CN101806802A - 基于荧光共振能量转移的多组分同时检测的均相免疫分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于荧光共振能量转移的多组分同时检测的均相免疫分析方法，该方法利用作为能量受体的荧光物质的多色性建立了一种基于荧光共振能量转移(FRET)的均相荧光免疫分析(FIA)的新方法，实现了对多组分抗原的同时检测。本发明将作为能量供体的荧光物质或化学发光物质以及作为能量受体的荧光物质分别标记需要检测的几种抗原和相应的抗体，抗原抗体的特异性结合使得能量供体和受体之间距离缩短，从而发生从能量供体到受体的FRET，根据受体的荧光强度变化得出样品中抗原浓度，是一种快速、灵敏、多组分同时检测的均相免疫分析新方法。

Description

基于荧光共振能量转移的多组分同时检测的均相免疫分析方法

技术领域：本发明属于荧光免疫分析技术领域。

背景技术：免疫分析法是一种微量生物分析方法，它利用抗原抗体间的高亲和性以及作为探针的标记物的高度可测性，能够对生物体内微量物质进行准确的定量分析，具有操作简单、特异性好、灵敏度高等优点，已成为生物学、医学、化学等学科领域研究的重要手段。免疫分析法根据其标记物的不同可分为放射免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附分析法(ELISA)、荧光免疫分析法(FIA)和化学发光免疫分析法(CLIA)等。RIA灵敏度高但存在放射性污染，已逐渐退出市场。ELISA是目前国内外应用最为广泛的免疫分析方法，但灵敏度较低，一般仅用于定性或半定量分析。CLIA是上个世纪90年代发展起来的一种新的免疫分析方法，但成本较高，且灵敏度并未达到RIA的水平，目前并未广泛应用。常规荧光免疫分析法(FIA)因无放射性、无酶试剂的不稳定性及效期限制，在超微量免疫分析领域引起人们更大的关注。在FIA领域中，最重要的改进之一是发展了时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)，具有灵敏度高、线性范围宽等优点。

免疫分析根据其反应系统的物理状态的不同可以分为均相免疫分析和非均相免疫分析。在现有的免疫分析方法中，非均相免疫分析法以RIA、ELISA和CLIA应用最为广泛，但非均相免疫分析需要进行抗原抗体复合物与游离抗原抗体的分离步骤，从而提高信噪比和分析的灵敏度，所以操作相对繁琐。分离抗原抗体复合物与游离抗原抗体是关键，也最容易产生误差。而且由于非均相免疫分析包括了包被(抗原或抗体)、封闭、多次温育、洗涤以及检测等过程，一般需要2小时以上。均相免疫分析因其具有不需要分离抗原抗体复合物与游离抗原抗体即可直接以及均相反应比固相、半固相反应更为简便迅速等特点，成为目前免疫分析方法研究中的重要方向。其中均相荧光免疫分析在抗原抗体特性性反应完成之后，无需将抗原抗体复合物与游离的抗原抗体进行分离，可以直接进行测定，操作简单快捷，易于实现自动化，得到了广泛应用。

荧光共振能量转移(FRET)是一种非辐射的能量转移，其产生需满足以下4个条件：

1)能量供体的发射光谱与能量受体的激发光谱有效重叠；

2)能量供体的量子产率较高；

3)供体受体间满足一定的耦极取向；

4)供体受体间的距离小于10nm。

供体与受体之间发生FRET将会使能量供体的荧光强度降低，受体发射的荧光强度增强，同时伴随它们的荧光寿命的相应缩短和延长。FRET技术作为一种高效的光学“分子尺”，在于生物大分子相互作用、免疫分析、核酸检测等方面有广泛的应用。

FRET属于一种比较简便的均相免疫分析法，由于其操作简单，反应速度较快，越来越引起人们的关注。

以FRET为基础的均相免疫分析法可分为夹心法和竞争法。

夹心法就是能量转移的供体和受体分别标记同一个抗原相结合的两种抗体，形成D-Ab1:Ag:Ab2-A形式的抗原抗体复合物，使供体和受体之间的距离减小，发生FRET，从而可以判断免疫反应的发生。

竞争法就是能量转移的供体和受体分别标记抗原和抗体中的一种。由于抗原、抗体之间的特异性结合，使供体和受体之间发生能量转移，当加入未标记的抗原或抗体时，由于与标记的抗原或抗体发生竞争，产生无FRET现象的抗原抗体复合物，从而可以检测抗原或抗体。基于荧光共振能量转移的均相免疫分析方法是由1976年Ullman等人首先提出的，实现了抗原抗体的均相免疫分析的定量测定(Ullman E F，Schwarzberg M，Rubenstein K E.J Biol Chem，1976，251(14)：4172-4178)。

目前基于荧光共振能量转移的均相免疫测定已应用于检测抗原。Ueda等(Ueda H，Kubota K，Wang Y，et al.Biotechniques，1999，27(4)：738-742)用琥珀酰亚胺脂和荧光黄-X分别标记抗体的重链和轻链，两者在比色杯中混合后再加入抗原，抗原抗体的特异结合，使琥珀酰亚胺脂与荧光黄-X靠近，用490nm波长激发琥珀酰亚胺脂，检测到520nm发射光减弱，605nm的发射光增强，随着抗原量的增加，605nm的荧光亦增强。在检测中只能对一种抗原进行定量分析。

量子点是一种宽激发的荧光染料，相对于有机染料有很多优点，自2001年起就被应用于FRET中。首先，激发量子点的激发波长范围很宽，可以从紫外到远红外区，因此可以用同一波长的光激发不同大小的量子点，并且可以通过选择合适的激发波长来避免对受体分子的直接激发。其次，量子点的大小不同，所发射的荧光颜色不同，可以通过改变量子点的大小来调节量子点的发射光谱与受体分子吸收光谱的重叠程度，从而可以调节FRET的效率。再次，量子点的荧光谱峰狭窄而对称，半高峰宽通常为25～45nm；量子点的发光强度可达有机荧光染料罗丹明6G的数十倍，且荧光量子产率较高，对光漂白有强烈的抵制作用。由于这些独特的量子优势，近来对其应用于FRET的研究更为深入，范围不断扩展。

本发明致力于利用宽激发的荧光材料激发波长范围宽且发射光谱可调的特性，建立一种基于荧光共振能量转移的多组分同时检测的均相免疫分析方法。

发明内容：

本发明的目的在于建立一种多组分同时检测的均相荧光免疫分析方法，以克服现有技术在多组分检测中存在的步骤繁琐、灵敏度低等不足，达到快速、灵敏的检测目标。

FRET技术主要用于液相反应中，将FRET应用于免疫分析即可根据标记物荧光信号的变化达到检测的目的，无需洗涤分离的步骤，即均相免疫分析，从而实现快速检测。宽激发的荧光材料具有激发波长范围宽且发射光谱可调的特性，为多组分同时检测提供了可能性。

实现本发明的技术方案是：本发明提供的这种基于荧光共振能量转移(FRET)的多组分同时检测的均相免疫分析方法，是以高量子产率的荧光物质或化学发光物质为能量供体，以两种或两种以上宽激发的荧光染料为能量受体，按下列步骤操作：

步骤一：用同一种所述的能量供体标记两种或两种以上待测抗原，用不同的能量受体分别标记相应的两种或两种以上的抗体，或用所述的两种或两种以上的能量受体分别标记两种或两种以上的待测抗原，用一种所述的能量供体标记相应的两种或两种以上抗体，得到标记组分，且所述的作为能量供体和能量受体的荧光物质为符合FRET特征的试剂对；

步骤二：配制五个已知浓度梯度的两种或两种以上待测抗原溶液，令步骤一得到的标记组分与该已知浓度梯度的两种或两种以上待测抗原溶液进行均相竞争免疫反应，反应过程如下：将步骤一得到的标记组分与待测抗原溶液在pH6-8的缓冲液中混合均匀，25℃温育30分钟，得到混合体系；

步骤三：免疫反应完成后，以所用能量供体的最大激发波长为激发光，以所用的不同能量受体的发射波长检测混合体系的荧光强度，得到各种能量受体的荧光光谱数据；

步骤四：依据各种能量受体的荧光光谱数据，采用去卷积法【参见：Ellen R.Goldman，Aaron R.Clapp，George P.Anderson，etal，Analytical Chemistry，2004(76)：684-688】，计算得到所用能量受体的相对荧光强度；

步骤五：制作待测抗原的标准曲线，进行公式拟合，分别得到各种待测抗原浓度的计算公式；

步骤六：令未知浓度的两种或两种以上待测抗原与标记组分重复以上步骤二、步骤三、步骤四，将最终得到的相对荧光强度代入上述步骤五得到的拟合公式中计算即得到各待测抗原的浓度。

本发明方法中作为能量供体的荧光物质是荧光素、荧光蛋白或稀土元素；作为能量供体的化学发光物质是发光蛋白或鲁米诺；作为能量受体的是宽激发的荧光染料，所述的宽激发的荧光材料是量子点、双光子试剂或荧光蛋白。本发明方法中作为能量供体的稀土元素离子是Tb³⁺、Dy³⁺、Sm³⁺或Eu³⁺。

在本发明方法所述的混合体系中，所用的能量供体是同一种，所用的能量受体是不同种，所用的能量受体与能量供体能组合成符合FRET特征的试剂对。

本发明方法所述的待测的两种或两种以上抗原可以是病毒、细菌、真菌、衣原体、支原体、肿瘤相关抗原或具有抗原决定簇的物质。

本发明将高量子产率的荧光物质或化学发光物质作为能量供体的前提下，将宽激发的荧光染料作为荧光共振能量转移的受体，因宽激发的荧光染料荧光寿命很短(一般仅为3～15ns)，在时间分辨模式下，宽激发的荧光染料自身被仪器光源激发所发射的荧光信号被消除，而具有高量子产率的荧光物质或化学发光物质将能量转移至能量受体的荧光信号就能被记录，这样就能解决其宽激发的问题，并且在时间分辨模式下能消除背景荧光的影响，大大提高分析方法的灵敏度。

本发明是用于检测样本中两种或两种以上待测抗原浓度的方法，先进行抗原抗体的标记，当抗原标记上能量供体时，抗体标记能量受体；当抗体标记上能量供体时，抗原标记能量受体；在将检测待测样本与标记的抗原抗体相互接触前后受体的相对荧光强度的变化，对待测样本中的多种目标抗原浓度进行定量分析。具体是将两种或两种以上的待测抗原和分别特异识别这几种抗原的单克隆抗体分别标记荧光特性能够满足发生FRET的能量供受体对，由于抗原抗体的特异性结合，将能量供受体的距离拉近，达到发生FRET的距离要求以内，即1～10nm，而发生FRET现象。加入几种待测抗原后，待测抗原分别与荧光标记的抗原竞争而减弱了FRET现象，相应的能量供体的发射光增强，而能量受体的发射光减弱。分别测定几种能量受体发射光荧光强度的变化，可以对待测样本中的多种目标抗原浓度进行定量分析。

本发明建立了一种基于荧光共振能量转移(FRET)的均相时间分辨荧光免疫分析(FIA)的方法，有效解决了免疫分析方法中存在的操作步骤繁琐、灵敏度低等缺点，保证了方法的快速灵敏，实现了多组分同时检测。

附图说明

图1为本发明原理示意图，图中：1、2代表两种不同发射波长的能量受体，3、4代表两种待测抗原，5、6代表与3、4对应的单克隆抗体，7代表能量供体，8代表发生荧光共振能量转移的过程。该原理示意图中相同的图形代表相同的内容。

图2是AFP浓度的标准曲线。

图3是HCGβ浓度的标准曲线。

具体实施方式

实施例1

制作标准曲线

选用稀土元素离子Tb³⁺为能量供体，宽激发的荧光材料——两种量子点为能量受体，以甲胎蛋白(AFP)和人绒毛膜促性腺激素(HCGβ)为两种待测抗原，阐述具体实施方式。

1.使用的仪器：

多标记分析仪Perkin Elmer 1420；

紫外-可见分光光度计(北京普析TU1901)

2.使用的试剂：

氧化铽购自国药集团；

碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)，购自sigma试剂；

稀土元素配体BBCAP购自sigma试剂；

两种量子点(发射波长为分别565nm、655nm)，购自美国Invitrogen公司；

三羟甲基氨基甲烷(Tris)，碳酸盐，磷酸盐，二甲基亚砜(DMSO)等为分析纯。

3.条件和步骤：

由以下三个步骤组成：

①稀土元素配体BBCAP标记抗原

配制溶液：

稀土元素离子Tb³⁺溶液：称取50mg氧化铽，溶于50mL 6M的盐酸

溶液中，得到TbCl₃溶液，即为Tb³⁺溶液；

偶联缓冲液：0.05M(pH9.5)NaHCO₃缓冲液；

活化缓冲液：0.01M(pH7.4)磷酸盐缓冲液；

透析缓冲液：0.01M(pH8.0)Tris-HCl含0.9％(w/v)NaCl；

贮存缓冲液：0.01M(pH8.0)Tris-HCl含0.05％(w/v)NaN₃。

标记方法：

●称取BBCAP 6.0mg，溶于0.5mL偶联缓冲液中，加入9.0mgEDC·HCl，冰水浴中搅拌30分钟，得到BBCAP与EDC·HCl混合液；

●称取AFP抗原1.0mg，溶于0.3mL偶联缓冲液中，逐滴滴入BBCAP与EDC·HCl混合液中，继续冰水浴搅拌20小时；

●4℃透析过夜，换液三次。产物用Sephedex 650柱层析(0.01MpH8.0Tris-HCl平衡)，取集第一峰，加0.05％NaN₃(w/v)于4℃保存；

●用同样的方法标记HCGβ。

②量子点标记抗体；

●以DMSO为溶剂，配制10mM的SMCC溶液。在125μL量子点溶液中加入14μL SMCC溶液，充分混匀后室温下反应1小时，得到活化的量子点；

●以活化缓冲液为溶剂，分别配制1M的DTT溶液和1mg/mL的AFP单抗溶液。在300μL单抗溶液中加入6.1μL DTT溶液，迅速混匀后室温下反应30分钟，得到活化的AFP单抗；

●分别将上述活化的量子点和活化的AFP单抗经Sephadex 625柱层析纯化，再将纯化的产物混合，室温下反应1小时，得到偶联反应物；

●用蒸馏水配制10mM的2-巯基乙醇溶液，在上述偶联反应物中加入10μL 2-巯基乙醇溶液，室温下反应30分钟，得到偶联产物；

●偶联产物用Superdex 200柱层析纯化(0.01M pH7.4PBS溶液平衡)，取集第一峰，加0.05％NaN₃(w/v)于4℃保存。

③进行基于荧光共振能量转移的均相时间分辨荧光免疫分析试剂准备：

稀释液：0.01M(pH8.0)Tris-HCl含0.9％(w/v)NaCl，0.2％(w/v)BSA；

AFP抗原已知浓度的溶液：0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、0.8ng/mL、1.0ng/mL；

HCGβ抗原已知浓度的溶液：0.2ng/mL、0.4ng/mL、0.8ng/mL、1.5ng/mL、2.0ng/mL；

AFP-BBCAP：1.2μg/mL；

HCGβ-BBCAP：2.0μg/mL；

QD₅₆₅-Ab_AFP：0.3μM

QD₆₆₅-Ab_HCGβ：0.5μM

分析方法：

将AFP-BBCAP、HCGβ-BBCAP分别稀释500倍，QD₅₆₅-Ab_AFP、QD₆₆₅-Ab_HCGβ分别稀释100倍；

在荧光微孔板中每孔加入两种抗原标准点各30μL，再加入AFP-BBCAP、HCGβ-BBCAP各35μL，最后加入QD₅₆₅-Ab_AFP、QD₆₆₅-Ab_HCGβ各35μL，37℃温育1小时；

多标记分析仪在时间分辨模式下分别检测565nm和655nm的荧光强度，结果如下：

QD₅₆₅的荧光强度

QD₆₆₅的荧光强度

依据两种量子点的荧光光谱数据，采用去卷积法【参见：Ellen R.Goldman，Aaron R.Clapp，George P.Anderson，et al，AnalyticalChemistry，2004(76)：684-688】，计算得到各种能量受体的相对荧光强度，制作AFP与HCGβ的标准曲线，见图2和图3。AFP与HCGβ的标准曲线的计算公式分别为：Y＝-1.84X+3.52，Y＝-0.718X+4.23。

血清中AFP与HCGβ浓度的测定

将待测血清按照上述分析方法进行操作，测得565nm和655nm处的荧光强度分别为1356和2237，通过去卷积法计算得到的相对荧光强度分别为2.35和3.85，分别代入AFP与HCGβ的标准曲线公式，计算得到AFP与HCGβ的浓度分别为0.63ng/mL和0.53ng/mL。用时间分辨荧光免疫分析法(TR-FIA)测得的结果与上述结果一致。

Claims (8)

1.基于荧光共振能量转移的多组分同时检测的均相免疫分析方法，其特征在于，以高量子产率的荧光物质或化学发光物质为能量供体，以两种或两种以上宽激发的荧光染料为能量受体，按下列步骤操作：

步骤一：用同一种所述的能量供体标记两种或两种以上待测抗原，用不同的能量受体分别标记相应的两种或两种以上的抗体，或用所述的两种或两种以上的能量受体分别标记两种或两种以上的待测抗原，用一种所述的能量供体标记相应的两种或两种以上抗体，得到标记组分，且所述的作为能量供体和能量受体的荧光物质为符合FRET特征的试剂对；

步骤二：配制五个已知浓度梯度的两种或两种以上待测抗原溶液，令步骤一得到的标记组分与该已知浓度梯度的两种或两种以上待测抗原溶液进行均相竞争免疫反应，反应过程如下：将步骤一得到的标记组分与待测抗原溶液在pH 6-8的缓冲液中混合均匀，25℃温育30分钟，得到混合体系；

步骤三：免疫反应完成后，以所用能量供体的最大激发波长为激发光，以所用的不同能量受体的发射波长检测混合体系的荧光强度，得到各种能量受体的荧光光谱数据；

步骤四：依据各种能量受体的荧光光谱数据，采用去卷积法，计算得到所用能量受体的相对荧光强度；

步骤五：制作待测抗原的标准曲线，进行公式拟合，分别得到各种待测抗原浓度的计算公式；

步骤六：令未知浓度的两种或两种以上待测抗原与标记组分重复以上步骤二、步骤三、步骤四，将最终得到的相对荧光强度代入上述步骤五得到的拟合公式中计算即得到各待测抗原的浓度。

2.按照权利要求1所述的分析方法，其特征在于，作为能量供体的荧光物质是荧光素、荧光蛋白或稀土元素。

3.按照权利要求1所述的分析方法，其特征在于，作为能量供体的化学发光物质是发光蛋白或鲁米诺。

4.按照权利要求1所述的分析方法，其特征在于，作为能量受体的是宽激发的荧光染料。

5.按照权利要求4所述的分析方法，其特征在于，所述的宽激发的荧光材料是量子点、双光子试剂或荧光蛋白。

6.按照权利要求2所述的分析方法，其特征在于，作为能量供体的稀土元素离子是Tb³⁺、Dy³⁺、Sm³⁺或Eu³⁺。

7.按照权利要求1至6中任一项所述的分析方法，其特征在于，在所述的混合体系中，所用的能量供体是同一种，所用的能量受体是不同种，所用的能量受体与能量供体能组合成符合FRET特征的试剂对。

8.按照权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的待测的两种或两种以上抗原可以是病毒、细菌、真菌、衣原体、支原体、肿瘤相关抗原或具有抗原决定簇的物质。

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