CN112567245A - 检测目标物质的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种检测目标物质的方法。所述方法包括：a)将包含目标物质的样品引到基板上，b)使与对接股接合的检测探针特异性地结合到目标物质，c)引入一种或更多种能够互补地结合到对接股的分离股，对接股或分离股或两者以至少一种供体荧光物质和至少一种受体荧光物质标记，以及d)测量由供体荧光物质和受体荧光物质之间的FRET产生的荧光信号来识别目标物质。
Description
技术领域
本公开总体上涉及用于检测目标物质的方法和试剂盒，并且更具体地涉及用于以非常高的灵敏度多重检测目标物质的方法和试剂盒。
背景技术
生物标志物是指可以指示生物状态或状况的生物性标志物，例如蛋白质、DNA、RNA、代谢物等。可以基于存在于来自活生物体内的特定样品的生物标志物的检测来确定生物体的正常或病理状态，并可以客观地测量对药物的反应。最近，生物标志物检测作为一种诊断癌症和诸如心脏病、中风和失智症的医学界其他顽固性疾病的有效方法受到了关注。
用于生物标志物检测的常规技术主要基于ELISA，并且要求生物样品的量高于一预定水平，在至多数pg/ml至数十pg/ml的范围内，生物样品的量与灵敏度成比例。
根据大多数基于ELISA的技术，当使用生物标志物确定肿瘤是否生长时，通过各种检查识别出各种生物标志物。由此，检查重复了数次。然而，当肿瘤生长时，不仅一种生物标志物的水平改变，而且两种或更多种生物标志物的水平也改变。据此，需要同时检测数种类型的生物标志物以确定肿瘤是否生长，由此提高了确定疾病是否存在的准确性。
在现有技术的当前状态中，多种生物标志物的检测需要与生物标志物的数量成比例的足够量的血液和足够数量的检测试剂盒。大量血液的采样施加受试者精神和身体上的负担，并且使用大量检测试剂盒不仅造成经济负担，而且给疾病的早期诊断带来困难。由此，有必要同时诊断一种或更多种类型的生物标志物。
因此，需要开发高度灵敏的、多重的诊断技术，用以在非常少量的生物样品中同时检测两种或更多种类型的生物标志物。
[现有技术文件]
(专利文件0001)标题为“用于乳癌诊断的多种生物标志物、其检测方法以及使用针对其的抗体的用于乳癌诊断的试剂盒”的韩国专利第1431062号(2013年9月23日公开)
(专利文件0002)标题为“基于3D蛋白质纳米粒子探针的同时检测多种疾病的方法和试剂盒”的韩国专利公开第20170096619号(2017年8月24日出版)
发明内容
本发明要解决的问题
根据本公开的一个方面，提供一种用于检测目标物质的方法，包括：a)将含有目标物质的样品引到基板上，b)使与对接股接合的检测探针特异性地结合到目标物质，c)引入一种或更多种能够互补地结合到对接股的分离股，对接股或分离股或两者以至少一种供体荧光物质和至少一种受体荧光物质标记，以及d)测量由供体荧光物质和受体荧光物质之间的FRET产生的荧光信号来识别目标物质。
根据本公开的又一方面，提供一种用于检测目标物质的方法，包括：a)将含有作为目标物质的核酸或核酸类似物的样品引到基板上，b)引入一种或更多种能够互补地结合到目标物质的股的分离股，目标物质的股或分离股或两者以至少一种供体荧光物质和至少一种受体荧光物质标记，以及c)测量由供体荧光物质和受体荧光物质之间的FRET产生的荧光信号来识别目标物质。
根据本公开的另一方面，提供一种检测目标物质的方法，包括：a)将含有目标物质的样品引到基板上，b)使与标签股接合的检测探针特异性地结合到目标物质，c)以一种或更多种类型的供体荧光物质和一种或更多种类型的受体荧光物质标记标签股，以及d)测量由供体荧光物质和受体荧光物质之间的FRET产生的荧光信号来识别目标物质。
在一个实施方案中，供体荧光物质的峰值吸收波长可以短于受体荧光物质的峰值吸收波长，并且供体荧光物质的峰值发射波长可以短于受体荧光物质的峰值发射波长。
在一个实施方案中，在激发供体荧光物质的光的波长处，供体荧光物质的消光系数可以比受体荧光物质的消光系数高至少3倍。
在一个实施方案中，供体荧光物质和受体荧光物质之间的福斯特半径为至少0.208nm。
在一个实施方案中，供体荧光物质和受体荧光物质可以经由连接子标记在对接股或分离股上。
在一个实施方案中，连接子的长度可以为10nm或更小。
在一个实施方案中，所述方法可以进一步包括控制滤光片的波长，使得荧光信号的信噪比至少为2。
在一个实施方案中，分离股可以包括以一种或更多种类型的供体荧光物质标记的一种或更多种类型的供体股和以一种或更多种类型的受体荧光物质标记的一种或更多种类型的受体股。
在一个实施方案中，目标物质可以是两种或更多种类型，并且一种或更多种供体股或受体股可以取决于目标物质的类型而具有不同的序列，或者可以被不同类型的荧光物质或在不同位点标记。
在一个实施方案中，所述方法可以进一步包括：在识别目标物质之后，去除供体股和/或受体股，并使用不同于被去除的供体股和/或受体股的供体股和/或受体股重复步骤d)来识别其他目标物质。
在一个实施方案中，当供体股和受体股同时或顺序地结合至对接股时，供体股和受体股之间的间隙可以小于对接股的持久性长度。
在一个实施方案中，所述方法可以进一步包括控制供体股或受体股的浓度，使得供体股或受体股结合至对接股所花费的时间为10分钟或更少，同时保持荧光信号的信噪比为2或大于2。在此实施方案中，供体股或受体股的浓度可以为10nM至10μM。
在一个实施方案中，当对接股或受体股为核酸时，与对接股互补的受体股的碱基数可以为至少8。在此实施方案中，与对接股互补的供体股的碱基数可以为6到12。
在一个实施方案中，当对接股或受体股为核酸类似物时，与对接股互补的受体股的碱基数可以为至少5。在此实施方案中，与对接股互补的供体股的碱基数可以为3至9。
在一个实施方案中，受体股或对接股可以用形成FRET对的两种或更多种类型的荧光物质标记。
在一个实施方案中，分离股可以包括以一种或更多种类型的供体荧光物质标记的一种或更多种类型的供体股，并且对接股可以包括一种或更多种类型的受体荧光物质。
在一个实施方案中，分离股包含以一种或更多种类型的受体荧光物质标记的一种或更多种类型的受体股，并且对接股包含一种或更多种类型的供体荧光物质。
在一个实施方案中，标签股可以包括两个或更多个FRET对。
在一个实施方案中，可以通过由以下等式定义的FRET效率来测量由FRET产生的荧光信号：
FRET效率＝(来自受体的光的强度)/(来自供体的光的强度与来自受体的光的强度的总和)
在一个实施方案中，FRET效率的测量可以包括在光漂白之前和之后测量来自供体或受体的光的亮度值。
在一个实施方案中，可以控制FRET对之间的间隙，以便不影响每个FRET对的FRET效率。FRET对之间的间隙可以为至少5nm。
在一个实施方案中，可以通过确定取决于荧光物质之间的距离而区分的FRET效率之间的差异来同时识别两种或更多种类型的目标物质。
在一个实施方案中，可以通过确定不同类型的荧光物质之间的通过FRET的发射光谱之间的差异来同时识别两种或更多种类型的目标物质。
在一个实施方案中，所述方法可以进一步包括由荧光信号被成像的区域的每单位面积的目标物质的数量确定样品中目标物质的浓度。
根据本公开的另一方面，提供一种用于检测目标物质的试剂盒，其包括与目标物质特异性地结合并与对接股接合的一种或更多种类型的检测探针，其中对接股包括一种或更多种类型的供体荧光物质和一种或更多种类型的受体荧光物质，并且当供体荧光物质被激发时，通过在供体荧光物质和受体荧光物质之间的FRET发射光。
在一个实施方案中，标签股可以包括两个或更多个FRET对。
根据本公开的另一方面，提供一种用于检测目标物质的试剂盒，其包括：a)一种或更多种类型的特异性地结合到目标物质并与对接股接合的检测探针，以及b)一种或更多种与对接股互补地结合的分离股，其中对接股或分离股或两者以至少一种供体荧光物质和至少一种受体荧光物质标记，当供体荧光物质被激发时，通过在供体荧光物质和受体荧光物质之间的FRET发射光。
根据本公开的另一方面，提供一种用于检测目标物质的试剂盒，其包括与作为目标物质的核酸或核酸类似物的股互补地结合的一种或更多种分离股，其中分离股包括以至少一种供体荧光物质标记的供体股和以至少一种受体荧光物质标记的受体股，并且当供体荧光物质被激发时，通过在供体荧光物质和受体荧光物质之间的FRET发射光。
根据本公开的又另一方面，提供一种用于检测目标物质的试剂盒，其包括与目标物质特异性地结合并与标签股接合的一种或更多种类型的检测探针，其中标签股包括一种或更多种类型的供体荧光物质和一种或更多种类型的受体荧光物质，并且当供体荧光物质被激发时，通过在供体荧光物质和受体荧光物质之间的FRET发射光。
在一个实施方案中，试剂盒可以进一步包括可以捕获目标物质的基板。可以将一种或更多种类型的捕获探针固定在基板上以捕获目标物质。捕获探针可以与标签股接合。
在一个实施方案中，试剂盒可以进一步包括与检测探针的标签股和捕获探针的标签股互补地结合的桥股，以形成FRET对。
附图说明
图1a至1k示出FRET-PAINT的原理和特性。
图2a至2e比较DNA-PAINT和FRET-PAINT的成像速度。
图3a至3h示出FRET-PAINT的多重能力。
图4a至4c示出各种浓度下生物标志物的定量。
图5示出供体和受体的重叠光谱。
图6示出供体股和结合至对接股的受体股。
图7示出供体荧光物质(实线)和受体荧光物质(虚线)的发射光谱。
图8a示出以照相机拍摄的受体荧光信号。
图8b比较信号强度和噪声强度。
图9示意性地示出根据本公开的一个实施方案的用于同时检测多种生物标志物的试剂盒。
图10示意性地示出根据本公开的一个实施方案的在标签股上标记的供体和受体。
图11示出根据本公开的一个实施方案的使用单分子显微镜的成像过程。
图12示出根据本公开的一个实施方案的供体和受体的FRET效率的测量。
图13示出根据本公开的一个实施方案的以两个或更多个供体-受体FRET对标记的标签股。
图14示出根据本公开的一个实施方案的两个或更多个供体-受体FRET对中的供体和受体的组合。
图15示意性地示出根据本公开的一个实施方案的不同类型的生物标志物的检测。
图16示意性地示出根据本公开的一个实施方案的用于同时检测多种生物标志物的试剂盒。
图17示意性地示出根据本公开的一个实施方案的用于同时检测多种生物标志物的试剂盒。
图18示意性地示出根据本公开的一个实施方案的用于同时检测多种生物标志物的试剂盒。
图19至21示意性地示出根据本公开的各种实施方案的用于同时检测多种生物标志物的试剂盒。
图22示意性地示出根据本公开的一个实施方案的用于同时检测N类型生物标志物的试剂盒。
图23示意性地示出根据本公开的一个实施方案的用于同时检测N类型生物标志物的试剂盒。
图24示意性地示出根据本公开的一个实施方案的用于同时检测多种生物标志物的试剂盒。
图25示意性地示出根据本公开的一个实施方案的用于同时检测多种生物标志物的试剂盒。
图26示意性地示出根据本公开的一个实施方案的用于同时检测生物标志物的试剂盒。
图27示意性地示出根据本公开的一个实施方案的用于检测microRNA的试剂盒。
图28示出根据本公开的一个实施方案的吸收和发射光谱。
图29示意性地示出根据本公开的一个实施方案的同时检测多种生物标志物的原理。
图30示出根据本公开的一个实施方案在不同浓度的供体股记录的荧光图像。
图31示例性地示出根据本公开的一个实施方案的用于同时检测多种生物标志物的试剂盒。
图32示出取决于供体和受体之间的距离的发射光谱。
图33示例性地示出根据本公开的一个实施方案的用于同时检测多种生物标志物的试剂盒。
图34a至34c示出以两种或更多种类型的受体标记的对接股的发射光谱。
图35a和35b示例性地示出根据本公开的一个实施方案的用于同时检测多种生物标志物的方法。
图36a和36b示例性地示出根据本公开的一些实施方案的用于同时检测多种生物标志物的试剂盒。
图37示例性地示出使用如图36b所示的包括供体股和受体股的检测试剂盒来识别生物标志物类型的方法。
图38a和38b示例性地示出根据本公开的一些实施方案的用于同时检测多种生物标志物的试剂盒。
图39示例性地示出根据本公开的一个实施方案的用于检测microRNA的试剂盒。
具体实施方式
本文中使用的术语简要定义如下。
如本文所使用的，术语“物标志物”旨在包括可以用于确定生物体的正常或病理状态的所有生物材料。
如本文所使用的，术语“FRET”是指通过两种相邻荧光物质的共振的能量转移的机制。具体地，它是指能量从被光激发的荧光物质到另一相邻的荧光物质的转移，并且旨在包括本领域技术人员认知的FRET的一般含义。
如本文所使用的，术语“FRET效率”是指从被光激发的荧光物质转移到另一相邻的荧光物质的能量的值。FRET效率取决于荧光物质之间的距离而改变。此术语旨在包括本领域技术人员认知的FRET效率的一般含义。
如本文所使用的，术语“供体”是指当被光激发时传递能量的荧光物质。当两种或更多种荧光物质彼此相邻时，吸收或发射相对短波长的光的荧光物质用作供体。
如本文所使用的，术语“受体”是指接收从激发的供体转移的能量的荧光物质。当两种或更多种荧光物质彼此相邻时，吸收或发射相对长波长的光的荧光物质用作受体。
如本文所使用的，术语“股(strand)”是指生物聚合物的链或模拟生物聚合物的聚合物的链。生物聚合物可以具有单股或双股结构，并且旨在包括核酸、核酸类似物、多肽和碳水化合物。核酸包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。核酸类似物包括肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)、锁核酸(locked nucleic acids,LNA)、吗啉代核酸(morpholino nucleic acid,MNA)、二醇核酸(glycol nucleic acid,GNA)和苏糖核酸(threose nucleic acid,TNA)。
现在将参考附图详细描述各种实施方案。然而，可以对这些实施方案进行修改，并且因此本申请的范围不受实施方案的限制或限缩。应当理解，所有变化、等同物和替代物都涵盖在所附权利要求的范围内。
如本文中所使用的术语仅出于说明性目的，并且不应被解释为限制。如本文所使用的，单数形式“一”、“一个”和“所述”也旨在包括复数形式，除非上下文另外明确指出。将进一步理解的是，术语“包含”、“包含有”、“包括”、“包含有”、“有”和/或“具有”指定所陈述的特征、整数、步骤、操作、元素、组件和/或其组合的存在，但不排除存在或增加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元素、组件和/或其组合。
除非另有定义，否则本文中使用的所有术语，包括技术或科学术语，具有与本公开所属技术领域的普通技术人员一般理解的含义相同的含义。除非在本申请中明确定义，否则应将如同在通用词典中定义的那些术语解释为具有与相关技术领域中的上下文含义等同的含义，并且不应解释为具有理想或过度形式化的含义。
在参照附图对各种实施方案的描述中，除非另有阐明，否则省略对相同组件的重复解释。
单分子荧光显微镜的近期发展已允许观察单个分子。当应用于生物标志物检测时，单分子荧光显微镜具有在fg/ml范围内的敏感度，其大约高出现存荧光成像技术的1000倍(Nature 473,484-488,2011)。根据一般的荧光成像技术，荧光物质固定到要观察的分子上，从而使用荧光信号区分不同类型的生物标志物。虽然基于荧光物质的不同颜色来区分不同类型的生物标志物，但是以一般的图像传感器只能分辨和观察到3-4种类型的荧光物质。因而，使用单分子荧光显微镜，其灵敏度在fg/ml范围内，对应于大约是现存荧光成像技术的1000倍，能够检测到3-4种类型的生物标志物。
DNA-PAINT技术(Nature Methods 11，313-318，2014)在单分子荧光显微镜中的应用允许同时分析多种生物标志物，同时保持单分子荧光显微镜的高灵敏度。根据这种融合技术，允许将与荧光物质以外的对接股接合的检测抗体结合到分析物生物标志物上，将荧光物质标记在成像股上，成像股附接到对接股上一段时间(几秒钟)，然后从对接股上脱离，并且当成像股结合到对接股被检测到时，荧光信号产生。以此方式，可以用单色荧光物质检测多种类型的生物标志物，同时保持高灵敏度。
然而，当使用DNA-PAINT技术时，因为所有成像股都发射荧光信号，不论它们是否与对接股结合，所以产生高背景噪声。由此，成像股的浓度被限制在几nM至几十nM，不利地导致低检测率。
本公开的一个实施方案提供一种在保持单分子荧光显微镜的高灵敏度的同时通过FRET-PAINT同时检测多种目标物质的方法。FRET-PAINT是基于荧光共振能量转移(FRET)的DNA-PAINT技术的一种变体。FRET是一种现象，其中最初激发的供体的能量转移到受体上。一般而言，供体材料发射与受体材料相比短波长的光。发射波长在光谱上与受体的吸收波长重叠。能量传递速率和效率取决于供体的发射波长与受体的吸收波长之间的重叠程度、供体的量子效率、供体与受体的跃迁偶极的相对排列以及供体与受体之间的距离。
例如，根据FRET-PAINT技术，对接股具有两个DNA结合位点：一个用于供体股，另一个用于受体股。对于单分子定位，使用受体的FRET信号。由于受体不是直接激发，而是被FRET激发，可以使用数十倍至数百倍的成像剂(供体和受体)浓度，这表明与DNA-PAINT相比，FRET-PAINT的成像速度为较高的数十倍至数百倍。
本公开的一个方面提供一种用于检测目标物质的方法。所述方法包括：a)将含有目标物质的样品引到基板上，b)使与对接股接合的检测探针特异性地结合到目标物质，c)引入一种或更多种能够互补地结合到对接股的分离股，对接股或分离股或两者以至少一种供体荧光物质和至少一种受体荧光物质标记，以及d)测量通过供体荧光物质和受体荧光物质之间的FRET的所有或一些发射光谱来识别目标物质。
所述方法的各个步骤如下所述。
首先，在步骤a)中，将含有目标物质的样品引到基板上。基板提供用于捕获和观察目标物质的区域。基板的结构不受限制。例如，基板在结构上可以是平面的、球形的或棒状的。可替代地，基板可以是不规则形状的。用于基板的材料可以是例如玻璃、石英或塑料。基板可以是载玻片或盖玻片。优选地，基板是#1或#1.5盖玻片。
样品不限于特定种类，只要其含有目标物质即可。所述样品分离自怀疑患有疾病的动物或人类个体，并且可以选自但不特定限于由组织、血液、血清、血浆、唾液、粘液和尿液所组成的组。
感兴趣的分析物可以用于作为目标物质而没有特别限制。例如，目标物质可以是金属(Ca、Mg、Pb等)，金属离子或生物材料。生物材料可以是生物标志物、血液、血浆、血清、体液、蛋白质、肽、核酸、细菌、病毒、内质网、miRNA、外泌体和循环肿瘤细胞。优选地，目标物质是生物标志物。
本公开可以用于观察细胞、组织、器官和其他生物样品。特别地，本公开使得能够通过用于快速和早期疾病诊断的单个检查来检测多种类型的生物材料。因此，本公开非常适合用于生物标志物的检测。
生物标志物没有特别限制。例如，生物标志物可以是通常在科学和医学领域中使用的那些，包括用于治疗应用的生物治疗过程、病原过程和药理过程的测量或评估。
生物标志物可以是可以从体液检测到的多肽、肽、核酸、蛋白质或代谢物，所述体液例如血液、唾液和尿液。具体地，生物标志物可以是甲胎蛋白(AFP)、CA15-3、CA27-29、CA19-9、CA-125、降钙素、钙网膜蛋白、癌胚抗原(CEA)、CD34、CD99、MIC-2、CD117、嗜铬粒蛋白、各种类型的细胞角蛋白(TPA、TPS、Cyfra21-1)、结蛋白、上皮膜抗原(EMA)、因子VIII、CD31、FL1、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、巨囊性病液体蛋白(GCDFP-15)、HMB-45、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、免疫球蛋白、抑制素、角蛋白、各种类型的角蛋白、淋巴细胞标记、MART-1(Melan-A)、Myo D1、肌肉特异性肌动蛋白(MSA)、神经丝、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)、前列腺特异性抗原(PSA)、PTPRC(CD45)、S100蛋白，平滑肌肌动蛋白(SMA)、突触素、胸苷激酶(TK)、甲状腺球蛋白(Tg)、甲状腺转录因子-1(TTF-1)、M2-PK、波形蛋白、白介素、CD24、CD40、整联蛋白、胱抑素、干扰素、肿瘤坏死因子(TNF)、MCP、VEGF、GLP、ICA、HLA-DR、ICAM、EGFR、FGF、BRAF、GFEB、FRS、LZTS、CCN、粘蛋白、凝集素、载脂蛋白、酪氨酸、神经细胞粘附分子样蛋白、纤连蛋白、葡萄糖、尿酸、碳酸酐酶或胆固醇。
样品可以用无生物标志物的溶液稀释。样品中生物标志物的浓度取决于生物标志物的类型而有从fg/ml到mg/ml的巨大变化。优选地，以各种比例稀释样品，从而通过图像传感器检测适当数量的生物标志物分子。优选以不同比例稀释相同样品，最优选以1:10至1000的重量比稀释。
目标物质可以直接附接到基板上。可替代地，可以经由附接到基板的捕获探针将目标物质引到基板上。可以用合适的聚合物涂覆基板，从而使诸如抗原、抗体和荧光物质的不期望的物质不会附接到基板表面上。所述聚合物可以是例如聚乙二醇(PEG)或丙烯酰胺。
捕获探针特异性地结合到目标物质，以将目标物质固定在基板上。捕获探针可以是抗体或适体。例如，捕获探针可以是能够特异性地结合到生物标志物以捕获生物标志物的捕获抗体。可以通过将生物素引入捕获抗体的表面，然后将能够结合到生物素的抗生物素蛋白、中性亲和素或链霉亲和素引到基板上，捕获抗体可以被附接到基板。
例如，分析物生物标志物可以直接附接到基板表面，而无需使用捕获抗体，用以进行快速且方便的测量。可替代地，生物标志物分子可以通过抗原-抗体反应附接到固定在基板表面上的捕获抗体，用以实现更高的测量结果准确性。
在将生物标志物直接附接到基板表面的情况下，例如，将盖玻片以珠溶液涂覆，并且将与样品相对应的细胞培养并固定在基板表面上。通过以pH 9.5的0.06M碳酸盐或碳酸氢盐缓冲溶液稀释捕获抗体，并使稀释液在预定温度下与基板接触一段预定时间，可以将捕获抗体附接到基板上。然后，用未加工或加工过的样品处理基板。吸附到基板上的捕获抗体与样品中的生物标志物形成复合物。以诸如Tween 20的缓冲液或诸如蒸馏水的清洁剂清洗复合物以去除非特异性结合的抗体或污染物。
在步骤b)中，使与对接股接合的检测探针特异性地结合到目标物质。检测探针可以是抗体或适体。例如，可以将对接股标示在能够特异性地结合到分析物生物标志物的检测抗体上。
具体地，本文中用于指代捕获抗体和检测抗体的术语“抗体”可以包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段(例如，表现出所需生物活性的抗体的可变区和其他区域)。所述抗体旨在包括单克隆和多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。优选地，抗体包括Fab、F(ab)2、Fab’、F(ab’)2、Fv、双抗体、纳米抗体和scFv。更优选地，抗体是scFv、Fab、纳米抗体或免疫球蛋白分子。
可以通过本领域已知的用于将蛋白质分子到结合核酸分子的一般方法，例如基于核酸分子和蛋白质分子之间的结合反应，使用具有两个不同的反应基团，将对接股附接到作为检测探针的抗体或适体，所述反应基团例如其中NHS-酯基团与胺反应并且马来酰亚胺基团与硫醇反应的4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)。通过使含硫醇基的对接股与SMCC反应并使所得产物与在检测抗体的N-末端的胺基或赖氨酸的胺基反应，可以将对接股附接到检测抗体。
为了精确测量，检测抗体是一级抗体，并且对接股附接到一级抗体。为了快速测量，检测抗体是一级抗体和二级抗体的组合，并且对接股附接到二级抗体。
一级抗体可以是特异性地结合到生物标志物的免疫球蛋白分子，并且它们的类型不受限制。在以下的示例部分中，抗微管蛋白抗体和抗Tom20抗体被用作一级抗体。
二级抗体是指与结合到生物标志物的一级抗体结合的抗体，并且它们的类型不受限制。在以下的示例部分中，驴抗兔IgG抗体或驴抗大鼠IgG抗体用作二级抗体。
在步骤c)中，将能够互补地结合到对接股的一种或更多种分离股引入对接股。
以至少一种供体荧光物质和至少一种受体荧光物质标记对接股或分离股或两者。
分离股可以互补地结合到对接股，并且可以取决于附接到股的荧光物质的类型分为供体股、受体股和FRET股。供体股可以用至少一种用作供体的荧光物质标记，并且受体股可以用至少一种用作受体且可以被从供体荧光物质转移的能量激发的荧光物质标记。FRET股可以包括形成FRET对的供体和受体荧光物质。
在一个实施方案中，分离股可以包括用一种或更多种类型的供体荧光物质标记的一种或更多种类型的供体股和用一种或更多种类型的受体荧光物质标记的一种或更多种类型的受体股。
FRET是一种现象，其中当两种不同类型的荧光物质彼此的位置非常靠近时，一种荧光物质(供体)的能量转移到另一种荧光物质(受体)上。基于所述现象，可以有效地检测目标物质。为了使受体发光，受体应接收从供体传递的能量。只有当供体股和受体股同时结合到对接股时，才发生此能量转移。由此，来自受体的荧光信号反映了目标物质的位置。
图1b示出使用图1a所示的供体股和受体股基于FRET-PAINT技术检测目标物质的原理。当发生FRET时，能量从供体转移到受体，结果为供体变暗而受体发光并且显得明亮。
根据此技术，DNA-PAINT的成像股被区分为供体股和受体股。当标记在供体股上的荧光物质被在λex处的光激发时观察到的来自供体的荧光信号被光学滤光片去除，并且结果为，可以观察到来自受体的荧光信号。即，所有供体荧光物质都发射光，其被光学滤光片去除，并且受体荧光物质不会被在λex处的光直接激发，导致非常低的背景噪声。与DNA-PAINT不同，由于供体引起的背景噪声为可以忽略的低，因此可以将供体股的浓度增加到高达数百nM，实现了数百倍的快速测量。
在一个实施方案中，分离股包括以一种或更多种类型的受体荧光物质标记的一种或更多种类型的受体股，并且对接股可以包括一种或更多种类型的供体荧光物质。优选地，将量子点作为荧光物质引入到对接股中。在这种情况下，不同于当引入荧光蛋白、有机荧光团等，不会发生光漂白。据此，不需要引入供体股以解决由供体荧光物质引起的光漂白的问题，并且减少了由使用供体股引起的背景噪声，导致了高的信噪比。另外，实现了简单的构造，从经济的观点这是有利的，并且可以简化分析过程。
包括对接股和分离股的股可以是核酸、多肽或碳水化合物。优选地，所述股是对接股可以互补地结合到分离股、易于合成、便宜并且提供容易附接荧光物质的所需位点的核酸。核酸可以选自由DNA、RNA、PNA、LNA、MNA、GNA和TNA组成的组，其能够互补地结合到分离股上。核酸可以是单股或双股的。
将对接股接合到检测探针，并且成像股、供体股和受体股可以互补地结合到对接股。当采用DNA-PAINT技术时，使用成像股。当采用FRET-PAINT技术时，使用供体股和受体股。
成像股取决于生物标志物的类型而具有不同的序列。例如，在两条成像股结合到两种不同类型的生物标志物的情况下，它们的序列在至少一个碱基上是不同的，这指出不论生物标志物类型数量如何，结合到不同类型的生物标志物的成像股的序列是不同的。
在一个实施方案中，供体股和受体股取决于生物标志物的类型而具有不同的序列。例如，使用具有不同的序列的N个供体股和N个受体股对于检测N种不同类型的生物标志物是必要的。即，供体股的序列在至少一个碱基上是不同的，结合到不同类型的生物标志物的受体股的序列在至少一个碱基上也是不同的，并且所有供体和受体股具有不同的序列。
在一个实施方案中，受体股可以具有与一些或所有的生物标志物相同的序列；并且，供体股的序列可以与受体股的序列不同，并且取决于生物标志物的类型可以彼此不同。例如，当打算检测两种不同类型的生物标志物时，结合到不同生物标志物的供体股的序列在至少一个碱基上可以是不同的，并且具有相同序列的受体股可以用于检测生物标志物。
在一个实施方案中，供体股可以具有与一些或所有的生物标志物相同的序列；并且，受体股的序列可以与供体股的序列不同，并且取决于生物标志物的类型可以彼此不同。例如，当打算检测两种不同类型的生物标志物时，结合到不同生物标志物的受体股的序列在至少一个碱基上可以是不同的，并且具有相同序列的供体股可以用于检测生物标志物。
对接股可以包括与供体股和受体股的序列互补的序列。
所述股可以具有各种结构。例如，股可以具有本领域已知的结构。可替代地，可以将官能基团引入股中，从而使得荧光物质附接到股上。所述股可以预先与荧光物质附接。当将官能基团引入股中时，所需的荧光物质可以附接到股的所需位点。相同或不同的官能基团可以附接到每个股。供体和受体之间的距离和FRET效率可以取决于供体和受体附接的股的位点而改变。这些特性使得能够对目标物质进行多重检测。
荧光物质被诸如UV、可见光或红外光、电能或热能的外部能量激发，以将能量转化为光。荧光物质的示例包括有机和无机荧光团。有机荧光团的示例包括若丹明(rhodamine)、Alexa Fluor染料、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、5-羧基荧光素(FAM)、ATTO染料、BODIPY、CF染料、花菁(Cy)染料、DyLight Fluor和Texas Red。无机荧光团可以是例如量子点。
标记在供体股上的荧光物质的发射光谱的峰值波长比标记在受体股上的荧光物质的吸收光谱的峰值波长短。
供体-受体关系中两种荧光物质之间的FRET信号强度与两种荧光物质之间的距离相关。例如，每个DNA股都是线性延伸排列的核苷酸，每个核苷酸由包括A、T、G和C的四种不同类型的碱基之一、一种糖和一种磷酸构成。两股的碱基彼此互补地结合。所需的官能基团或荧光物质可以附接到每个核苷酸中的碱基、糖和磷酸中的任何一个。由于DNA双螺旋中两个相邻碱基之间的距离为0.34nm，因此可以非常精确地控制FRET对的距离。当需要以其之间存在M个碱基的两种不同的荧光物质标记单股DNA时，在特定碱基上标示一个胺基，在位于与所述特定碱基相距M个碱基处的一个碱基上标示一个巯基(硫醇基；SH)。然后，使DNA与附接有与胺基反应的NHS-酯基的荧光物质A和附接有与巯基反应的马来酰亚胺基的荧光物质B反应以标记FRET对。使用不同的反应基团能够标记三种以上的荧光物质。例如，醛基附接到DNA的特定位置，并且附接有与醛基反应的酰肼基的荧光物质C附接到DNA。
目标物质与检测或捕获探针之间的特异性结合反应可以通过基于诸如夹心ELISA或特异性适体结合的免疫反应的结合而进行。
在以下的步骤d)中，测量由在供体荧光物质和受体荧光物质之间的FRET产生的荧光信号，以识别目标物质。可以通过FRET从所有或一些发射光谱中测量荧光信号。例如，当通过FRET效率区分目标物质时，仅测量每种荧光物质的光谱的一部分(主要是峰值)。通过光谱形状区分目标物质时，可以测量所有光谱。
步骤d)包括检测在步骤c)中产生的荧光信号。当成像股结合到对接股或供体和受体股同时结合到对接股时，可以产生荧光信号。具体地，当成像股在预定时间内保持结合到对接股时，或者标记在供体股上的供体荧光物质的位置在预定时间内非常靠近被对接股标记在受体股上的受体荧光物质时，可以产生荧光信号。可以使用高敏感度的图像传感器(例如，EMCDCD、sCMOS或iCMOS)来检测荧光信号。
在一个实施方案中，所述方法可以进一步包括：在识别目标物质之后，去除供体股和/或受体股，并使用不同于被去除的供体股和/或受体股的供体股和/或受体股重复步骤d)来识别其他目标物质。在完全去除供体股和受体股之后，可以使用不同股的组合。可替代地，供体股或受体股可以稳定地结合到对接股并且保持不被去除。将未去除的供体股或受体股用来作为普通股，并去除其他不稳定结合的股。
所述方法基于使用不同序列的股进行多重检测。据此，可以通过将加载互补地结合至对接股的供体股(或受体股或供体股和受体股二者)N次，然后重复清洗，来检测N种目标。例如，可以通过重复步骤c)和d)与生物标志物种类的数量同样多的次数来检测多种生物标志物。当检测到以荧光物质标记的供体股和受体股结合到对接股时，产生荧光信号。然后，去除像是结合的股。使用不同的股重复相同的程序，并检测所得的荧光信号。此程序重复数次，优选地，与生物标志物种类的数量同样多的次数。例如，由9个碱基组成的供体股可以具有49个(＝262,144)序列。由于供体股的序列数量大于人体中所有蛋白质的数量，因此将具有不同序列的供体股和受体股分配给所有生物标志物，从而可以顺序地测量生物标志物。
供体和受体荧光物质之间的FRET反应可以通过各种技术测量。
当产生荧光信号时，由于衍射现象，看起来比实际尺寸大得多。据此，当两种目标物质在基板上彼此的位置非常靠近并且同时发射荧光信号时，点形式的发光区域重叠，使得不可能精确地测量荧光信号。
在一个实施方案中，对接股可以用受体荧光物质标记或与受体股结合。在此实施方案中，可以通过测量在供体股结合到对接股时产生的荧光信号的FRET效率或发射光谱来检测生物标志物。供体股一次或多次结合到所有对接股。据此，每当供体股结合到对接股时，都需要测量FRET效率或发射光谱。由此，需要相对较长的时间(数十秒到几分钟)来检测所有生物标志物，尽管两种生物标志物彼此非常接近，但是可以区分两种生物标志物。当两种彼此位置非常靠近的荧光物质同时发射光时，以照相机只能观察到亮度翻倍的一个点，使得无法区分荧光物质的FRET效率。相反地，当两种荧光物质以一定时间间隔顺序发射光时，可以测量每个点的准确位置和FRET效率，结果为可以识别两种生物标志物。另外，可以测量一个对接股中的数个FRET效率，这对于多重检测是有利的。如果具有数个FRET效率的荧光物质同时发射光，则无法个别确定FRET效率。
在一个实施方案中，可以在将供体和受体荧光物质标记在对接股上或者将供体和受体股都结合到对接股的状态下，在激发供体之后测量荧光信号。由于所有荧光团在供体被激发后便立即发射光，因此可以在短时间内测量荧光信号。然而，当荧光团之间的距离随着生物标志物的浓度的增加而减小时，点形式的发光区域重叠，使得难以准确地测量荧光信号。进一步地，不能测量一种生物标志物的数个FRET效率，并且可以检测到减少数量的生物标志物。然而，由于生物标志物通过发射光谱的形状来区分，因此在生物标志物的多重检测中可能没有问题。
本公开的又一方面提供一种用于检测目标物质的试剂盒，包括：a)一种或更多种类型的特异性地结合到目标物质并与对接股接合的检测探针，以及b)一种或更多种互补地结合到对接股的分离股。以至少一种供体荧光物质和至少一种受体荧光物质标记对接股或分离股或两者，并且当供体荧光物质被激发时，在供体荧光物质和受体荧光物质之间的FRET发射光。
在一个实施方案中，所述试剂盒可以进一步包括可以在其上捕获目标物质的基板。可以将合适的涂层引到基板上，或者可以修饰基板的表面以防止目标物质以外的物质非特异性地结合到基板上或促进目标物质附接到基板上。目标物质可以直接附接到基板上。可替代地，可以通过以预先附接到基板上的捕获探针进行捕获来引入目标物质。
在一个实施方案中，所述试剂盒可以包括：a)一种或更多种类型的与对接股接合的检测抗体，和b)一种或更多种类型的以荧光物质标记的供体股和以荧光物质标记的受体股。当与对接股接合的检测抗体结合到生物标志物并且对接股结合到供体股和受体股时，试剂盒检测产生的信号。
所述试剂盒可以包括：i)基板，ii)捕获抗体，iii)与对接股接合的一级检测抗体，或未与对接股接合的一级检测抗体和与对接股接合的二级检测抗体，以及iv)供体股和受体股。优选地，试剂盒由基板，捕获抗体，与对接股、供体股和受体股接合的一级检测抗体组成。
所述试剂盒可以是用于检测生物标志物的体外诊断产品。例如，试剂盒可以是仅用于研究(research use only,RUO)的试剂盒、仅用于研究(investigational use only,IUO)的试剂盒或体外诊断(in vitro diagnostic,IVD)的试剂盒。
本公开的另一方面提供一种用于作为样品中的目标物质的检测核酸或核酸类似物的方法。所述方法包括：a)将作为目标物质的含有核酸或核酸类似物的样品引到基板上，b)引入一种或更多种能够互补地结合到目标物质的股的分离股，以至少一种供体荧光物质和至少一种受体荧光物质来标记目标物质的股或分离股或两者，并且c)测量由在供体荧光物质和受体荧光物质之间的FRET产生的荧光信号以识别目标物质。
与前述方面不同，在此方面中使用作为目标物质的核酸或核酸类似物避免对于对接股的需要。目标物质优选是RNA、microRNA(miRNA)，无细胞(cell-free DNA,cfDNA)或循环游离DNA或循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)，其可以用于确定生物体的正常或病理状态。
在一个实施方案中，所述方法可以包括：a)将存在于来自受试者的样品中的一种或更多种类型的核酸附接到基板表面，b)使核酸与供体股和受体股接合，以及c)检测步骤b)中产生的荧光信号。
在一个实施方案中，在检测到荧光信号之后，去除像是结合的供体股和像是结合的受体股，将不同的成像股或供体和受体股的不同组合接合到核酸，并且重复步骤b)和c)与目标核酸种类的数量同样多的次数。
将给出所述方法的各个步骤的描述。
在步骤a)中，将存在于从受试者获得的样品中的一种或更多种类型的核酸附接到基板的表面。核酸可以用作要检测的生物标志物。核酸优选是非编码RNA。非编码RNA是缺少特定蛋白质的氨基酸编码的RNA类型。不同于翻译基因序列的mRNA，非编码RNA以各种形式存在，并且可以从mRNA副产物或降解产物或通过单独的转录过程产生。已知非编码RNA在调节染色体活性或蛋白质表达中起作用。分析物RNA旨在包括小RNA，诸如miRNA、snRNA、snoRNA、aRNA、siRNA、piRNA、exRNA和scaRNA，但是优选是microRNA。
microRNA(miRNA)是小的非表达RNA分子，由大约22个碱基组成。miRNA在RNA沉默和转录后参与基因表达的调控。在诸如血液和尿液的许多生物流体中发现了miRNA，并且它们的水平因各种疾病而不同。由于这些原因，miRNA作为生物标志物正受到关注。
抗原抗体反应无法捕获核酸。在本公开中，通过将具有与分析物核酸的部分互补的序列的捕获探针固定到基板上并使核酸互补地结合到捕获探针，将分析物核酸附接到基板表面。样品可以用无核酸溶液稀释。样品中核酸的浓度可以取决于核酸的类型而有巨大改变。据此，可以用各种比例稀释样品，从而通过图像传感器检测适当数量的核酸分子。
接下来，在步骤b)中，核酸与供体股和受体股结合。设计供体和受体股，使得它们可以互补地结合到与捕获探针不互补地结合的核酸的单股部分。捕获探针、供体股和受体股分别选自由DNA、RNA、PNA和LNA股组成的组。
在步骤c)中，检测在步骤b)中产生的荧光信号。当供体股和受体股同时结合到与捕获探针不互补地结合的核酸单股部分时，产生荧光信号。更具体地，当成像股在预定时间内保持结合到与捕获探针不互补地结合的核酸的单链部分，或者当标记在供体股上的供体荧光物质的位置通过核酸在预定时间内非常靠近标记在受体股上的受体荧光物质时，可以产生荧光信号。可以使用高敏感度的图像传感器(例如，EMCCD、sCMOS或iCMOS)来检测荧光信号。
本公开的另一方面提供一种用于作为样品中的目标物质的检测核酸或核酸类似物的试剂盒。所述试剂盒包括互补地结合到作为目标物质的核酸或核酸类似物的股的一条或多条分离股。分离股包括以至少一种供体荧光物质标记的供体股和以至少一种受体荧光物质标记的受体股。当供体荧光物质被激发时，在供体荧光物质和受体荧光物质之间的FRET发射光。
在一个实施方案中，所述试剂盒包括一种或更多种类型的以荧光物质标记的供体股和一种或更多种类型的以荧光物质标记的受体股，并检测当成像股或供体和受体股结合到目标物质时产生的信号。
在一个实施方案中，所述试剂盒可以进一步包括可以在其上捕获核酸的基板。
在一个实施方案中，可以将具有与分析物核酸的一部分互补的序列的捕获探针固定到基板上。可替代地，可以对基板进行表面修饰，使得捕获探针可以附接到基板表面。
在以下的示例部分中，发现FRET-PAINT较常规DNA-PAINT具有优势。
在以下的示例部分中，确定是否可以通过显微镜检查进行FRET-PAINT。为此，将对接股固定在石英表面上，注入以荧光物质标记的供体和受体股，然后记录单分子图像，结果为，发现清楚的荧光的强度(见示例1-1和图1c)。
在下面的示例部分中，使用两个FRET对(Cy3-Cy5和Alexa488-Cy5)进行相同实验。结果为，当供体和受体股之间的间隙为2nt时，Alexa488-Cy5FRET对给出最高的荧光信号，而当供体和受体股之间的间隙为6nt时，Cy3-Cy5 FRET对给出最高的荧光信号(见示例1-1和图1d)。
在以下的示例部分中，测量了超分辨率荧光图像，并且比较不同DNA浓度下DNA-PAINT和FRET-PAINT的信噪比(SNR)。结果为，当DNA-PAINT的DNA浓度≥5nM并且当FRET-PAINT的DNA浓度≥100nM时，在单分子图像中出现噪声，表明在较高的成像剂浓度下，FRET-PAINT与DNA-PAINT相比，可以获得相同的SNR(见示例1-1和图1e至1k)。
在以下的示例部分中，以与对接股接合的抗微管蛋白抗体对细胞进行免疫染色，使用DNA-PAINT观察微管，并使用FRET-PAINT对相同区域的微管进行成像。定量并且比较DNA-PAINT和FRET-PAINT的成像速度，结果为，对于DNA-PAINT，以10Hz的速率记录图像，总成像时间为30分钟，对于FRET-PAINT，以10Hz的速率记录图像，总成像时间为60秒，表明发现到FRET-PAINT的成像速度高于DNA-PAINT的成像速度(见示例1-2和图2a至2e)。
在以下的示例部分中，以抗微管蛋白抗体和与对接股接合的抗Tom20抗体对细胞进行免疫染色，细胞顺序或同时以供体股和受体股处理，并且记录图像，结果为，以供体和受体股顺序处理发现在多重成像中更有效(见示例1-3和图3a至3h)。
在以下的示例部分中，在不同的生物标志物浓度下测量图像中发现的分子数量。结果为，在10pg/mg至400pg/ml的范围内可以很好地区分单个分子，从而能够测量生物标志物的浓度。相反地，在高于1000pg/ml的浓度，分子开始重叠，使得无法测量准确的浓度。在以适当的比例稀释样品使得浓度达到大约100pg/ml后，测量分子数并除以稀释比例，以计算生物标志物浓度，所述浓度与原始浓度完全一致。在当前广泛使用的生物标志物的浓度范围内(数pg/ml到数十ng/ml)，可以进行准确的测量(见示例1-4和图4a至4c)。
如上所述，使用单分子荧光显微镜和FRET-PAINT系统，能够从非常小量的生物流体中，以常规方法的1000倍的灵敏度，检测各种生物标志物，由此可用于包括癌症的各种疾病的早期诊断，同时解决使用生物标志物的常规诊断方法的问题。
为了通过本公开的方法和试剂盒有效检测目标物质，需要最大化供体和受体之间的FRET效应。为此，优选为选择合适的供体和受体，使得供体和受体的光谱有效重叠以诱导最佳的能量转移。
图5示出供体和受体的重叠光谱。
在一个实施方案中，可以选择供体和受体，使得供体的峰值吸收波长短于受体的峰值吸收波长，并且供体的峰值发射波长短于受体的峰值发射波长。结果为，因为供体的峰值吸收波长短于受体的峰值吸收波长，所以能量可以从供体转移到受体，并且仅供体可以被特定波长的激发光选择性地激发。可以用诸如二向色镜、棱镜或衍射光栅的适合工具去除来自供体的荧光信号，并且由于供体的峰值发射波长短于受体的峰值发射波长，因此可以选择性地检测来自受体的荧光信号。
在供体和受体之间的FRET效率(EFRET)由等式1计算：
(等式1)
其中R是供体-受体距离，R0(福斯特半径(
radius))是FRET效率为0.5时的供体-受体距离，可以由等式2定义：
(等式2)
其中κ是代表偶极子方向影响的常数，n是代表介质折射率的常数，ΦD是供体荧光物质的量子产率，并取决于供体荧光物质的类型而改变，JDA是光谱重叠积分，可以由等式3定义：
(等式3)
其中，εA是受体荧光物质的消光系数，FD是供体荧光分子的荧光发射强度。JDA取决于供体荧光物质的发射光谱与受体荧光物质的吸收光谱之间的光谱重叠而改变，并且由此与ΦD一起是确定R0的重要因素。
例如，可以选择供体和受体，使得供体在激发光的波长处的消光系数比受体在激发光的波长处的消光系数高出至少3倍，优选为至少5倍，更优选为至少10倍。在这种情况下，当能量通过FRET而不是通过激发光从供体转移时，大多数受体都会被激发。因为受体是由FRET而不是由激发光激发，所以随着供体的消光系数与受体的消光系数的比值增加，信噪比增加。因此，更优选为更高的供体的消光系数与受体的消光系数的比值。
为了容易检测到目标物质，在供体和受体之间的FRET效率优选为至少0.05，使得可以从背景噪声中识别出荧光信号。
为此，当如在先前的用于检测目标物质的方法中观察到受体信号时，优选为选择供体和受体荧光物质，使得供体和受体的福斯特半径(或福斯特距离)例如为至少0.208nm。作为另一示例，当测量FRET效率以用于目标物质的多重检测时，优选为选择供体和受体荧光物质，使得供体和受体的福斯特半径(或福斯特距离)例如，如下所述，至少为0.83nm。在使用核酸调节供体-受体距离的情况下，两种荧光物质之间的最短距离是1个碱基对(bp)，即0.34nm。据此，当福斯特半径为至少0.208nm时，在0.34nm的距离处的FRET效率可以为至少0.05。如果福斯特半径小于0.208nm，则FRET效率在1bp的距离处接近0，使得很难观察到受体信号。福斯特半径越大，在相同距离处的FRET效率越高，使得受体更亮。据此，更大的福斯特半径是更优选的。
作为另一个示例，当测量FRET效率用以进行多重检测时，小于0.83nm的福斯特半径会导致依据距离的FRET效率显着降低。即使当供体-受体距离仅达到3bp时，FRET效率也降低到小于0.05，使得难以观察受体信号和测量FRET效率。据此，对于3种或更多种的不同目标物质的检测，优选为0.83nm以上的福斯特半径。较大的福斯特半径能够在较大的距离范围内对FRET效率进行差分检测。
为了诱导最佳的能量转移，必须考虑供体-受体相互作用来确定合适的供体-受体距离。
图6示出与对接股结合的供体股和受体股。参照图6，例如，供体和受体荧光物质之间的实际间隙可以对应于以荧光物质标记的股的碱基之间的距离，并且可以取决于供体和受体在其上的股的位置而改变，或者供体和受体股之间的间隙结合到对接股。
在一个实施方案中，当供体股和受体股同时结合到对接股时，供体股和受体股之间的间隙(单股)小于对接股的持续长度。
例如，双股DNA的碱基距离为0.34nm，并且持续长度为50nm，而单股的碱基距离为0.5nm以上，并且持续长度仅为几nm。如本文所使用的，术语“持续长度”是指诸如DNA的聚合物链保持其线性的距离，并且可以取决于诸如聚合物链的结构和电荷以及缓冲液的盐浓度的各种因素而改变。如果单个对接股的持续长度大于间隙，则对接股可能会在间隙的某个位置弯曲。在这种情况下，供体-受体距离可能比预期距离短得多，结果为，不能获得期望的荧光信号，这可能引起问题。因此，间隙优选地小于对接股的持续长度，使得对接股保持其线性。
在一个实施方案中，当荧光物质附接在股上时，可以将柔性连接子插入股和荧光物质之间。由于连接子使荧光团自由旋转，因此亮度可以保持恒定，而独立于观察者观看的方向。每个连接子可以包括诸如-CH2-和-CH2CH2O-的一个或更多个柔性或可旋转的重复单元。连接子的长度可以是0.1nm至最大10nm。当连接子的长度较大时，观察到的荧光团的位置会大大改变。如果连接子过长，则可能难以区分目标物质。由此，优选为将连接子的长度限制为10nm以下。
供体和受体荧光物质可以是诸如Alexa和CF的亲水性荧光物质以及诸如Cy和量子点的疏水性荧光物质。然而，在供体和受体股足够靠近以彼此相互作用的情况下，优选为仅使用亲水性荧光物质或亲水性荧光物质和疏水性荧光物质的组合。彼此非常靠近的两种疏水性荧光物质之间的疏水性相互作用可能会使荧光信号不稳定(图1(d)中的Cy3-Cy5)。
在一个实施方案中，诸如环辛酸酯(COT)、硝基芐醇(NBA)或trolox的稳定剂可以附接到荧光物质或荧光物质附近，或者可以存在于缓冲液中以稳定荧光信号。
在一个实施方案中，可以在缓冲液中存在除氧剂(例如，葡萄糖+葡萄糖氧化酶+过氧化氢酶或PCA+PCD)，以防止荧光物质被氧光漂白。
需要使荧光信号的噪声最小化以提高目标物质的检测准确度。为了满足此需求，可以使用滤光片适当地去除供体的发射波长以使来自供体的荧光信号最小化。
在一个实施方案中，可以控制滤光片的波长，使得荧光信号的信噪比(SNR)为2或更大。例如，长通滤光片的截止波长、短通滤光片的截止波长或带通或带阻滤光片的起始波长可以长于或等于其中受体的发射光谱为0.01的波长，并且可以短于或等于其中供体的发射光谱为0.01的波长。
图7示出供体荧光物质(实线)和受体荧光物质(虚线)的发射光谱。λmin代表受体的发射光谱为0.01的波长处的波长，并且λmax代表供体的发射光谱为0.01处的波长。
可以使用预定波长以上的波长通过的长通二向色镜或二向色滤光片，通过其中高于预定波长通，预定波长以下的波长通过的短通二向色镜或二向色滤光片或是通过/反射预定波长带的带通二向色镜或二向色滤光片来检测供体信号。
对于比截止波长更长的波长通过的长通二向色滤光片(以下简称为“滤光片”)，当滤光片的截止波长短于λmin时，受体信号会通过光学滤光片保持相同，同时供体信号增加，导致低的信噪比。据此，截止波长优选地长于或等于λmin。同时，当截止波长长于或等于λmax时，通过二向色镜的供体信号保持相同，同时受体信号减小，导致低的信噪比。据此，截止波长优选地短于或等于λmax。
在此，信噪比可以如下定义。图8a示出用照相机拍摄的受体荧光信号。沿白色虚线截取一个横截面，以比较信号强度和噪声强度。横截面在图8b中示出。此图由高斯函数拟合。高斯函数的幅度定义为“信号”。没有受体荧光信号的其他像素的值绘制为具有正态分布的直方图。正态分布的半峰全宽(full width at half maximum,FWHM)定义为“噪声”。信号与噪声的比值定义为信噪比(signal-to-noise rati,SNR)。
另一方面，供体股和受体股的浓度增加导致噪声产生。由此，优选为减少噪声并准确地确定受体信号。可以考虑SNR来选择其中目标信号会被最好地检测的供体和受体股的浓度。
在一个实施方案中，当使用供体-受体荧光物质和滤光片的预定组合时，可将供体股的浓度调节至10nM或更高，使得将供体股结合到对接股所需的时间的平均为50-100秒，并且等于或小于10μM会使得信噪比为2或更大。
供体股结合到对接股是从受体产生信号的先决条件。将供体股结合到对接股所需的平均时间与对接股周围的供体股的浓度成反比，如等式4给定的：
(等式4)
将供体股结合到对接股所需的平均时间＝(500-1000s×nM)/[供体股浓度(nM)]
当浓度为1nM时，平均时间为500-1000秒，当浓度为10nM时，平均时间为50-100秒，当浓度为100nM时，平均时间为5-10秒。为了准确检测目标物质，供体股应结合到相应的对接股至少5次。供体股的浓度优选为10nM或更高，以在10分钟内完成整个测量，从经济效率的角度来看，这是优选的。
当供体股的浓度增加时，受体信号的强度保持相同，而噪声的强度增加，导致信噪比降低。当供体股的浓度为10μM以下，优选为5μM以下时，信噪比为2以上。不同于供体股，受体股的浓度为1μM以下就足够了，因为受体股结合到对接股后可以长时间保持。
另一方面，结合到对接股上的供体和受体股的保留时间可以取决于供体和受体股的长度来调节。稳定结合到对接股的受体股的长期保留允许在引入供体股后快速成像，从而有助于缩短检测时间。即使在低浓度下使用供体股，也可以在相同的成像时间内容易地检测出生物标志物。
在一个实施方案中，当股是DNA或RNA股时，与对接股互补的核苷酸的数量对于供体股优选为6至12，对于受体股优选为至少8。在以下的示例部分中，通常使用互补地结合到对接股的7-9nt长的供体股。然而，当缓冲液中的阳离子浓度高时，供体股的长度可能减少，并且当缓冲液中的阳离子浓度低时，供体股的长度可能增加。当与对接股互补的供体股的实际长度为7nt时，与对接股不互补的错配序列的掺入导致供体股的全长按需要增加。因此，优选为通过互补核苷酸的数量而不是全长来表达供体股。
在一个实施方案中，当股可以是PNA、LNA或GNA股而不是DNA或RNA股时，与对接股互补的核苷酸的数量对于供体股优选为3至9，对于受体股优选为至少5。由于XNA股对于对接股的结合亲和力高于DNA或RNA股的结合亲和力，因此XNA股与对接股的互补核苷酸数量可能减少。
对接股的长度优选高于供体股和受体股的预期互补地结合的最小水平。如上所述，错配序列或间隙(单股DNA片段)的掺入可以根据需要增加对接股的长度，这解释了对接股以其最小长度表达的原因。
受体股可以具有细长的形状，使得它们长时间保持结合到对接股或不与对接股解除结合。受体荧光物质也可以直接附接在对接股上。不同于仅由激发光激发以发射光的供体，受体仅在当供体股和受体股同时结合到对接股时才发射光，从而降低了光漂白的风险。
在供体股结合到对接股之前，受体股可能已经结合到对接股。在这种情况下，受体股可能相对较长，并且供体股可能在长度上较短，以增加了受体通过FRET发射光的可能性。
当将受体股保持结合到对接股的时间定义为“a”，并且将受体股结合到对接股要花费的时间定义为“b”时，受体股保持结合的概率通过“a/(a+b)”表示。a随受体股长度的增加和盐浓度的增加而增加，同时b随受体股浓度的增加而减小。概率为1表示，只要供体股结合到对接股，受体产生信号。概率为0.5表示，当供体股结合到对接股时，受体产生信号的概率为0.5。即，当结合到对接股的供体股的数量加倍时，可以获得相同的受体信号。总的来说，较高的概率(即较高的a或较低的b)导致检测时间更短。
在现有细胞成像方法中存在受体光漂白的风险，但是在生物标志物检测中光漂白的可能性很小。在一个优选的实施方案中，受体股的长度增加，或者受体荧光物质直接标记在对接股上以增加a。当受体股的浓度增加时，b可能降低，这在信噪比方面是不希望的。
DNA股带负电荷，倾向于互相排斥。由此，优选为将正电荷引入缓冲液以中和带负电荷的DNA股。当DNA股彼此互补地结合时，每个碱基形成两个或三个氢键(吸引力)。据此，序列越长，结合越稳定。当Na+的浓度为500mM且受体股的长度为10nt时，结合平均保持40秒。较长的受体股保持较长时间的结合。
例如，由于PNA股不带负电荷，不同于DNA股，PNA-PNA结合和PNA-DNA结合比DNA-DNA结合稳定得多。据此，PNA或LNA股可以用于作为受体股，并且DNA股可以用于作为对接股和供体股。
另一方面，在检测期间样品中目标物质的浓度过高可能导致信号重叠，使得难以准确地定量目标物质。
大多数目标物质的血浓度是已知的，但可能会取决于受试者的状态而有显着改变。取决于目标物质的类型，浓度可能从10-15g/ml到10-3g/ml不等，差1012倍。
由此，需要稀释样品，使得例如通过以下程序在检测图像中显示适当数量的目标物质。首先，准备具有孔1、孔2、孔3、…的孔板或Lab-Tek。将针对预期浓度为低的目标物质的捕获抗体和检测抗体铺在孔1和孔2中。将针对预期浓度为高的目标物质的捕获抗体和检测抗体铺在孔2和孔3中。
将血液稀释至标准浓度并置于孔1中。将标准稀释液进一步稀释并置于孔2中。将所得溶液进一步稀释并置于孔3中。将目标物质固定到基板上。在孔1中检测到预期浓度为低的目标物质。继续进行测量，直到观察到适当数量的目标物质为止。如果目标物质的数量太少而无法测量，则将孔1划分为数个区域，并合并划分区域中的目标物质的数量。同时，如果目标物质的数量太大而无法分析，则尝试在孔2中检测目标物质。
在孔2中检测到预期浓度为高的目标物质。继续进行测量，直到观察到适当数量的目标物质为止。如果目标物质的数量太少而无法测量，则将孔2划分为数个区域，并合并划分区域中的目标物质的数量。同时，如果目标物质的数量太大而无法分析，则尝试在孔3中检测目标物质。当发现目标物质的数量过大时，分子间重叠会成为问题。可以通过降低供体股的浓度，降低缓冲液中盐的浓度或掺入具有较大错配数或较短长度的替代供体股来解决此问题，这表示与对接股的互补键数量小于原始的供体股。
如上所述，根据本发明的方法和试剂盒的使用，使得能够从非常小量的生物流体中，以常规方法和试剂盒的1000倍的灵敏度，检测各种生物标志物。因此，本公开的方法和试剂盒可用于包括癌症的多种疾病的早期诊断。
除了上述用于观察受体荧光信号的方法之外，本公开提供一种通过使用取决于目标物质的类型而引入了各种FRET对的股，测量FRET效率用以多重检测多种目标物质的方法。
本公开的另一方面提供一种试剂盒，所述试剂盒用于使用与标记有荧光物质的标签股接合的检测探针来检测目标物质。所述试剂盒包括一种或更多种特异性结合到目标物质并与标签股接合的检测探针。标签股包括一种或更多种类型的供体荧光物质和一种或更多种类型的受体荧光物质。当供体荧光物质被激发时，在供体荧光物质和受体荧光物质之间的FRET发射光。
在一个实施方案中，标签股可以具有两个或更多个FRET对。
在一个实施方案中，所述试剂盒可以包括基板、以荧光物质标记的两种或更多种类型的标签股以及与标签股接合的两种或更多种类型的检测抗体，并且通过荧光物质使用FRET效率同时识别两种或更多种类型的生物标志物。荧光物质可以在特定碱基、3'-或5'-末端或骨架上用作供体或受体。可以使用取决于供体和标记在标签股上的受体之间的距离所测量的不同的FRET效率，同时检测两种或更多种生物标志物。
检测抗体是用于通过抗原-抗体反应检测生物标志物的检测探针。检测抗体的种类数量优选为与目标生物标志物的种类数量相同。为了在检测时测量FRET效率，优选为使用与标记有荧光物质的标签股接合的检测抗体。在本公开的一个实施方案中，标签股通常是DNA股，但不必限于此。优选地，标签股是核酸或其类似物或生物聚合物。核酸可以选自由DNA、RNA、PNA、LNA、MNA、GNA和TNA组成的组。生物聚合物可以选自由多肽和碳水化合物组成的组。
如本文所使用的，术语“FRET效率”是指从被光激发的荧光物质转移到另一相邻的荧光物质的能量的值。FRET效率取决于荧光物质之间的距离而改变。具体地，FRET效率由等式5计算：
(等式5)
FRET效率＝(来自受体的光的强度)/(来自供体的光的强度与来自受体的光的强度的总和)
来自供体或受体的光的强度可能受供体-受体距离的影响，但是可以通过在特定碱基、3'-或5'-末端或骨架上标记供体或受体以及改变供体-受体的距离来控制FRET效率。
在此，可以通过校正来自被用于激发供体的光所激发的受体的光的波长差异所产生的图像传感器的检测效率的差异、没有被光学组件(例如，二向色镜)完全分离的来自供体和受体的一部分光或从供体和受体发射的光，从而获得FRET效率。
可以通过以下程序使用FRET效率检测目标物质。当供体与受体之间存在一个碱基时，供体与受体之间的间隙定义为“1”。构建了两种或更多种类型的标签股，其中供体和受体之间被1、2、3，…n个间隙彼此隔开。测量针对不同间隙的FRET效率以构建数据库。相同类型的标签股接合到相同类型的检测抗体，并且不同类型的标签股接合到不同类型的检测抗体。此后，当使与含有生物标志物的样品的反应进行时，生物标志物与特异性检测抗体结合。此时，测量来自供体和受体的光的强度以计算FRET效率。通过将计算出的FRET效率与数据库中储存的值进行比较，可以确定检测抗体的类型，并最终识别出生物标志物的类型。
例如，基于前面的描述，假设可以区分FRET效率的间隙是4到20的整数，则可以使用一种类型的供体和一种类型的受体构建17种类型的标签股。如果存在两个供体-受体对，则可以在相同条件下构建289种类型的标签股。如果存在三个供体-受体对，则可以在相同条件下构建4,913种类型的标签股。因此，可以最小化检测各种类型的生物标志物所需的荧光物质的类型数量。
在一个实施方案中，标签股可以用两种或更多种不同的荧光物质标记。图9示意性地示出根据本公开的一个实施方案的用于同时检测多种生物标志物的试剂盒。如图9所示，将生物标志物固定到基板上，将与标签股接合的检测抗体(检测抗体标签)结合到生物标志物。图9所示的试剂盒包括特异性地结合到N种生物标志物的N种检测抗体和接合到检测抗体的N种标签股。
这种构建的原因是，当从与结合到不同生物标志物的不同检测抗体接合的不同标签股中测量到相同的FRET效率时，不能识别检测到的生物标志物的类型。由此，优选地，使用与目标生物标志物的数量同样多的不同的标签股来获得可区分的FRET效率。
具体地，标记在两种或更多种类型的标签股上的供体和受体之间可以存在不同数量的碱基。更具体地，取决于标记在标签股上的供体和受体的位置，可以获得不同的FRET效率。标签股可以用多个供体或受体标记。在这种情况下，两种或更多种供体可以是不同于受体的荧光物质，并且可以是不同类型。可替代地，两种或更多种受体可以是不同于供体的荧光物质，并且可以是不同类型。例如，标签股可以用一种受体和多种供体标记，如图10所示。在此，供体优选是不同于受体的荧光物质，并且优选是不同类型。例如，基于前面的描述，假设可以区分FRET效率的间隙是4到20的整数，则理论上可以以一种FRET效率构建17种类型的标签股。即，理论上可以用供体1-供体2、供体2-供体3、供体3-供体4和供体4-受体之间总共4个FRET效率，构建以四种供体和一种受体标记的标签股的83,521(17×17×17×17)种类型。
图11示出用于从图10所示的标记在标签股上的荧光物质测量FRET效率的过程，并且示意性地示出使用单分子显微镜对荧光物质进行成像的原理。
首先，将以荧光物质标记的标签股固定到基板上。然后，以图11所示的单分子荧光显微镜观察每种荧光物质的亮度。基于光的衍射，不能区分在约300nm内彼此的位置非常靠近时的分子，并且可以观察到一个点的形式。由此，标记在一个标签股上并以300nm以下的距离排列的荧光物质以一个点的形式显现。相反，由于不同的荧光物质发射不同波长的光束，因此可以使用经由/透过其来反射/透射的特定波长带中的光的光学组件(例如，二向色镜)，取决于它们的波长来分离所发射的光束，以测量来自特定荧光物质的光的亮度。
图11的左图像示意性地示出以照相机在一个图像中输出来自作为四种荧光物质的Cy2、Cy3、Cy5和Cy7的光的过程。图11的右图像示意性地示出取决于荧光物质的类型以不同照相机的成像过程。上述过程可以用于计算供体和受体之间的FRET效率，但是也可以使用其他过程而没有特别限制。具体地，就分析时间而言，优选为分别通过供体照相机和受体照相机对来自供体和受体的光的强度进行成像的过程。
图12示出使用以作为供体的Cy3和Cy5和作为受体的Cy7标记的标签股通过上述方法的成像结果。参照图12，当通过如图11的左图像中所示的方法测量亮度值时，在一个监视器上从最左侧到最右侧以Cy3、Cy5和Cy7的顺序显示成像结果。当红色激光束照射到标签股上时，首先激发Cy5，然后通过FRET将能量转移到Cy7，然后从Cy7发射光。结果为，在Cy3区域中未观察到任何亮点，仅在Cy5和Cy7区域中观察到了亮点。在此，从光的亮度比测量Cy5和Cy7之间的FRET效率，以确定它们之间的距离。另外，在以绿色激光照射期间，Cy3被激发并且能量通过FRET被转移到Cy5和Cy7，并且光从Cy3、Cy5和Cy7发射。在这种情况下，基于Cy5与Cy7之间的所测得的FRET效率确定Cy3与Cy5之间的距离。
在一个实施方案中，每个标签股可以用两个供体-受体FRET对标记，如图13和14所示。
在此实施方案中，FRET对优选地彼此间隔开一定距离，以最小化每个FRET对在相邻FRET对的FRET效率上的影响。具体地，标记的FRET对更优选为彼此间隔至少5nm。
每个标签股可以包括两个或更多个供体-受体FRET对，其中供体和受体彼此通过不同的间隙间隔开。所述间隙优选为不同的，使得当考虑到在测量期间可能引起的误差范围和噪声时，所测量的FRET效率可充分区分。
作为另一示例，在两个或更多个FRET对中使用相同类型的供体。在这种情况下，可以标记相同或不同类型的受体，但是受体的类型优选为与供体的类型不同。
作为另一示例，在两个或更多个FRET对中使用相同类型的受体。在这种情况下，可以标记相同或不同类型的供体，但是供体的类型优选为与受体的类型不同。
具体地，当每个标签股都以两个FRET对标记时，FRET对的供体和受体可以在下列四种组合中使用：
i)供体可以是相同的荧光物质，受体可以是相同的荧光物质；
ii)供体可以是不同的荧光物质，受体可以是相同的荧光物质；
iii)供体可以是相同的荧光物质，受体可以是不同的荧光物质；和
iv)供体可以是不同的荧光物质，受体可以是不同的荧光物质。
组合i)在图13例示。参照图13，供体1和供体2以荧光物质A标记，受体1和受体2以荧光物质B标记。如果以相同的荧光物质标记的两个供体和以相同的荧光物质标记的两个受体彼此相邻，它们影响供体-受体FRET对的FRET效率。据此，当一个标签股用相同的两个或更多个供体和相同的两个或更多个受体标记时，如图13所示，FRET对优选为彼此间隔至少5nm。
组合ii)至iv)分别在图14a至14c例示。
图14a示出组合ii)。如图14a所示，供体1以荧光物质A标记，供体2以荧光物质B标记，受体1和受体2以相同的荧光物质C标记。即，标记在一条标签股上的两个FRET对以相同类型的受体标记。
图14b示出组合iii)。如图14b所示，供体1和供体2以相同的荧光物质A标记，受体1以荧光物质B标记，受体2以荧光物质C标记。图14c示出组合iv)。如图14c所示，供体1以荧光物质A标记，供体2以荧光物质B标记，受体1以荧光物质C标记，受体2以荧光物质D标记，一条标签股以不同类型的荧光物质标记。
如图所示。如图14a至图14c所示，第一供体1-受体1FRET对和第二供体2-受体2FRET对彼此间隔开。这是为了使相邻的FRET对彼此之间的影响最小化，如图13所示。第一和第二FRET对中的供体和受体之间的间隙可以彼此相同或不同。在第一和第二FRET对中使用相同类型的供体和相同类型的受体的情况下，i)以其FRET效率为a和b的第一和第二FRET对标记的标签股不能与ii)以其FRET效率为a和b的第一和第二FRET对标记的标签股区分。由此，只能使用标签股i)和ii)中的一个。
在一个实施方案中，每个标签股可以包括两个或更多个FRET对。标签股的结构可以与上述相同。即，标签股可以与图13所示的相似，或者可以具有与图14a、14b或14c所示的相同的结构。
为了测量FRET效率使用试剂盒，首先要激发供体。在激发之后的预定时间，荧光物质不再发光，这被称为“光漂白”。一旦光漂白，光的强度就会改变。同样在这种情况下，测量并比较光漂白之前和之后的光的强度，以确定每个供体-受体对的FRET效率。
通过比较光漂白之前和之后的光的亮度值来测量FRET效率是基于以下基本原理。当光漂白时，供体不再发射光或不将能量传递给受体。受体不能从供体接收能量，导致来自供体和受体的光的强度降低。相反，当受体被光漂白时，供体不将能量转移到受体，而是将所有能量用于发光，导致来自供体的光的亮度增加，并且来自受体的光的亮度降低。将参考示例2-3更详细地描述此原理。
在一个实施方案中，所述试剂盒可以进一步包括捕获抗体。
图16示意性地示出根据本公开的一个实施方案的包括捕获抗体的试剂盒。捕获抗体可以预先附接到基板或可以在检测期间附接到基板。捕获抗体可以与标签股接合。
接合到捕获抗体的标签股(以下称为“捕获抗体标签”)可以具有与接合到检测抗体的标签股(以下称为“检测抗体标签”)相同或相似的骨架。具体地，标签股可以是诸如DNA、RNA、PNA、LNA、MNA、GNA或TNA股的核酸或它们的类似物或诸如多肽或碳水化合物的生物聚合物。标签股可以具有图17所示的结构，但不特别限于此。
在一个实施方案中，所述试剂盒可进一步包括桥股。
桥股优选为具有与检测抗体标签和捕获抗体标签相同或相似的骨架。更优选地，桥股是具有特定序列的单股核酸。在一个实施方案中，桥股可以互补地结合到检测抗体标签和捕获抗体标签。
当桥股是单股核酸时，桥股的一些序列与捕获抗体标签的一些序列互补，并且桥股的其他序列与检测抗体标签的一些序列互补。即，部分桥股互补地结合检测抗体标签和捕获抗体标签以形成两个不同的双股核酸。此结构在图18中示出。
仅当检测抗体标签互补地结合到桥股时，才形成了区分生物标志物所必需的一些FRET对。其他FRET对仅在捕获抗体标签互补地结合到桥股时形成。在生物标志物检测过程中对所有FRET对的观察表示，桥股互补地结合到检测抗体标签和捕获抗体标签上。这也表示生物标志物与捕获抗体和检测抗体结合。相反，仅观察到多个FRET对中的一些，表示检测抗体与基板的非特异性结合，而非与生物标志物结合。此非特异性结合会产生伪阳性信号，并导致测量错误。即，使用互补地结合到检测抗体标签和捕获抗体标签的桥股能够去除伪阳性信号，从而达到提高分析准确性的结果。
在一个实施方案中，可以在每个桥股的特定碱基、3'-或5'-末端或骨架上标记供体或受体。优选地，通过在桥股的特定碱基上标记用作供体或受体的荧光物质来测量FRET效率。
FRET效率可以在捕获抗体标签、检测抗体标签和桥股结合并且如下以供体或受体标记后进行测量。
1)检测抗体标签互补地结合到桥股，形成一个或更多个FRET对。
a)仅供体标记在检测抗体标签上，并且受体标记在桥股上。
b)仅受体标记在检测抗体标签上，并且供体标记在桥股上。
c)供体或受体或两者标记在检测抗体标签上，并且供体或受体或两者标记在桥股上。
2)捕获抗体标签互补地结合到桥股，形成一个或更多个FRET对。
a)仅供体标记在捕获抗体标签上，并且受体标记在桥股上。
b)仅受体标记在捕获抗体标签上，并且供体标记在桥股上。
c)供体或受体或两者标记在捕获抗体标签上，并且供体或受体或两者标记在桥股上。
上述原理也可以应用于1)和2)。对于以相同类型供体和相同类型受体标记的FRET对，i)其FRET效率为a和b的第一和第二FRET对不能与ii)其FRET效率为b和a的第一和第二FRET对区分。由此，优选为构建捕获抗体标签、检测抗体标签和桥股，使得仅可以使用i)和ii)中的其中一个。优选地，将供体和受体以一定间隔标记在捕获抗体标签、检测抗体标签和桥股上，使得所测量的FRET效率可区分。
对于1)和2)，供体和受体优选为以不同的荧光物质标记。当使用多个供体或多个受体时，相同或不同类型的供体可以标记在捕获抗体标签、检测抗体标签或桥股上，相同或不同类型的受体可以标记在捕获抗体标签、检测抗体标签或桥股上。
例如，当使用试剂盒检测生物标志物1时，使用捕获抗体1、检测抗体1和桥股1，并且捕获抗体标签1和检测抗体标签1结合到桥股1。在这种情况下，当供体1标记在捕获抗体标签1的一个碱基上，受体1标记在与捕获抗体标签1结合的桥股1的位点的一个碱基上，从而获得所需的FRET效率。同时，可以用作为不同的荧光物质的供体1和受体1或供体2和受体2标记检测抗体标签1和与检测抗体标签1结合的桥股1的位点，从而获得所需的FRET效率。可替代地，可以标记供体1和受体2或供体2和受体1。在此，供体1和受体1应为不同的荧光物质，并且供体2和受体2也应为不同的荧光物质。
本公开的另一方面提供一种使用与以荧光物质标记的标签股接合的检测探针检测目标物质的方法。所述方法包括：a)将含有目标物质的样品引到基板上，b)使与标签股接合的检测探针特异性地结合到目标物质，c)以一种或更多种类型的供体荧光物质和一种或更多种类型的受体荧光物质标记标签股，以及d)测量由供体荧光物质和受体荧光物质之间的FRET产生的荧光信号来识别目标物质。
在一个实施方案中，标签股可具有两个FRET对。
可以通过确定FRET效率来测量FRET产生的荧光信号。可以通过测量供体或受体的光漂白之前和之后的光的亮度值来确定FRET效率。
控制FRET对之间的间隙，以不影响FRET对的FRET效率。FRET对之间的间隙优选为至少5nm。
在一个实施方案中，提供一种用于同时检测多种生物标志物的方法。所述方法包括将两种或更多种类型的生物标志物附接到基板，使与以荧光物质标记的标签股(检测抗体标签)接合的两种或更多种类型的检测抗体结合到两种或更多种类型的生物标志物，并且测量通过所述结合产生的荧光信号，以确定FRET效率。根据此方法，荧光物质的FRET效率可以用于同时识别生物标志物的类型并且由每单位面积的生物标志物的数量确定样品中生物标志物的浓度。
荧光物质可以在标签股的特定碱基、3'-或5'-末端或骨架上用作供体或受体。优选地，用作供体或受体的荧光物质标记在标签股的特定碱基上以测量FRET效率。
可以通过以下程序使用同时检测多种生物标志物的试剂盒来执行所述方法。
在执行所述方法之前，可以构建用于FRET效率的数据库。数据库架构如下。例如，预先测量可区分的FRET效率参考值以构建数据库，并将其与在反应后测量的FRET效率进行比较以识别生物标志物的类型。
可以通过以下程序构建FRET效率的数据库。
首先，将不同的荧光物质A和B分别用来作为供体和受体，并标记在DNA骨架的特定碱基上，以与所需种类数量同样多的数量的不同的DNA股。例如，当数据库需要50种类型时，制备以在不同距离处的A和B标记的50种类型的DNA股。将一种材料施加到基板上，并且将对所施加的材料具有结合亲和力的材料附接并固定在每条DNA股的一端。可替代地，可以使用以作为供体和受体的荧光物质标记的商购DNA股，而无需直接构建DNA股。在确定作为供体和受体的荧光物质时，优选为供体荧光物质的峰值发射波长短于受体荧光物质的峰值发射波长。
制备两种或更多种类型的DNA股后，将以在距离1处的A和B标记的DNA股固定到基板上，并测量FRET效率。然后，对标记的DNA股重复相同的程序，从以在距离2处的A和B标记的DNA股开始，获取FRET效率的参考值，并将其构建到数据库中。
此后，将在生物标志物检测期间所测量的FRET效率与FRET效率的参考值进行比较。由此比较，可以确定用于检测的标签股的供体和受体之间的距离，结果为，可以直接识别检测到的生物标志物的类型。
然而，噪声可能会导致FRET效率测量中的误差。由于这种可能性，在不同距离处的所有FRET效率都无法区分。例如，当在距离1处的FRET效率为0.95(平均值)±0.05(偏差)，并且在距离2处的FRET效率为0.94±0.05时，距离1和2不能通过FRET效率来区分。由此，优选为仅使用从储存在数据库中的值中清楚地区分FRET效率的距离，用以进行实际的生物标志物检测。
获得FRET效率的参考值后，将含有目标生物标志物的样品引到基板上，并将生物标志物附接到基板上。
在一个实施方案中，所述方法可以进一步包括将捕获抗体附接到基板上。捕获抗体可以与标签股(捕获抗体标签)接合。
例如，可以通过以0.06M碳酸盐或pH 9.5的碳酸氢盐缓冲溶液稀释捕获抗体并使稀释液在预定温度下与基板接触预定时间来将捕获抗体吸附到基板上。可替代地，捕获抗体可以通过以生物素化的聚乙二醇(PEG)或牛血清白蛋白(BSA)涂覆基板表面，将涂覆的基板与链霉亲和素结合，并且将与链霉亲和素结合的基板与生物素化的捕获抗体结合，从而吸附到基板。然后，以原始或处理过的样品处理基板。吸附到基板的捕获抗体与样品中的生物标志物形成复合物。另外，优选为以诸如Tween 20或TritonX-100的清洁缓冲液清洗复合物以去除非特异性结合的抗体或污染物。
在一个实施方案中，所述方法可以进一步包括使捕获抗体标签结合到桥股，并且使检测抗体标签结合到桥股。
桥股可以包括与标签股和捕获抗体标签的序列互补的序列。桥股是单股核酸。在这种情况下，桥股的一些序列与标签股的序列互补，并且桥股的其他序列与捕获抗体标签的序列互补。互补地结合不特别限于这些范围。
与检测抗体标签有关的所有描述都可以应用于捕获抗体标签，并且可以等同或类似地应用于包括捕获抗体的试剂盒和检测方法。
所述方法和试剂盒的使用能够使用FRET效率同时检测两种或更多种生物标志物，并从小量样品中在低浓度下识别生物标志物。具体地，本公开的方法可有效地同时检测最大量约1000种生物标志物，包括在1fg/ml的水平以极小量存在的生物标志物，并且需要非常短的时间用以进行检测和分析。
将参考以下的示例部分给出关于使用本公开的方法检测两种或更多种类型的生物标志物的更详细描述。
本公开的另一方面提供一种基于荧光物质的FRET效率同时检测和识别N种生物标志物的试剂盒和方法。
所述试剂盒可包括以形成FRET对的两种或更多种类型的受体荧光物质标记的供体股和受体股。用作供体和受体的两种受体荧光物质和受体股由此被称为“FRET股”。
具体地，所述试剂盒和检测方法使用标记在对接股或FRET股上的两种或更多种荧光物质的FRET效率和标记在供体股上的供体来同时检测N种生物标志物。
所述试剂盒包括基板、接合到N种类型的检测抗体的n种类型的对接股，以及互补地结合到N种类型的对接股的供体股。对接股或供体股包括荧光物质。测量荧光物质的FRET效率，以同时识别N种类型的生物标志物。
在一个实施方案中，所述试剂盒可进一步包括以荧光物质标记的FRET股。FRET股可以互补地结合到N种类型的对接股。
荧光物质可以在对接股、供体股或FRET股的特定碱基、3'-或5'-末端或骨架上用作供体或受体。
在一个实施方案中，所述试剂盒可以进一步包括捕获抗体。
本公开的一个实施方案提供一种用于同时检测多种生物标志物的方法，包括将N种类型的生物标志物附接到基板，使与N种类型的对接股接合的N种类型的检测抗体结合N种类型的生物标志物，使供体股结合到N种类型的对接股，并测量标记在对接股或供体股上的荧光物质的FRET效率。使用FRET效率识别出N种类型的生物标志物后，可由每单位面积的生物标志物的数量测量生物标志物的浓度。
在一个实施方案中，所述方法可以进一步包括使以荧光物质标记的FRET股结合到N种类型的对接股。FRET股可以与N种类型的对接股互补。
在一个实施方案中，所述方法可以进一步包括将捕获抗体附接到基板。
例如，可以通过以下程序使用FRET效率检测目标物质。当供体和受体之间存在一个碱基时，供体与受体之间的间隙定义为“1”。形成两个或更多个FRET对，其中供体和受体彼此被1、2、3、…n的间隙分开。测量不同间隙的FRET效率以构建数据库。相同类型的对接股接合到相同类型的检测抗体，并且不同类型的对接股接合到不同类型的检测抗体。N种类型的FRET对也可以直接标记在对接股上。此后，当使与含有生物标志物的样品的反应进行时，特异性生物标志物结合到特异性检测抗体。此时，测量来自供体和受体的光的强度以计算FRET效率。例如，当以用作供体1的荧光物质标记的供体股结合到对接股时，可以测量由吸收来自激发的供体1的光的供体2和受体组成的FRET对的FRET效率。
另外，FRET对标记在FRET股上，但不标记在对接股上。在这种情况下。可以在当供体股和FRET股结合到对接股时测量FRET效率。通过将所测量的值与储存在数据库中的值进行比较，可以确定用于检测的检测抗体的类型，并最终识别出生物标志物的类型。
图19至21示意性地示出根据本公开的各种实施方案的用于同时检测多种生物标志物的试剂盒。
首先，如图19中所例示的，所述试剂盒具有包括检测抗体、接合到检测抗体的N种类型的对接股以及互补地结合到对接股的供体股的结构。作为荧光物质的供体1标记在供体股上，并且由供体2和受体荧光物质组成的FRET对标记在对接股上。可以在供体股结合到对接股时测量FRET效率。
在一个实施方案中，所述试剂盒可以进一步包括FRET股。在此实施方案中，以保持未光漂白的荧光物质标记的供体和FRET股重复地结合到对接股并与对接股解除结合，并且可以在重复结合和解除结合期间测量FRET效率。
如图20中所例示的，所述试剂盒具有包括检测抗体、接合到检测抗体的N种类型的对接股、互补地结合到对接股的供体股以及互补地结合到对接股中的特定一种的FRET股的结构。作为荧光物质的供体1标记在供体股上，并且由供体2和受体荧光物质组成的FRET对标记在FRET股上。可以在供体股和FRET股两者都结合到对接股时测量FRET效率。
如图21中所例示的，所述试剂盒具有包括检测抗体、接合到检测抗体的N种类型的对接股、互补地结合到对接股的供体股以及互补地结合到对接股中的特定一种的FRET股的结构。作为荧光物质的供体1标记在供体股上，并且由供体2、供体3和受体荧光物质组成的FRET对标记在FRET股上。以两种或更多种荧光物质标记FRET股能够使用最小可能数量类型的荧光物质检测多种生物标志物。
图22示意性地示出根据本公开的一个实施方案的用于同时检测N种类型的生物标志物的试剂盒。
如图22所示，所述试剂盒具有包括检测抗体、接合到检测抗体的N种类型的对接股以及互补地结合到对接股的供体股的结构。作为荧光物质的供体1标记在供体股上，并且由供体2和受体荧光物质组成的FRET对标记在对接股上。为了使供体2和标记在接合到检测抗体1的对接股上的受体的FRET效率低，它们在位置上彼此远离。为了使供体2和标记在接合到检测抗体1的对接股上的受体的FRET效率高，它们在位置上彼此靠近。
此构建的原因是，从接合到与N种类型的生物标志物结合的N种类型的检测抗体的对接股所测量的相同FRET效率，使得无法指定所检测生物标志物的类型。
所以，为了获得可区别的FRET效率，优选使用N种不同类型的对接股和N种不同类型的FRET对，其对应于目标生物标志物的数量。结合到N种类型的对接股的供体股优选是相同类型。
具体地，当两种或更多种类型的荧光物质直接标记在对接股上时，两种或更多种类型的标记的荧光物质之间可以存在不同数量的碱基。更具体地，可以用具有不同的FRET效率的FRET对来标记N种类型的对接股。当两种或更多种类型的荧光物质标记在FRET股上时，两种或更多种类型的标记的荧光物质之间可以存在不同数量的碱基。更具体地，可以用具有不同的FRET效率的FRET对来标记N种类型的FRET股。在此，标记在对接股或FRET股上的两种或更多种类型的荧光物质可以用作供体或受体。
图23示意性地示出根据本公开的又一实施方案的用于同时检测N种类型的生物标志物的试剂盒。如图23中所例示的，所述试剂盒具有包括检测抗体、接合到检测抗体的N种类型的对接股、互补地结合到对接股的供体股以及互补地结合到对接股中的特定一种的FRET股的结构。作为荧光物质的供体1标记在供体股上。为了使供体2和标记在FRET股1上、互补地结合到对接股上的受体的FRET效率低，它们在位置上彼此远离。为了使供体2和标记在FRET股N上、互补地结合到与检测抗体接合的对接股上的受体的FRET效率高，它们在位置上彼此靠近。所述结构和原理与图22所示的相同，除了FRET对标记在FRET股上而不是对接股上。
图24示意性地示出根据本公开的又一实施方案的用于同时检测多种生物标志物的试剂盒。如图24中所例示的，所述试剂盒具有包括检测抗体、接合到检测抗体的N种类型的对接股、互补地结合到对接股的供体股以及互补地结合到对接股中的特定一种的FRET股的结构。作为荧光物质的供体1标记在供体股上。如图24所示，两个FRET股1-1和1-2结合到一个对接股。作为荧光物质的供体1标记在供体股上，并且由供体2和受体组成的FRET对标记在互补地结合到与检测抗体接合的对接股的FRET股1-1和1-2的每个上。优选为对FRET对进行标记，以具有不同的FRET效率。
具有相同FRET效率的FRET股可以具有相同的序列。据此，一种类型的FRET股可以互补地结合到许多类型的对接股。例如，在将三种类型的FRET股设计为具有0.25、0.5和0.75的FRET效率的情况下，将生物标志物1设计为具有0.25和0.5的FRET效率，将生物标志物2设计为具有0.25和0.75的FRET效率，并且将生物标志物3设计为具有0.5和0.75的FRET效率，具有0.25的FRET效率的FRET股互补地结合到与生物标志物1和生物标志物2接合的对接股，具有0.5的FRET效率的FRET股互补地结合到与生物标志物1和生物标志物3接合的对接股，并且具有0.75的FRET效率的FRET股互补地结合到与生物标志物2和生物标志物3接合的对接股。在此，互补地结合到N种类型的对接股的FRET股的类型数量不得大于N。
图25示意性地示出根据本公开的另一实施方案的用于同时检测多种生物标志物的试剂盒。如图25中所例示的，所述试剂盒具有包括检测抗体、接合到检测抗体的N种类型的对接股、互补地结合到对接股的供体股以及互补地结合到对接股中的特定一种的FRET股的结构。作为荧光物质的供体1标记在供体股上，并且由供体2和受体组成的FRET对标记在互补地结合到与检测抗体接合的对接股的FRET股1上。在此，每个对接股被构建为具有两种或更多种供体股和FRET股互补地结合的结合位点。此结构能够具有比图23的结构至少快2倍的分析，因为当供体股和FRET股同时结合到至少一个结合位点时，可以测量FRET效率。
即使当FRET对标记在对接股上而不是在FRET股上时，也可以获得相同的效果。
可以用多个供体或受体标记对接股或FRET股。在此，两种或更多种供体可以是与受体不同类型的荧光物质，并且可以是不同类型的荧光物质。可替代地，两种或更多种受体可以是与供体不同类型的荧光物质，并且可以是不同类型的荧光物质。
例如，可以将多种对接股附接到一种检测抗体。对接股为相同类型。相同类型的供体股和相同类型的FRET股结合到每种对接股。此结构在图26中示意性地示出。
图26示出一种试剂盒，其包括检测抗体、接合到检测抗体的N种类型的对接股、互补地结合到对接股的供体股以及互补地结合到对接股中的特定一种的FRET股。具体地，两种或更多种对接股可以接合到一种检测抗体。作为荧光物质的供体1标记在供体股上，并且由供体2和受体组成的FRET对标记在互补地结合到与检测抗体1接合的对接股的FRET股1上。此结构能够具有比图23的结构至少快2倍的分析，因为当供体股和FRET股同时结合到两种或更多种对接股中的一种时，可以测量FRET效率。即，当示出于图26时的试剂盒所获得的效果与当示出于图25时的试剂盒时所获得的效果相似。即使当FRET对标记在对接股上而不是在FRET股上时，也可以获得相同的效果。
作为又一的示例，图25所示的结构可以与图26所示的结构组合以提供用于同时检测多种生物标志物的试剂盒。
图27示出根据本公开的另一实施方案的用于同时检测多种生物标志物的试剂盒。所述试剂盒适合检测microRNA。所述试剂盒检测诸如DNA和RNA的核酸，包括microRNA。在将对涂覆在基板上的材料具有结合亲和力的材料附接到每个目标核酸的一端，或是与每个目标核酸的一部分互补的核酸预先涂覆在基板上之后，将N种类型的目标核酸固定到基板上。由于已知N种类型的目标核酸的序列，因此可以使用N种类型的供体股和与目标核酸互补的FRET股识别核酸。
图28示出根据本公开的一个实施方案的供体1(Alexa Fluor 488)、供体2(Cy5)和受体(Cy7)的吸收和发射光谱。图28的(a)示出荧光物质的吸收光谱。例如，图28的(a)中的黑色垂直虚线表示用于激发供体1的波长(488nm)。在此，供体1被激发，但是供体2和受体未被激发。在这种情况下，由于供体2和受体仅当通过FRET从供体1接收能量时才可以发射光，因此仅当以供体1标记的供体股结合到对接股时，才可以测量FRET对的FRET效率。当使用FRET股时，仅当供体股和FRET股同时结合到对接股时，才可以测量FRET对的FRET效率。
图28的(b)示出荧光物质的发射光谱。例如，来自供体2的光的亮度通过使用二向色镜将在左右黑色垂直虚线之间限定的波长带中的光的强度进行组合来测量，并且来自受体的光的亮度通过组合比右虚线较长的波长带中的光的强度来测量。FRET对的FRET效率可以由来自供体2的光的亮度和来自受体的光的亮度来计算。在此，优选为在使供体1和供体2之间的FRET效率达到1并且通过光学滤光片去除来自供体1的信号之后，仅测量来自供体2和受体的光的强度。
另外，可以通过改变标记在供体股上的供体1和标记在FRET股上的供体2之间的距离来控制供体1和供体2之间的FRET效率，并且可以通过测量来自供体1和供体2的光的强度来计算FRET效率。以这种方式，可以检测多种生物标志物。
图29示意性地示出根据本公开的一个实施方案的同时检测多种生物标志物的原理。
将N种类型的生物标志物附接到放置基板的孔上，使与N种类型的对接股接合的N种类型的检测抗体结合到N种类型的生物标志物，并且在孔中填充含有供体股的缓冲液。供体股互补地结合到孔中的对接股。测量来自FRET对的光的强度，以确定FRET效率并识别多种生物标志物。可以通过使用二向色镜测量不同波长的光的强度或使用棱镜或光栅测量荧光物质的相对光谱强度来计算FRET效率。
图29示出使用二向色镜测量来自供体2和受体的光的强度的过程。
在图29的(a)中，两种类型的生物标志物1和2被固定在基板上。与对接股1接合的检测抗体1结合到生物标志物1，并且与对接股2接合的检测抗体2结合到生物标志物2。图29的(b)示出供体股结合到对接股2的状态，结果为，FRET对发射光。测量来自供体2和受体的光的亮度值，以计算生物标志物2的FRET效率。图29的(c)示出供体股与对接股2解除结合的状态，结果为，FRET对不发射光。图29的(d)示出供体股结合到对接股1的状态，结果为，FRET对发射光。测量来自供体2和受体的光的亮度值，以计算生物标志物1的FRET效率。图29的(e)示出供体股与对接股1解除结合的状态，结果为，FRET对不发射光。图29的(f)示出供体股再次结合到对接股1的状态，结果为，FRET对发射光。同样在这种情况下，测量来自供体2和受体的光的亮度值以计算生物标志物1的FRET效率。继续进行所述程序，直到对观察区域中所有生物标志物的每个FRET效率进行一次或多次测量。此后，使用FRET效率识别生物标志物的类型，并从每单位面积的生物标志物的数量确定生物标志物的浓度。
供体股结合到对接股和与其解除结合所花费的时间可以通过改变供体股的类型(DNA、RNA、PNA等)、供体股结合到对接股的长度以及缓冲液的离子浓度来控制。可以延长时间，使得供体股结合到大多数对接股，从而有助于缩短测量时间。同时，当时间减少时，供体股不结合到大多数对接股。如果供体股暂时结合到对接股中的一个，以使FRET对发射光，则大多数相邻的对接股不发射光。据此，可以在不受其他FRET对干扰的情况下测量FRET效率，结果为，可以小于10nm的高准确度测量FRET对的位置。另外，可以在一个图像中同时测量许多生物标志物，从而确保宽动态范围。同样地应用于FRET股也是如此。供体股解除结合的时间优选为减少到短至数秒，并且FRET股解除结合的时间优选为延长到长至数秒。
可以通过增加其中供体股或FRET股与对接股的结合率成正比的供体股或FRET股的浓度来提高分析速率。
图30示出根据本公开的一个实施方案在不同浓度的供体股上记录的荧光图像。如图28的(b)所示，供体1的光谱与供体2的光谱部分重叠。重叠区域影响来自供体2的光的亮度的测量。使用成像照相机测量来自供体2的光的亮度，并且示出于图30中。图30的(a)、(b)和(c)是当供体股在缓冲液中的浓度为100nM、500nM和1000nM时分别记录的图像。如图30所示，供体2的图像中的背景噪声随着供体股的浓度的增加而增加，从而损害供体2的光的亮度测量的准确性。即，分析速率增加，但FRET效率的测量准确度随着供体股浓度的增加而降低。为了满足速率和准确度方面的要求，优选为将缓冲液中供体股的浓度调节至1nM到1μM。
作为另一示例，多个FRET股可以结合到一个对接股。在这种情况下，结合到对接股的供体股的数量可以与FRET股的数量相同。当标记在多个FRET股上的受体是相同类型时，可以标记相同或不同类型的供体。在此，供体的类型优选为与受体的类型不同。
具体地，当多个FRET股结合到一个对接股时，在以下四种组合中，标记在FRET股上的供体和受体可以标记在FRET股上：
i)标记在多个FRET股上的供体可以是相同的荧光物质，并且标记在多个FRET股上的受体可以是相同的荧光物质；
ii)标记在多个FRET股上的供体可以是不同的荧光物质，并且标记在多个FRET股上的受体可以是相同的荧光物质；
iii)标记在多个FRET股上的供体可以是相同的荧光物质，并且标记在多个FRET股上的受体可以是不同的荧光物质；以及
iv)标记在多个FRET股上的供体可以是不同的荧光物质，并且标记在多个FRET股上的受体可以是不同的荧光物质。
荧光物质可以在所述股的特定碱基、3'-或5'-末端或骨架上用作供体或受体。优选地，用作供体或受体的荧光物质标记在对接股、供体股或FRET股的特定碱基上以测量FRET效率。
本公开中使用的样品可以选自由血液、血清、血浆、唾液、组织液和尿液所组成的组，但是没有特别限制，只要其含有取决于诊断的类型或特征的目标生物标志物即可。
根据用于通过观察受体信号来检测两种或更多种生物标志物的FRET-PAINT，引入一种类型的供体股，发现并清洗与供体股互补的对接股，并将此过程重复N次。整个测量时间约为N分钟(每种类型约为1分钟，N从数百到数千)。数百nM的浓度的供体股使用N次，这在经济效率方面是不利的。
相反，根据本发明的方法，由于目标物质是利用受体股的FRET效率而不是受体股的序列来区分的。可以使用相同类型的供体股，而无需引入和清洗新的供体股。整个测量时间可以减少到大约1分钟，并且数百nM浓度的供体股仅消耗一次。
由于以一个受体股可区分出10个FRET效率，因此可以取决于目标数量增加受体股的数量。然而，当以一个受体股区分的目标数量为10时，以两个受体股区分的目标数量不是100而是55。以此方式，以三个受体股区分的目标数量不是220而是1,000，并且以四个受体股区分的目标数量不是715而是10,000。此原因为，适用于0.1和0.2的FRET效率的目标1和适用于0.1和0.3的FRET效率的目标2是可以彼此区分，但是适用于0.1和0.2的FRET效率的目标1和适用于0.2和0.1的FRET效率的目标2是不能彼此区分。
通过使用N种类型的普通供体股可以解决上述问题。例如，在使用普通供体股的情况下，适用于0.1和0.2的FRET效率的目标1和适用于0.2和0.1的FRET效率的目标2不能区分。相反，当引入一级供体股时，分别测量目标1和目标2的0.1和0.2。当引入次要供体股时，分别针对目标1和目标2测得0.2和0.1。因此，目标1和目标2可以彼此区分。即，当使用N种类型的普通供体股时，仅将供体股引入N次，并且在测量后重复清洗，将10N个目标物质，例如100(N＝2)、1,000(N＝3)和10,000(N＝4)种目标物质可以区分。
如上所述，FRET效率可以用于同时检测两种或更多种类型的生物标志物并且从小量样品中在低浓度下区别出生物标志物的类型。以荧光物质标记的股倾向于彼此暂时结合。因此，即使当对用作供体或受体的荧光物质进行了光漂白，供体股或以保持未光漂白的荧光物质标记的FRET股也可以结合到对接股，并且可以在重复结合和解除结合过程中测量FRET效率，从而能够同时检测N种类型的生物标志物，而不论是否发生光漂白。
标记在FRET股上的荧光物质仅在当供体股和FRET股同时结合到对接股时才发射光。同时，当不使用FRET股时，标记在对接股上的荧光物质仅在当供体股结合到对接股时才发射光。因此，可以测量暂时发光的荧光物质而不会受到相邻的荧光物质的干扰，并且结果为，可以用小于10nm的高准确度测量荧光物质的位置。此外，可以在一个图像中同时测量许多生物标志物，从而确保宽动态范围。
将参考以下的示例部分给出关于使用本公开的方法检测N种类型的生物标志物的更详细的描述。
本公开的另一方面提供了一种试剂盒和方法，用于基于通过在不同类型的荧光物质之间的FRET的发射光谱的测量来同时检测和识别N种类型的生物标志物。
根据本公开，受体荧光物质的相同组合标记在不同的受体股上，但是因为受体股之间的距离不同，因此可以确定受体股的FRET效率以区分目标。
相反，受体荧光物质的不同组合标记在不同的受体股上，并且可以确定受体股的FRET效率以区分目标。例如，在以受体1和受体2标记目标1，在以受体1和受体5标记目标2的情况下，目标1的光谱与目标2的光谱有所区分。据此，由于不同的受体可能同时发射光，所有供体和受体都可以标记在对接股上。由于所有受体在当供体被激发的那一刻都发射荧光信号，因此整个测量时间可以减少到仅几秒钟，并且无须使用供体股，这在经济上是需要的。
在一个实施方案中，所述试剂盒包括基板、以两种或更多种类型的荧光物质标记的N种类型的对接股以及与对接股接合的N种类型的检测抗体。
在又一个实施方案中，所述试剂盒包括基板、以一种或更多种类型的荧光物质标记的N种类型的对接股、与对接股接合的N种类型的检测抗体以及以一种或更多种类型的荧光物质标记的供体股。
在另一个实施方案中，所述试剂盒包括基板、N种类型的对接股、与对接股接合的N种类型的检测抗体、以一种或更多种类型的荧光物质标记的供体股和以一种或更多种类型的荧光物质标记的受体股。
在每个实施方案中，荧光物质可以在对接股、供体股或受体股的特定碱基、3'-或5'-末端或骨架上用作供体或受体。
根据前述实施方案的试剂盒可以通过不同类型的荧光物质之间FRET测量发射光谱，以同时识别N种类型的生物标志物。
对接股能够与供体股或受体股互补地结合。
在一个实施方案中，每种试剂盒可以进一步包括捕获抗体。
根据本公开的一个实施方案的用于同时检测多种生物标志物的方法包括将N种类型的生物标志物附接到基板，使与N种类型的对接股接合的N种类型的检测抗体结合N种类型的生物标志物，并测量对接股的发射光谱。在此，通过不同荧光物质之间的FRET测量发射光谱，以同时识别N种类型的生物标志物，然后从每单位面积的生物标志物的数量测量样品中生物标志物的浓度。
根据本公开的一个实施方案的用于同时检测多种生物标志物的方法包括将N种类型的生物标志物附接到基板，使与N种类型的对接股接合的N种类型的检测抗体结合N种类型的生物标志物，使供体股结合到N种类型的对接股，并测量发射光谱。在此，通过不同荧光物质之间的FRET测量发射光谱，以同时识别N种类型的生物标志物，然后从每单位面积的生物标志物的数量测量样品中生物标志物的浓度。
在一个实施方案中，所述方法可以进一步包括使以荧光物质标记的受体股结合到对接股。
在一个实施方案中，所述方法可以进一步包括将捕获抗体附接到基板。
根据本公开的试剂盒和方法，基于由标记在对接股或供体或受体股上的两种或更多种类型的荧光物质的共振诱导的FRET来测量发射光谱，以同时检测多种生物标志物。
检测抗体用于基于抗原-抗体反应的检测。检测抗体的种类数量优选为与目标生物标志物的种类数量相同。标记在N种类型的对接股上的供体或受体是相同类型，这对于检测试剂盒的简单构建是优选的。具体地，当标记在N种类型的对接股上的供体是相同类型时，可以仅使用一个光源而不用另外的光源和光学过滤器来测量对接股的发射光谱，以识别N种类型的生物标志物。更具体地，当作为供体的荧光物质的发射光谱在预定的波长范围内与用作受体的荧光物质的吸收光谱重叠时，发生FRET。
例如，当将以相同类型的供体标记的对接股与检测抗体1至N接合，并且受体1至N标记在对接股上时，如图31所示，相同类型的供体仅激发一个光源用于初始照射。由于发射光谱取决于用作受体的荧光物质的类型而改变，因此可以通过确定所测量的光的光谱来识别受体的类型。以受体N标记与检测抗体N接合的对接股N使得能够识别以受体标记的检测抗体以及对检测抗体具有结合亲和力的生物标志物的类型。
如图32所示，可以用相同类型的供体和相同类型的受体标记接合到检测抗体1至N的对接股。供体和受体之间的距离改变，如图32的(a)、(b)和(c)所示。通过FRET效率，供体和受体的使用能够基于光谱差异同时检测多种生物标志物，如图32右光谱所示。
可替代地，相同类型的受体和两种或更多种类型的供体也可以标记在与检测抗体接合的对接股上，如图33所示。由于用作供体的两种或更多种类型的荧光物质的光谱(虚线)重叠(见图33的右光谱)，所以可以通过一个光源激发两种或更多种荧光物质。另外，可以清楚地区分发射光谱(实线)。总的来说，使用两种或更多种类型的供体能够检测与使用相同类型的供体相比更大数量类型的生物标志物(见图31或32)。
作为又一示例，相同类型的供体和两种或更多种类型的受体可以标记在接合到检测抗体的对接股上，如图34a至34c所示。
标记的两种或更多种类型的受体可以彼此相邻以形成受体-受体FRET对，如图34a所示，或者可以与供体相邻以形成供体-受体FRET对，如图34b所示。可以通过改变受体-受体FRET对中标记的受体之间的距离来识别生物标志物的类型。图34c示出通过以如图34a所示的相同类型的供体和五种类型的受体标记受体-受体FRET对来进行多重检测的结果。具体地，图34c以从底部开始的顺序，示出从以FRET对((受体1，受体2)，(受体1，受体3)，(受体1，受体4)，(受体1，受体5)，(受体2，受体3)，(受体2，受体4)，(受体2，受体5)，(受体3，受体4)，(受体3，受体5)和(受体4，受体5))标记的对接股发射出的光的光谱。即，可以基于所测量的光谱来清楚地区分对接股的类型，并且结果为，可以确定在对接股中使用的受体-受体FRET对的类型以识别检测到的生物标志物的类型。
根据本公开的前述实施方案的试剂盒可单独或以其组合用于～1,000种类型的生物标志物的多重检测和识别。
在一种对接股上的两种或更多种的相同类型的两种或更多种荧光物质的组合可以使信号强度增强至少2倍。
图35a和35b示出根据本公开的示例性实施方案的用于同时检测多种生物标志物的方法。根据这些方法，可以通过测量接合到与目标生物标志物特异性结合的N种类型的检测抗体的N种类型的对接股的不同发射光谱，来识别N种类型的目标生物标志物。
首先，将生物标志物固定在基板上，并使其与检测抗体结合。N种类型的捕获抗体可以预先附接到基板上。在这种情况下，优选为N种类型的捕获抗体特异性地结合到相应的生物标志物。然而，这仅是示例性的，并且生物标志物可直接附接到基板以进行快速、经济和方便的测量。如果需要，还可以通过与附接到基板的捕获抗体的抗原-抗体反应来检测生物标志物，从而获得更高的测量结果准确度。
目标生物标志物可以直接附接到基板表面。可替代地，可以对基板进行表面修饰，使得捕获抗体附接到基板表面以捕获生物标志物。基板优选地涂覆有能够特异性地结合到捕获抗体的材料。具体地，优选为基板涂覆有对捕获抗体具有特异性并且对检测抗体或股具有非非特异的材料。
通过以0.06M的碳酸盐或pH 9.5的碳酸氢盐缓冲溶液稀释捕获抗体，并使稀释液在预定温度下与基板接触一段预定时间，可以将捕获抗体附接到基板。通过将生物素化的聚乙二醇(PEG)或牛血清白蛋白(BSA)涂覆基板表面，将被涂覆的基板与链霉亲和素结合，以及将与链霉亲和素结合的基板与生物素化的捕获抗体结合，可以将捕获抗体吸附到基板。然后，以原始或处理过的样品处理基板。吸附到基板的捕获抗体与样品中的生物标志物形成复合物。另外，优选为以诸如Tween 20或TritonX-100的清洁缓冲液清洗复合物以去除非特异性结合的抗体或污染物。
如上所述，通过捕获抗体或施加到基板上的材料将N种类型的生物标志物固定在基板上，并且使检测抗体结合到生物标志物。此后，对接股的发射光谱被测量，并与储存在数据库中的先前测量的发射光谱进行比较，以识别相应的生物标志物。可以通过将图像中每单位面积的生物标志物的数量与先前在不同浓度下每单位面积的生物标志物的数量进行比较来测量生物标志物的浓度。当供体被来自光源的光照射而激发时，在图像中观察到每个分子的发射光谱，如图35a所示，并与储存在数据库中的先前测量的发射光谱(A，B，C等)进行比较，以识别哪个生物标志物对应于图像中观察到的每个分子(例如，当光谱形状为A时，为生物标志物1，当光谱形状为B时，为生物标志物2，当光谱形状为C时，为生物标志物3)。此后，可以通过测量图像中每单位面积的生物标志物的数量并将其与先前测量的在不同浓度下每单位面积的生物标志物的数量进行比较，来测量样品中每种生物标志物的浓度。例如，当先前测量的在预定浓度下每单位面积(ng/ml)的生物标志物1的数量为10，并且实际测量的每单位面积的生物标志物1的数量为5时，样品中生物标志物1的浓度为0.5ng/ml。
图35b示出用于测量发射光谱的示例性方法。例如，当使用一般显微镜观察到各种类型的荧光物质时，无论发射光谱如何，都可以观察到圆点扩展函数(circular pointspread functions,PSF)，如左图像所示。但是，使用在光路上引起与波长有关的光程差的光学组件(诸如棱镜或光栅)可以将每种荧光物质的圆点扩展函数改变为椭圆形。可以通过将原始圆的中心与椭圆的中心进行比较并分析沿椭圆长轴的轮廓来测量发射光谱。将所测量的发射光谱与储存在数据库中的先前测量的发射光谱进行比较，以确定相应分子的组成荧光物质(见“超高通量单分子光谱和光谱分辨超分辨率显微镜”，Zhengyang Zhang,Samuel J Kenny,Margaret Hauser,Wan Li&Ke Xu,Nature Methods volume 12(2015),pages 935-938)。
在一个实施方案中，与检测抗体接合的对接股可以互补地结合到供体股或受体股。
在此实施方案中，以供体标记供体链，以一种或更多种类型的受体或受体-受体FRET对标记受体股。当直接以两种或更多种类型的受体标记对接股时，如图36a所示，供体股可以互补地结合到邻近标记区域的位点。FRET在结合的时刻发生，并且结果为，受体可以发射光。当没有以荧光物质标记对接股时，如图36b所示，供体股和受体股重复地结合到对接股和与对接股解除结合。由此，受体仅在当供体股和受体股同时结合到对接股的时刻发射光，并且可以测量它们的发射光谱。为了此理由，给予预定的反应时间是允许的，即使一些荧光物质会被光漂白，在供体股和以未光漂白的荧光物质标记的受体股同时结合到对接股的时刻，可以测量发射光谱。另外，在供体股和受体股同时结合到对接股的时刻，可以测量并记录发射光谱。这可以为以下问题提供解决方案，在一个图像中同时输出与生物标志物的类型相对应的许多图像，使得难以识别生物标志物。
图37示出使用包括图36b示出的供体股和受体股的检测试剂盒来识别生物标志物类型的示例性方法。
首先，当打算检测N种类型的生物标志物时，设计N种类型的对接股以及互补地结合到对接股的供体股和受体股，并预先测量所述股的发射光谱以构建数据库。使检测抗体1至N分别结合到生物标志物1至N，并且将对接股1至N分别接合到检测抗体1至N。
数据库记录完成后，将生物标志物固定在基板上。使用适合于如下所述的目标生物标志物类型的对接股来识别生物标志物。使检测抗体结合到相应的生物标志物，并且使先前构建的供体股和受体股区域在预定的时间内重复结合到对接股和与对接股解除结合。当供体和受体股同时结合到一个对接股时，信号将显示在图像中，如图37所示。分析相应信号的光谱，并将其与在数据库中记录的先前测量的光谱进行比较，以识别生物标志物的类型。累积显示在每个图像上检测到信号的位置，并且通过一个生物标志物分子重复产生的信号在特定位置周围形成高斯函数形式的种群。通过将一个种群视为一个生物标志物分子来计算每单位面积生物标志物的数量，并且可以通过与先前测量的在不同浓度下每单位面积的生物标志物的数量进行比较来测量样品中生物标志物的浓度。
对于图31至34中示出的结构中的两个或更多个的组合，可以通过在供体股上标记供体并在对接股或受体股上标记受体来识别大约1,000种类型的生物标志物。例如，多种供体股和多种受体股互补地结合到一种对接股，如图38a所示。此组合使得能够检测与通过图36b的结构检测到的生物标志物相同类型的生物标志物。由于互补地结合到供体和受体股的两个或更多个位点存在于对接股中，因此只要供体和受体股同时结合到任一位点，就可以测量发射光谱。因此，供体和受体股的重复结合和解除结合可以增加结合到对接股的可能性，达成至少2倍的快速检测。
在这种情况下，不同的供体可以标记在多个供体股上。可以用供体标记多个供体股中的每一个，使得相邻的受体或受体-受体FRET对在不同的距离处用以实现不同的FRET效率。受体或受体-受体FRET对可以由不同的荧光物质组成。可以对多个受体或受体-FRET对进行标记，使得它们与供体在不同的距离处，以实现不同的FRET效率。可以对受体-受体FRET对进行标记，使得受体在不同的距离处，以实现不同的FRET效率。
作为为了获得与图38a示出的效果相似的方法，具有相同结构的对接股可以接合到一种检测抗体，用以更快速地检测生物标志物，如图38b所示。
作为在图38a和38b中示出的结构的组合，可以将多种供体股和多种受体股可以互补地结合的两种或更多种类型的对接股接合到一种检测抗体。这种组合可以进一步提高生物标志物的检测率。
根据本公开的一个实施方案的用于同时检测多种生物标志物的试剂盒可用于检测microRNA，如图39所示。
图39示出用于检测诸如DNA和RNA且包括microRNA的核酸的示例性试剂盒。在将对涂覆在基板上的材料具有结合亲和力的材料附接到每个目标核酸的一端，或是与每个目标核酸的一部分互补的核酸预先涂覆在基板上之后，将N种类型的目标核酸固定在基板上。由于N种类型的目标核酸的序列是已知的，因此可以使用与目标核酸互补的N种类型的供体股和受体股来识别核酸。
诸如DNA、RNA、PNA、LNA、MNA、GNA或TNA的核酸或其类似物可以用于作为对接股、供体股或受体股。另外，可以省略供体股和受体股的使用，如图31至34所示。在这种情况下，对接股可以是多肽或碳水化合物。
来自供体或受体的光的强度可能受供体与受体之间距离的影响，但是可以通过在所需的特定碱基、3'-或5'端或骨架上标记供体和受体中的每一个来构建具有不同FRET效率的对接股，用以控制供体-受体距离或受体-受体距离。
例如，具有不同FRET效率的荧光物质标记在N种类型的对接股上，并且预先测量对接股的发射光谱以构建数据库，并将其与在反应中产生的用于生物标志物检测的发射光谱进行比较，结果为，可以检测生物标志物的类型。具有不同FRET效率的荧光物质可以由(供体1，受体1)、(供体1，受体2)、…(供体1，受体N)、…、(供体1，受体1)、(供体2，受体1)、…、(供体N，受体1)组成。具有不同FRET效率的荧光物质可以由两种或更多种不同类型的受体组成，诸如(受体1，受体2)、(受体1，受体3)、(受体2，受体3)、…在对接股上标记有相同的供体。
具有不同的FRET效率的荧光物质的组合仅是示例性的，并且没有特别的限制，只要FRET效率足够不同以在检测时被区分即可。
根据本公开的一个实施方案，每个方法可以进一步包括测量N种类型的对接股的发射光谱以构建数据库。在检测反应之前，将对接股设计为具有一种或更多种的上述结构，并测量其发射光谱以构建数据库，并将其与反应时测量的值进行比较，以确定用于检测的检测抗体的类型以及最终可以识别生物标志物的类型。
为了检测N种类型的生物标志物，可以同时或顺序地测量发射光谱。例如，当打算检测三种类型的生物标志物时，供体股互补地结合到同时或顺序接合到检测抗体1、2和3的对接股1、2和3。当受体直接标记在对接股上时，仅可以在当供体股临时结合到对接股的时刻测量发射光谱。当进一步使用受体股1、2和3时，它们同时或顺序重复地到结合受体股1、2和3和与其解除结合。在重复的结合和解除结合过程中，仅可以在当供体股同时结合到对接股中的任一个的时刻测量发射光谱。换句话说，仅可以在当供体股和受体股1同时结合到对接股1的时刻测量对接股1的发射光谱。相反，在供体股仅结合到对接股2或3的时刻的情况下，当受体股1结合到对接股1时，不能测量对接股1的发射光谱。即，可以同时或顺序地测量发射光谱用以检测N种类型的生物标志物，并且将测量值与储存在数据库中的值进行比较，以同时识别N种类型的生物标志物。
根据本公开，可以基于FRET同时检测N种类型的生物标志物，并且可以从小量样品中在低浓度下区别出生物标志物的类型，如上所述。具体地，根据本公开，可以基于能量共振来测量以荧光物质标记的股的发射光谱，以识别生物标志物的类型。另外，通过均等地标记用作供体的荧光物质，可以用一个光源识别多个生物标志物，而无需额外的光源和滤光片。这有助于简化结构，并防止测量所需的发射光谱被附加的滤光片丢失。
此外，以供体和受体标记的股倾向于暂时结合到另一个股。因此，即使当用作供体或受体的荧光物质被光漂白，在当供体股和以保持未光漂白的荧光物质标记的受体股结合到对接股的时刻，在重复的结合和解除结合的过程中，也可以测量发射光谱，从而能够同时检测N种类型的生物标志物，不论是否发生光漂白。再者，可以测量暂时发光的荧光物质而不受相邻的荧光物质的干扰，并且结果为，可以用小于10nm的高准确度测量荧光物质的位置，从而确保宽动态范围。
将参考以下的示例部分给出关于使用本公开的方法检测N种类型的生物标志物的更详细的描述。
[示例]
1.使用具有不同序列的供体股对生物标志物进行多重检测
实验方法
1)试剂和材料
修饰的DNA寡核苷酸购自Integrated DNA Technologies。AF488(Alexa Fluor488NHS酯，目录号：A20000)购自Thermo Fisher Scientific。Cy3(Cy3NHS酯，目录号：PA13101)和Cy5(Cy5 NHS酯，目录号：PA15101)购自GE Healthcare Life Sciences。COS-7细胞购自韩国细胞系银行。抗微管蛋白抗体(目录号：ab6160)购自Abcam。抗Tom20抗体(sc-11415)购自Santa Cruz Biotechnology公司。驴抗兔IgG抗体(目录号：711-005-152)和驴抗大鼠IgG抗体(目录号：712-005-153))购自Jackson ImmunoResearch Laboratories公司。羧基乳胶珠(目录号：C37281)购自Thermo Fisher Scientific，并且多聚甲醛(目录号：1.04005.1000)购自Merck。戊二醛(目录号：G5882)、Triton X-100(目录号：T9284)和牛血清白蛋白(BSA，目录号：A4919)购自Sigma-Aldrich。使用购自Solulink的抗体-寡核苷酸多合一接合试剂盒(目录号：A-9202-001)将对接股接合到二级抗体。
2)以荧光团标记DNA
以具有NHS酯化学基团的荧光团标记胺修饰的DNA寡核苷酸。将5μl的1mM DNA与25μl的100mM四硼酸钠缓冲液(pH 8.5)混合。然后添加于DMSO中5μl的20mM荧光团。将混合物在4℃下孵育过夜。加入265μl的蒸馏水、900μl的乙醇和30μl的3M乙酸钠(pH 5.2)并充分混合。将混合物在-20℃下孵育1小时，然后离心几小时。乙醇完全蒸发后，将DNA沉淀物重悬于50μl的蒸馏水中，并测量荧光标记效率。
3)细胞培养和固定
为了对DNA-PAINT成像进行偏移校正，以羧基乳胶珠涂覆玻璃盖玻片。
以在蒸馏水中稀释的1:10珠溶液涂覆盖玻片，在100℃的加热板上加热10分钟，用蒸馏水清洗，然后用N2气体干燥。COS-7细胞在涂覆珠子的盖玻片上生长，然后固定10分钟。2％的戊二醛用于微管成像，3％的多聚甲醛和PBS缓冲液中0.1％的戊二醛混合物用于微管和线粒体成像。固定的样品在4℃的PBS缓冲液中保存直至需要。
4)免疫染色
在盖玻片上进行细胞培养并固定后，将微管在阻断溶液(PBS缓冲液中的5％的BSA和0.25％的Triton X-100)中以1：100稀释的抗微管蛋白抗体处理，在4℃孵育过夜，并进行免疫染色。以PBS缓冲液彻底冲洗掉游离的抗微管蛋白抗体后，将细胞和与对接股(Docking_P1)接合的100nM的二级抗体孵育1小时。以1：100稀释的抗Tom20抗体处理线粒体，在4℃孵育过夜，并进行免疫染色。以PBS缓冲液彻底冲洗掉游离的抗Tom20抗体后，将细胞和与对接股(Docking_P2)接合的100nM的二级抗体孵育1小时。
5)单分子成像
为了单分子成像，使用棱镜型全内反射荧光(total internal reflectionfluorescence,TIRF)显微镜和高倾斜和层压光学片(highly inclined and laminatedoptical sheet,HILO)显微镜。通过改装商用倒置显微镜(IX71，Olympus)来建造显微镜，并配备100X 1.4NA油浸物镜(UPlanSApo，Olympus)。
通过使用链霉亲和素-生物素相互作用，将对接股固定在聚合物涂覆的石英载玻片表面上，并将供体和受体股添加到成像通道中。Alexa488、Cy3和Cy5分别由蓝色激光(473nm，100mW，MBL-III-473-100mW，CNI)、绿色激光(532nm，50mW，Compass 215M-50，Coherent)和红色激光(642nm，60mW，Excelsior-642-60，Spectra-Physics)激发。使用二向色镜(640dcxr，Chroma)对Cy3信号进行滤波，使用二向色镜(740dcxr，Chroma)对Cy5信号进行滤波。以电子倍增电荷耦合装置(electron multiplying charge-coupled device,EMCCD)相机(iXon Ultra DU-897UCS0-#BV，Andor)以10Hz的帧率记录单分子图像。
6)FRET对表征
为了表征在图1d中每帧检测到的检测到的光子，分别收集针对2nt、4nt、6nt和11nt的13997(8096)、11021(5100)、11208(3451)和17051(3980)单分子点。为了表征图1j-1k中的SNR，分别收集针对Cy3、Cy3-Cy5对和Alexa488-Cy5对的795、2322和742个单分子点。
7)偏移校正
为了以DNA-PAINT进行超分辨率成像，使用了基于图像相关方法的自制自动聚焦和偏移校正系统。制片前，拍摄了一张对焦的明场图像和两张失焦的图像。这三个参考图像用于跟踪x、y和z轴的偏移。使用压电平台(PZ-2000，Applied ScientificInstrumentation)实时校正z方向的偏移，而在图像分析过程中校正xy平面的偏移。
示例1-1：FRET-PAINT的表征
使用表面固定的DNA股和TIRF显微镜测试FRET-PAINT显微镜的可行性。
图1a至1k示出FRET-PAINT的原理和表征。
具体地，图1a示出用于表征FRET-PAINT的对接股(黑色)、供体股(深灰色)和受体股(亮灰色)，图1b是FRET-PAINT的示意图，图1c示出代表性的Cy5荧光的强度时间轨迹(1000nM的Donor_P1_Alexa488和100nM的Acceptor_P11_Cy5)，图1d示出Cy3-Cy5和Alexa488-Cy5对的与与供体-受体距离相关的受体亮度。
图1e示出在Acceptor_P11_Cy3的指示浓度下的表面固定的对接股(Docking_P0)的DNA-PAINT图像，图1f示出在Donor_P1_Cy3的指示浓度下的Docking_P0的FRET-PAINT图像，其中Acceptor_P6_Cy5固定为10nM，图1g示出在Acceptor_P6_Cy5的指示浓度下的Docking_P0的FRET-PAINT图像，其中Donor_P1_Cy3固定为10nM，图1h示出在Donor_P1_Alexa488的指示浓度下的Docking_P0的FRET-PAINT图像，其中Acceptor_P2_Cy5固定为10nM，图1i示出在Acceptor_P2_Cy5的指示浓度下的Docking_P0的FRET-PAINT图像，其中Donor_P1_Alexa488固定为10nM(比例尺:1μm)。
图1j比较不同Cy3成像股浓度下的DNA-PAINT与不同Cy3供体股和Cy5受体股浓度下的FRET-PAINT的SNR，并且图1k比较不同Cy3成像股浓度下的DNA-PAINT与不同Alexa488供体股和Cy5受体股浓度下的FRET-PAINT的SNR。
如图1a所示，FRET-PAINT使用了三种DNA股(对接、供体和受体股)。在5'-末端标记有生物素的对接股(Docking_P0)有两个对接位点，每个对接位点均与供体或受体股碱基配对。为了增加FRET概率，让选择供体股的长度比受体股的长度短，而使用相对较长的受体股。供体股在3'-末端标记有Alexa488(Donor_P1_Alexa488)，而受体股在3'-末端标记有Cy5(Acceptor_P11_Cy5)。
所述股的序列如下：
Docking_P0＝5'-生物素-TTGATCTACATATTCTTCATTA-3'(SEQ ID NO：1)
Donor_P1_Cy3＝5'-TAATGAAGA-Cy3-3'(SEQ ID NO：2)
Donor_P1_Alexa488＝5'-TAATGAAGA-Alexa488-3'(SEQ ID NO：2)
Acceptor_P2_Cy5＝5'-Cy5-TATGTAGATC-3'(SEQ ID NO：3)
Acceptor_P6_Cy5＝5'-TATG-Cy5-TAGATC-3'(SEQ ID NO：3)
Acceptor_P11_Cy5＝5'-TATGTAGATC-Cy5-3'(SEQ ID NO：3)
然后，使用链霉亲和素-生物素相互作用将对接股固定在聚合物涂覆的石英表面上，并在注入供体(1000nM)和受体(100nM)股后，通过使用蓝色激光(图1b)激发Alexa488，拍摄Cy5的单分子图像。
结果为，在高供体和受体浓度下获得了清楚的Cy5荧光的强度时间阶梯，如图1c所示。
执行相同的方案以找到FRET探针的最佳标记位置，所述位置为两个FRET对(Cy3-Cy5和Alexa488-Cy5)提供最大FRET信号。为此，供体股在3'-端标记有Cy3(Donor_P1_Cy3)或Alex488(Donor_P1_Alexa488)，并且受体股在不同位置(Acceptor_P2_Cy5、P4_Cy5、P6_Cy5和P11_Cy5)标记有Cy5。
结果为，当供体和受体股之间的间隙为6nt时，Cy3-Cy5 FRET对给出最高的Cy5信号，而当供体和受体股之间的间隙为2nt时，Alexa488-Cy5 FRET对给出最高的Cy5信号，如图1d所示。
然后，使用HILO(高倾斜和层压光学片)显微镜记录超分辨率荧光图像。比较了在不同DNA浓度下DNA-PAINT和FRET-PAINT的信噪比(SNR)。
结果示于图1e至1i中，对于DNA-PAINT，当DNA浓度高于5nM时，在单分子图像中会出现噪声(图1e)。对于Cy3-Cy5对FRET-PAINT，当DNA浓度高于100nM时会出现噪声(图1f和1g)。对于Alexa488-Cy5对FRET-PAINT，当DNA浓度高于150nM时会出现噪声(图1h和1i)。
这些图像示出，与DNA-PAINT相比，在FRET-PAINT中在较高的成像剂浓度下可以获得相同的SNR。例如，将5nM的成像剂浓度用于DNA-PAINT以获得3.3SNR，如图1j和1k所示。对于相同的SNR，对于Cy3-Cy5对FRET-PAINT使用180nM的供体浓度和120nM的受体浓度，并且对于Alexa488-C5对FRET-PAINT使用250nM的供体浓度和90nM的受体浓度。
示例1-2：使用DNA-PAINT和FRET-PAINT的超分辨率成像
进行以下实验程序以比较DNA-PAINT和FRET-PAINT的超分辨率成像速度。
首先，COS-7细胞的微管以标记有Docking_P1的抗微管蛋白抗体进行免疫染色。
然后，对于DNA-PAINT，在注入1nM的以Cy5标记的成像股(Acceptor_P2’_Cy5)之后，对微管进行成像。对于FRET-PAINT，在注入30nM的供体(Donor_P1_Alexa488)和20nM的受体(Acceptor_P2_Cy5)股之后，对相同区域的微管进行成像。以10Hz的帧率记录单分子图像，所述帧率足够快以可靠地检测供体和受体股的结合。
为了定量比较DNA-PAINT和FRET-PAINT的成像速度，测量图2a和2b中的点的数量。对另外九个成像区域执行相同的分析，并比较平均速度。对以((定位准确度)2+(奈奎斯特(Nyquist)分辨率)2)1/2(6)计算的卷积分辨率进行定量，以比较DNA-PAINT和FRET-PAINT的成像速度。DNA-PAINT和FRET-PAINT的定位准确度分别为6.9nm和11.1nm。
结果示于图2a至2e中。图2a至2e比较DNA-PAINT和FRET-PAINT的成像速度。
具体地，图2a示出在指示的获取时间重建的DNA-PAINT图像，图2b示出与在指示的获取时间重建的图2a相同区域的FRET-PAINT图像，图2c示出累积的定位点的数量与图2a的DNA-PAINT图像和图2b的FRET-PAINT图像的时间的函数关系，图2d比较FRET-PAINT和DNA-PAINT每秒定位的单分子点的数量，并且图2e比较DNA-PAINT和FRET-PAINT的空间分辨率与成像时间的函数关系。误差柱代表标准偏差。
由于对于DNA-PAINT以10Hz的帧率总共记录18000帧，因此总成像时间为30分钟(图2a)。另一方面，由于对于FRET-PAINT以10Hz的帧率总共记录600帧，因此总成像时间为60秒(图2b)。与DNA-PAINT相比，FRET-PAINT的成像速度提高29倍(图2c)。在不同区域测得的平均值表明，成像速度平均提高32倍(图2d)。基于其卷积分辨率比较DNA-PAINT和FRET-PAINT的成像速度，并且结果为，FRET-PAINT的成像速度提高36倍(图2e)。
示例1-3：FRET-PAINT多重成像
FRET-PAINT显微镜的多重能力通过以下实验程序进行评估。
分别使用抗微管蛋白抗体和抗Tom20抗体对COS-7细胞的微管和线粒体进行免疫染色。抗微管蛋白抗体和抗Tom20抗体分别与Docking_P1和Docking_P2正交接合。在本发明中，两种方法用于多重成像。
所述结果示于图3a至3h中。
图3a至3h示出FRET-PAINT的多重能力。具体地，图3a示意性地示出使用供体和受体股交换方案的多重成像。图3b至图3d示出使用方案(3a)以及为图3b和图3c的覆盖图像的方案(3d)获得的微管(3b)和线粒体(3c)的FRET-PAINT图像，图3e示意性示出没有缓冲液交换的多重成像，并且图3f至3h示出使用方案(3e)以及为图3f和图3g的覆盖图像的方案(3h)获得的微管(3f)和线粒体(3g)(MT，微管；MC，线粒体；DS，供体股；AS，受体股。比例尺：5μm)。
在图3a中示出的方法中(通过顺序以供体和受体股进行处理)，首先通过注入20nM的Donor_P1_AlexAF488和10nM的Acceptor_P2_Cy5(图3b)对微管进行成像，并且通过注入10nM的Donor_P2_AF488和10nM的Acceptor_P2_Cy5对线粒体进行成像(图3c)。在图3e所示的第二种方法中(通过同时以供体和受体股进行处理)，在注入所有DNA探针(用于微管的10nM的Donor_P1_Cy3，用于线粒体的20nM的Donor_P2_Alexa488，以及用于微管和线粒体两者的10nM的Acceptor_P2'_Cy5)后，同时，首先以Cy3激发对微管进行成像(图3f)，并且以Allexa488激发对线粒体进行成像(图3g)。
即使两种方法之间的成像时间没有差异，但第二种方法的缺点(通过同时以供体和受体股进行处理)是微管和线粒体图像之间的串扰。由此，证明以供体和受体股的顺序处理是进行多重成像的更好方法。
示例1-4：在宽浓度范围内测量生物标志物
在宽浓度范围内测量生物标志物的能力通过以下实验程序进行评估。
图4a至4c示出各种浓度下生物标志物的定量。
具体地，图4a示出固定在不同孔中并使用供体和受体股测量的浓度为10、40、100、400、1000和10000pg/ml的生物标志物，图4b示出在使用前分别稀释为1/10和1/100后的浓度为1000pg/ml和10000pg/ml的生物标志物，并且图4c图解示出在图4a和4b中指示浓度下测量的点的数量。在图4c中，通过计数稀释1/10后的点的数量并乘以10来获得1000pg/ml数据，并通过计数稀释1/100后的点的数量并乘以100来获得10000pg/ml数据。
将浓度为10、40、100、400、1000和10000pg/ml的生物标志物固定在不同的孔中，并使用供体和受体股测量图像中的点(单个生物标志物分子的数量)(图4a)。图像中的点的数量与浓度成正比。点在浓度≥1000pg/ml下开始重叠，使得无法准确计算它们的数量。
将浓度为1000和10000pg/ml的生物标志物稀释1/10和1/100并固定在不同的孔中，并且以供体股和受体股测量图像中的点的数量(图4b)。
绘制了在指示的浓度下计数的点的数量(图4c)。通过计数稀释1/10后的点的数量并乘以10来获得1000pg/ml数据，并通过计数稀释1/100后的点的数量并乘以100来获得10000pg/ml数据。
当数据拟合线性函数时，相关系数经计算为0.99997。由此，结论为即使稀释高浓度的生物标志物后也可以获得准确的测量结果。
2.使用两种或更多种类型的以供体或受体荧光物质标记的标签股对生物标志物进行多重检测
示例2-1：构建FRET效率数据库
如先前解释的，为了构建FRET效率数据库，作为供体的Cy3和作为受体的Cy5标记在DNA股上，以构建标签股。DNA的一端被生物素化，供体和受体附接在特定的碱基上并进行标记，使得供体-受体距离为1-50。总共制备了50种类型的标签股。
生物素化的原因是使用链霉亲和素-生物素相互作用将DNA固定在基板上。为了表现出类似的作用，还可以使用洋地黄毒苷(digoxigenin)及其抗体或诸如SNAP标签、CLIP标签、FLAG标签和His标签的标签以及各个配体之间的相互作用将DNA固定在基板上。
在以链霉亲和素涂覆基板后，其中供体-受体距离为1的DNA股被固定，并测量距离1的FRET效率，以建立参考值。FRET效率可以是通过针对取决于以下的波长差异的图像传感器的检测效率的差异进行补偿而获得的值：1)当供体被光激发时从被激发的受体射出的光；2)从不能被二向色镜完全分开的供体和受体射出的光的一部分；以及3)从供体和受体射出的光。
将相同的值应用于2-50的其他距离以获取其参考值。计算了由测量过程中产生的噪声引起的误差，并且仅使用了实际上可以清楚地区分FRET效率的距离。以下示例基于在距离1至50处可以清楚地区分10个FRET效率参考值的假设。
示例2-2：标签股构建
标签股的构建数量与实际目标生物标志物的类型数量一样多。可以不修饰地使用示例2-1中使用的DNA股，但是在使用前，将能够结合到检测抗体的官能基团附接至DNA股，而不是在DNA的一端标记生物素。根据用于在DNA上标记荧光物质的已知方法结合官能基团。
在示例2-1中以一个供体-受体对就可以清楚地区分10个FRET效率的假设下，则仅以一个供体-受体对就可充分检测到10种类型的生物标志物。
使用两个或更多个供体-受体对可以检测出超过10种类型的目标生物标志物。例如，当使用两个供体-受体对时，可以清楚地区分最多55个FRET效率。当使用三个供体-受体对时，可以清楚地区分最多205个FRET效率。如果以一个供体-受体对最多可区分10个FRET效率，则如理论上所计算的，以两个供体-受体对可区分的FRET效率数量为100。然而，其FRET效率为a和b的FRET对1不能与其FRET效率为b和a的FRET对2区分。据此，当以FRET对1或2标记标签股时，基本上可以区分总共55个FRET效率。当供体、受体或FRET对1和2中的所有荧光物质的类型不同时，以两对可区分100个FRET效率。以三对可区分1000个FRET效率。
示例2-3：光漂白之前和之后FRET效率的改变
在此示例中，使用以彼此间隔开的供体1-受体1和以供体2-受体2标记的DNA股。在光漂白之前测量来自供体和受体的光的亮度值和供体-受体对的FRET效率(表1)。每个FRET效率可以是通过针对取决于以下的波长差异的图像传感器的检测效率的差异进行补偿而获得的值：1)当供体被光激发时从被激发的受体射出的光；2)从不能被二向色镜完全分开的供体和受体射出的光的一部分；以及3)从供体和受体射出的光。
FRET对1的FRET效率为0.5，并且FRET对2的FRET效率为0.7，但实际观察到的FRET效率为0.6，这是两个FRET对的FRET效率的平均值。无法从观察值确定两个FRET对的FRET效率。
[表1]
表1示出的四个供体和受体可以进行光漂白。对于校正的FRET效率，在光漂白之前和之后，每个FRET对中来自供体和受体的光的亮度值的总和是恒定的。在此示例中，总和为100。FRET效率的测量如下。
1)当供体1被光漂白时
由于供体1和受体1均不发射光，因此来自供体的光的亮度值的总和从80变为30，并且来自受体的光的亮度值的总和从120变为70，结果为，光漂白之前和之后的亮度改变对于供体而言为50，对于受体而言为50。即，从光漂白之前和之后的亮度差所测量的FRET效率为0.5，并且从光漂白后观察的亮度所测量的FRET效率为0.7。据此，相应的标签股的FRET效率为0.5和0.7。
2)当供体2被光漂白时
由于供体2和受体2均不发射光，因此来自供体的光的亮度值的总和从80变为50，并且来自受体的光的亮度值的总和从120变为50，结果为，光漂白之前和之后的亮度改变对于供体而言为30，对于受体而言为70。即，从光漂白之前和之后的亮度差所测量的FRET效率为0.7，并且从光漂白后观察的亮度所测量的FRET效率为0.5。据此，相应的标签股的FRET效率为0.5和0.7。
3)当受体1被光漂白时
由于供体1代替受体1发射光，因此来自供体的光的亮度值的总和从80变为130，并且来自受体的光的亮度值的总和从120变为70，结果为，光漂白之前和之后的亮度改变对于供体而言为50，对于受体而言为50。在光漂白之前和之后，来自FRET对的供体和受体的光的亮度值的总和保持恒定(100)，结果为，来自受体的亮度(50)改变的FRET效率为0.5。除了来自供体1的光的亮度(100)，由来自光漂白后的供体的光的亮度值(130)的总和测量FRET效率为0.7。据此，相应的标签股的FRET效率为0.5和0.7。
4)当受体2被光漂白时
由于供体2代替受体2发射光，因此来自供体的光的亮度值的总和从80变为150，并且来自受体的光的亮度值的总和从120变为50，结果为，光漂白之前和之后的亮度改变对于供体而言为70，对于受体而言为70。在光漂白之前和之后，来自FRET对的供体和受体的光的亮度值的总和保持恒定(100)，结果为，来自受体的亮度(70)改变的FRET效率为0.7。除了来自供体2的光的亮度(100)，由来自光漂白后的供体的光的亮度值(150)的总和测量FRET效率为0.5。据此，相应的标签股的FRET效率为0.5和0.7。
测量亮度，直到一种荧光物质被光漂白，而对另一种荧光物质重复此程序，表明相应标签股的FRET效率为0.5和0.7。
示例2-4：FRET效率的测量和生物标志物类型的识别
通过以下程序制造用于检测生物标志物1和2的试剂盒。将标签股1接合到与生物标志物1结合的检测抗体1，并且将标签股2接合到与生物标志物2结合的检测抗体2。以两个供体-受体FRET对标记标签股1和2中的每个。检测抗体1的FRET效率参考值对于FRET对1为0.1，对于FRET对2为0.5。检测抗体2的FRET效率参考值对于FRET对1为0.2，对于FRET对2为0.4。
此后，如在示例2-3中，测量光漂白之前和之后的亮度差以分析FRET效率。以成像照相机观察分子A和B用以观察亮度。所测量的分子A的FRET效率为0.1和0.5，表示分子A是生物标志物1。基于相同原理，所测量的分子B的FRET效率为0.2和0.4，表示分子B是生物标志物2(图15)。
样品中生物标志物的浓度取决于生物标志物的类型而有从fg/ml到mg/ml的巨大变化。当将过高浓度的生物标志物固定到基板上时，在一个图像中观察到过多数量的点，并且彼此重叠。此重叠使得无法测量单个分子的FRET效率。因此，可以用各种比例稀释样品，使得在一个图像中检测到适当数量的生物标志物分子。
当打算检测相似浓度范围的生物标志物时，将生物标志物以相同比例稀释以进行分析。例如，如果通常在～1ng/ml的浓度的生物标志物以1：100的比例稀释，并且在一个图像中检测到适当数量的生物标志物分子，则通常在～100ng/ml的浓度的生物标志物以1：10000的比例稀释用以进行分析。
3.使用N种类型的对接股和N种类型的FRET股对生物标志物进行多重检测
示例3-1：用于FRET效率的数据库的构建
将不同的荧光物质A、B和C分别用于作为供体1、供体2和受体。供体1标记在供体股上，并且供体2和受体标记在FRET股上。
设置两种荧光物质A和B之间的距离，使得供体1和2的FRET效率最大。标记在FRET股上的荧光物质B和C构成FRET对。以不同数量的FRET对标记FRET股，视需要类型而定。
例如，当数据库需要50种类型时，制备以不同距离的荧光物质B和C标记的50种类型的FRET股。当市售荧光物质用于作为供体1、供体2和受体时，可以使用以供体1、供体2和受体标记的市售FRET股，而无需执行上述程序。
在确定作为供体1、供体2和受体的荧光物质时，优选为供体1的峰值发射波长最短，受体的峰值发射波长最长。
在制备两种或更多种类型的FRET股之后，使FRET股和其中供体2-受体距离为1的供体股结合到对接股，并测量在相应距离处的FRET效率。此后，从其中供体2-受体FRET对之间的距离为2的FRET股重复相同的程序，以获得FRET效率参考值，将其构建到数据库中。
此后，将在生物标志物检测期间测量的FRET效率值与FRET效率参考值进行比较。由此比较，确定FRET对的供体2-受体距离，以识别检测到的生物标志物的类型。
然而，由于误差可能是由FRET效率测量期间产生的噪声引起的，因此无法区分所有距离的FRET效率。例如，当FRET效率在距离1处为0.95(平均值)±0.05(误差)，在距离2处为0.94±0.05时，则不能通过FRET效率来区分距离(1和2)。由此，优选为在生物标志物的实际检测期间使用储存从在数据库中的值中清楚地区分FRET效率的距离。以下示例是基于在1至50的距离处可以清楚地区分10个FRET效率参考值的假设。
示例3-2：N种对接股和N种FRET股的构建
对接股的构建数量与实际目标生物标志物的类型数量一样多。
在示例3-1中以一个供体2-受体FRET对可清楚地区分10个FRET效率的假设下，仅以一个供体2-受体FRET对就可充分检测到10种类型的生物标志物。由此，一个FRET股被允许结合到每一个对接股。
使用两个或更多个供体2-受体对可以检测出超过10种类型的目标生物标志物。由此，两个或更多个FRET股被允许结合到每一个对接股。例如，当使用两个FRET对时，将清楚地区分最多55个FRET效率。当使用三个FRET对时，将清楚地区分最多205个FRET效率。如果以一个FRET对最多可区分10个FRET效率，则如理论上所计算的，以两个FRET对可区分的FRET效率数量为100。然而，其FRET效率为a和b的FRET对1不能与其FRET效率为b和a的FRET对2区分。据此，当以FRET对1或2标记对接股时，基本上可以区分总共55个FRET效率。当供体2、受体或FRET对1和2中的所有荧光物质的类型不同时，以两对可区分100个FRET效率。以三对可区分1000个FRET效率。
示例3-3：FRET效率测量和生物标志物识别
通过以下程序制造用于检测生物标志物1和2的试剂盒。
将对接股1接合到与生物标志物1结合的检测抗体1，并且将对接股2接合到与生物标志物2结合的检测抗体2。使对接股1和2中的每一个与两种类型的FRET股结合。具体地，使其FRET效率为0.2和0.4的FRET股结合到对接股1，并且使其FRET效率为0.6和0.8的另一FRET股结合到对接股2。
将生物标志物1和2固定在基板上，并使其分别与检测抗体1和2结合。将含有供体股和具有分别为0.2、0.4、0.6和0.8的FRET效率的四种类型的FRET股的缓冲液放入孔中，并测量结合到对接股的FRET股的FRET效率。如关于图29所述，以成像照相机观察分子1和2的位置作为间歇荧光信号，用以观察供体2和受体的亮度值。测量供体2和受体的亮度值以分析FRET效率。结果为，在分子1的位置处测量的FRET效率为0.2和0.4，表示分子1是生物标志物1。基于相同原理，在分子2的位置处测量的FRET效率为0.2和0.4，表示分子2是生物标志物2。
样品中生物标志物的浓度取决于生物标志物的类型而有从fg/ml到mg/ml的巨大变化。当将过高浓度的生物标志物固定到基板上时，在一个图像中观察到过多数量的点，并且彼此重叠。此重叠使得无法测量单个分子的FRET效率。因此，可以用各种比例稀释样品，使得在一个图像中检测到适当数量的生物标志物分子。
当打算检测相似浓度范围的生物标志物时，将生物标志物以相同比例稀释以进行分析。例如，如果通常在～1ng/ml的浓度的生物标志物以1：100的比例稀释，并且在一个图像中检测到适当数量的生物标志物分子，则通常在～100ng/ml的浓度的生物标志物以1：10000的比例稀释用以进行分析。
4.使用N种类型的对接股、供体股和受体股对生物标志物进行多重检测示例4-1：用于发射光谱的数据库的构建
构建以可通过一个光源激发的A类型供体标记的A类型的供体股(其中A是1或大于1的整数)。构建以与A类型供体形成FRET对的B类型受体标记的B类型的受体股(其中B是1或大于1的整数)。构建能够与A类型供体股和B类型受体股互补地结合的A×B类型对接股。
使用供体股1、受体股1和与其互补的对接股1测量供体和受体的发射光谱。同样应用于其他供体股和受体股的发射光谱。
考虑到由测量的A×B发射光谱中的噪声引起的误差，仅使用发射光谱中可清楚区分的其中一个来构建数据库，并且仅将提供相应发射光谱的供体股和受体股的组合用于生物标志物检测。
上述方法是组合图31和33示出的方法来解释图36b示出的结构。当储存在数据库中的发射光谱的数量小于目标生物标志物的数量时，进一步应用图32的结构，其建构为使得供体和受体之间的FRET效率不同，两种或更多种不同类型的受体标记在一个受体股上，如图36b所示，或者使两种或更多种不同类型的受体股结合到一个对接股上，结果为，发射光谱的数量大于储存在数据库中的目标生物标志物的数量。
示例4-2：N种对接股、供体股和受体股的构建
构建了N种类型的对接股以检测N种类型的生物标志物。N种对接股的序列与供体股和受体股的序列互补，从而将其发射光谱提供给数据库。
示例4-3：发射光谱的测量和生物标志物的识别
通过以下程序制造用于检测两种类型的生物标志物的试剂盒。
将对接股1接合到与生物标志物1结合的检测抗体1，并且将对接股2接合到与生物标志物2结合的检测抗体2。使供体股1和受体股1结合到对接股1以及供体股2，并且使受体股2结合到对接股2上。
将生物标志物1和2固定在基板上，并使其分别与检测抗体1和2结合。将供体股1、受体股1、供体股2和受体股2的缓冲液置于孔中，观察当供体股和受体股同时结合到对接股时发射的光的光谱。如图37所示，在以成像照相机拍摄的图像中，在分子1和2的位置处观察到间歇荧光信号。将对应位置处的发射光谱与储存在数据库中的光谱进行比较，以识别生物标志物的类型。
样品中生物标志物的浓度取决于生物标志物的类型而有从fg/ml到mg/ml的巨大变化。当将过高浓度的生物标志物固定到基板上时，在一个图像中观察到过多数量的点，并且彼此重叠。此重叠使得无法测量单个分子的FRET效率。因此，可以用各种比例稀释样品，使得在一个图像中检测到适当数量的生物标志物分子。
当打算检测相似浓度范围的生物标志物时，将生物标志物以相同比例稀释以进行分析。例如，如果通常在～1ng/ml的浓度的生物标志物以1：100的比例稀释，并且在一个图像中检测到适当数量的生物标志物分子，则通常在～100ng/ml的浓度的生物标志物以1：10000的比例稀释用以进行分析。
尽管已经参照限制的附图描述了示例性实施方案，但是本领域技术人员将理解，可以基于上述描述对实施方案进行各种技术变更和修改。例如，即使当所描述的技术可以用与所描述的方法不同的顺序执行和/或即使所描述的组件以与所描述的方法不同的形式耦合或组合，或者被其他组件或等同物取代或替换时，也可以获得适当的结果。因此，其他实施方案、其他示例以及权利要求的等同物都涵盖在所附权利要求的范围内。
<110> JL美迪乐博斯公司
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tatgtagatc 10
Claims (38)
1.一种用于检测目标物质的方法，包含a)将含有目标物质的样品引到基板上，b)使与对接股接合的检测探针特异性地结合到所述目标物质，c)引入一种或更多种能够互补地结合到所述对接股的分离股，所述对接股或所述分离股或两者以至少一种供体荧光物质和至少一种受体荧光物质标记，以及d)测量由所述供体荧光物质和所述受体荧光物质之间的FRET产生的荧光信号来识别所述目标物质。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述供体荧光物质的峰值吸收波长短于所述受体荧光物质的峰值吸收波长，并且所述供体荧光物质的峰值发射波长短于所述受体荧光物质的峰值发射波长。
3.根据权利要求1所述的方法，其中在激发所述供体荧光物质的光的波长处，所述供体荧光物质的消光系数比所述受体荧光物质的消光系数高至少3倍。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述供体荧光物质与所述受体荧光物质之间的福斯特半径为至少0.208nm。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述供体荧光物质和所述受体荧光物质经由连接子标记在所述对接股或所述分离股上。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述连接子的长度为10nm或更小。
7.根据权利要求1所述的方法，进一步包括控制滤光片的波长，使得所述荧光信号的信噪比至少为2。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述分离股包含以一种或更多种类型的供体荧光物质标记的一种或更多种类型的供体股和以一种或更多种类型的受体荧光物质标记的一种或更多种类型的受体股。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述目标物质是两种或更多种类型，并且一种或更多种供体股或受体股取决于所述目标物质的类型而具有不同的序列，或者被不同类型的荧光物质或在不同位点标记。
10.根据权利要求9所述的方法，进一步包含在识别所述目标物质之后，去除所述供体股和/或所述受体股，并使用不同于所述被去除的供体股和/或受体股的供体股和/或受体股重复步骤d)来识别其他目标物质。
11.根据权利要求8所述的方法，其中当所述供体股和所述受体股同时或顺序地结合至所述对接股时，所述供体股和所述受体股之间的间隙小于所述对接股的持久性长度。
12.根据权利要求8所述的方法，进一步包含控制所述供体股或所述受体股的浓度，使得所述供体股或所述受体股结合到所述对接股所花费的时间为10分钟或更少，同时保持所述荧光信号的信噪比为2或大于2。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述供体股或所述受体股的浓度为10nM至10μM。
14.根据权利要求8所述的方法，其中当所述对接股或所述受体股为核酸时，与所述对接股互补的所述受体股的碱基数为至少8。
15.根据权利要求14所述的方法，其中与所述对接股互补的所述供体股的碱基数为6至12。
16.根据权利要求8所述的方法，其中当所述对接股或所述受体股为核酸类似物时，与所述对接股互补的所述受体股的碱基数为至少5。
17.根据权利要求16所述的方法，其中与所述对接股互补的所述供体股的碱基数为3至9。
18.一种用于检测目标物质的方法，包含a)将含有作为目标物质的核酸或核酸类似物的样品引到基板上，b)引入一种或更多种能够互补地结合到所述目标物质的股的分离股，所述目标物质的股或所述分离股或两者以至少一种供体荧光物质和至少一种受体荧光物质标记，以及c)测量由所述供体荧光物质和所述受体荧光物质之间的FRET产生的荧光信号来识别所述目标物质。
19.根据权利要求8所述的方法，其中所述受体股或所述对接股以形成FRET对的两种或更多种类型的荧光物质标记。
20.根据权利要求19所述的方法，其中从由所述FRET对产生的荧光信号测量所述FRET效率，如以下等式所定义：
FRET效率＝(来自受体的光的强度)/(来自供体的光的强度与来自受体的光的强度的总和)。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述分离股包含以一种或更多种类型的供体荧光物质标记的一种或更多种类型的供体股，并且所述对接股包含一种或更多种类型的受体荧光物质。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述分离股包含以一种或更多种类型的受体荧光物质标记的一种或更多种类型的受体股，并且所述对接股包含一种或更多种类型的供体荧光物质。
23.一种用于检测目标物质的方法，包含a)将含有目标物质的样品引到基板上，b)使与标签股接合的检测探针特异性地结合到所述目标物质，c)以一种或更多种类型的供体荧光物质和一种或更多种类型的受体荧光物质标记所述标签股，以及d)测量由所述供体荧光物质和所述受体荧光物质之间的FRET产生的荧光信号来识别所述目标物质。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述标签股包含两个或更多个FRET对。
25.根据权利要求23所述的方法，其中由所述FRET产生的荧光信号通过由以下等式定义的FRET效率来测量：
FRET效率＝(来自受体的光的强度)/(来自供体的光的强度与来自受体的光的强度的总和)。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述FRET效率的测量包含在光漂白之前和之后测量来自所述供体或所述受体的光的亮度值。
27.根据权利要求24所述的方法，其中控制所述FRET对之间的间隙，以使得不影响每个FRET对的FRET效率。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述FRET对之间的间隙为至少5nm。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中通过确定取决于所述荧光物质之间的距离而区分的FRET效率之间的差异，来同时识别两种或更多种类型的目标物质。
30.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中通过确定来自不同类型的荧光物质之间的FRET的发射光谱之间的差异，来同时识别两种或更多种类型的目标物质。
31.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，进一步包含由所述荧光信号被成像的区域的每单位面积的目标物质的数量确定所述样品中目标物质的浓度。
32.一种用于检测目标物质的试剂盒，包含a)一种或更多种类型的特异性地结合到目标物质并与对接股接合的检测探针，以及b)一种或更多种与所述对接股互补地结合的分离股，其中所述对接股或所述分离股或两者以至少一种供体荧光物质和至少一种受体荧光物质标记，并且当所述供体荧光物质被激发时，通过在所述供体荧光物质和所述受体荧光物质之间的FRET发射光。
33.一种用于检测目标物质的试剂盒，包含一种或更多种与作为目标物质的核酸或核酸类似物的股互补地结合的分离股，其中所述分离股包含以至少一种供体荧光物质标记的供体股和以至少一种受体荧光物质标记的受体股，并且当所述供体荧光物质被激发时，通过在所述供体荧光物质和所述受体荧光物质之间的FRET发射光。
34.一种用于检测目标物质的试剂盒，包含一种或更多种类型与目标物质特异性地结合并与标签股接合的检测探针，其中所述标签股包含一种或更多种类型的供体荧光物质和一种或更多种类型的受体荧光物质，并且当所述供体荧光物质被激发时，通过在所述供体荧光物质和所述受体荧光物质之间的FRET发射光。
35.根据权利要求32至34中任一项所述的试剂盒，进一步包含可以捕获所述目标物质的基板。
36.根据权利要求35所述的试剂盒，其中将一种或更多种类型的捕获探针固定到所述基板上以捕获所述目标物质。
37.根据权利要求36所述的试剂盒，其中所述捕获探针与所述标签股接合。
38.根据权利要求37所述的试剂盒，进一步包含互补地结合到所述检测探针的标签股和所述捕获探针的标签股的桥股，以形成FRET对。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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