CN101191797A

CN101191797A - 一种荧光纳米微球制备技术及其应用

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Publication number: CN101191797A
Application number: CNA2006101490272A
Authority: CN
Inventors: 王珊珊
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2006-11-21
Filing date: 2006-11-21
Publication date: 2008-06-04

Abstract

本发明涉及一种氨基化核壳型荧光纳米微球制备技术及其应用。技术方案是，先合成聚丙烯酰胺(PAG)与荧光物质嵌合的核心纳米微球。然后再在核心微球外面包覆氨基化聚苯乙烯，制备成氨基化核壳型荧光纳米微球。这种方法制备的荧光纳米微球既有利于封闭和保护荧光物质，防止荧光泄漏，延长荧光衰减时间，又使得纳米微球外表面含有丰富的氨基基团，方便荧光纳米微球与抗原、抗体等蛋白质和多肽的交联。直接用双功能试剂——戊二醛就能使荧光纳米颗有效地标记抗体。氨基化核壳型荧光纳米微球可广泛应用于细胞因子、激素、各种标记蛋白的示踪和定量检测。也可作为微型生物传感器用于蛋白质相互作用、pH值及离子变化的检测。

Description

一种荧光纳米微球制备技术及其应用

技术领域：

荧光免疫检测纳米材料技术

技术背景：荧光纳米微球是近年来出现的一种新的纳米材料，广泛应用于探测和示踪细胞内PH值、离子浓度变化、单分子活动，以及体外定量检测细胞因子、标志蛋白和各种激素。目前荧光纳米微球多采用荧光嵌合方法合成荧光纳米微球，即在合成制备纳米微球的同时加入荧光物质，使荧光物质嵌入纳米材料内部形成荧光纳米微球。这种方法合成的荧光纳米微球容易产生荧光泄漏现象，使得荧光纳米微球中的荧光含量逐渐减少，本底荧光信号较高。为解决这一问题，一般采用在荧光纳米微球外面包覆一个外壳，制备成核壳型荧光纳米微球，来减少荧光物质的泄漏。目前，核心纳米材料主要有聚丙烯酰胺(PAG)、葡聚糖、硅胶等材料，荧光物质主要有无机金属螯合物〔联吡啶钌、镧系元素铕(Eu)、锝(Td)〕、有机荧光染料Cy5、Cy3、异硫氰酸荧光素(FITC)、Fura-2等。外壳多采用硅胶(SiO2)材料，在合成核心微球后再包覆SiO2。SiO2包覆的核壳荧光纳米微球比较适合于PH值或离子生物传感器的应用，但不便于与抗体、抗原或半抗原等物质交联，不适合于采用均相荧光分析法(homogeneous fluroimmunoassay，HFIA)均相免疫检测法、双抗体标记免疫检测法等时间分辨荧光免疫分析(time-resolued fluroimmunoassay，TRFIA)技术生物分子进行定量检测。

参考文献：

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发明内容：

本发明专利涉及一种氨基化核壳型荧光纳米微球制备技术及其应用。技术方案是，先合成聚丙烯酰胺(PAG)与荧光物质嵌合的核心纳米微球。然后再在核心微球外面包覆氨基化聚苯乙烯，制备成氨基化核壳型荧光纳米微球。这种方法制备的荧光纳米微球既有利于封闭和保护荧光物质，防止荧光泄漏，延长荧光衰减时间，又使得纳米微球外表面含有丰富的氨基基团，方便荧光纳米微球与抗原、抗体等蛋白质和多肽的交联。并且，抗体与荧光纳米颗之间通过一个化学臂连接，降低抗体的空间位阻，可以保护抗体的免疫活性。直接用双功能试剂——戊二醛就能使荧光纳米颗有效地标记抗体等多肽物质。聚苯乙烯包覆的核壳型荧光纳米微球可广泛应用于细胞因子、激素、各种标记蛋白的示踪和定量检测。也可作为微型生物传感器用于蛋白质相互作用、PH值及离子变化的检测。

实现方式：本发明的目的可以通过以下措施来达到(以制备Eu荧光纳米微球并用于检测促血管生成素2(angiopoietin-2，Ang-2)为例)：

1.材料与试剂：

1.1核心微球单体：丙稀酰胺(AG)；交联剂：二甲基丙稀酰胺(bis)；气溶胶：琥珀酸二辛酯磺酸钠(AOT)和乳化剂：Brij30；催化剂：过硫酸铵(AP)、加速剂：四甲基乙二胺(TEMED)；有机溶液：正己烷；磷酸缓冲液(PBS)，PH7.4；荧光材料：Eu螯合物TEKES-Eu

1.2外壳单体：苯乙烯(Styrene，St)、氨基官能团单体(Aminoethylmethacrylatehydrochloride，AEMH)、乳化剂(Hexadecyltrimethylammonium bromide，HDTAB)、引发剂(2，2’-azobisisobutyramidine dihydrochloride，AIBA或2，2’-azobisdimethylenisobutyramidine dihydrochloride，ADIBA)、终止剂(对苯二酚Hydroquinone)。

2.氨基化核壳荧光纳米微球制备配方见下表：

表1聚丙烯酰胺核心微球(core)合成配方

表2氨基化聚苯乙烯外壳合成配方

3.具体制备方法和操作步骤：

3.1铕(Eu)荧光纳米微球的制备。采用反相微乳液聚合法合成荧光纳米核心微球。在PH7.4的磷酸缓冲液中按照表1的配方和比例加入荧光物质、丙稀酰胺，交联剂双叉丙稀酰胺。溶解后加入19ml正己烷，再加入气溶胶琥珀酸二辛酯磺酸钠AOT和乳化剂Brij30，在通氮气条件下慢慢喷入催化剂过硫酸铵、加速剂四甲基乙二胺(TEMED)，室温反应2小时。反应完成后，旋转蒸发除去正己烷，产物用乙醇洗涤，最后可在30％乙醇中长期保存。

3.2纳米微球的氨基化包覆以ADIBA为引发剂、以HDTAB为乳化剂，按照表2的配方和比例，依次加入各种试剂，与氨基化单体AEMH交联，制备成氨基化荧光纳米微球。制备出的纳米微球直径在20-100nm之间，大部分为30nm左右。(注：在包覆聚苯乙烯的过程中不加入氨基化单体AEMH，可制备成非氨基化纳米微球)

3.3扫描电子显微镜测量荧光纳米微球的直径。纯化的纳米微球用正己烷稀释至0.1％的浓度，移到铜网上喷涂电子染料，扫描电子显微镜观测荧光纳米微球直径及大小，计算纳米微球平均直径及标准差。

4.核壳荧光纳米微球的应用。核壳纳米微球有多方面的应用，可作为生化传感器用于测定PH值和各种金属离子浓度，标记抗体可用于示踪和检测目的抗原。它的用途主要取决于纳米微球包覆的荧光材料及标记的物质。比如，包覆对PH值敏感的FITC可以作为PH传感器；包覆对钙离子敏感的Fura-2可作为Ca⁺⁺传感器。氨基化荧光纳米微球特别适合标记抗体。以下以荧光纳米微球标记促血管生成素(Ang-2)抗体，并用于定量检测Ang-2为例说明氨基化荧光纳米微球的应用

4.1Ang-2单克隆抗体用磷酸缓冲液(PBS，PH7.0)稀释成2mg/ml，分别与浓度为1％的荧光纳米微球混合，在终浓度为1.25％的戊二醛的帮助下进行微球与抗体的交联，交联完成后，用液相层析分离标记抗体。

4.2标记抗体的纯化。采用液相层析法纯化标记抗体。在内径为1.5-2.0cm的层析管内先填充Sepharose 6B 40ml，然后填充SephadexG50 20ml形成混装柱，加入标记好的荧光纳米微球，以磷酸缓冲液为流动相，分离纯化标记抗体。

4.3测定标记抗体的比活度。用反应液对荧光标记抗体进行递度稀释，与相应标准荧光作对照，荧光检测仪测定标记荧光的荧光信号强度，推算出抗体悬液中的荧光物质含量。然后在280nm处测定纯化标记抗体的吸光度值(OD值)，计算出抗体的浓度IgGmg/ml＝OD280-(0.008×荧光μmol/L)÷1.34，标记抗体的比活度为荧光μmo l/L与IgGmg/ml的比值。

4.4血清Ang-2含量均相免疫荧光检测实验。常规方法抽取外周血2ml，室温静置30分钟使血液凝固，2500转/分钟(rpm)离心，吸取清亮血清，-18℃冻存备用。取15μl缓冲液(R1)(5％聚乙二醇6000，20mM Tris-HCl缓冲液，PH6.0)和15μl处理液(R2)(600mM甘氨酸、0.2％Towen-20，PH2.5)加入到酶标板的微孔中，30秒钟内立即测定340nm激发光，615nm荧光强度值A1。然后37℃再反应20min，30秒钟内在730nm处测定反应液的荧光亮度值A2。荧光强度值ΔA＝A2-A1。以递度稀释的已知浓度的Ang-2蛋白溶液作为定量标准品绘制标准曲线，并计算目的蛋白含量。

Claims

1.一种荧光纳米微球制备技术。其特征是纳米微球为核壳结构，核心为聚丙烯酰胺(PAG)嵌合荧光物质，核心微球外面包覆氨基化聚苯乙烯，富含氨基基团。

2.权利要求1中提到的荧光纳米微球其特征是核心微球为聚丙烯酰胺(PAG)嵌合各种荧光物质，包括无机金属螯合物(联吡啶钌、镧系元素铕(Eu)、锝(Td))、有机荧光染料Cy5、Cy3、异硫氰酸荧光素(FITC)、Fura-2等许多荧光染料。

3.权利要求1中提到的荧光纳米微球其特征是表面富含氨基基团，在双功能交联剂(如戊二醛等化学物质)作用下，可以与富含氨基的抗原、抗体等各种蛋白质和多肽、半抗原及其他化学分子交联，用于临床上采用免疫荧光法对各种体液蛋白、激素、细胞因子、标志蛋白和半抗原进行定量检测。

4.权利要求1中提到的荧光纳米微球其特征是不加入氨基官能单体制备成非氨基化荧光纳米微球，可以作为微型生物传感器，用于蛋白质相互作用研究，PH值、钙、钠、钾等离子的测定。