CN101191798A - 一种均相荧光免疫检测领域新型荧光物质组合技术 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种均相荧光免疫检测领域荧光物质新型组合技术。技术方案是分别制备铕(Eu)和阿莱克萨红(Alexa 680)荧光纳米微球，并分别标记同一抗原的两株单克隆抗体。两种荧光纳米微球标记抗体同时加入到检测反应液中，用时间分辨荧光检测仪或荧光分光光度计在激发光为340nm，发射光730nm处检测反应液的荧光强度。如果反应液中存在待测抗原，将形成抗原、抗体复合物，使Eu荧光纳米微球和Alexa 680荧光纳米微球紧密接触，Eu荧光纳米微球受到340nm紫外光激发后，发射出的550－700nm荧光可以进一步激发Alexa 680发射出710－750nm荧光。以梯度稀释的已知抗原作标准曲线，可计算出待测样品中目的抗原的浓度。以铕(Eu)和阿莱克萨红(Alexa 680)两种荧光物质组合，采用均相免疫检测法来检测待测抗原的浓度，Eu发射光与Alexa 680发射光之间没有重叠，可避免目前Eu与Cy5或Cy3等荧光染料组合目的荧光信号与本底荧光之间重叠和干扰问题，显著提高730nm荧光信号的信噪比，可广泛用于细胞因子、激素和疾病标志蛋白的定量检测。
Description
技术领域：
荧光免疫检测技术
技术背景：
均相荧光免疫检测法(homogeneous fluroimmunoassay，HFIA)是基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)原理发展的一种新的免疫检测技术。常用的方法是用二个荧光物质分别标记同一抗原的二个抗体，其中一个荧光物质(供体)的发射光波长与另一个荧光物质(受体)的激发光波长相互重叠。当同把二个荧光标记抗体加入到反应液中，用双抗体夹心法检测待测抗原。如果待测样品中含有目的抗原，会发生抗原、抗体反应，形成抗原、抗体复合物，供体荧光物质与受体荧光物质紧密接触。这时采用荧光检测仪或时间分辨荧光检测仪检测反应液荧光信号，用短波长紫外光激发供体荧光，就会发生FRET。供体发射的荧光能进一步激发受体分子发射出更长波长的荧光。这样不仅可以增强荧光信号，并且可以降低背景荧光，减少非特异性荧光的干扰，显著提高信噪比。这是因为，(1)供体产生荧光后，再激发受体产生荧光，有放大荧光信号的作用。(2)受体荧光一般波长较长，多为红光或红外光。而样品中本底荧光物质在受到紫外光激发后波长位移没有这么大，多为绿色光和黄色光，并会迅速衰减。因此，长波长荧光信号不受非特异性荧光的干扰，信噪比较高。此外，均相免疫检测法是在抗原、抗体反应后，直接检测反应液的荧光信号，省却了酶联免疫检测法(ELISA)需要反复孵育和洗板等烦琐的操作步骤，也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰，操作简单，检测时间短，稳定性和重复性较好，能较真实地反映被测物质的含量。
传统的荧光染料激发光和发射光波长之间的Stokes位移较小，仅有30-80nm，常有部分重叠，较易受到非特异性荧光干扰。现在荧光FRET技术通常采用镧系元素铕(Eu)、锝(Tb)等作为供体荧光材料，激发光波长和发射光波长之间Stokes位移较大，超过250nm，如Eu的激发波长为340nm，最大发射波长为615nm，二者相差290nm，激发光谱和发射光谱没有重叠，可避免非特异性荧光的干扰。镧系离子螯合物经紫外光激发后不仅强度高，而且半衰期长(比普通的荧光物质半衰期长5-6个数量级)，稳定性好(低温条件可保存三年)，非常适合于抗原、抗体标记，因而成为二十一世纪最热门的荧光材料。
在均相荧光免疫检测技术中，通常将标记抗体的荧光物质制备成纳米颗粒。然后再标记相应的抗体或抗原。这样，既可以减少荧光物质的泄漏，也可以增强荧光物质的稳定性。当抗原、抗体发生反应形成抗原、抗体复合物时，荧光纳米颗粒紧密接触，在受到激发光刺激后，通过纳米颗粒间发生的FRET，显著增强荧光信号。这种技术目前广泛应用于蛋白或半抗原的免疫荧光检测或制备微型生物传感器。
目前，均相荧光免疫检测技术常用的荧光物质配伍组合是铕(Eu)或锝(Tb)与Cy5、Cy3或藻红蛋白等组合方式。Eu的最大激发光为340nm，最大发射光为615nm，Cy5的最大激发光为643nm，最大发射光为670nm。Eu发射光与Cy5发射光之间仍有部分重叠，本底荧光还比较高，影响均相荧光免疫检测的灵敏度和信噪比。
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发明内容：
本发明专利涉及一种均相荧光免疫检测领域荧光物质新型组合技术。主要技术特点是，分别制备铕(Eu)和阿莱克萨红(Alexa 680)荧光纳米微球，并分别标记同一抗原的两株单克隆抗体。Alexa 680的最大激发波长为680nm，最大发射波长为730nm。两种荧光纳米微球标记抗体同时加入到检测反应液中，用时间分辨荧光检测仪或荧光分光光度计在激发光为340nm，发射光730nm处检测反应液的荧光强度。如果反应液中存在待测抗原，将形成抗原、抗体复合物，使得Eu荧光纳米微球和Alexa 680荧光纳米微球紧密接触，Eu荧光纳米微球受到340nm紫外光激发后，发射出的550-700nm荧光可以进一步激发Alexa 680发射出710-750nm荧光。以梯度稀释的已知抗原作标准曲线，可计算出待测样品中目的抗原的浓度。以铕(Eu)和阿莱克萨红(Alexa 680)两种荧光物质组合分别标记抗体，采用均相免疫检测法来检测待测抗原的浓度，Eu发射光(550-700nm)与Alexa 680发射光(710-750nm)之间没有重叠，可避免目的荧光信号与本底荧光之间重叠和干扰问题，显著提高730nm荧光信号的信噪比。这种新型荧光物质组合方式比采用Eu与Cy5或Cy3等荧光染料组合特异性更好、信噪比更高。
实现方式：本发明技术可以通过分别制备铕(Eu)和阿莱克萨红(Alexa 680)荧光纳米微球，荧光纳米微球分别标记同一抗原的两株单克隆抗体，组合形成检测试剂盒，采用均相荧光免疫检测法来实现对待测样品目的抗原含量的检测。具体的荧光纳米微球制备方法、标记抗体方法及均相荧光免疫检测方法(以标记促血管生成素2(angiopoietin-2，Ang-2)抗体，检测血清Ang-2含量为例)如下：
1.材料与试剂：
1.1核心微球单体：丙稀酰胺(AG)；交联剂：二甲基丙稀酰胺(bis)；气溶胶：琥珀酸二辛酯磺酸钠(AOT)和乳化剂：Brij30；催化剂：过硫酸铵(AP)、加速剂：四甲基乙二胺(TEMED)；有机溶液：正己烷；磷酸缓冲液(PBS)，PH7.4；荧光材料：Eu螯合物TEKES-Eu；阿莱克萨红(AlexaFluor 680)
1.2外壳单体：苯乙烯(Styrene，St)、氨基官能团单体(Aminoethylmethacrylatehydrochloride，AEMH)、乳化剂(Hexadecyltrimethylammonium bromide，HDTAB)、引发剂(2，2’-azobisisobutyramidine dihydrochloride，AIBA或2，2’-azobisdimethylenisobutyramidine dihydrochloride，ADIBA)、终止剂(对苯二酚Hydroquinone)。
2.氨基化核壳荧光纳米微球制备配方见下表：
表1-1聚丙烯酰胺核心微球(core)合成配方
表1-2聚丙烯酰胺核心微球(core)合成配方
表2氨基化聚苯乙烯外壳合成配方
3.具体制备方法和操作步骤：
3.1铕(Eu)荧光纳米核心微球的制备。采用反相微乳液聚合法合成荧光纳米核心微球。在PH7.4的磷酸缓冲液中，按照表1-1的配方和比例加入Eu螯合物TEKES-Eu、丙稀酰胺，交联剂双又丙稀酰胺。溶解后加入20ml正己烷，再加入气溶胶琥珀酸二辛酯磺酸钠AOT和乳化剂Brij30，在通氮气条件下慢慢喷入催化剂过硫酸铵、加速剂四甲基乙二胺(TEMED)，室温反应2小时。反应完成后，旋转蒸发除去正己烷，产物用乙醇洗涤，最后可在30％乙醇中长期保存。
3.2阿莱克萨红(AlexaFluor 680)荧光纳米核心微球的制备。制备方法与上述Eu荧光纳米微球制备方法相似。也是采用反相微乳液聚合法合成荧光纳米核心微球。不同的是在PH7.4的磷酸缓冲液中，按照表1-2的配方和比例加入荧光染料阿莱克萨红(AlexaFluor 680)，然后再加入丙稀酰胺，交联剂双叉丙稀酰胺等试剂。在通氮气条件下慢慢喷入催化剂过硫酸铵、加速剂四甲基乙二胺(TEMED)，室温反应2小时。反应完成后，旋转蒸发除去正己烷，产物用乙醇洗涤，最后可在30％乙醇中长期保存。
3.3Eu、Alexa680纳米微球的氨基化包覆。按照表2的配方和比例，以ADIBA为引发剂、以HDTAB为乳化剂，与氨基化单体AEMH交联，制备成氨基化荧光纳米微球。制备出的纳米微球直径在20-100nm之间，大部分为30nm左右。(注：在包覆聚苯乙烯的过程中不加入氨基化单体AEMH，可制备成非氨基化纳米微球)
3.4扫描电子显微镜测量荧光纳米微球的直径。纯化的纳米微球用正己烷稀释至0.1％的浓度，移到铜网上喷涂电子染料，扫描电子显微镜观测荧光纳米微球直径及大小，计算纳米微球平均直径及标准差。
4.Eu、Alexa680纳米微球组合在均相荧光免疫检测中的应用。以Eu、Alexa680纳米微球分别标记促血管生成素(Ang-2)两株抗体，并用于定量检测血清Ang-2含量为例介绍检测方法
4.1荧光微球标记抗体。Ang-2单克隆抗体用磷酸缓冲液(PBS，PH7.0)稀释成2mg/ml，分别与浓度为1％的荧光纳米微球混合，在终浓度为1.25％的戊二醛的帮助下进行微球与抗体的交联，交联完成后，用液相层析分离标记抗体。
4.2标记抗体的纯化。采用液相层析法纯化标记抗体。在内径为1.5-2.0cm的层析管内先填充Sepharose 6B 40ml，然后填充SephadexG50 20ml形成混装柱，加入标记好的荧光纳米微球，以磷酸缓冲液为流动相，分离纯化标记抗体。
4.3测定标记抗体的比活度。用反应液对荧光标记抗体进行递度稀释，与相应标准荧光作对照，荧光检测仪测定标记荧光的荧光信号强度，推算出抗体悬液中的荧光物质含量。然后在280nm处测定纯化标记抗体的吸光度值(OD值)，计算出抗体的浓度IgGmg/ml＝OD280-(0.008×荧光μmol/L)÷1.34，标记抗体的比活度为荧光μmol/L与IgGmg/ml的比值。
4.4血清Ang-2含量均相免疫荧光检测实验。常规方法抽取外周血2ml，室温静置30分钟使血液凝固，2500转/分钟(rpm)离心，吸取清亮血清，-18℃冻存备用。取15μl缓冲液(R1)(5％聚乙二醇6000，20mM Tris-HCl缓冲液，PH6.0)和15μl处理液(R2)(600mM甘氨酸、0.2％Towen-20，PH2.5)加入到酶标板的微孔中，30秒钟内立即测定340nm激发光，615nm荧光强度值A1。然后37℃再反应20min，30秒钟内在730nm处测定反应液的荧光亮度值A2。荧光强度值ΔA＝A2-A1。以递度稀释的已知浓度的Ang-2蛋白溶液作为定量标准品绘制标准曲线，并计算目的蛋白含量。
Claims (4)
1.一种均相荧光免疫检测领域荧光物质新型组合技术。其特征是采用铕(Eu)和阿莱克萨红(Alexa 680)荧光物质组合，分别标记同一抗原的两株单克隆抗体，应用于均相荧光免疫检测法对细胞因子、激素和疾病标志蛋白进行定量检测。
2.权利要求1中所述的Eu和Alexa680荧光物质组合其特征是两种荧光材料先制备成核壳型纳米微球，核心为聚丙烯酰胺(PAG)嵌合荧光物质，核心微球外面包覆氨基化聚苯乙烯，富含氨基基团。
3.权利要求1中所述的荧光物质组合其特征是可以与富含氨基的抗原、抗体等各种多肽蛋白质、半抗原及其他化学分子交联，制备成检测试剂，应用于均相荧光免疫法对各种体液蛋白、激素、细胞因子、标志蛋白和半抗原进行定量检测。
4.权利要求1中所述的荧光物质组合其特征是即使不制备成荧光纳米微球，也可以用于标记各种多肽蛋白质、半抗原及其他化学分子，应用于均相荧光免疫法对各种体液蛋白、激素、细胞因子、标志蛋白和半抗原进行定量检测。
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20080604 |