリを検出する方法が報告さ
れている（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３３
巻、２１６２−２１６５、１９９５年、特開平１０−１
０１２８号公報（特許第３０４３９９９号））。

【０００８】しかし、ポリクローナル抗体は、一般に交
差反応性があり、特異性が劣るうえ、抗血清のロット毎
に抗体価や特異性が変動する欠点があるので、ポリクロ
ーナル抗体を用いた診断薬の製造は、本質的に品質管理
が難しいという問題点がある。現実に、特許第３０４３
９９９号の特許権者であるメリディアン社により製造さ
れたポリクローナル抗体を用いた糞便中ヘリコバクター
・ピロリ抗原検出キット「ＨｐＳＡ」に関しては、偽陰
性の出現や特異性の低さが問題となっている（Ｍｅｄｉ
ｃａｌ Ｔｒｉｂｕｎｅ、４−５、１９９９年６月３日
号；Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、９４
巻、１８３０−１８３３、１９９９年）。

【０００９】これに対して、特開平１０−１０１２８号
公報には、ヘリコバクター・ピロリは菌株の変異を起こ
すので、単一の抗原のみとしか反応できないモノクロー
ナル抗体は、ヘリコバクター・ピロリの検出には不適で
あり、逆に、多様な抗原やエピトープに対応し得る点
で、ポリクローナル抗体の方がヘリコバクター・ピロリ
の検出には適していると記載されている。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記現状に
鑑み、被験者に苦痛を与えず、特別の装置を必要とせず
に、安価にヘリコバクター・ピロリの感染が診断でき、
また、単一の抗体を用いることにより、交差反応性がな
く特異性に優れ、ロット毎の変動がなく品質管理が容易
であり、更に、単一のモノクローナル抗体を用いた場合
でも優れた感度を有する診断方法を提供することを目的
とするものである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は、ヘリコバクタ
ー・ピロリのカタラーゼを抗原とするモノクローナル抗
体である。本発明は、また、ヘリコバクター・ピロリの
カタラーゼを抗原とするモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマである。本発明のモノクローナル抗体の
少なくとも１種を用いて行う免疫学的測定法もまた、本
発明の１つである。本発明のモノクローナル抗体の少な
くとも１種を含む診断キットもまた、本発明の１つであ
る。なお、本明細書において、カタラーゼとは、ＳＤＳ
等の変性剤で変性・乖離され、立体構造がほどかれたサ
ブユニットに相当するタンパク質を含まないものであ
る。以下に本発明を詳述する。

【００１２】本発明のモノクローナル抗体は、ヘリコバ
クター・ピロリのカタラーゼを抗原とするものである。
本発明のモノクローナル抗体は、本発明のハイブリドー
マにより産生することができ、例えば、本発明のハイブ
リドーマを培養し、その培養液から得ることができる。
しかしながら、本発明のモノクローナル抗体の製造方法
としては特に限定されず、例えば、遺伝子工学的に得ら
れたものであっても、ヘリコバクター・ピロリのカタラ
ーゼと特異的に結合することができる限り本発明の範囲
に含まれるものである。

【００１３】本発明のハイブリドーマは、ヘリコバクタ
ー・ピロリのカタラーゼを抗原とするモノクローナル抗
体を産生するものであって、ヘリコバクター・ピロリで
免疫した動物の脾細胞又はリンパ節細胞と、骨髄腫細胞
とを融合して得られるものである。

【００１４】本発明のハイブリドーマは、公知の細胞融
合法により作製することができる。即ち、ヘリコバクタ
ー・ピロリを免疫原としてヒト以外の動物を免疫し、そ
の脾細胞又はリンパ節細胞と骨髄腫細胞とを融合させて
ハイブリドーマを作製し、その中からヘリコバクター・
ピロリを認識するモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマを選択することにより本発明のハイブリドーマ
を得ることができる。

【００１５】上記免疫原としては、ヘリコバクター・ピ
ロリのカタラーゼを含有するものであれば特に限定され
ず、例えば、ヘリコバクター・ピロリの菌株を適当な培
地で培養して得られる培養物、らせん状体の菌体、球状
体の菌体、これらの菌体の破砕物、溶解物、抽出物、こ
れらを分画したもの等を挙げることができる。上記菌体
は、死菌体であっても、生菌体であってもよい。

【００１６】上記カタラーゼとしては特に限定されず、
例えば、失活したもの、一部の立体構造が壊れているも
の、一部が欠損したもの等であってもよいが、４個のサ
ブユニットを有するものが好ましく、Ｎａｔｉｖｅなも
のがより好ましい。なお、本明細書において、Ｎａｔｉ
ｖｅな酵素とは、ほぼ生理的な条件でとっている固有の
構造を保持しているものを指し、全てのサブユニットを
有し、かつ、活性を有しているものをいう。

【００１７】上記免疫原のなかでも、球状体の菌体の破
砕物が好ましい。ヘリコバクター・ピロリはｉｎ ｖｉ
ｔｒｏでは低温、栄養欠乏、酸素欠乏等のように環境条
件が悪化すると、通常のらせん状体から培養不能な球状
体へ形態変化するので、消化管排泄物中においても分離
培養不能な球状体に変化していると考えられる。また、
ヘリコバクター・ピロリの菌体は下部消化管では破砕さ
れた状態であると考えられる。

【００１８】上記免疫原として用いるヘリコバクター・
ピロリの菌株種としては特に限定されず、例えば、標準
菌株であるＡＴＣＣ４３５０４株、ＮＣＴＣ１１６３８
等を挙げることができ、更に感染者から採取した他の株
であってもよい。上記免疫原として用いるヘリコバクタ
ー・ピロリの遺伝子型も特に限定されず、例えば、ｖａ
ｃＡやｃａｇＡを有していても有していなくてもよく、
更に、ｖａｃＡがＳ１ａ、Ｓ１ｂ、Ｓ２のいずれの配列
を有していてもよく、ｍ１、ｍ２のどちらの配列を有し
ていてもよい。

【００１９】本発明のハイブリドーマを作製するために
用いる被免疫動物としては特に限定されず、例えば、ヤ
ギ、ヒツジ、モルモット、マウス、ラット、ウサギ等を
挙げることができるが、なかでもマウスが好ましい。

【００２０】上記被免疫動物を免疫する方法としては、
公知の方法を用いることができ、例えば、マウスを免疫
する場合、１回に１〜１００μｇ、好ましくは５０〜１
００μｇの免疫用抗原を等容量（０．１ｍＬ）の生理食
塩水及びフロイントの完全アジュバント又はＲＩＢＩア
ジュバントシステムで乳化して、上記被免疫動物の背
部、腹部の皮下又は腹腔内に２〜３週毎に３〜６回接種
する方法等を挙げることができる。

【００２１】本発明においては、上記被免疫動物を免疫
後、抗体価の高い個体を選び、最終免疫３〜５日後に脾
臓又はリンパ節を摘出し、公知の細胞融合法に従って、
融合促進剤の存在下で、これらの組織に含まれる抗体産
生細胞を骨髄腫細胞と融合させることができる。

【００２２】上記融合促進剤としては特に限定されず、
例えば、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧとい
う）や、センダイウイルス等を挙げることができるが、
好ましくはＰＥＧが用いられる。

【００２３】上記骨髄腫細胞としては特に限定されず、
例えば、Ｐ３Ｕ１、ＮＳ−１、Ｐ３ｘ６３．Ａｇ８．６
５３等のマウス由来の細胞；ＡＧ１、ＡＧ２等のラット
由来の細胞等を挙げることができる。

【００２４】上記細胞融合法としては特に限定されず、
例えば、脾細胞と骨髄腫細胞とを１：１〜１０：１の比
率で混合し、これに分子量１，０００〜６，０００のＰ
ＥＧを１０〜８０％の濃度で添加し、２０〜３７℃、好
ましくは３０〜３７℃で３〜１０分間インキュベートす
る方法等を挙げることができる。

【００２５】本発明において、ヘリコバクター・ピロリ
を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マの選択は、例えば、ハイブリドーマのみが生育できる
ＨＡＴ培地等の選択培地で培養し、ハイブリドーマ培養
上清中の抗体活性を固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）
等の方法を用いて測定することにより行うことができ
る。更に、本発明において、ヘリコバクター・ピロリを
認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
の樹立は、例えば、ヘリコバクター・ピロリを認識する
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに対し、
限界希釈等の方法によりクローニングを繰り返すことに
より行うことができる。

【００２６】本発明のハイブリドーマとしては、例え
ば、２１Ｇ２（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７３３６）、
４１Ａ５（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７３３７）、及
び、８２Ｂ９（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７３３８）を
挙げることができる。これらのハイブリドーマは、平成
１１年１０月１４日に通商産業省工業技術院生命工学工
業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３
号）に寄託（原寄託）されたものであり、平成１２年１
０月２３日に原寄託である微工研菌寄第Ｐ−１７６０４
（２１Ｇ２）、Ｐ−１７６０５（４１Ａ５）、及び、Ｐ
−１７６０６（８２Ｂ９）より、それぞれ移管されたも
のである。

【００２７】本発明のモノクローナル抗体を大量に調製
する方法としては特に限定されず、例えば、あらかじめ
プリスタンを投与したマウスの腹腔にハイブリドーマを
移植して、回収した腹水から得る方法等を挙げることが
できる。腹水中の本発明のモノクローナル抗体は、プロ
テインＡやプロテインＧカラム等を使用する公知の方法
等により精製することができる。

【００２８】本発明のモノクローナル抗体は、カタラー
ゼを抗原とするものである。上記カタラーゼとしてはエ
ピトープが保持されているものであれば特に限定され
ず、例えば、失活したもの、一部の立体構造が壊れてい
るもの、一部が欠損したもの等であってもよいが、４個
のサブユニットを有するものが好ましく、Ｎａｔｉｖｅ
なものがより好ましい。なお、上記カタラーゼは、変異
等を有するものも含むものである。

【００２９】上記カタラーゼを産生するヘリコバクター
・ピロリの菌株種としては特に限定されない。また、上
記カタラーゼを産生するヘリコバクター・ピロリの遺伝
子型としても特に限定されず、例えば、ｖａｃＡやｃａ
ｇＡを有していても有していなくてもよく、更に、ｖａ
ｃＡがＳ１ａ、Ｓ１ｂ、Ｓ２のいずれの配列を有してい
てもよく、ｍ１、ｍ２のどちらの配列を有していてもよ
い。

【００３０】上記カタラーゼを産生するヘリコバクター
・ピロリの形態としては特に限定されず、例えば、らせ
ん状体のヘリコバクター・ピロリ、球状体のヘリコバク
ター・ピロリを挙げることができる。

【００３１】本発明のモノクローナル抗体のクラス・サ
ブクラスとしては特に限定されず、ＩｇＧ_１、Ｉｇ
Ｇ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＭ、ＩｇＥ、Ｉｇ
Ａ_１、ＩｇＡ_２、ＩｇＤのいずれであってもよく、ま
た、Ｌ鎖も特に限定されず、λ鎖であっても、κ鎖であ
ってもよい。

【００３２】また、本発明のモノクローナル抗体として
はヘリコバクター・ピロリのカタラーゼと特異的に結合
することができるものであれば特に限定されず、例え
ば、本発明のモノクローナル抗体の分解物であるＦ（ａ
ｂ′）_２、Ｆａｂ′、Ｆａｂや、キメラ抗体であっても
よい。

【００３３】上述の、２１Ｇ２（受託番号ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−７３３６）、４１Ａ５（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−
７３３７）、及び、８２Ｂ９（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ
−７３３８）のハイブリドーマが産生するモノクローナ
ル抗体（以下、それぞれモノクローナル抗体２１Ｇ２、
モノクローナル抗体４１Ａ５、モノクローナル抗体８２
Ｂ９ともいう）は、ヘリコバクター・ピロリのＮａｔｉ
ｖｅなカタラーゼを認識するものである。

【００３４】本発明者らが、モノクローナル抗体２１Ｇ
２、モノクローナル抗体４１Ａ５、及び、モノクローナ
ル抗体８２Ｂ９をそれぞれ用いてヘリコバクター・ピロ
リの菌体破砕物に対して抗体固定アフィニティークロマ
トグラフィーを行ったところ、ヘリコバクター・ピロリ
の菌体破砕物に含まれていた２７０ｋＤａの分子量を有
するタンパク質が検出された。このタンパク質に対して
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ったとこ
ろ５９ｋＤａの分子量を有する単一のバンドが検出され
た。また、このタンパク質のＮ末端のアミノ酸配列を調
べたところヘリコバクター・ピロリのカタラーゼのアミ
ノ酸配列と一致した。ヘリコバクター・ピロリのカタラ
ーゼは２００ｋＤａの分子量を有し、５０ｋＤａの分子
量を有するサブユニットが４個集合した４量体の構造を
有することが知られている（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．（１９９１），１３７，５７−６１）。

【００３５】従って、以上の結果より、モノクローナル
抗体２１Ｇ２、モノクローナル抗体４１Ａ５、及び、モ
ノクローナル抗体８２Ｂ９が検出したタンパク質は４個
のサブユニットを有するヘリコバクター・ピロリのカタ
ラーゼであると同定され、上記の各モノクローナル抗体
は、４個のサブユニットを有するカタラーゼを認識する
ものであることが明らかとなった。

【００３６】上記抗体固定アフィニティークロマトグラ
フィーで検出されたカタラーゼの活性を測定したとこ
ろ、活性を有しており、このカタラーゼがいわゆるＮａ
ｔｉｖｅな酵素であったことも判明した。なお、モノク
ローナル抗体２１Ｇ２、モノクローナル抗体４１Ａ５、
及び、モノクローナル抗体８２Ｂ９はいずれも、解離し
たカタラーゼのサブユニットとは反応しなかった。

【００３７】ヘリコバクター・ピロリの菌体中の総タン
パク質のうちカタラーゼの占める割合は、Ｊ．Ｇｅｎ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１），１３７，５７−６
１に記載されたカタラーゼの精製過程における比活性の
上昇度から概算して、重量換算でたかだか０．５％であ
る。この点に鑑みると、モノクローナル抗体２１Ｇ２、
モノクローナル抗体４１Ａ５、及び、モノクローナル抗
体８２Ｂ９が、４個のサブユニットを有するカタラーゼ
を認識するものであったということは驚くべきことであ
り、到底予見しえない事項であった。

【００３８】カタラーゼは異なる種の間でも極めてよく
保存されており、ヘリコバクター・ピロリのカタラーゼ
も他の細菌のカタラーゼと相同性が高いことが知られて
いる（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９６），１７８
（２３），６９６０−６９６７）。しかしながら、モノ
クローナル抗体２１Ｇ２、モノクローナル抗体４１Ａ
５、及び、モノクローナル抗体８２Ｂ９は、実施例３に
示したとおり、ヘリコバクター・ピロリ以外の細菌のカ
タラーゼとは全く反応しなかった。

【００３９】また、ヘリコバクター・ピロリには多様な
変異株が存在することが知られているが（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９６），２
０，８３３−８４２）、驚くべきことに、モノクローナ
ル抗体２１Ｇ２、モノクローナル抗体４１Ａ５、及び、
モノクローナル抗体８２Ｂ９は、実施例３に示したとお
り、いずれのヘリコバクター・ピロリに対しても良好に
反応した。

【００４０】本発明のモノクローナル抗体がヘリコバク
ター・ピロリの多様な変異株に対して良好に反応するこ
とに鑑みると、本発明のモノクローナル抗体が認識する
エピトープは変異株同士のカタラーゼの間で極めてよく
保存されている部位であると思われる。

【００４１】以下に詳述するように、本発明のモノクロ
ーナル抗体は、糞便を検体として、極めて高い精度でヘ
リコバクター・ピロリへの感染の有無を判定することが
できるものである。

【００４２】モノクローナル抗体２１Ｇ２、モノクロー
ナル抗体４１Ａ５、及び、モノクローナル抗体８２Ｂ９
を用いて、糞便を検体として免疫学的測定を行ったとこ
ろ、上記の各モノクローナル抗体はヘリコバクター・ピ
ロリに感染している被験者の糞便のみと反応した。これ
により、ヘリコバクター・ピロリに感染している被験者
の糞便中には、４個のサブユニットを有するヘリコバク
ター・ピロリのカタラーゼが存在していることが明らか
になった。糞便中に存在するヘリコバクター・ピロリの
カタラーゼがサブユニットごとに解離したものではな
く、４個のサブユニットを保有するものであるというこ
とは今まで全く知られておらず、このことは、通常タン
パク質は消化管中でタンパク質分解酵素により分解され
てしまうことに鑑みても全く驚くべきことである。

【００４３】また、ヘリコバクター・ピロリの感染者の
糞便を試料として、モノクローナル抗体２１Ｇ２を固定
したカラムを作製し、アフィニティークロマトグラフィ
ーを行い、その溶出画分について、ＥＬＩＳＡとカタラ
ーゼ活性測定を行ったところ、カタラーゼ活性と抗原性
とは一致した。

【００４４】以上のことから、ヘリコバクター・ピロリ
の感染者の糞便中には４個のサブユニットを有し、カタ
ラーゼ活性も有するＮａｔｉｖｅなカタラーゼが含まれ
ることがわかった。ヘリコバクター・ピロリのカタラー
ゼが消化管内で消化されずに、活性を有するＮａｔｉｖ
ｅな酵素として排出され、糞便中に存在していたという
ことは全く予想できないことであった。

【００４５】特開平９−３２２７７２号公報及びＩｎｆ
ｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９７），６５，４６６８−
４６７４にはヘリコバクター・ピロリのカタラーゼをＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥにより変性・乖離させて得られた、ほど
けたサブユニットに相当するタンパク質と反応するモノ
クローナル抗体が開示されている。しかしながら、これ
らのモノクローナル抗体が、Ｎａｔｉｖｅな、立体構造
を保持し活性を有するカタラーゼと反応するか否か、ま
た、糞便等の排泄物検体中のヘリコバクター・ピロリを
検出することができるか否かは不明である。

【００４６】これに対して、本発明のモノクローナル抗
体は、採取が容易である糞便等の消化管排泄物中を検体
として用いてヘリコバクター・ピロリへの感染の有無を
認識することができるものである。

【００４７】本発明のモノクローナル抗体の用途として
は特に限定されるものではないが、免疫学的測定法にお
いて、ヘリコバクター・ピロリへの感染の判定に用いる
ことができる。

【００４８】本発明の免疫学的測定法は、本発明のモノ
クローナル抗体のうちの少なくとも１種を用いて行うも
のであり、１種のみを用いても実施することができるも
のである。

【００４９】一般的に、免疫測定法に用いる抗体として
は、特異性が低く、バックグラウンドが高いポリクロー
ナル抗体よりも、特異性が高く、バックグラウンドが低
いことから、感度に優れるモノクローナル抗体の方が好
ましいとされている。

【００５０】しかしながら、ヘリコバクター・ピロリに
は多様な変異株が存在することが知られており、このた
め、単一のモノクローナル抗体を用いては感染や存在を
検出することが極めて困難であると考えられていた。特
開平１０−１０１２８号公報に記載のように、多様な抗
原を有する細菌への感染や、その細菌の存在を検出する
ためには、多様な抗原に対応しうるポリクローナル抗体
の方が適しているという見解もあり、また、複数のモノ
クローナル抗体を併用してヘリコバクター・ピロリを検
出する方法は開示されている（ＷＯ００／２６６７１）
が、単一のモノクローナル抗体を用いてヘリコバクター
・ピロリを検出する方法は今まで開発されてはいなかっ
た。

【００５１】これに対して、驚くべきことに、本発明の
モノクローナル抗体は、１種の抗体のみを用いることに
より極めて優れた精度でヘリコバクター・ピロリを検出
することができるものであった。

【００５２】なお、ＷＯ００／２６６７１に記載されて
いるモノクローナル抗体は、ウレアーゼ、熱ショックタ
ンパク質、アルカリヒドロペルオキシダーゼ−レダクタ
ーゼ、２０ｋＤａのタンパク質（３−デヒドロキナーゼ
２型）、１６．９ｋＤａタンパク質（好中球活性化タン
パク質）、及び、３３．８ｋＤａタンパク質（フルクト
ース−ビスホスファターゼ−アルドラーゼ）を抗原とす
るものであり、カタラーゼに関しては全く触れられてい
ない。また、ＷＯ００／２６６７１に記載されている測
定方法の検出感度は充分なものではなかった。

【００５３】本発明の免疫学的測定法としては、例え
ば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、固相酵素免疫測定法
（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免
疫測定法（ＦＩＡ）、ウエスタンブロット法、イムノク
ロマトグラフィー法等を挙げることができる。上記の各
種免疫学的測定法は、競合法やサンドイッチ法等によ
り、標識剤で標識された抗原又は抗体を用い、目的とす
る抗原又は抗体を測定することができるものである。上
記の各種免疫学的測定法のなかでも、ＥＬＩＳＡ法及び
イムノクロマトグラフィー法が好ましい。

【００５４】上記競合法は、例えば、検体中のヘリコバ
クター・ピロリのカタラーゼと、既知の量の標識された
ヘリコバクター・ピロリのカタラーゼとの、本発明のモ
ノクローナル抗体に対する結合の量的な競合反応による
ものである。上記で例示した競合法においては、ヘリコ
バクター・ピロリのカタラーゼを含む検体液に、担体上
に保持された一定量の抗体を加え、更に標識剤で標識し
た一定量のヘリコバクター・ピロリのカタラーゼを加え
る。その後、担体上に保持された標識剤又は担体上に保
持されなかった標識剤の活性を測定する。この際、抗体
と標識された抗原の添加はほぼ同時に行うことが好まし
い。

【００５５】上記サンドイッチ法は、例えば、固相化さ
れた本発明のモノクローナル抗体と、標識剤で標識され
た本発明のモノクローナル抗体とで、検体中のヘリコバ
クター・ピロリのカタラーゼをサンドイッチするもので
あり、酵素等の標識剤に対する基質等を加え発色等させ
ることにより、検体中のヘリコバクター・ピロリのカタ
ラーゼを検出するものである。

【００５６】上記標識剤としては、^１２５Ｉ等の放射性
同位元素（以下、ＲＩと記す）、酵素、酵素基質、発光
物質、蛍光物質、ビオチン、着色物質等を挙げることが
できる。これら標識剤と抗原又は抗体との結合には、マ
レイミド法［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９７６），７
９，２３３］、活性化ビオチン法［Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．（１９７８），１００，３５８５］、疎水
結合法等が用いられる。

【００５７】上記酵素としては、例えば、ペルオキシダ
ーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダー
ゼ、グルコースオキシダーゼ等を挙げることができる。
この際用いる基質としては、選択した酵素に適したもの
を選べばよく、例えば、ＡＢＴＳ、ルミノール−Ｈ_２Ｏ
_２、ｏ−フェニレンジアミン−Ｈ_２Ｏ_２（ペルオキシダ
ーゼ用）、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、メチルウ
ンベリフェリルホスフェート、３−（２'−スピロアダ
マンタン）−４−メトキシ−４−（３"−ホスホリルオ
キシ）フェニル−１，２−ジオキセタン（アルカリホス
ファターゼ用）、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラク
トース、メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトー
ス（β−ガラクトシダーゼ用）等を挙げることができ
る。

【００５８】上記測定は、４〜４０℃で１分〜１８時間
反応させ、生じた発色、蛍光量、発光量又は着色量を測
定することにより行うことができ、他にも、４〜４０℃
の範囲で加温しながら行ういわゆるレート法を採用して
もよい。

【００５９】上記抗原又は抗体への放射標識は、市販さ
れているボルトンハンター試薬により容易に行うことが
できる。例えば、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液に
溶かした抗原又は抗体溶液にボルトンハンター試薬を加
え１〜２時間後に、Ｇ−２５の脱塩カラム等を用いて未
反応のボルトンハンター試薬を除去することにより実施
することができる。この他、クロラミンＴ法やヨードジ
ン法等を採用することにより容易に^１２５Ｉによる放射
標識を行うことができる。

【００６０】上記発光物質としては、例えば、イソルミ
ノールやアクリジンエステル等を挙げることができ、上
記蛍光物質としては、例えば、フルオレセインやローダ
ミン等を挙げることができる。この際、標識の方法は活
性化エステル法やイソシアネート法を採用することによ
り容易に行うことができる（「酵素免疫測定法」医学書
院、１９８７年）。上記着色物質としては、例えば、着
色ラテックス粒子、金コロイド等を挙げることができ
る。

【００６１】本発明の免疫学的測定法として、上記競合
法を実施するには、例えば、未知量のヘリコバクター・
ピロリのカタラーゼを含有する検体を、公知の手段で物
理的又は化学的に本発明のモノクローナル抗体を結合さ
せた固相に加えて反応させる。また、同時に標識剤で標
識したヘリコバクター・ピロリのカタラーゼの一定量を
加えて反応させる。

【００６２】本発明の免疫学的測定法として、上記サン
ドイッチ法を実施するには、例えば、未知量のヘリコバ
クター・ピロリのカタラーゼを含有する検体を、公知の
手段で物理的又は化学的に本発明のモノクローナル抗体
を結合させた固相に加えて反応させる。その後標識剤で
標識した本発明のモノクローナル抗体を加えて反応させ
る。

【００６３】次いで、いずれの方法においても、必要な
場合には固相をよく洗浄した後で、固相上に結合してい
る標識剤の活性を測定する。上記標識剤がＲＩである場
合、ウェル・カウンター又は液体シンチレーション・カ
ウンターを用いて測定する。標識剤が酵素である場合、
基質を加えて放置し、比色法又は蛍光法により酵素活性
を測定する。標識剤が蛍光物質、発光物質、着色物質で
あっても、それぞれ公知の方法に従って測定する。

【００６４】本発明の免疫学的測定法は、本発明のモノ
クローナル抗体を用いるものであるので、ヘリコバクタ
ー・ピロリのカタラーゼに特異的に存在するエピトープ
を認識することができ、他の物質を、交差反応を原因と
して誤って検出してしまうことがなく、特異性が極めて
高い測定を行うことができるという極めて優れた特色を
有する。

【００６５】本発明の免疫学的測定法を実施するために
本発明の診断キットを用いることができる。本発明の診
断キットは、本発明のモノクローナル抗体の少なくとも
１種を含むものであり、１種のみのモノクローナル抗体
を含むものであってもよい。本発明の診断キットにおい
て用いられる本発明のモノクローナル抗体としては、ヘ
リコバクター・ピロリのカタラーゼを認識するものであ
れば特に限定されず、本発明のモノクローナル抗体の分
解物であるＦ（ａｂ′）_２、Ｆａｂ′、Ｆａｂ等であっ
てもよい。

【００６６】本発明の診断キットは、ヘリコバクター・
ピロリの菌体又はヘリコバクター・ピロリのカタラーゼ
の存在を免疫学的に検出することができ、ヘリコバクタ
ー・ピロリへの感染を判定するものである。本発明の診
断キットでは、本発明のモノクローナル抗体はあらかじ
め固相化されていてもよく、また、本発明のモノクロー
ナル抗体はあらかじめ上記標識剤で標識されていてもよ
い。

【００６７】本発明の診断キットにおいて用いる固相と
しては特に限定されず、例えば、ポリスチレン等のポリ
マー、ガラスビーズ、磁性粒子、マイクロプレート、イ
ムノクロマトグラフィー用濾紙、グラスフィルター等の
不溶性担体を挙げることができる。

【００６８】本発明の診断キットは、更に他の成分を含
んでいてもよい。上記他の成分としては特に限定され
ず、例えば、標識に用いる酵素、その基質、放射性同位
元素、発光物質、蛍光物質、着色物質、緩衝液、プレー
ト等を挙げることができ、これらとしては上記に掲げた
ものを用いることができる。

【００６９】本発明の診断キットの形態としては特に限
定されないが、迅速かつ簡便に診断を行うためには本発
明の診断キットの構成成分が一体となった一体型の診断
キットであることが好ましい。上記一体型の診断キット
としては特に限定されず、例えば、カセット型、カート
リッジ型等を挙げることができる。

【００７０】上記カセット型の態様としては、例えば、
イムノクロマトグラフィー法を用い、反応カセット内に
メンブレンが収納されており、そのメンブレン上の一端
（下流側）には本発明のモノクローナル抗体が固相化さ
れており、メンブレン上の逆の一端（上流側）には、展
開液が装着されており、その近傍の下流側には、上記標
識剤の基質が添加されたパッドが配置されており、メン
ブレンの中間部には上記標識剤で標識された本発明のモ
ノクローナル抗体が添加されたパッドが配置されている
態様等を挙げることができる。

【００７１】上記に例示したカセット型の態様を有する
診断キットを使用する場合、上記標識剤で標識された本
発明のモノクローナル抗体が添加されたパッド上に検体
を添加し、検体に含まれるヘリコバクター・ピロリのカ
タラーゼと上記標識剤で標識された本発明のモノクロー
ナル抗体との結合体を形成させた後、上記展開液を展開
させると、形成された結合体は本発明のモノクローナル
抗体が固相化されている箇所まで移送され、そこでヘリ
コバクター・ピロリのカタラーゼと上記標識剤で標識さ
れた本発明のモノクローナル抗体と固相化された本発明
のモノクローナル抗体との複合体が形成される。次い
で、上記標識剤と上記基質が反応し、発色等する。この
発色等を感知することによって、ヘリコバクター・ピロ
リへの感染を判定することができる。

【００７２】検体を充分な量の展開液で希釈してからメ
ンブレン上に滴下する態様を採用する場合は、あらかじ
めメンブレン上に展開液を装着しておかなくともよい。
また、上記標識剤として着色ラテックス粒子等の着色物
質を用いる場合は、基質は不要であり、本発明のモノク
ローナル抗体が固相化されている箇所で上記複合体が形
成されたか否かは、着色物質による着色により判断され
る。

【００７３】上記カートリッジ型の態様としては、例え
ば、反応が上記競合法である場合には、複数のウェルを
有するカートリッジであり、（ａ）本発明のモノクロー
ナル抗体が収納されたウェル、（ｂ）上記標識剤で標識
されたヘリコバクター・ピロリ等を含む液状試薬（例：
バッファー溶液）が収納されたウェル、（ｃ）上記標識
剤の基質を含む液状試薬（例：バッファー溶液）が収納
されたウェル、が一体的に形成されてなるカートリッジ
等を挙げることができ、反応がサンドイッチ法である場
合には、複数のウェルを有するカートリッジであり、
（ａ）本発明のモノクローナル抗体が固相化された不溶
性担体が収納されたウェル、（ｂ）上記標識剤で標識さ
れた本発明のモノクローナル抗体を含む液状試薬（例：
バッファー溶液）が収納されたウェル、（ｃ）上記標識
剤の基質を含む液状試薬（例：バッファー溶液）が収納
されたウェル、が一体的に形成されてなるカートリッジ
等を挙げることができる。

【００７４】上記に例示したカートリッジ型の本発明の
診断キットを使用する場合は、通常、競合法やサンドイ
ッチ法を実施する際と同様に、反応及び測定を行うこと
ができる。本発明の診断キットは、上記競合法と上記サ
ンドイッチ法のいずれの方法を実施するものであっても
よいが、上記サンドイッチ法を実施するものであること
が好ましい。上記サンドイッチ法は、感度が高く、反応
時間が短くてすみ、精度に優れるという利点を有する。
上記サンドイッチ法としてイムノクロマトグラフィー法
を用いると、試験操作が簡便で、結果の判定も目視で容
易に行うことのできるキットを作製することができる。
また、ＥＬＩＳＡとして上記サンドイッチ法を用いる
と、測定対象物質の量に依存して酵素反応生成物が生じ
るので、ヘリコバクター・ピロリへの感染が陽性である
場合の発色等を目視で確認できるような系の設定が容易
である。

【００７５】本発明の診断キットに用いる検体としては
特に限定されず、例えば、胃内容物、胃洗浄液、消化管
排泄物等を挙げることができるが、採取が容易で被験者
への負担が少ない点で糞便等の消化管排泄物が好まし
い。本発明の診断キットは、除菌治療前に感染の有無を
調べるために用いてもよく、除菌治療後にその成否の判
定を行うために用いてもよい。

【００７６】本発明の診断キットは、モノクローナル抗
体を用いるためロット毎の差がなく、検出感度が高く、
偽陰性や偽陽性の問題を生じない。本発明によれば、ヘ
リコバクター・ピロリのカタラーゼを抗原とするモノク
ローナル抗体を用いることによって、検体中の他の物質
による影響を排除できるので、極めて高感度かつ特異的
に、ヘリコバクター・ピロリの存在を検出することがで
きる。また、ヘリコバクター・ピロリのカタラーゼに対
するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマが樹立され
たことにより、同一のモノクローナル抗体を半永久的に
製造することが可能となる。本発明のモノクローナル抗
体を用いた診断キットは、消化管排泄物を検体とするこ
とができるので、被験者に苦痛を与えることなく、簡便
かつ効率よくヘリコバクター・ピロリ感染を検出するこ
とができる。また、本発明のモノクローナル抗体を用い
た診断キットは、１種のみのモノクローナル抗体を用い
る場合であっても、極めて優れた精度を呈し、ロット毎
の差がなく、安定しているので、常に特異的かつ精度良
くヘリコバクター・ピロリ感染を検出することができ
る。また、上記診断キットは、測定が簡便であり、医療
現場で非常に有用である。

【００７７】

【実施例】以下に実施例、試験例を挙げ、本発明を更に
詳細に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるも
のではない。

【００７８】実施例１ ［モノクローナル抗体の作製］ （１）ヘリコバクター・ピロリ球状菌体懸濁液（免疫
原）の調製 ５％馬脱繊血を添加したブレインハートインヒュージョ
ン寒天培地（ディフコ社製）上にヘリコバクター・ピロ
リ（ＡＴＣＣ４３５０４）を筋状に画線した。このプレ
ートを３７℃微好気性環境下にて３〜４日培養後、更に
３７℃嫌気性環境下にて７日間インキュベートし、球状
化させた。得られたコロニーを白金耳等でかきとり、リ
ン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）に懸濁した。４℃にて、
１００００×ｇで１０分間遠心分離したヘリコバクター
・ピロリの菌体を０．５％ホルマリンに懸濁し、４℃に
て４日間放置して不活化した。その後、ＰＢＳに懸濁
し、４℃にて、１００００×ｇで１０分間遠心分離する
操作を３回繰り返し、上記菌体を洗浄した後、ＰＢＳに
懸濁した。

【００７９】（２）ヘリコバクター・ピロリ球状菌体破
砕物（免疫原）の調製 （１）で得られた菌体懸濁液を、超音波破砕機（セイコ
ー電子工業社製、Ｍｏｄｅｌ ７２５０）を用いて、ｏ
ｕｔｐｕｔ ３、５０％ ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅの条件
にて１０分間超音波処理して菌体を破砕した。

【００８０】（３）免疫及び細胞融合 （１）、（２）にて調製した免疫原（ヘリコバクター・
ピロリ球状菌体懸濁液又はヘリコバクター・ピロリ球状
菌体破砕物）とＦｒｅｕｎｄのコンプリートアジュバン
ト（カルビオケム社製）を当量混合し、オイルエマルジ
ョンとした。これをＢＡＬＢ／ｃＡマウス（日本クレア
社製、６週齢、雌）の背部皮下に０．２ｍＬずつ投与し
た。初回免疫後７日目と１４日目に追加免疫を行い、更
に細胞融合３日前に上記免疫原を０．２ｍＬずつ腹腔内
に投与した。最終免疫から３日目のマウス脾細胞を摘出
し、骨髄腫細胞（Ｐ３ｘ６３．Ａｇ８．６５３株、ＲＣ
Ｂ０１４６、理研ジーンバンク）と１０：１の割合で混
合し、５０％ポリエチレングリコール４０００を用いて
融合した後、ＨＡＴ培地（ギブコ社製）によりハイブリ
ドーマを選択培養した。

【００８１】（４）ハイブリドーマの選択 細胞融合後１２日目に培養上清中の抗体活性をＥＬＩＳ
Ａにより測定した。免疫原１０μｇ／ｍＬを固相化した
９６穴ＥＬＩＳＡプレート（コースター社製）の各穴に
融合細胞の培養上清液２００μＬを添加し、３７℃で１
時間反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０入りＰＢＳ（洗
浄液）で洗浄し、ぺルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ
（Ｃａｐｐｅｌ社製、１：２００００）２００μＬを添
加した。３７℃で１時間反応後、上記洗浄液で洗浄し
た。洗浄後、基質液（０．１Ｍ ｏ−フェニレンジアミ
ンと０．０１２％過酸化水素水）を各穴に２００μＬず
つ添加し、室温で１５分反応させた。反応後、各穴に
３．５Ｎ硫酸を５０μＬずつ添加し酵素反応を停止し、
４９２ｎｍにおける吸光値を測定した。吸光値が０．１
５以上を示した、上記免疫原に反応する抗体を産生する
ハイブリドーマクローンを選択した。各クローンを限界
希釈法により２回クローニングを行った。クローニング
後のハイブリドーマをＢＡＬＢ／ｃＡマウスに移植した
結果、腹水として回収できるモノクローナル抗体を産生
したハイブリドーマは３２クローンであった。

【００８２】実施例２ ［サンドイッチＥＬＩＳＡによる消化管排泄物中のヘリ
コバクター・ピロリを特異的に認識するモノクローナル
抗体の選択］ （１）モノクローナル抗体固相化プレートの作製 ３２クローンの腹水各１ｍＬをＰＢＳで２倍に希釈し、
飽和硫酸アンモニウム２ｍＬを滴下して４℃で４時間放
置した。その後、３０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離
し、沈査をＰＢＳ２ｍＬに浮遊し透析を行った。これら
のモノクローナル抗体を以下の方法により９６穴ＥＬＩ
ＳＡプレートに固相化した。即ち、各モノクローナル抗
体を５μｇ／ｍＬに希釈した後、９６穴ＥＬＩＳＡプレ
ートの各穴に０．２ｍＬ加え、４℃で一夜放置した後、
ＰＢＳで洗浄した。洗浄後、１％スキムミルク−ＰＢＳ
を各穴に０．２５ｍＬ加え、４℃で１時間放置してマス
キングを行った。マスキング後、上記洗浄液で洗浄し
た。

【００８３】（２）ビオチン標識モノクローナル抗体の
作製 （１）にて調製した３２クローンのモノクローナル抗体
３ｍｇとビオチニル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエス
テル（ザイメッド社製）１０ｍｇを混合し、０．１Ｍ炭
酸水素ナトリウム（ｐＨ８）中、室温で、３時間攪拌し
ながら反応させた。反応液をＰＢＳ ５Ｌに対して４℃
で一夜透析し、ビオチン標識モノクローナル抗体を得
た。

【００８４】（３）消化管排泄物中のヘリコバクター・
ピロリを特異的に認識するモノクローナル抗体の選択 尿素呼気試験によりヘリコバクター・ピロリ陽性者及び
陰性者と判定された各１名の糞便検体２５０ｍｇを０．
１％スキムミルク−ＰＢＳ ０．５ｍＬに懸濁後、３０
００ｒｐｍで１０分間遠心分離した上清を集め、糞便抽
出液とした。糞便抽出液０．２ｍＬを（１）にて調製し
た各モノクローナル抗体固相化プレートの各穴に添加し
た。３７℃で１時間放置後、上記洗浄液にて５回洗浄
し、（２）にて調製した各ビオチン標識モノクローナル
抗体０．２ｍＬを添加した。３７℃で１時間放置後、上
記洗浄液にて洗浄し、ぺルオキシダーゼ標識アビジン
０．２ｍＬ（ザイメッド社製）を添加した。３７℃で１
時間放置後、上記洗浄液にて洗浄後、基質液（０．１Ｍ
ｏ−フェニレンジアミンと０．０１２％過酸化水素
水）を各穴に０．２ｍＬずつ添加し、室温で１０分反応
させた。反応後、各穴に３．５Ｎ硫酸を５０μＬずつ添
加し酵素反応を停止し、４９２ｎｍにおける吸光値を測
定した。結果を表１に示した。

【００８５】

【表１】

【００８６】表１に示した通り、３種のモノクローナル
抗体２１Ｇ２、４１Ａ５、８２Ｂ９を単独又は組合わせ
たサンドイッチＥＬＩＳＡは、ヘリコバクター・ピロリ
感染者の糞便検体に対して高い反応性を示すことがわか
った。各モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
はそれぞれハイブリドーマ２１Ｇ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−
７３３６）、ハイブリドーマ４１Ａ５（ＦＥＲＭ ＢＰ
−７３３７）、及び、ハイブリドーマ８２Ｂ９（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−７３３８）として工業技術院生命工学工業技
術研究所に寄託されている。なお、各モノクローナル抗
体のイムノグロブリンサブクラスをイムノグロブリンタ
イピングキットマウス（和光純薬工業社製）により調べ
た結果、３クローン共ＩｇＧ_１で、Ｌ鎖はκ型であっ
た。

【００８７】実施例３ ［菌株による反応性の比較及び他菌種との反応性］ （１）ヘリコバクター・ピロリ菌体懸濁液の調製 ５％馬脱繊血を添加したブレインハートインヒュージョ
ン寒天培地上にヘリコバクター・ピロリ（ＡＴＣＣ４３
５０４；東海大学病院臨床分離株Ｎｏ．１３０、及び、
Ｎｏ．１１２；兵庫医科大学臨床分離株Ｎｏ．５２６、
Ｎｏ．４４８４、Ｎｏ．５０１７、Ｎｏ．５０２５、Ｎ
ｏ．５０４９、Ｎｏ．５１４２、Ｎｏ．５２８７、Ｎ
ｏ．５３０８、Ｎｏ．５３１４、及び、Ｎｏ．５３３
０）を筋状に画線した。このプレートを３７℃で３〜４
日間微好気性培養して得られたらせん状菌のコロニー、
又は、更に３７℃で嫌気性環境下にて７日間放置して得
られた球状菌のコロニーを白金耳等でかきとり、ＰＢＳ
に懸濁した。４℃にて、１００００×ｇで１０分間遠心
分離した菌体を０．５％ホルマリンに懸濁し、４℃にて
４日間放置して不活化した。その後、ＰＢＳに懸濁し、
４℃にて、１００００×ｇで１０分間遠心分離する操作
を３回繰り返し、菌体を洗浄した後、再度、ＰＢＳに懸
濁し、ヘリコバクター・ピロリらせん状菌体懸濁液及び
球状菌体懸濁液を得た。

【００８８】（２）ヒト腸内菌及びキャンピロバクター
・ジェジュニの菌体懸濁液の調製 ヒト糞便から分離される代表的な腸内菌バクテロイデス
・ブルガタス、エシェリヒア・コリの２菌種及びらせん
状菌であるキャンピロバクター・ジェジュニを以下の方
法で培養し、得られたコロニーから（１）と同様の方法
により各菌の菌体懸濁液を調製した。即ち、バクテロイ
デス・ブルガタス（ＩＦＯ１４２９１）は５％馬脱繊血
を添加したＢＬ寒天培地（日水製薬社製）上で３７℃で
２日間、嫌気培養した。エシェリヒア・コリ（ＡＴＣＣ
２５９２２）はブレインハートインヒュージョン寒天培
地上で、３７℃で１日間、好気培養した。キャンピロバ
クター・ジェジュニ（８００６８ 東海大学病院臨床分
離株）は５％馬脱繊血を添加したブレインハートインヒ
ュージョン寒天培地上で３７℃で２日間微好気培養し
た。

【００８９】（３）他のヘリコバクター属の菌体懸濁液
調製 ヘリコバクター・フェリス（ＡＴＣＣ４９１７９）とヘ
リコバクター・ヘパティカス（ＡＴＣＣ５１４４８）と
を５％馬脱繊血を添加したブレインハートインヒュージ
ョン寒天培地上で（１）と同様に培養して、得られたら
せん状菌のコロニーから（１）と同様にしてらせん状菌
体懸濁液を得た。

【００９０】（４）菌体破砕物の調製 （１）、（２）及び（３）で得られた各菌体懸濁液を、
超音波破砕機（セイコー電子工業社製、Ｍｏｄｅｌ ７
２５０）を用いて、ｏｕｔｐｕｔ ３、５０％ｄｕｔｙ
ｃｙｃｌｅの条件にて１０分間超音波処理して菌体を
破砕した。

【００９１】（５）サンドイッチＥＬＩＳＡ （４）で得られた各菌体破砕物（タンパク質濃度１０μ
ｇ／ｍＬ）０．２ｍＬをそれぞれ、実施例２（３）の方
法によりサンドイッチＥＬＩＳＡ（モノクローナル抗体
４１Ａ５固相化プレート：ビオチン標識モノクローナル
抗体８２Ｂ９、モノクローナル抗体２１Ｇ２固相化プレ
ート：ビオチン標識モノクローナル抗体４１Ａ５、モノ
クローナル抗体２１Ｇ２固相化プレート：ビオチン標識
モノクローナル抗体８２Ｂ９、モノクローナル抗体２１
Ｇ２固相化プレート：ビオチン標識モノクローナル抗体
２１Ｇ２、及び、メリディアン社製ＨｐＳＡ）を行っ
た。結果を表２に示した。

【００９２】

【表２】

【００９３】表２に示した通り、モノクローナル抗体２
１Ｇ２、４１Ａ５、８２Ｂ９は、ヘリコバクター・ピロ
リの各菌株のらせん状菌体、球状菌体に対して高い反応
性を示すことがわかった。一方、バクテロイデス・ブル
ガタス、エシェリヒア・コリ、キャンピロバクター・ジ
ェジュニ、ヘリコバクター・フェリス、及び、ヘリコバ
クター・ヘパティカスに対しては全く反応しなかった。
これに対して、メリディアン社製ＨｐＳＡは、ヘリコバ
クター・フェリス、及び、ヘリコバクター・ヘパティカ
スに対して反応性を示した。

【００９４】実施例４ ［サンドイッチＥＬＩＳＡによる糞便検体中ヘリコバク
ター・ピロリの検出（１）］尿素呼気試験の結果、ヘリ
コバクター・ピロリ陽性、陰性であったそれぞれ３名よ
り提供された糞便検体２５０ｍｇを０．１％スキムミル
ク−ＰＢＳ ０．５ｍＬに懸濁し、実施例２（３）と同
様の操作にて試験した。また、同じ糞便検体をメリディ
アン社製のＨｐＳＡ ＥＬＩＳＡを用いて操作方法に従
って試験し、４５０ｎｍの吸光値を測定した。それぞれ
の吸光値及び尿素呼気試験結果を表３に示した。

【００９５】

【表３】

【００９６】尿素呼気試験結果が陽性であった被験者
（Ｎｏ．４、５、６）より提供された糞便検体は、陰性
検体（Ｎｏ．１、２、３）に比べて著しく高い吸光値を
示すことがわかった。

【００９７】実施例５ ［サンドイッチＥＬＩＳＡによる糞便検体中ヘリコバク
ター・ピロリの検出（２）］ （１）モノクローナル抗体の調製 ハイブリドーマ２１Ｇ２をＢＡＬＢ／ｃＡマウスに移植
して回収した腹水５ｍｌをＰＢＳで２倍に希釈し、飽和
硫酸アンモニウム１０ｍＬを滴下して４℃、４時間放置
した。その後、３０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離し、
沈渣をＰＢＳ１０ｍＬに溶解した後、ＰＢＳに対して透
析を行った。

【００９８】（２）モノクローナル抗体固相化プレート
の作製 （１）で調製したモノクローナル抗体２１Ｇ２溶液を以
下の方法により９６穴ＥＬＩＳＡプレートに固相化し
た。ＰＢＳにて抗体濃度５μｇ／ｍＬに希釈した後、９
６穴ＥＬＩＳＡプレートの各穴に０．２ｍＬ加え、４
℃、一夜放置した後、ＰＢＳで洗浄した。

【００９９】（３）ペルオキシダーゼ標識モノクローナ
ル抗体作製 マレイミド法（石川栄治著、生物化学実験法２７、酵素
標識法、ｐ．５１、１９９１年、学会出版センター）を
用いてペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体を作製
した。（１）で調製したモノクローナル抗体５ｍｇとＳ
−ａｃｅｔｙｌｍｅｒｃａｐｔｏｓｕｃｃｉｎｉｃ ａ
ｎｈｙｄｒｉｄｅ（アルドリッチ社製）０．６ｍｇを混
合し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）０．５ｍＬ
中、３０℃で、３０分間反応させた。反応液に０．１Ｍ
ＥＤＴＡ２０μＬ、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．０）０．１ｍＬ、１Ｍヒドロキシルアミン（ｐＨ
７．０）０．１ｍＬを加えて、３０℃、５分間放置後、
１００００ｒｐｍ、５分間遠心分離して上清を得た。上
清をセントリコン３０（ａｍｉｃｏｎ社製）で限外ろ過
して、試薬を除去した後、５ｍＭ ＥＤＴＡ−０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１ｍＬに置換し、チオール
基導入モノクローナル抗体を得た。

【０１００】ペルオキシダーゼ（西洋ワサビ、東洋紡社
製）５ｍｇとＮ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−（Ｎ
−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）−ｃｙｃｌｏｈｅ
ｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ−（ＩＣＮ Ｂ
ｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）１ｍｇを混合し、０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．５ｍＬ中、３０℃で、
１時間反応させた。反応液を１００００ｒｐｍ、５分間
遠心分離して上清を得た。上清をセントリコン３０で限
外ろ過して、試薬を除去した後、０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）１ｍＬに置換し、マレイミド基導入ペル
オキシダーゼを得た。

【０１０１】上記のチオール基導入モノクローナル抗体
とマレイミド基導入ペルオキシダーゼをモル比１：５で
混合し、室温で３０分間反応させた。反応液をＳｅｐｈ
ａｃｒｙｌ−Ｓ３００ＨＲカラムのゲル濾過カラム（直
径２６×長さ８７０ｍｍ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
６．５））に負荷し、ペルオキシダーゼ標識モノクロー
ナル抗体を含む画分を集めた。

【０１０２】（４）サンドイッチＥＬＩＳＡによる糞便
検体中ヘリコバクター・ピロリの検出 尿素呼気試験によりヘリコバクター・ピロリ陽性者及び
陰性者と判定された各１０名の糞便検体２５０ｍｇを
０．１％スキムミルク−ＰＢＳ ０．５ｍＬに懸濁後、
３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した上清を集め、糞
便抽出液とした。糞便抽出液５０μＬ及び（３）で作製
したペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体５０μＬ
を上記モノクローナル抗体固相化プレートの各穴に添加
した。２５℃、１時間放置後、洗浄液（０．０５％ツィ
ーン２０−ＰＢＳ）にて５回洗浄後、基質液（テトラメ
チルベンチジン＋過酸化水素、ＢｉｏＦＸ社製）０．１
ｍＬを各穴に添加し、室温で１０分反応させた。反応
後、各穴に１Ｎ硫酸を５０μＬずつ添加し酵素反応を停
止し、吸光値（４５０ｎｍ−６３０ｎｍ）を測定した。
また、同じ糞便検体を、ＨｐＳＡを用いて試験し、吸光
値（４５０ｎｍ−６３０ｎｍ）を測定した。結果を表４
に示した。

【０１０３】

【表４】

【０１０４】表４に示した通り、モノクローナル抗体２
１Ｇ２を単独で用いたサンドイッチＥＬＩＳＡは、ヘリ
コバクター・ピロリ感染者の糞便検体に対して高い反応
性を示し、尿素呼気試験による判定結果と完全に一致し
た。一方、ＨｐＳＡでは２検体（検体番号１６、１９）
が不一致（偽陽性）であった。

【０１０５】実施例６ ［イムノクロマトグラフィー法による糞便中ヘリコバク
ター・ピロリの検出］ （１）抗体固相化支持体の作製 抗ヘリコバクター・ピロリモノクローナル抗体及び抗ウ
サギＩｇＧ抗体を線状に固相化した抗体固相化支持体を
作製するために、ニトロセルロースシート（ワットマン
社製）を５ｍｍ×２０ｍｍに裁断し、その下端より１０
ｍｍの位置にモノクローナル抗体２１Ｇ２の溶液、１５
ｍｍの位置に抗ウサギＩｇＧヤギポリクローナル抗体
（Ｃａｐｐｅｌ社製）の溶液をバイオジェットＱ３００
０（Ｂｉｏｄｏｔ社製）を用いて塗布した。室温で２時
間乾燥後、１％スキムミルク（Ｄｉｆｃｏ社製）−０．
１％ツィーン２０−ＰＢＳに１０分浸漬しマスキングを
行った。その後、充分に乾燥した。

【０１０６】（２）着色ラテックス粒子標識物の調製 ａ．赤色ラテックス粒子標識抗ヘリコバクター・ピロリ
抗体 赤色ラテックス粒子分散液（ＰＬ−Ｌａｔｅｘ、１０
％、４５０ｎｍ、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ社製）３００μＬにＰＢＳ１．２ｍＬを加え、１
３０００ｒｐｍ、５分間遠心分離を行った。沈渣にモノ
クローナル抗体２１Ｇ２溶液（５ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬを
加え、充分混和して、室温、１時間反応を行った。未反
応のモノクローナル抗体を除去するため、１３０００ｒ
ｐｍ、５分間遠心分離を行い、沈渣をＰＢＳ１．５ｍＬ
に懸濁し、再度遠心分離を行った。１％スキムミルク１
ｍＬを加え、室温、１時間反応させてマスキングを行っ
た。その後、１３０００ｒｐｍ、５分間遠心分離を行
い、沈渣を１％スキムミルク−０．０１％アジ化ナトリ
ウムを含むＰＢＳ１．５ｍＬに懸濁した。

【０１０７】ｂ．青色ラテックス粒子標識ウサギＩｇＧ 青色ラテックス粒子分散液（ＰＬ−Ｌａｔｅｘ、１０
％、４５０ｎｍ、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ社製）及びウサギＩｇＧ（０．５ｍｇ／ｍＬ、Ｃ
ａｐｐｅｌ社製）を用いて上記と同様な操作で青色ラテ
ックス粒子標識ウサギＩｇＧを調製した。

【０１０８】ｃ．着色ラテックス粒子標識物 上記２種類の着色ラテックス粒子標識抗体を等量混和
し、ベンリーゼ（商標登録）不織布（旭化成社製）５ｍ
ｍ×５ｍｍに１０μＬ含浸させ、通風乾燥した。

【０１０９】（３）イムノクロマトグラフィー試験片の
作製 抗体固相化支持体の下端から２．５ｍｍの位置まで着色
ラテックス標識物を重ねた。更に、着色ラテックス標識
物上に被検液浸漬用担体（３ＭＭ Ｃｈｒ、ワットマン
社製）を下端から２．５ｍｍの位置まで重ねた。また、
抗体固相化支持体の上端から２ｍｍの位置まで吸水性担
体（３ＭＭ Ｃｈｒ、ワットマン社製）を重ね、最後に
透明なテープを上部に貼り固定してイムノクロマトグラ
フィー試験片とした。

【０１１０】（４）糞便検体中ヘリコバクター・ピロリ
の検出 実施例４に記載した６名（陽性、陰性各３名）の糞便を
用いて試験した。各糞便０．１ｇを採取し、０．１％Ｂ
ＳＡ−０．０５％ツィーン２０−ＰＢＳ１ｍＬに懸濁し
た。３０００ｒｐｍ、１分間遠心分離して夾雑物を除去
し、上清５０μＬを（３）で作製したイムノクロマトグ
ラフィー試験片の被検液浸漬用担体部に滴下した。１０
分後に抗ヘリコバクター・ピロリモノクローナル抗体固
相化部位に現れる赤いラインの有無を判定した。その結
果、陰性検体では全例赤いラインは確認できず、陽性検
体では全例赤いラインが確認できた。なお、青ラインは
全検体で確認されたので、試験は成功であった。

【０１１１】実施例７ ［ラテックス凝集法による糞便中ヘリコバクター・ピロ
リの検出］ （１）ラテックス粒子標識抗ヘリコバクター・ピロリ抗
体の調製 白色ラテックス粒子分散液（ＰＬ−Ｌａｔｅｘ、１０
％、４４０ｎｍ、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ社製）０．１ｍＬにＰＢＳ０．４ｍＬを加え、１
３０００ｒｐｍ、５分間遠心分離を行った。沈渣にＰＢ
Ｓ０．５ｍＬ及びモノクローナル抗体２１Ｇ２溶液（１
ｍｇ／ｍＬ）０．５ｍＬを加え、充分混和して、室温、
一晩反応を行った。未反応のモノクローナル抗体を除去
するため、１３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離を行
い、沈渣をＰＢＳ１ｍＬに懸濁し、再度遠心分離を行っ
た。１％スキムミルク１ｍＬを加え、室温、１時間反応
させてマスキングを行った。その後、１３０００ｒｐ
ｍ、５分間遠心分離を行い、沈渣を１％スキムミルク−
０．０１％アジ化ナトリウム含有ＰＢＳ１ｍＬに懸濁し
た。

【０１１２】（２）糞便検体中ヘリコバクター・ピロリ
の検出 実施例４に記載した６名（陽性、陰性各３名）の糞便を
用いて試験した。各糞便０．１ｇを採取し、０．１％Ｂ
ＳＡ−０．０５％ツィーン２０含有ＰＢＳ１ｍＬに懸濁
した。３０００ｒｐｍ、１分間遠心分離して夾雑物を除
去し、上清を得た。この糞便懸濁液上清５０μＬ及び
（１）で調製したラテックス粒子標識抗ヘリコバクター
・ピロリ抗体５０μＬをラテックス凝集盤上に滴下し、
スライドローター（栄研化学社製）を用いて混和した。
５分後に凝集の有無を目視判定した。その結果、陰性検
体では全例凝集は確認できず、陽性検体では全例凝集が
確認できた。

【０１１３】実施例８ ［ゲル濾過法による糞便中抗原の分子量測定］ヘリコバ
クター・ピロリ陽性者（表３のＮｏ．４及びＮｏ．５）
より提供された糞便検体２０ｇを氷冷したＰＢＳ１００
ｍＬに懸濁した。１００００×ｇで１０分間遠心分離
し、残渣を取り除き、更に９００００×ｇで３０分間遠
心分離を行い、上清を得た。この上清１．５ｍＬをＳｅ
ｐｈａｃｒｙｌ−Ｓ３００ＨＲ（ファルマシア社製）を
充填したゲル濾過カラム（１．５×１４０ｃｍ、０．１
Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．５）に適用し、１．５ｍＬご
とに分画した。分子量マーカーには、チログロブリン、
フェリチン、カタラーゼ、牛血清アルブミン及びチトク
ロームｃを使用した。実施例２（３）に記載したサンド
イッチＥＬＩＳＡ（モノクローナル抗体４１Ａ５固相化
プレート、ビオチン標識モノクローナル抗体８２Ｂ９、
及び、モノクローナル抗体２１Ｇ２固相化プレート、ビ
オチン標識モノクローナル抗体４１Ａ５）により各画分
の抗原を検出した。その結果、糞便中のヘリコバクター
・ピロリ特異的抗原の分子量は、２７０ｋＤａであるこ
とがわかった。

【０１１４】実施例９ ［抗原の同定］ （１）抗原の精製 アマシャムファルマシアバイオテク社アフィニティーク
ロマトグラフィーハンドブックに記載の方法により、モ
ノクローナル抗体８２Ｂ９を、ＣＮＢｒ−活性化Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅ４Ｂ（アマシャムファルマシアバイオテク
社製）に固定化したカラムを作製した（１０ｍＬ）。ヘ
リコバクター・ピロリ（ＡＴＣＣ４３５０４）菌体を超
音波破砕後、超遠心分離により得た上清（タンパク質濃
度４ｍｇ／ｍＬ）５ｍＬをこのカラムに負荷した。室温
にて２時間静置後、ＰＢＳ １２０ｍＬ（流速約２ｍＬ
／分）にてカラムを洗浄し、０．２Ｍ グリシンＨＣｌ
緩衝液（ｐＨ３．０）１３０ｍＬにて溶出した。洗浄、
溶出とも１０ｍＬずつ分画し、２８０ｎｍの吸光度及び
抗原性を測定した。抗原性の測定は、実施例２に記載の
サンドイッチＥＬＩＳＡ（固相化２１Ｇ２、標識８２Ｂ
９）により行った。その結果、図１に示した通り、溶出
画分（画分Ｎｏ．１４〜１７）のみに抗原性が確認され
た。

【０１１５】（２）精製抗原の純度及び分子量 溶出画分（Ｎｏ．１４）５０μＬを、等量のサンプル緩
衝液（２％ＳＤＳ−５％メルカプトエタノール）と混合
し、１００℃、５分間煮沸した。この溶液２０μＬを用
いてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（４−２
０％アクリルアミドゲル）を行った。分子量マーカー
は、ホスホリラーゼｂ、牛血清アルブミン、卵白アルブ
ミン、炭酸脱水酵素、大豆トリプシンインヒビター、及
び、α−ラクトアルブミンを用いた。泳動後、シルバー
ステインＫＡＮＴＯ ＩＩＩ（関東化学社製）を用い
て、ゲルを染色した。その結果、精製抗原は単一バンド
を示し、その分子量は５９ｋＤａであった。また、溶出
画分（Ｎｏ．１４）１ｍＬを実施例６に記載したのと同
様の方法でＳｅｐｈａｃｒｙｌ−Ｓ３００ＨＲのゲル濾
過を行った。得られた画分について、サンドイッチＥＬ
ＩＳＡにより抗原性を調べた結果、本精製抗原の分子量
は、２７０ｋＤａであり、糞便中抗原と同じであること
がわかった。

【０１１６】（３）精製抗原のアミノ末端側アミノ酸配
列の決定 溶出画分（Ｎｏ．１４）３００μＬを用いてＨＰ Ｇ１
００５Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓ
ｙｓｔｅｍ（日本ヒューレット・パッカード社製）によ
り精製抗原のアミノ末端側アミノ酸配列を決定した。ア
ミノ末端から８残基の配列は、Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ａｓｎ
−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎであった。
この配列は、ヘリコバクター・ピロリのカタラーゼのア
ミノ末端からの配列（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９
９６），１７８，６９６０−６９６７）と完全に一致し
た。

【０１１７】（４）精製抗原のカタラーゼ活性及び紫外
可視吸収スペクトルの測定 精製抗原のアミノ末端側アミノ酸配列がカタラーゼと一
致したので、各画分のカタラーゼ活性を測定した。反応
液には、１１ｍＭ過酸化水素を含むＰＢＳを用いた。各
画分をＰＢＳにて１００倍希釈した後、その５０μＬを
反応液２ｍＬに添加して反応を開始した。反応は室温に
て行った。経時的に２４０ｎｍの吸光度を測定し、１分
間あたりの吸光度の減少を求めた。ブランクにはＰＢＳ
を用いた。その結果、図１に示した通り、抗原画分には
カタラーゼ活性が検出された。

【０１１８】カタラーゼに含まれるヘムを確認するた
め、溶出画分Ｎｏ．１４の紫外可視吸収スペクトルを測
定した。その結果、４０７及び２７７ｎｍに吸収極大を
認めた。この値はヘリコバクター・ピロリのカタラーゼ
の文献値（４０５及び２８０ｎｍ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．（１９９１），１３７，５７−６１）と
ほぼ一致した。

【０１１９】（５）精製抗原の保存安定性 溶出画分（Ｎｏ．１４）を１．４μｇ／ｍＬとなるよう
に０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳにて希釈した溶液を、２５
℃で１週間保存した。保存後の精製抗原の抗原性を実施
例５に記載したサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、ま
た、カタラーゼ活性を（４）に記載した方法によりそれ
ぞれ測定した。−８０℃で凍結保存した精製抗原と比較
した結果、抗原性は２５℃保存でほとんど変化しなかっ
た。しかし、カタラーゼ活性は著しく失活し、活性残存
率５％以下となった。

【０１２０】実施例１０ ［抗ヘリコバクター・ピロリモノクローナル抗体と糞便
中抗原のサブユニットとの反応性］抗ヘリコバクター・
ピロリモノクローナル抗体と糞便中抗原のサブユニット
との反応性を測定するため、実施例８に記載のヘリコバ
クター・ピロリ陽性者の糞便懸濁液上清５０μＬを用い
て、実施例９（２）に記載したＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行った。対照として実施例９の精製
抗原（溶出画分Ｎｏ．１４）５０μＬも同様に電気泳動
した。泳動後、ウェスタンブロッティング法によりニト
ロセルロース膜にタンパク質を転写した。ニトロセルロ
ース膜を１％スキムミルク液に１時間浸してマスキング
した後、モノクローナル抗体２１Ｇ２又は８２Ｂ９と１
時間反応させた。ニトロセルロース膜を０．０５％ツィ
ーン２０−ＰＢＳで５回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識
抗マウスＩｇＧ抗体と反応させた。ニトロセルロース膜
を０．０５％ツィーン２０−ＰＢＳで５回洗浄後、基質
液（過酸化水素＋３，３'−ジアミノベンチジン）を加
えて１０分間インキュベートしたが、糞便抗原、精製抗
原を泳動したレーンともに、いずれのモノクローナル抗
体を用いても抗原性に由来する発色は認められなかっ
た。サブユニット分子に抗原性が認められなかった原因
を明らかにするため、サブユニットへの解離処理で抗原
性が変わるかどうかドットブロッティング法により調べ
た。１％ＳＤＳによる解離処理前後の検体をそれぞれニ
トロセルロース膜に５μＬ滴下し、風乾した。ニトロセ
ルロース膜に吸着したタンパク質の抗原性を上記と同様
の方法で調べた結果、糞便抗原、精製抗原ともに１％Ｓ
ＤＳによる解離処理後は、抗原性が著しく低下すること
がわかった。従って、本発明のモノクローナル抗体はカ
タラーゼのサブユニット即ち一次構造上のエピトープを
認識するのではなく、よりＮａｔｉｖｅな高次構造をエ
ピトープとして認識していることが示唆された。

【０１２１】実施例１１ ［糞便中抗原の精製］ （１）糞便中抗原の分子量 糞便中ヘリコバクター・ピロリ抗原が最高値を示した陽
性者（表４の検体番号８）から提供された糞便１６５ｇ
を４倍量のＰＢＳに懸濁し、遠心分離（７０００ｒｐ
ｍ、３０分）して得られた上清を更に超遠心分離（３０
０００ｒｐｍ、３０分）して上清を得た。上清６８０ｍ
Ｌに４０％飽和となるように硫安１６５ｇを加えて撹拌
後、生じた沈殿を遠心分離（７０００ｒｐｍ、３０分）
により除去した。上清７５０ｍＬに８０％飽和となるよ
うに硫安２１４ｇを加えて撹拌し、生じた沈殿を遠心分
離（７０００ｒｐｍ、３０分）により回収した。沈殿を
ＰＢＳに懸濁し、１０Ｌの蒸留水に対して透析した。透
析内液８２ｍＬの内、２ｍＬを用いて実施例６と同様の
方法でＳｅｐｈａｃｒｙｌ−Ｓ３００ＨＲカラムによる
ゲル濾過を行った。得られた画分について、実施例５と
同様の方法でサンドイッチＥＬＩＳＡにより抗原性を調
べた結果、本糞便中抗原の分子量は、２７０ｋＤａであ
り、実施例８に記載した陽性者２名の糞便中抗原及び実
施例９に記載した精製抗原の分子量と同じであった。

【０１２２】（２）糞便中抗原の精製 （１）の透析内液４０ｍＬを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）で１００ｍＬに希釈した後、同緩衝液で平衡
化した陽イオン交換樹脂ＣＭ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−５
０（アマシャムファルマシアバイオテク社製）のカラム
（１×２．５ｃｍ）に負荷した。同緩衝液１０ｍＬで洗
浄後、ＰＢＳ１０ｍＬで溶出した。通塔、洗浄、溶出の
各画分を０．１％スキムミルクを含むＰＢＳにて３２０
倍希釈した後、実施例５に記載のサンドイッチＥＬＩＳ
Ａにより抗原性を測定した。抗原性は溶出画分に認めら
れた。

【０１２３】アマシャムファルマシアバイオテク社アフ
ィニティークロマトグラフィーハンドブックに記載の方
法により、モノクローナル抗体２１Ｇ２を、ＣＮＢｒ−
活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（アマシャムファルマシ
アバイオテク社製）に固定化したカラムを作成した（２
×３ｃｍ）。上記溶出画分６ｍＬをモノクローナル抗体
固定化カラムに負荷し、室温にて２時間静置した。ＰＢ
Ｓ５０ｍＬで洗浄した後、０．２ＭグリシンＨＣｌ緩衝
液（ｐＨ３．０）で溶出し、１０ｍＬづつ分画した。各
画分を０．１％スキムミルクを含むＰＢＳにて１０倍希
釈した後、実施例５に記載のサンドイッチＥＬＩＳＡに
より抗原性を測定した。また、実施例９に記載した方法
によりカタラーゼ活性を測定した。その結果、図２に示
した通り、矢印で示した溶出開始直後の溶出画分（画分
Ｎｏ．７〜８）に抗原性が認められ、カタラーゼ活性
も、抗原性と一致した。以上のことから本糞便中には４
個のサブユニットを有し、カタラーゼ活性も有するＮａ
ｔｉｖｅな抗原が含まれることがわかった。

【０１２４】

【発明の効果】本発明は、上述の構成よりなるので、ヘ
リコバクター・ピロリのカタラーゼに特異的に存在する
エピトープを認識することができるモノクローナル抗体
を提供することができ、更に、本発明のモノクローナル
抗体を用いれば、ヘリコバクター・ピロリを極めて特異
的に認識することができる。また、ヘリコバクター・ピ
ロリのカタラーゼを認識するモノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマの樹立に成功したので、同一のモノクロー
ナル抗体を半永久的に製造することができる。本発明の
モノクローナル抗体を用いた診断キットは、消化管排泄
物を検体とすることができ、被験者に苦痛を与えること
なく、簡便かつ効率よくヘリコバクター・ピロリ感染を
検出することができる。また、本発明のモノクローナル
抗体を用いた診断キットは、１種のみのモノクローナル
抗体を用いる場合であっても、極めて優れた精度を呈
し、ロット毎の差がなく、安定しており、常に特異的か
つ精度良くヘリコバクター・ピロリ感染を検出すること
ができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例９におけるアフィニティークロマトグラ
フィーの溶出パターンを示した図である。

【図２】実施例１１におけるアフィニティークロマトグ
ラフィーの溶出パターンを示した図である。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年４月２７日（２００１．４．２
７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【請求項４】 請求項２又は３記載のハイブリドーマに
より産生されることを特徴とするモノクローナル抗体。 ─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１４年２月４日（２００２．２．４）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｃ１２Ｒ 1:91） //(Ｃ１２Ｎ 15/02 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:91） 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 平田 晴久 東京都中央区日本橋室町１丁目５番３号 わかもと製薬株式会社内 Ｆターム(参考） 4B024 AA13 BA50 DA02 GA03 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA15 4B065 AA91X AB05 AC14 CA25 CA46 4H045 AA11 BA10 CA40 DA76 EA50 FA72 FA74

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヘリコバクター・ピロリのカタラーゼを
   抗原とすることを特徴とするモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】 ヘリコバクター・ピロリのカタラーゼを
   抗原とするモノクローナル抗体を産生することを特徴と
   するハイブリドーマ。
3. 【請求項３】 ハイブリドーマは、２１Ｇ２（ＦＥＲＭ
   ＢＰ−７３３６）、４１Ａ５（ＦＥＲＭ ＢＰ−７３
   ３７）、又は、８２Ｂ９（ＦＥＲＭ ＢＰ−７３３８）
   であることを特徴とする請求項２記載のハイブリドー
   マ。
4. 【請求項４】 請求項２又は３記載のハイブリドーマに
   より産生されることを特徴とするモノクローナル抗体。
5. 【請求項５】 請求項１又は４記載のモノクローナル抗
   体の少なくとも１種を用いて行うことを特徴とする免疫
   学的測定法。
6. 【請求項６】 請求項１又は４記載のモノクローナル抗
   体のいずれか１種を用いて行うことを特徴とする請求項
   ５記載の免疫学的測定法。
7. 【請求項７】 ヘリコバクター・ピロリへの感染を判定
   するために用いられることを特徴とする請求項５又は６
   記載の免疫学的測定法。
8. 【請求項８】 検体は、消化管排泄物であることを特徴
   とする請求項５、６又は７記載の免疫学的測定法。
9. 【請求項９】 ＥＬＩＳＡ法によることを特徴とする請
   求項５、６、７又は８記載の免疫学的測定法。
10. 【請求項１０】 イムノクロマトグラフィー法によるこ
    とを特徴とする請求項５、６、７又は８記載の免疫学的
    測定法。
11. 【請求項１１】 請求項１又は４記載のモノクローナル
    抗体の少なくとも１種を含むことを特徴とする診断キッ
    ト。
12. 【請求項１２】 請求項１又は４記載のモノクローナル
    抗体のいずれか１種を含むことを特徴とする請求項１１
    記載の診断キット。
13. 【請求項１３】 ヘリコバクター・ピロリへの感染を判
    定するために用いられることを特徴とする請求項１１又
    は１２記載の診断キット。
14. 【請求項１４】 検体は、消化管排泄物であることを特
    徴とする請求項１１、１２又は１３記載の診断キット。
15. 【請求項１５】 ＥＬＩＳＡ法によることを特徴とする
    請求項１１、１２、１３又は１４記載の診断キット。
16. 【請求項１６】 イムノクロマトグラフィー法によるこ
    とを特徴とする請求項１１、１２、１３又は１４記載の
    診断キット。