WO2018073872A1 - 標的核酸分子の検出方法 - Google Patents

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nucleic acid
acid molecule
target nucleic
fluorescent substance
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拓哉 葉梨
田邊　哲也
健志 花見
林崎　良英
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オリンパス株式会社
国立研究開発法人理化学研究所
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    • G01N2021/6441—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks with two or more labels

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a target nucleic acid molecule with high sensitivity by using fluorescence resonance energy transfer (FRET).
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • a method of detecting a target nucleic acid molecule by using FRET is known (for example, see Patent Document 1).
  • a donor probe to which a fluorescent substance (donor dye) serving as an energy donor for FRET is bound and an acceptor probe to which a fluorescent substance (acceptor dye) serving as an energy acceptor are bound are adjacent to each other in the target nucleic acid molecule.
  • Two regions are associated (hybridized).
  • the acceptor dye and the donor dye are close to each other.
  • the aggregate is irradiated with light having the excitation wavelength of the donor dye, the excited donor FRET occurs from the dye and fluorescence from the acceptor dye is generated.
  • FRET does not occur in the target nucleic acid molecule to which either probe is not bound, and fluorescence from the acceptor dye cannot be obtained.
  • the method is used for detection and quantification of the target nucleic acid molecule.
  • Patent Documents 2 and 3 include a nucleic acid probe labeled with a fluorescent atomic group exhibiting exciton effect (exciton coupling). The method used is disclosed.
  • the exciton effect is an effect in which, for example, a plurality of dyes gather in parallel to form an H aggregate (H-aggregate), so that almost no fluorescence is emitted.
  • the probe having an exciton effect (E probe) emits little fluorescence in the free state, but emits fluorescence because the H aggregate is dissociated by associating with the target nucleic acid molecule.
  • the amount of detected fluorescence is significantly smaller than when using a probe labeled with a normal single fluorescent dye, and the target nucleic acid molecule The detection efficiency decreases.
  • An object of the present invention is to provide a method for detecting a target nucleic acid molecule with high sensitivity using FRET, and a probe set used for the method.
  • the present inventors have formed an aggregate in a target nucleic acid molecule so that two donor probes are arranged at a position sandwiching one acceptor probe, and one acceptor.
  • the present inventors have found that the fluorescence intensity from the acceptor probe can be enhanced by supplying fluorescence resonance energy from two donor probes to the probe, thereby completing the present invention.
  • the target nucleic acid molecule detection method and probe set according to the present invention are the following [1] to [11].
  • [1] (a) a nucleic acid-containing sample, a first probe labeled with a first fluorescent substance serving as an energy donor in a fluorescence resonance energy transfer phenomenon, an energy acceptor in a fluorescence resonance energy transfer phenomenon; Mixing a second probe labeled with a second fluorescent substance and a third probe labeled with the first fluorescent substance to prepare a sample solution; (B) associating the target nucleic acid molecule in the sample solution prepared in the step (a) with the first probe, the second probe, and the third probe, and Forming an assembly comprising a second probe, the third probe, and the target nucleic acid molecule; (C) After the step (b), the sample solution is irradiated with light having an excitation wavelength of the first fluorescent substance, and the target nucleic acid molecule is released from the second fluorescent substance in the aggregate.
  • the method for detecting a target nucleic acid molecule wherein a region associated with the second probe in the target nucleic acid molecule is between a region associated with the first probe and a region associated with the third probe.
  • the first probe, the second probe, or the third probe is a probe whose emission luminance changes depending on whether the target nucleic acid molecule is associated with or not associated with the target nucleic acid molecule, [1] The method for detecting a target nucleic acid molecule.
  • the method for detecting a target nucleic acid molecule according to [2], wherein the first fluorescent substance or the second fluorescent substance is a fluorescent atomic group exhibiting an exciton effect.
  • a base in the target nucleic acid molecule with which a base to which the first fluorescent substance in the first probe is bound is associated, and the second fluorescent substance in the second probe
  • the distance from the base in the target nucleic acid molecule to which the bound base is associated is 8 bases or less;
  • the base in the target nucleic acid molecule to which the base to which the first fluorescent substance in the third probe is bound is associated with the second fluorescent substance in the second probe.
  • the method for detecting a target nucleic acid molecule according to any one of [1] to [4], wherein the base length of the second probe is 5 to 17 bases.
  • the nucleic acid-containing sample includes a first target nucleic acid molecule associated with the first probe, the second probe, and the third probe, and the first probe and the third probe.
  • a second target nucleic acid molecule that binds only to either one of the second probes and
  • the sample solution is irradiated with light having an excitation wavelength of the first fluorescent substance, and the luminance of the fluorescence emitted from the second fluorescent substance in a single molecule aggregate is used as an index.
  • a probe set for detecting a target nucleic acid molecule A first probe in which a single-stranded nucleic acid molecule associated with the target nucleic acid molecule is labeled with a first fluorescent substance serving as an energy donor in a fluorescence resonance energy transfer phenomenon; A second probe in which a single-stranded nucleic acid molecule associated with the target nucleic acid molecule is labeled with a second fluorescent substance serving as an energy acceptor in a fluorescence resonance energy transfer phenomenon; A single-stranded nucleic acid molecule associated with the target nucleic acid molecule, a third probe labeled with the first fluorescent substance; With The first probe, the second probe, and the third probe are the target nucleic acid molecule, and the third probe is opposite to the first probe with respect to the second probe.
  • the first probe, the second probe, or the third probe is a probe whose emission luminance changes in a state where it is associated with the target nucleic acid molecule and in a state where it is not associated with the target nucleic acid molecule, [7] Probe set.
  • the aggregate is The base in the target nucleic acid molecule to which the base to which the first fluorescent substance in the first probe is bound is associated with the second fluorescent substance in the second probe.
  • the distance from the base in the target nucleic acid molecule with which the base is associated is 8 bases or less
  • the base in the target nucleic acid molecule to which the base to which the first fluorescent substance in the third probe is bound is associated with the second fluorescent substance in the second probe.
  • the probe set according to any one of [7] to [9] above, wherein the distance from the base in the target nucleic acid molecule with which the base is associated is 8 bases or less.
  • the probe set according to any one of [7] to [10], wherein the base length of the second probe is 5 to 17 bases.
  • the detection method for detecting a target nucleic acid molecule since fluorescence resonance energy is supplied from two donor probes to one acceptor probe, conventional FRET using one acceptor probe and one donor probe is used. Compared with the detection method used, the fluorescence intensity emitted from the aggregate consisting of the target nucleic acid molecule, the acceptor probe, and the donor probe is large. For this reason, the detection efficiency of a target nucleic acid molecule can be improved by using the said detection method. Moreover, the detection method can be carried out simply and easily by using the probe set according to the present invention.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of an aggregate formed by each probe and a target nucleic acid molecule in a detection method using a conventional FRET probe (left) and a detection method according to the present invention (right).
  • FIG. 2 is a diagram showing the measurement results of the fluorescence luminance of each sample solution in Example 1.
  • FIG. 3 is a diagram showing the measurement results of the number of molecules of aggregates in each sample solution measured by SSMC in Example 1.
  • FIG. 4 is a diagram showing the measurement results of the fluorescence luminance of each sample solution in Reference Example 1.
  • FIG. 5 is a diagram showing the measurement results of the number of molecules of aggregates in each sample solution measured by SSMC in Reference Example 1.
  • FIG. 6 is a diagram showing the measurement results of the number of molecules of aggregates in each sample solution measured by SSMC in Reference Example 2.
  • the method for detecting a target nucleic acid molecule according to the present invention is a method for detecting a target nucleic acid molecule using a FRET probe, and in the FRET phenomenon.
  • a third probe labeled with is used.
  • the “first fluorescent substance” may be referred to as “donor fluorescent substance”
  • the “second fluorescent substance” may be referred to as “acceptor fluorescent substance”.
  • the first probe and the third probe labeled with a donor fluorescent substance are so-called donor probes, and the second probe labeled with an acceptor fluorescent substance is a so-called acceptor probe.
  • one acceptor probe and two donor probes are arranged and associated with one target nucleic acid molecule so that the two donor probes sandwich the acceptor probe.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of an aggregate formed by each probe and a target nucleic acid molecule in a detection method using a conventional FRET probe and the detection method according to the present invention.
  • FRET is caused by associating one acceptor probe and one donor probe adjacent to each other with respect to one molecule of a target nucleic acid molecule (left figure).
  • first probe and third probe are used as acceptor probes (second probes) for the target nucleic acid molecule. Since they are arranged so as to be sandwiched and associated with each other, fluorescence resonance energy is supplied from two donor probes to one acceptor probe (right figure). Theoretically, the amount of fluorescence resonance energy supplied to the acceptor is about twice that of the conventional method, the brightness of the fluorescence emitted from the acceptor is enhanced, and the detection sensitivity of the aggregate is improved.
  • the donor fluorescent substance and the acceptor fluorescent substance used in the present invention may be a combination of substances that generate FRET when sufficiently close to each other and do not inhibit the formation of aggregates. It can be used by appropriately selecting from the substances used. For example, combining PE (phycoerythrin) as a donor fluorescent substance, Cy5, Cy5.5, Texas Red (registered trademark), Alexa fluor (registered trademark) 610, Alexa fluor 647, and Alexa fluor 680 as an acceptor fluorescent substance. Can be used. APC (allophycocyanin) can be used as a donor fluorescent material, and Cy5.5 can be used as an acceptor fluorescent material in combination.
  • the first probe, the second probe, and the third probe used in the present invention can be probes whose emission luminance changes in a state where they are associated with a target nucleic acid molecule and in a state where they are not associated. .
  • a probe that has a low emission intensity when not associated with a target nucleic acid molecule and a high emission intensity when associated with a target nucleic acid molecule a background for detecting fluorescence of FRET is used. And noise can be suppressed, and the detection sensitivity of the target nucleic acid molecule can be further increased.
  • a probe whose emission luminance changes in a state where it is associated with a target nucleic acid molecule and a state where it is not associated with the target nucleic acid molecule can be obtained.
  • Both the donor fluorescent material and the acceptor fluorescent material may be a fluorescent atomic group exhibiting an exciton effect, and either one may be a fluorescent atomic group exhibiting an exciton effect.
  • the donor fluorescent material is preferably a fluorescent atomic group exhibiting an exciton effect.
  • Fluorescent atomic groups exhibiting exciton effects include thiazole orange and its derivatives, oxazole yellow and its derivatives, cyanine and its derivatives, hemicyanine and its derivatives, methyl red and its derivatives, and other commonly called cyanine dyes and azo dyes
  • a dye group is mentioned.
  • cyanine dyes include Cy5 and Cy5.5.
  • known dyes that change fluorescence intensity by binding to nucleic acids such as DNA fluorescent dyes that change fluorescence intensity according to microscopic polarity, and groups derived therefrom are also used as appropriate. Can do.
  • Examples of the fluorescent dye that changes the fluorescence intensity by binding to a nucleic acid include ethidium bromide.
  • Examples of the fluorescent dye whose fluorescence intensity changes according to the microscopic polarity include pyrenecarboxamide and prodan. In addition, it can be used as a fluorescent atomic group showing an exciton effect using fluorescein.
  • the probe exhibiting an exciton effect may be obtained by binding a fluorescent atomic group exhibiting one exciton effect directly or indirectly via an appropriate linker to a single-stranded nucleic acid molecule for associating with a target nucleic acid molecule,
  • a single-stranded nucleic acid molecule for associating with a target nucleic acid molecule may be bound in the state of proximity to at least two fluorescent atomic groups exhibiting exciton effects.
  • one base in a single-stranded nucleic acid molecule for associating with a target nucleic acid molecule can be represented by the following general formula (1).
  • the thing which combined the group which consists of structures can be mentioned (refer patent document 2).
  • A is CR, N, P, PO, B, or SiR, and R is a hydrogen atom, an alkyl group, or an arbitrary substituent.
  • B 1 , B 2 and B 3 are linkers (bridge atoms or atomic groups), and the main chain length is arbitrary.
  • the main chain may or may not contain C, N, O, P, B, Si, S, single bond, double bond, triple bond, amide bond, ester bond, disulfide bond, imino group, ether A bond, a thioether bond, and a thioester bond may or may not be included.
  • B 1 , B 2 and B 3 may be the same as or different from each other.
  • the group having the structure of the general formula (1) binds to a side chain in the base constituting the single-stranded nucleic acid molecule in B 3 (asterisk in the formula (1)).
  • C 1 and C 2 are fluorescent atomic groups that exhibit an exciton effect, and may be the same or different.
  • Examples of the fluorescent atomic group exhibiting the exciton effect include those listed above.
  • it can also be set as the atomic group represented by the following general formula (2) or general formula (3).
  • R 1 and R 2 are each independently a hydrogen atom, a halogen atom, an alkyl group, an alkoxy group, a nitro group, a cyano group, a carbonyl group, a carboxyl group, an amino group, a silyl group, or a boryl group.
  • AR is an arbitrary aromatic ring and may or may not be present.
  • C 1 or C 2 in general formula (1) is an atomic group represented by general formula (2) or general formula (3)
  • E, AR, n and R 1 to R 12 in C 1 and E, AR, n, and R 1 to R 12 in C 2 may be the same as or different from each other.
  • the first probe and the third probe are each obtained by labeling a single-stranded nucleic acid molecule that is associated with a target nucleic acid molecule with a donor fluorescent substance.
  • the second probe is obtained by labeling a single-stranded nucleic acid molecule associated with a target nucleic acid molecule with an acceptor fluorescent substance.
  • Each probe may bind a donor fluorescent substance or an acceptor fluorescent substance directly to a single-stranded nucleic acid molecule associated with a target nucleic acid molecule, or indirectly through a linker. Examples of the linker include a single-stranded nucleic acid molecule having a length of 1 to 10 bases.
  • the binding between the donor fluorescent substance or the acceptor fluorescent substance and the single-stranded nucleic acid molecule or the linker associated with the target nucleic acid molecule can be performed by a conventional method.
  • the base sequence of the single-stranded nucleic acid molecule associated with the target nucleic acid molecule in each probe is designed based on the base sequence information of the target nucleic acid molecule. For designing, a commonly used primer / probe design software can also be used.
  • the first probe, the second probe, and the third probe are the target nucleic acid molecule and the aggregate so that the third probe is disposed on the opposite side of the first probe with respect to the second probe.
  • the region that associates with the second probe (“R2” in FIG. 1) is the region that associates with the first probe (“R1” in FIG. 1) and the third probe.
  • the base sequence of the single-stranded nucleic acid molecule that associates with the target nucleic acid molecule of each probe is designed so as to be between the regions to be associated (“R3” in FIG. 1).
  • the region associated with the second probe and the region associated with the first probe may be adjacent to each other or may be separated by 1 to 5 bases.
  • the region associated with the second probe and the region associated with the third probe may be adjacent to each other or may be separated by 1 to 5 bases.
  • the donor fluorescent substance in the first probe and the acceptor fluorescent substance in the second probe, and the donor fluorescent substance in the third probe and the second probe FRET needs to occur between the acceptor fluorescent substance in the probe. Therefore, the region associated with the first probe, the region associated with the second probe, and the region associated with the third probe in the target nucleic acid molecule are the donor fluorescent substance and the second probe in the first probe.
  • the distance between the acceptor phosphor in the third probe and the acceptor phosphor in the second probe is FRET so that the distance between the acceptor phosphor in the second probe is sufficiently short for FRET to occur.
  • the base in the target nucleic acid molecule to which the base to which the acceptor fluorescent substance in the second probe binds associates is 8 bases or less, preferably 6 bases or less, more preferably 4 bases or less.
  • the region associated with the third probe and the region associated with the second probe in the target nucleic acid molecule are the regions in the target nucleic acid molecule associated with the base to which the donor fluorescent substance in the third probe is associated.
  • the distance between the base and the base in the target nucleic acid molecule to which the base to which the acceptor fluorescent substance in the second probe is associated is 8 bases or less, preferably 6 bases or less, more preferably 4 bases or less.
  • the base to which the acceptor fluorescent substance is bound is preferably at or near the center of the probe, and the base length is preferably 5 to 17 bases.
  • the base sequence of the single-stranded nucleic acid molecule that associates with the target nucleic acid molecule in each probe may be a sequence that can specifically associate with the target region of the target nucleic acid molecule.
  • the base sequence of the single-stranded nucleic acid molecule associated with the target nucleic acid molecule in the first probe is preferably a sequence complementary to the region associated with the first probe designed in the target nucleic acid molecule.
  • a sequence having a mismatch in which 1 to 5 bases are substituted, deleted, or inserted into a sequence complementary to the base sequence of the region may be used.
  • the base sequence of the single-stranded nucleic acid molecule that associates with the target nucleic acid molecule is the region associated with the second probe designed in the target nucleic acid molecule and the first probe.
  • the sequence complementary to the region associated with the probe 3 is preferably a sequence having a mismatch in which 1 to 5 bases are substituted, deleted, or inserted into the sequence complementary to the base sequence of the region. There may be.
  • the base length of the single-stranded nucleic acid molecule that associates with the target nucleic acid molecule in the first probe and the third probe is not particularly limited as long as it can specifically associate with the target region of the target nucleic acid molecule. And can be the same as a general probe. Specifically, for example, it can be 15 to 50 bases, preferably 15 to 35 bases.
  • the target nucleic acid molecule may be composed of only natural nucleotides such as DNA or RNA, 2′-O-methyl RNA, or may be an artificial nucleic acid molecule partially or entirely containing an artificial nucleotide. .
  • the single-stranded nucleic acid molecule associated with the target nucleic acid molecule in each probe may be composed only of natural nucleotides such as DNA, RNA, 2′-O-methyl RNA, or a part of artificial nucleotides or It may be an artificial nucleic acid molecule contained in all.
  • “Artificial nucleotide” means an artificially synthesized nucleotide having a structure different from that of a natural nucleotide but capable of functioning in the same manner as a natural nucleotide.
  • “can function in the same manner as a natural nucleotide” means that a nucleic acid molecule can be formed by a phosphodiester bond or the like as in a natural nucleotide.
  • BNA Bridged nucleic acid
  • ENA ENA (2′-O, 4′-C-ethylene-crosslinked nucleic acid
  • PNA peptide nucleic acid
  • GAA glycol nucleic acid
  • threose examples include nucleic acid (TNA) and HNA (Hexitol Nucleic Acid).
  • BNA is a nucleic acid in which part of a natural nucleotide is cross-linked, and is a cross-linked artificial nucleotide in which the 2′-position oxygen atom and the 4′-position carbon atom of the ribose ring are bonded via methylene. Contains some LNA (Locked nucleic acid).
  • a single-stranded nucleic acid molecule associated with the target nucleic acid molecule in the second probe has a relatively short base length, in order to specifically associate with the target region of the target nucleic acid molecule, LNA, ENA, etc. It is preferable to include an artificial nucleotide with artificially enhanced recognition ability.
  • the detection method includes the following steps (a) to (c).
  • C After the step (b), the sample solution is irradiated with light having an excitation wavelength of the first fluorescent substance, and the target nucleic acid molecule is released from the second fluorescent substance in the aggregate. Detecting the emitted fluorescence as an index.
  • the target nucleic acid molecule means a nucleic acid molecule having a specific base sequence (target base sequence) that is a detection target.
  • the target nucleic acid molecule is not particularly limited as long as the base sequence information is clarified to such an extent that the first probe or the like can be designed.
  • it may be a nucleic acid molecule having a base sequence present in animal or plant chromosomes, bacterial or viral genes, or a nucleic acid molecule having an artificially designed base sequence.
  • the target nucleic acid molecule may be a double-stranded nucleic acid or a single-stranded nucleic acid.
  • any of DNA and RNA may be sufficient. Examples of the target nucleic acid molecule include mRNA, hnRNA, genomic DNA, synthetic DNA obtained by PCR amplification, cDNA synthesized from RNA using reverse transcriptase, and the like.
  • the nucleic acid-containing sample is not particularly limited as long as it is a sample containing nucleic acid molecules.
  • the nucleic acid-containing sample include biological samples collected from animals and the like, samples prepared from cultured cells, and reaction solutions after nucleic acid synthesis reaction.
  • the nucleic acid-containing sample may be a biological sample itself, or a nucleic acid solution extracted and purified from a biological sample.
  • a sample solution is prepared by mixing a nucleic acid-containing sample and three kinds of probes.
  • an appropriate solvent may be added as necessary.
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not inhibit FRET between the donor fluorescent material and the acceptor fluorescent material or detection of fluorescence emitted from the acceptor fluorescent material. It can be used by appropriately selecting from the buffers used.
  • the buffer include a phosphate buffer such as PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4), a Tris buffer, and the like.
  • a surfactant may be added to the sample solution in advance in order to suppress non-specific association between each probe and a nucleic acid molecule other than the target nucleic acid molecule.
  • a surfactant may be added alone or in combination of two or more. By adding these compounds, non-specific association can be made difficult to occur in a relatively low temperature environment.
  • step (b) the target nucleic acid molecule in the sample solution prepared in step (a) is associated with the three types of probes to form an aggregate.
  • the target nucleic acid molecule and each probe first, all the nucleic acid molecules in the sample solution are denatured and then an aggregate is formed.
  • “denaturing a nucleic acid molecule” means dissociating base pairs.
  • thermal modification high-temperature treatment
  • modification by low salt concentration treatment it is preferable to perform heat denaturation because the operation is simple. Denaturing conditions depend on the target nucleic acid molecule and the base sequence and base length of each probe. For example, heat denaturation is generally performed by incubating the sample solution at 90 to 100 ° C. when the target nucleic acid molecule or probe is DNA, or at 70 ° C. when RNA is used for several seconds to 2 minutes. Can be made.
  • denaturation by low salt concentration treatment can be performed by adjusting the sample solution to have a sufficiently low salt concentration by, for example, dilution with purified water or the like.
  • the temperature of the sample solution is lowered to a temperature at which the target nucleic acid molecule and each probe can associate with each other.
  • An association of the probe, the second probe, and the third probe can be formed.
  • the Tm value of single-stranded nucleic acid molecules associated with the target nucleic acid molecule in each probe is lowered to a temperature of about ⁇ 3 ° C.
  • the temperature is lowered to the lowest Tm value of about ⁇ 3 ° C.
  • the target nucleic acid molecule and each probe can be associated with each other in the same manner by adding a salt solution after the low salt concentration treatment.
  • a salt solution By raising the concentration, an aggregate of the target nucleic acid molecule, the first probe, the second probe, and the third probe in the sample solution can be formed.
  • the Tm value of a single-stranded nucleic acid molecule associated with the target nucleic acid molecule of each probe can be calculated by using a commonly used primer / probe design software or the like.
  • the sample solution is irradiated with the light having the excitation wavelength of the donor fluorescent material, and the fluorescence of the fluorescence wavelength of the acceptor fluorescent material is detected.
  • the donor fluorescence in the first probe FRET occurs between the substance and the acceptor fluorescent substance in the second probe and between the donor fluorescent substance in the third probe and the acceptor fluorescent substance in the second probe. Fluorescence is emitted from the fluorescent material.
  • the target nucleic acid molecule, the first probe, the second probe, and the third probe are measured by measuring the fluorescence signal of the fluorescence wavelength of the acceptor fluorescent substance that is detected by emitting light having the excitation wavelength of the donor fluorescent substance. Can be detected.
  • the target nucleic acid molecule is contained in the nucleic acid-containing sample, when light having the excitation wavelength of the donor fluorescent material is emitted, fluorescence at the fluorescence wavelength of the acceptor fluorescent material is detected.
  • the target nucleic acid molecule is not contained in the nucleic acid-containing sample, the fluorescence of the acceptor fluorescent material is not detected when the light of the excitation wavelength of the donor fluorescent material is emitted.
  • the method for measuring the fluorescence signal at the fluorescence wavelength of the acceptor fluorescent substance released from the aggregate containing the target nucleic acid molecule in the sample solution is not particularly limited, and even if the fluorescence intensity of the entire sample solution is measured.
  • a method of detecting and measuring molecules emitting fluorescence in the sample solution for each molecule may be used.
  • the fluorescence intensity of the sample solution can be measured by a conventional method using a fluorescence spectrophotometer such as a fluorescence plate reader.
  • the fluorescence intensity at the fluorescence wavelength of the acceptor fluorescent substance in the sample solution depends on the amount of the aggregate of the target nucleic acid molecule and the three probes contained in the sample solution. For this reason, for example, by preparing a calibration curve indicating the relationship between the amount of the acceptor fluorescent substance to be detected and the fluorescence intensity in advance, the amount of the aggregate containing the target nucleic acid molecule in the sample solution, that is, the nucleic acid The amount of target nucleic acid molecule in the contained sample can be quantified.
  • a scanning molecule counting method (Scanning) single-molecule counting, SSMC) (International Publication No. 2012/102260), a fluorescence correlation spectroscopy (Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCS). ), Fluorescence intensity distribution analysis (FluorecscencescIntensity Distribution, FIDA), and fluorescence polarization intensity distribution analysis (FIDA polarization, FIDA-PO).
  • SSMC scanning molecule counting method
  • FCS Fluorescence Correlation Spectroscopy
  • FIDA Fluorescence intensity distribution analysis
  • FIDA-PO fluorescence polarization intensity distribution analysis
  • Such detection and analysis of a single molecule fluorescence signal can be performed by a conventional method using, for example, a known single molecule fluorescence analysis system such as MF20 (manufactured by Olympus).
  • an assembly formed by two donor probes (first probe and third probe), one acceptor probe (second probe), and a target nucleic acid molecule is one donor probe (first probe).
  • the intensity of the fluorescence emitted from the acceptor by FRET is stronger than the association formed by the probe or the third probe), one acceptor probe (second probe), and the target nucleic acid molecule.
  • the detection method according to the present invention distinguishes and detects two types of target nucleic acid molecules (first target nucleic acid molecule and second target nucleic acid molecule) having similar base sequences. You can also
  • first, the first probe, the second probe, and the third probe are all associated with the first target nucleic acid molecule to form an aggregate.
  • the second target nucleic acid molecule is associated with the second probe, the first probe and the third probe are designed to associate with only one of them.
  • step (c) when light having an excitation wavelength of the first fluorescent substance is emitted to the sample solution, the luminance of the fluorescence emitted from the acceptor in the aggregate is one donor in the aggregate.
  • the first aggregate containing two donor probes in the aggregate is stronger than the second aggregate containing only the probe. Therefore, the first target nucleic acid molecule contained in the first aggregate and the second group using the luminance of fluorescence emitted from the acceptor (second fluorescent substance) in the aggregate of one molecule as an index.
  • the second target nucleic acid molecule contained in the coalescence can be detected separately.
  • the molecule with the brighter fluorescence emitted from the acceptor by FRET is the first aggregate containing the first target nucleic acid molecule, and the darker molecule is A second aggregate comprising a second target nucleic acid molecule.
  • the luminance value of the fluorescence emitted from the acceptor is used as an index to detect the first aggregate and the second aggregate separately, the number of molecules of the first target nucleic acid molecule in the sample solution and the second The abundance ratio of the first target nucleic acid molecule and the second target nucleic acid molecule in the sample solution can also be calculated from the number of molecules of the target nucleic acid molecule.
  • the detection method according to the present invention can also be used for detection of genetic polymorphism.
  • the mutant type is the first target nucleic acid molecule
  • the wild type is the second target nucleic acid molecule
  • the first probe and the second probe are the bases of the wild type and the mutant type.
  • the sequence is designed to associate with a common region so that the third probe associates with the mutant first target nucleic acid molecule but not with the wild-type second target nucleic acid molecule. design.
  • the aggregate containing the wild-type target nucleic acid molecule is detected as a molecule having low fluorescence luminance
  • the aggregate containing the mutant target nucleic acid molecule is detected as a molecule having strong fluorescence luminance.
  • the abundance ratio between the mutant nucleic acid molecule and the wild-type nucleic acid molecule in the nucleic acid-containing sample can be determined.
  • the first probe, the second probe, and the third probe are set as a set.
  • the detection method according to the present invention can be carried out more easily and simply.
  • the kit can contain various buffers used for preparing a sample solution, an incubator with a thermostat used for denaturation treatment and aggregate formation, and the like.
  • Example 1 Any concentration of target nucleic acid molecule was detected using two donor probes and one acceptor probe.
  • ⁇ 1> Formation of an association of two donor probes, one acceptor probe, and target DNA Final DNA concentration of 0 to 100 mM of target DNA (5'-AGAGCTACGAGCTGCCTGACGGCCAGGTCATCACCCATTGCAATGAGCGGTTC-3 ', SEQ ID NO: 1), final concentration of 20 nM donor probe a (5′-GAACCGCCTCATGCCCAATGGTGATG-3 ′, SEQ ID NO: 2, probe modified with a fluorescent group in which thiazole orange was doubled at the second T), donor probe b (5′-GTCAGCGCGCTCGTTAGCTCTTC-3) ', A probe in which a fluorescent atomic group having 2 thiazole oranges in the 2nd T is modified), acceptor probe a (5'-A) having a final concentration of 20 nM CTGGCC-3 ′, SEQ ID NO: 4, probe in which fluorescent substance ATTO633 is modified at the 4th T.
  • target DNA 5'-AGAGCTACGAGCTGCCTGACGGCCAG
  • sample solution 1-1 Base other than 4th T is ENA.
  • Reaction buffer (10 mM Tris-HCl, 400 mM)
  • a sample solution (sample solution 1-1) was prepared by dissolving in NaCl, 0.05% Triton X-100). The prepared sample solution 1-1 was incubated at 95 ° C. for 10 seconds using a thermal cycler, and then the temperature was lowered to 25 ° C. and incubated for 30 minutes.
  • sample solution 1-2 was prepared in the same manner as in the above ⁇ 1>, except that a probe with a fluorescent substance ATTO633 modified at ⁇ 3 ′, SEQ ID NO: 5, 5 ′ end was used. The obtained sample solution 1-2 was incubated at 95 ° C. for 10 seconds using a thermal cycler, and then the temperature was lowered to 25 ° C. and incubated for 30 minutes.
  • ⁇ 3> Measurement of aggregate in sample solution by SSMC
  • each sample solution was measured using a single-molecule fluorescence measuring apparatus MF-20 (Olympus Co., Ltd.) equipped with a confocal fluorescence microscope optical system and a photon counting system. Intensity data (photon count data) was obtained.
  • the sample solution was excited with a laser of 488 nm and 300 ⁇ W which is the excitation wavelength of thiazole orange, and fluorescence of 600 to 660 nm which is the fluorescence wavelength of ATTO633 was detected using a bandpass filter.
  • the light detection area in the sample solution was moved at a moving speed of 15 mm / second, and measurement was performed for 20 seconds. Further, the BIN TIME was set to 10 ⁇ s, and the time series light intensity data obtained by the measurement was smoothed, and then the peak was detected by differentiation. Among the regions regarded as peaks, peak intensities that can be approximated to a Gaussian function and have an intensity of 0.8 or more were extracted.
  • the measurement results of the fluorescence luminance of each sample solution are shown in FIG. As a result, it was observed that the fluorescence intensity of the fluorescence wavelength of ATTO 633 increased in any sample solution depending on the concentration of the target DNA. In particular, the fluorescence intensity was saturated at a target DNA concentration of 30 nM, and it was considered that all probes formed aggregates with the target DNA.
  • the fluorescence luminance of each sample solution is compared, in the sample solution 1-1 using two donor probes at the saturation point (sample solution having a target DNA concentration of 30 nM), the sample solution 1 using one donor probe 1- As compared with 2, the fluorescence brightness was about twice. Therefore, it was shown that the fluorescence intensity increases by arranging two donor probes for one acceptor probe.
  • FIG. 3 shows the measurement results of the number of associated molecules in each sample solution measured by SSMC.
  • the number of detected molecules in SSMC is as follows. At the saturation point (target DNA concentration: 30 nM), in the sample solution 1-1 using two donor probes, the fluorescence is different from that in the sample solution 1-2 using one donor probe. The brightness has increased 10 times. It was thought that this was because the detection efficiency of one molecule was improved by increasing the fluorescence intensity per molecule.
  • target DNA-1 (5′-AACTATACAACGGGGCTGAA-3 ′, SEQ ID NO: 6), target DNA-2 (5′-AACTATACAACGGGGCTGAAGGGCTGAA-3 ′, SEQ ID NO: 7), target DNA-3 (5′-AACTATACAACGGGGCTGAAGGGCTGAAGGGCTGAA- 3 ′, SEQ ID NO: 8), target DNA-4 (5′-AACTATACAACGGGGCTGAAGGGCTGAAGGGCTGAAGGGCTGAA-3 ′, SEQ ID NO: 9), target DNA-5 (5′-AACTATACAACGGGCTGGAAGGGCTGAAGGGCTGAAGGGCTGAAGGGCTGAA-3 ′) Target DNA-1 to target DNA-5 are associated with 1 to 5 donor probes in the same direction with respect to the acceptor probe.
  • sample solutions containing target DNA-1 to target DNA-5 were designated as sample solution 2-1 to sample solution 2-5, respectively.
  • sample solution 2-0 a sample solution prepared in the same manner except that no target DNA was added was designated as sample solution 2-0.
  • each sample solution was incubated at 95 ° C. for 10 seconds using a thermal cycler, and then the temperature was lowered to 25 ° C. and incubated for 30 minutes.
  • FIG. 4 shows the measurement result of the fluorescence luminance of each sample solution
  • FIG. 5 shows the measurement result of the number of molecules of the aggregates in each sample solution measured by SSMC. 4 and 5, “N” indicates the result of the sample solution 2-0, and “1-repeat” to “5-repeat” indicate the results of the sample solution 2-1 to the sample solution 2-5, respectively.
  • N indicates the result of the sample solution 2-0
  • 1-repeat” to “5-repeat” indicate the results of the sample solution 2-1 to the sample solution 2-5, respectively.
  • FIG. 4 There was no difference in brightness (FIG. 4). Therefore, it was shown that even when a plurality of donor probes are arranged on one side of the acceptor probe, the fluorescence intensity emitted from the aggregate does not increase. Further, as shown in FIG. 5, the same behavior was shown with respect to the number of detected molecules. That is, it has been clarified that the effect of increasing the fluorescence luminance cannot be obtained unless the donor probes are arranged on both sides of the acceptor probe as in Example 1.
  • Target DNA-1 (5′-TGAGGGTAGTAGTTGTTAGTT-3 ′, SEQ ID NO: 13) having a final concentration of 20 mM
  • Donor probe-1 having a final concentration of 20 nM
  • acceptor probe having a final concentration of 20 nM -1 (5′-AACTATACAAC-3 ′, SEQ ID NO: 15, probe modified with fluorescent substance ATTO633 at the 3 ′ end) (10 mM Tris-HCl, 400 mM NaCl, 0.05% Triton) X-100) to prepare a sample solution (sample solution 3-1).
  • each sample solution was incubated at 95 ° C. for 10 seconds using a thermal cycler, and then the temperature was
  • ⁇ 2> Formation of an aggregate in which the distance between the acceptor fluorescent substance and the donor fluorescent substance is 4 bases on the target nucleic acid molecule.
  • Donor probe-2 (5′-CACTACTCTCA-3) is used as a donor probe instead of donor probe-1.
  • a sample solution (sample solution 3-2) in the same manner as in the above ⁇ 1> except that a probe having a modified fluorescent atomic group with two thiazole oranges in the fifth T is used. was prepared. Next, each sample solution was incubated at 95 ° C. for 10 seconds using a thermal cycler, and then the temperature was lowered to 25 ° C. and incubated for 30 minutes.
  • ⁇ 3> Formation of an aggregate in which the distance between the acceptor fluorescent substance and the donor fluorescent substance is 8 bases on the target nucleic acid molecule Donor probe-3 (5′-CACTACTCTCA-3) instead of donor probe-1 as a donor probe ', A sample solution (sample solution 3-3) in the same manner as in the above ⁇ 1> except that a probe having a modified fluorescent atomic group in which thiazole orange is doubled at the 9th T is used. was prepared. Next, each sample solution was incubated at 95 ° C. for 10 seconds using a thermal cycler, and then the temperature was lowered to 25 ° C. and incubated for 30 minutes.
  • sample solution 3-4 Formation of an aggregate in which the distance between the acceptor fluorescent substance and the donor fluorescent substance is 13 bases on the target nucleic acid molecule
  • Target DNA-2 (5′-GTTGTAGTAGTTGAGGTAGTAG-) instead of target DNA-1 as the target nucleic acid molecule
  • a sample solution was prepared in the same manner as in the above ⁇ 3> except that 3 ′ and SEQ ID NO: 16) were used. Next, each sample solution was incubated at 95 ° C. for 10 seconds using a thermal cycler, and then the temperature was lowered to 25 ° C. and incubated for 30 minutes.
  • ⁇ 5> Formation of an aggregate in which the distance between the acceptor fluorescent substance and the donor fluorescent substance is 17 bases on the target nucleic acid molecule.
  • the target nucleic acid molecule is the above except that target DNA-2 is used instead of target DNA-1.
  • a sample solution (Sample Solution 3-5) was prepared. Next, each sample solution was incubated at 95 ° C. for 10 seconds using a thermal cycler, and then the temperature was lowered to 25 ° C. and incubated for 30 minutes.
  • ⁇ 6> Formation of an aggregate in which the distance between the acceptor fluorescent substance and the donor fluorescent substance is 20 bases on the target nucleic acid molecule.
  • the target nucleic acid molecule is the above except that target DNA-2 is used instead of target DNA-1.
  • a sample solution (Sample Solution 3-6) was prepared. Next, each sample solution was incubated at 95 ° C. for 10 seconds using a thermal cycler, and then the temperature was lowered to 25 ° C. and incubated for 30 minutes.
  • FIG. 6 shows the measurement results of the number of associated molecules in each sample solution measured by SSMC.
  • “1 base”, “4 bases”, “8 bases”, “13 bases”, “17 bases”, and “20 bases” indicate the results of sample solution 3-1 to sample solution 3-6, respectively.
  • the sample solution 3-2 showed the maximum number of detected molecules
  • the sample solution 3-3 maintained the number of detected molecules of 10% or more of the number of detected molecules of the sample solution 3-2.
  • the sample solution 3-4 to the sample solution 3-6 clearly had a small number of detected molecules.
  • the distance between the base associated with the base bound to the donor fluorescent substance in the donor probe and the base associated with the base bound to the acceptor fluorescent substance in the acceptor probe affects the detection efficiency of the target nucleic acid molecule, the longer the distance between the dyes, the lower the detection efficiency of the target nucleic acid molecule, and the shorter the distance between the dyes, the smaller the number of detected molecules, FRET It has been found that there is no limitation of the above, and that the distance between the dyes is preferably 8 bases or less.
  • the target nucleic acid molecule detection method according to the present invention can detect the target nucleic acid molecule present in the sample with high sensitivity and accuracy, biochemistry and molecules that detect or quantitatively analyze the nucleic acid in the sample. It can be used in fields such as biology and clinical testing.
  • T target nucleic acid molecule, d ... first fluorescent substance (donor fluorescent substance), a ... second fluorescent substance (acceptor fluorescent substance), 1 ... first probe, 2 ... second probe, 3 ... third Probe.

Abstract

本発明は、ＦＲＥＴを利用して、標的核酸分子を高感度に検出する方法を提供する。本発明は、標的核酸分子に、エネルギー・ドナーと成る第１の蛍光物質で標識された第１のプローブ及び第３のプローブと、エネルギー・アクセプターと成る第２の蛍光物質で標識された第２のプローブとを会合させて会合体を形成する工程と、形成された会合体に、前記第１の蛍光物質の励起波長の光を放射し、前記会合体中の前記第２の蛍光物質から放出された蛍光を指標として検出する工程と、を有し、前記標的核酸分子中、前記第２のプローブと会合する領域は、前記第１のプローブと会合する領域と前記第３のプローブと会合する領域の間にある、標的核酸分子の検出方法である。

Description

標的核酸分子の検出方法
　本発明は、蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｅｎｅｒｇｙ　ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＦＲＥＴ）を利用して、標的核酸分子を高感度に検出する方法に関する。
　特定の塩基配列を有する核酸を検出する方法として、プローブやプライマー等の人工合成した短鎖のオリゴヌクレオチドを用いて核酸の塩基配列を調べる方法が多数報告されている。特に、体細胞変異や一塩基多型などの遺伝子解析では、検出感度に優れていることから、蛍光を用いた様々な手法が開発されている。
　例えば、ＦＲＥＴを利用することにより、標的核酸分子を検出する方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。当該方法では、ＦＲＥＴのエネルギー・ドナーと成る蛍光物質（ドナー色素）が結合したドナープローブと、エネルギー・アクセプターと成る蛍光物質（アクセプター色素）が結合したアクセプタープローブとを、標的核酸分子の隣接する２領域にそれぞれ会合（ハイブリダイズ）させる。ドナープローブとアクセプタープローブの両者が標的核酸分子と会合した会合体では、アクセプター色素とドナー色素が近接しているため、当該会合体にドナー色素の励起波長の光を照射すると、励起されたドナー色素からＦＲＥＴが起こりアクセプター色素からの蛍光が発生する。一方で、どちらかのプローブが結合していない標的核酸分子ではＦＲＥＴが起こらず、アクセプター色素からの蛍光は得られない。このように、検出対象である標的核酸分子が存在する場合のみ、アクセプター色素からの蛍光を観測できるため、当該方法は標的核酸分子の検出や定量に用いられる。
　その他、ＦＲＥＴを利用せず、１種類のプローブのみで標的核酸分子を検出する方法として、特許文献２及び３には、エキシトン効果（exciton　coupling）を示す蛍光性原子団で標識された核酸プローブを用いる方法が開示されている。エキシトン効果とは、例えば、複数の色素が並行に集合し、Ｈ会合体（H－aggregate）を形成することにより、ほとんど蛍光発光を示さなくなる効果である。エキシトン効果を有するプローブ（Ｅプローブ）は、遊離の状態ではほとんど蛍光を放出しないが、標的核酸分子と会合することによりＨ会合体が解離するため、蛍光を発するようになる。
特許第４１１８９３２号公報 特開２０１３－１８３７３６号公報 国際公開第２０１４／０３４８１８号
　核酸分子の検出をＦＲＥＴプローブを用いて行う場合では、通常の単一の蛍光色素で標識されたプローブを用いて検出する場合よりも、検出される蛍光の光量が大幅に小さくなり、標的核酸分子の検出効率が低下する。
　本発明は、ＦＲＥＴを利用して、標的核酸分子を高感度に検出する方法、及び当該方法に利用するプローブセットを提供することを目的とする。
　本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、標的核酸分子に、１つのアクセプタープローブを挟む位置に２つのドナープローブが配置されるように会合体を形成させ、１つのアクセプタープローブに対して２つのドナープローブから蛍光共鳴エネルギーを供給させることによって、アクセプタープローブからの蛍光の輝度を増強させられることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明に係る標的核酸分子の検出方法及びプローブセットは下記［１］～［１１］である。
［１］　　（ａ）核酸含有試料に、蛍光共鳴エネルギー移動現象に於けるエネルギー・ドナーと成る第１の蛍光物質で標識された第１のプローブ、蛍光共鳴エネルギー移動現象に於けるエネルギー・アクセプターと成る第２の蛍光物質で標識された第２のプローブ、及び前記第１の蛍光物質で標識された第３のプローブを混合し、試料溶液を調製する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において調製された試料溶液中の標的核酸分子を、前記第１のプローブ、前記第２のプローブ、及び前記第３のプローブと会合させて前記第１のプローブと前記第２のプローブと前記第３のプローブと前記標的核酸分子とからなる会合体を形成する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の後、前記試料溶液に、前記第１の蛍光物質の励起波長の光を放射し、前記標的核酸分子を、前記会合体中の前記第２の蛍光物質から放出された蛍光を指標として検出する工程と、
を有し、
　前記標的核酸分子中、前記第２のプローブと会合する領域は、前記第１のプローブと会合する領域と前記第３のプローブと会合する領域の間にある、標的核酸分子の検出方法。
［２］　前記第１のプローブ、前記第２のプローブ、又は前記第３のプローブが、前記標的核酸分子と会合している状態と会合していない状態で発光輝度が変化するプローブである、前記［１］の標的核酸分子の検出方法。
［３］　前記第１の蛍光物質又は前記第２の蛍光物質が、エキシトン効果を示す蛍光性原子団である、前記［２］の標的核酸分子の検出方法。
［４］　前記第１のプローブ中の前記第１の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基と、前記第２のプローブ中の前記第２の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基との距離が、８塩基以下であり、
　前記第３のプローブ中の前記第１の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基と、前記第２のプローブ中の前記第２の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基との距離が、８塩基以下である、前記［１］～［３］のいずれかの標的核酸分子の検出方法。
［５］　前記第２のプローブの塩基長が５～１７塩基である、前記［１］～［４］のいずれかの標的核酸分子の検出方法。
［６］　前記核酸含有試料に、前記第１のプローブ、前記第２のプローブ、及び前記第３のプローブと会合する第１の標的核酸分子と、前記第１のプローブと前記第３のプローブのどちらか一方のみと前記第２のプローブと結合する第２の標的核酸分子が含まれており、
　前記（ｂ）において、前記第１の標的核酸分子と、前記第１のプローブと、前記第２のプローブと、前記第３のプローブとを会合させた第１の会合体と、前記第２の標的核酸分子と、前記第２のプローブと、前記第１のプローブ及び前記第３のプローブのいずれか一方とを会合させた第２の会合体と、を形成し、
　前記工程（ｃ）において、前記試料溶液に、前記第１の蛍光物質の励起波長の光を放射し、一分子の会合体中の前記第２の蛍光物質から放出された蛍光の輝度を指標として、前記第１の標的核酸分子と前記第２の標的核酸分子とを区別して検出し、前記試料溶液中の前記第１の標的核酸分子と前記第２の標的核酸分子の存在比を算出する、前記［１］～［５］のいずれかの標的核酸分子の検出方法。
［７］　標的核酸分子を検出するためのプローブセットであり、
　前記標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子が、蛍光共鳴エネルギー移動現象に於けるエネルギー・ドナーと成る第１の蛍光物質で標識された第１のプローブと、
　前記標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子が、蛍光共鳴エネルギー移動現象に於けるエネルギー・アクセプターと成る第２の蛍光物質で標識された第２のプローブと、
　前記標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子が、前記第１の蛍光物質で標識された第３のプローブと、
を備え、
　前記第１のプローブ、前記第２のプローブ、及び前記第３のプローブは、前記標的核酸分子と、前記第３のプローブが前記第２のプローブに対して前記第１のプローブとは反対側に配置されている会合体を形成することができ、
　前記会合体に、前記第１の蛍光物質の励起波長の光を放射すると、前記第１のプローブ中の前記第１の蛍光物質と前記第２のプローブ中の前記第２の蛍光物質との間、及び前記第３のプローブ中の前記第１の蛍光物質と前記第２のプローブ中の前記第２の蛍光物質との間に、蛍光共鳴エネルギー移動が起こり、前記第２の蛍光物質から放出された蛍光が検出される、プローブセット。
［８］　前記第１のプローブ、前記第２のプローブ、又は前記第３のプローブが、前記標的核酸分子と会合している状態と会合していない状態で発光輝度が変化するプローブである、前記［７］のプローブセット。
［９］　前記第１の蛍光物質又は前記第２の蛍光物質が、エキシトン効果を示す蛍光性原子団である、前記［８］のプローブセット。
［１０］　前記会合体が、
　前記第１のプローブ中の前記第１の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基と、前記第２のプローブ中の前記第２の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基との距離が、８塩基以下であり、
　前記第３のプローブ中の前記第１の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基と、前記第２のプローブ中の前記第２の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基との距離が、８塩基以下である、前記［７］～［９］のいずれかのプローブセット。
［１１］　前記第２のプローブの塩基長が５～１７塩基である、前記［７］～［１０］のいずれかのプローブセット。
　本発明に係る標的核酸分子の検出方法は、１つのアクセプタープローブに対して２つのドナープローブから蛍光共鳴エネルギーが供給されるため、アクセプタープローブとドナープローブを１つずつ使用する従来のＦＲＥＴを利用した検出方法に比べて、標的核酸分子とアクセプタープローブとドナープローブとからなる会合体から発される蛍光輝度が大きい。このため、当該検出方法を用いることにより、標的核酸分子の検出効率を高めることができる。
　また、本発明に係るプローブセットを用いることにより、当該検出方法を簡便かつ容易に実施することができる。
図１は、従来のＦＲＥＴプローブを利用した検出方法（左）と本発明に係る検出方法（右）の各プローブと標的核酸分子とが形成する会合体の模式図である。 図２は、実施例１において、各試料溶液の蛍光輝度の測定結果を示した図である。 図３は、実施例１において、ＳＳＭＣにより測定された各試料溶液中の会合体の分子数の測定結果を示した図である。 図４は、参考例１において、各試料溶液の蛍光輝度の測定結果を示した図である。 図５は、参考例１において、ＳＳＭＣにより測定された各試料溶液中の会合体の分子数の測定結果を示した図である。 図６は、参考例２において、ＳＳＭＣにより測定された各試料溶液中の会合体の分子数の測定結果を示した図である。
　本発明に係る標的核酸分子の検出方法（以後、「本発明に係る検出方法」ということがある。）は、ＦＲＥＴプローブを用いて標的核酸分子を検出する方法であって、ＦＲＥＴ現象に於けるエネルギー・ドナーと成る第１の蛍光物質で標識された第１のプローブ、ＦＲＥＴ現象に於けるエネルギー・アクセプターと成る第２の蛍光物質で標識された第２のプローブ、及び前記第１の蛍光物質で標識された第３のプローブを用いることを特徴とする。以降、「第１の蛍光物質」を「ドナー蛍光物質」、「第２の蛍光物質」を「アクセプター蛍光物質」ということがある。ドナー蛍光物質で標識された第１のプローブと第３のプローブがいわゆるドナープローブであり、アクセプター蛍光物質で標識された第２のプローブがいわゆるアクセプタープローブである。本発明に係る検出方法では、標的核酸分子１分子に対して、１つのアクセプタープローブと２つのドナープローブを、２つのドナープローブがアクセプタープローブを挟むように配置させて会合させる。従来のＦＲＥＴプローブを利用した検出方法と本発明に係る検出方法の各プローブと標的核酸分子とが形成する会合体の模式図を図１に示す。従来の方法では、１分子の標的核酸分子に対して、１つのアクセプタープローブと１つのドナープローブを互いに隣接するように会合させてＦＲＥＴを起こさせる（左図）。これに対して、本発明に係る標的核酸分子の検出方法では、標的核酸分子に対して、２つのドナープローブ（第１のプローブと第３のプローブ）がアクセプタープローブ（第２のプローブ）を挟むように配置させて会合させるため、２つのドナープローブから１つのアクセプタープローブに対して蛍光共鳴エネルギーが供給される（右図）。理論的には、アクセプターに対して供給される蛍光共鳴エネルギー量が、従来方法の２倍程度になり、アクセプターから放出される蛍光の輝度が増強され、当該会合体の検出感度が向上される。
　本発明において用いられるドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質は、十分に近接した場合にＦＲＥＴが生じる物質同士の組み合わせであり、かつ会合体の形成を阻害しないものであればよく、ＦＲＥＴプローブにおいて一般的に用いられている物質の中から、適宜選択して用いることができる。例えば、ＰＥ（フィコエリスリン）をドナー蛍光物質として、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ（登録商標）、Ａｌｅｘａ　ｆｌｕｏｒ（登録商標）　６１０、Ａｌｅｘａ　ｆｌｕｏｒ　６４７、及びＡｌｅｘａ　ｆｌｕｏｒ６８０をアクセプター蛍光物質として、組み合わせて用いることができる。また、ＡＰＣ（アロフィコシアニン）をドナー蛍光物質として、Ｃｙ５．５をアクセプター蛍光物質として、組み合わせて用いることができる。
　本発明において用いられる第１のプローブ、第２のプローブ、及び第３のプローブとしては、標的核酸分子と会合している状態と会合していない状態で発光輝度が変化するプローブとすることもできる。例えば、標的核酸分子と会合していない状態では発光強度が小さく、標的核酸分子と会合している状態では発光強度が強くなるようなプローブを用いることにより、ＦＲＥＴの蛍光を検出する際のバックグラウンドやノイズを抑えることができ、標的核酸分子の検出感度をより高めることができる。
　例えば、ドナー蛍光物質又はアクセプター蛍光物質として、エキシトン効果を示す蛍光性原子団を用いることにより、標的核酸分子と会合している状態と会合していない状態で発光輝度が変化するプローブとすることができる。ドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質の両方をエキシトン効果を示す蛍光性原子団としてもよく、いずれか一方をエキシトン効果を示す蛍光性原子団としてもよい。いずれか一方とする場合には、より効率的にバックグラウンドやノイズを抑えることができるため、ドナー蛍光物質をエキシトン効果を示す蛍光性原子団とすることが好ましい。
　エキシトン効果を示す蛍光性原子団としては、チアゾールオレンジとその誘導体、オキサゾールイエローとその誘導体、シアニンとその誘導体、ヘミシアニンとその誘導体、メチルレッドとその誘導体、ほか一般的にシアニン色素、アゾ色素と呼ばれる色素群が挙げられる。シアニン色素としては、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５等が挙げられる。また、ＤＮＡ等の核酸に結合することによって蛍光強度を変化させる蛍光色素として公知の色素や微視的極性に応じて蛍光強度が変化する蛍光色素、及びこれらから誘導される基も、適宜用いることができる。核酸に結合することによって蛍光強度を変化させる蛍光色素としては、例えば、エチジウムブロミドが挙げられる。微視的極性に応じて蛍光強度が変化する蛍光色素としては、例えば、ピレンカルボキシアミド、プロダンが挙げられる。その他、フルオレセインも用いるエキシトン効果を示す蛍光性原子団として使用することができる。
　エキシトン効果を示すプローブは、標的核酸分子と会合するための一本鎖核酸分子に、１つのエキシトン効果を示す蛍光性原子団を直接又は適切なリンカーを介して間接的に結合させてもよく、標的核酸分子と会合するための一本鎖核酸分子に、少なくとも２つのエキシトン効果を示す蛍光性原子団を近接した状態で結合させてもよい。２つのエキシトン効果を示す蛍光性原子団を近接した状態で結合させプローブとしては、例えば、標的核酸分子と会合するための一本鎖核酸分子中の一つの塩基に、下記一般式（１）の構造からなる基を結合させたものを挙げることができる（特許文献２参照。）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　一般式（１）中、Ａは、ＣＲ、Ｎ、Ｐ、ＰＯ、Ｂ若しくはＳｉＲであり、Ｒは、水素原子、アルキル基又は任意の置換基である。
　一般式（１）中、Ｂ１、Ｂ２及びＢ３は、リンカー（架橋原子又は原子団）であり、主鎖長は任意である。主鎖中にＣ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｂ、Ｓｉ、Ｓを含んでいてもいなくてもよく、単結合、二重結合、三重結合、アミド結合、エステル結合、ジスルフィド結合、イミノ基、エーテル結合、チオエーテル結合、及びチオエステル結合をそれぞれ含んでいてもいなくてもよい。Ｂ１、Ｂ２及びＢ３はそれぞれの同一でも異なっていてもよい。一般式（１）の構造からなる基は、Ｂ３（式（１）中のアスタリスク）において、一本鎖核酸分子を構成する塩基中の側鎖に結合する。
　一般式（１）中、Ｃ１及びＣ２は、エキシトン効果を示す蛍光性原子団であり、それぞれ同一でも異なっていてもよい。エキシトン効果を示す蛍光性原子団としては、前記で列挙したものが挙げられる。また、下記一般式（２）又は一般式（３）で表される原子団とすることもできる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　一般式（２）及び一般式（３）中、Ｅは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅであり、ｎは、０又は正の整数である。Ｒ１及びＲ２のうち一方は、一般式（１）中のＢ１又はＢ２に結合する連結基であり、他方は、水素原子又は低級アルキル基である。Ｒ３～Ｒ１２は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基、ニトロ基、シアノ基、カルボニル基、カルボキシル基、アミノ基、シリル基、ボリル基である。ＡＲは、任意の芳香環であり、あってもなくてもよい。一般式（２）又は（３）中においてＲ３が複数存在する場合は、同一でも異なっていてもよく、一般式（２）又は（３）中においてＲ４が複数存在する場合は、同一でも異なっていてもよい。
　一般式（１）中のＣ１又はＣ２が一般式（２）又は一般式（３）で表される原子団である場合、Ｃ１中のＥ、ＡＲ、ｎ及びＲ１～Ｒ１２と、Ｃ２中のＥ、ＡＲ、ｎ及びＲ１～Ｒ１２とは、互いに同一でも異なっていてもよい。
　第１のプローブ及び第３のプローブは、それぞれ、標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子を、ドナー蛍光物質で標識させることにより得られる。同様に、第２のプローブは、標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子を、アクセプター蛍光物質で標識させることにより得られる。各プローブは、ドナー蛍光物質又はアクセプター蛍光物質を、標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子に直接結合させてもよく、リンカーを介して間接的に結合させてもよい。当該リンカーとしては、例えば、１～１０塩基長の一本鎖核酸分子が挙げられる。ドナー蛍光物質又はアクセプター蛍光物質と標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子又はリンカーとの結合は、常法により行うことができる。
　各プローブ中の標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子の塩基配列は、標的核酸分子の塩基配列情報に基づいて設計される。設計には、汎用されているプライマー／プローブ設計ソフトウェア等を用いることもできる。
　第１のプローブ、第２のプローブ、及び第３のプローブは、標的核酸分子と、第３のプローブが第２のプローブに対して第１のプローブとは反対側に配置されるように会合体を形成させる。このため、標的核酸分子中、第２のプローブと会合する領域（図１中、「Ｒ２」）が、第１のプローブと会合する領域（図１中、「Ｒ１」）と第３のプローブと会合する領域（図１中、「Ｒ３」）の間になるように、各プローブの標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子の塩基配列を設計する。標的核酸分子中、第２のプローブと会合する領域と第１のプローブと会合する領域は、隣接していてもよく、１～５塩基離れていてもよい。同様に、標的核酸分子中、第２のプローブと会合する領域と第３のプローブと会合する領域は、隣接していてもよく、１～５塩基離れていてもよい。
　標的核酸分子と３種のプローブとの会合体において、第１のプローブ中のドナー蛍光物質と第２のプローブ中のアクセプター蛍光物質との間、及び第３のプローブ中のドナー蛍光物質と第２のプローブ中のアクセプター蛍光物質との間に、ＦＲＥＴが生じる必要がある。このため、標的核酸分子中、第１のプローブと会合する領域と第２のプローブと会合する領域と第３のプローブと会合する領域は、第１のプローブ中のドナー蛍光物質と第２のプローブ中のアクセプター蛍光物質との間の距離がＦＲＥＴが起こるために充分に短くなるように、かつ第３のプローブ中のドナー蛍光物質と第２のプローブ中のアクセプター蛍光物質との間の距離がＦＲＥＴが起こるために充分に短くなるように、設計する。例えば、標的核酸分子中の第１のプローブと会合する領域と第２のプローブと会合する領域を、第１のプローブ中のドナー蛍光物質が結合している塩基が会合する標的核酸分子中の塩基と、第２のプローブ中のアクセプター蛍光物質が結合している塩基が会合する標的核酸分子中の塩基との距離が、８塩基以下、好ましくは６塩基以下、より好ましくは４塩基以下となるように設計する。同様に、標的核酸分子中の第３のプローブと会合する領域と第２のプローブと会合する領域を、第３のプローブ中のドナー蛍光物質が結合している塩基が会合する標的核酸分子中の塩基と、第２のプローブ中のアクセプター蛍光物質が結合している塩基が会合する標的核酸分子中の塩基との距離が、８塩基以下、好ましくは６塩基以下、より好ましくは４塩基以下となるように設計する。このため、第２のプローブにおいては、アクセプター蛍光物質が結合している塩基はプローブの中央又はその付近にあることが好ましく、塩基長が５～１７塩基であることが好ましい。
　各プローブ中の標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子の塩基配列は、標的核酸分子の目的の領域に特異的に会合可能な配列であればよい。例えば、第１のプローブ中の標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子の塩基配列は、標的核酸分子において設計された第１のプローブと会合する領域と相補的な配列であることが好ましいが、当該領域の塩基配列と相補的な配列に対して１～５塩基を置換、欠失、又は挿入したミスマッチのある配列であってもよい。同様に、第２のプローブ及び第３のプローブにおいても、標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子の塩基配列は、それぞれ、標的核酸分子において設計された第２のプローブと会合する領域及び第３のプローブと会合する領域と相補的な配列であることが好ましいが、当該領域の塩基配列と相補的な配列に対して１～５塩基を置換、欠失、又は挿入したミスマッチのある配列であってもよい。
　第１のプローブと第３のプローブにおける標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子の塩基長は、標的核酸分子の目的の領域と特異的に会合できる長さであれば特に限定されるものではなく、一般的なプローブと同様とすることができる。具体的には、例えば、１５～５０塩基とすることができ、１５～３５塩基とすることが好ましい。
　標的核酸分子は、ＤＮＡやＲＮＡ、２'－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌ　ＲＮＡのような天然型ヌクレオチドのみからなるものであってもよく、人工的ヌクレオチドを一部又は全部に含む人工核酸分子であってもよい。
　各プローブにおける標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子は、ＤＮＡやＲＮＡ、２'－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌ　ＲＮＡのような天然型ヌクレオチドのみからなるものであってもよく、人工的ヌクレオチドを一部又は全部に含む人工核酸分子であってもよい。
　「人工的ヌクレオチド」とは、人工的に合成されたヌクレオチドであって、天然型ヌクレオチドとは構造が異なるが、天然型ヌクレオチドと同様に機能し得るものを意味する。ここで、「天然型ヌクレオチドと同様に機能し得る」とは、天然型ヌクレオチドと同様にリン酸ジエステル結合等により核酸分子を形成することができることを意味する。
　このような人工的ヌクレオチドとしては、例えば、ＢＮＡ（Bridged nucleic acid）、ＥＮＡ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン－架橋化核酸）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ＨＮＡ（Hexitol Nucleic Acid）等が挙げられる。ＢＮＡは、天然型ヌクレオチドの一部が架橋化された核酸であり、リボース環の２’位の酸素原子と４’位の炭素原子がメチレンを介して結合している架橋された人工的ヌクレオチドであるＬＮＡ（Locked nucleic acid）を含む。
　特に、第２のプローブ中の標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子は比較的塩基長が短いため、標的核酸分子の目的の領域と特異的に会合させるために、ＬＮＡやＥＮＡ等のような人工的に認識能を高めた人工的ヌクレオチドを含むことが好ましい。
　本発明に係る検出方法は、下記工程（ａ）～（ｃ）を有する。
（ａ）核酸含有試料に、前記第１のプローブ、前記第２のプローブ、及び前記第３のプローブを混合し、試料溶液を調製する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において調製された試料溶液中の標的核酸分子を、前記第１のプローブ、前記第２のプローブ、及び前記第３のプローブと会合させて前記第１のプローブと前記第２のプローブと前記第３のプローブと前記標的核酸分子とからなる会合体を形成する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の後、前記試料溶液に、前記第１の蛍光物質の励起波長の光を放射し、前記標的核酸分子を、前記会合体中の前記第２の蛍光物質から放出された蛍光を指標として検出する工程。
　本発明において標的核酸分子とは、検出の標的である特定の塩基配列（標的塩基配列）を有する核酸分子を意味する。当該標的核酸分子としては、第１のプローブ等の設計が可能な程度に塩基配列情報が明らかになっているものであれば、特に限定されるものではない。例えば、動物や植物の染色体や、細菌やウィルスの遺伝子に存在する塩基配列を有する核酸分子であってもよく、人工的に設計された塩基配列を有する核酸分子であってもよい。なお、本発明において、標的核酸分子としては、二本鎖核酸であってもよく、一本鎖核酸であってもよい。また、ＤＮＡとＲＮＡのいずれであってもよい。該標的核酸分子として、例えば、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＰＣＲ増幅等による合成ＤＮＡ、ＲＮＡから逆転写酵素を用いて合成されたｃＤＮＡ等がある。
　また、本発明において核酸含有試料とは、核酸分子を含有する試料であれば、特に限定されるものではない。当該核酸含有試料として、例えば、動物等から採取した生体試料、培養細胞等から調製された試料、核酸合成反応後の反応溶液等が挙げられる。核酸含有試料は、生体試料等そのものであってもよく、生体試料等から抽出・精製した核酸溶液でもよい。
　まず、工程（ａ）として、核酸含有試料と３種の前記プローブを混合して試料溶液を調製する。この際、必要に応じて適当な溶媒を添加してもよい。当該溶媒は、ドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質との間のＦＲＥＴやアクセプター蛍光物質から発される蛍光の検出を阻害しない溶媒であれば、特に限定されるものではなく、当該技術分野において一般的に用いられているバッファーの中から、適宜選択して用いることができる。当該バッファーとして、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）等のリン酸バッファーやトリスバッファー等がある。
　その他、各プローブと標的核酸分子以外の核酸分子との非特異的な会合を抑制するために、予め試料溶液中に、界面活性剤、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、又は尿素等を添加しておくことも好ましい。これらの化合物は、１種のみを添加してもよく、２種類以上を組み合わせて添加してもよい。これらの化合物を添加しておくことにより、比較的低い温度環境下において、非特異的な会合を起こりにくくすることができる。
　次いで工程（ｂ）として、前記工程（ａ）において調製された試料溶液中の標的核酸分子を、前記３種のプローブと会合させて会合体を形成する。標的核酸分子と各プローブを特異的に会合させるために、まず、試料溶液中の核酸分子を全て変性させた後、会合体を形成させる。
　本発明において、「核酸分子を変性させる」とは、塩基対を解離させることを意味する。本発明においては、ドナー蛍光物質やアクセプター蛍光物質への影響が比較的小さいことから、高温処理による変性（熱変性）又は低塩濃度処理による変性を行うことが好ましい。中でも、操作が簡便であるため、熱変性を行うことが好ましい。変性条件は、標的核酸分子や各プローブの塩基配列や塩基長に依存する。例えば、熱変性は、一般的には、当該試料溶液を、標的核酸分子やプローブがＤＮＡの場合は９０～１００℃、ＲＮＡの場合は７０℃で数秒間から２分間程度、保温することによって変性させることができる。一方、低塩濃度処理による変性は、例えば、精製水等により希釈することによって、当該試料溶液の塩濃度が十分に低くなるように調整することによって行うことができる。
　熱変性を行った場合には、高温処理後、当該試料溶液の温度を、標的核酸分子と各プローブが会合可能な温度にまで低下させることにより、当該試料溶液中の標的核酸分子と第１のプローブと第２のプローブと第３のプローブとの会合体を形成させることができる。具体的には、各プローブ中の標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子のＴｍ値（二本鎖ＤＮＡの５０％が一本鎖ＤＮＡに解離する温度）±３℃の温度程度まで低下させる。標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子のＴｍ値が各プローブで異なる場合には、最も低温のＴｍ値±３℃の温度程度まで低下させる。一方、低塩濃度処理による変性を行った場合にも、同様に、低塩濃度処理後、塩溶液を添加する等により、当該試料溶液の塩濃度を、標的核酸分子と各プローブが会合可能な濃度にまで上昇させることにより、当該試料溶液中の標的核酸分子と第１のプローブと第２のプローブと第３のプローブとの会合体を形成させることができる。各プローブの標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子のＴｍ値は、汎用されているプライマー／プローブ設計ソフトウェア等を用いることにより算出することができる。
　工程（ｂ）の後、工程（ｃ）として、試料溶液にドナー蛍光物質の励起波長の光を放射し、アクセプター蛍光物質の蛍光波長の蛍光を検出する。当該試料溶液中の標的核酸分子と第１のプローブと第２のプローブと第３のプローブとの会合体にドナー蛍光物質の励起波長の光が照射されると、第１のプローブ中のドナー蛍光物質と第２のプローブ中のアクセプター蛍光物質との間及び第３のプローブ中のドナー蛍光物質と第２のプローブ中のアクセプター蛍光物質との間にＦＲＥＴが起こるため、当該会合体からは、アクセプター蛍光物質から蛍光が放出される。つまり、ドナー蛍光物質の励起波長の光を放出して検出されるアクセプター蛍光物質の蛍光波長の蛍光シグナルを測定することにより、標的核酸分子と第１のプローブと第２のプローブと第３のプローブとの会合体を検出することができる。核酸含有試料に標的核酸分子が含まれていた場合には、ドナー蛍光物質の励起波長の光を放射した場合に、アクセプター蛍光物質の蛍光波長の蛍光が検出される。一方で、核酸含有試料に標的核酸分子が含まれていなかった場合には、ドナー蛍光物質の励起波長の光を放射した場合に、アクセプター蛍光物質の蛍光波長の蛍光は検出されない。
　試料溶液中の標的核酸分子を含む会合体から放出されるアクセプター蛍光物質の蛍光波長の蛍光シグナルの測定方法は特に限定されるものではなく、試料溶液全体の蛍光強度を測定する方法であってもよく、試料溶液中の蛍光を発する分子を一分子ごとに検出して測定する方法であってもよい。
　試料溶液の蛍光強度は、蛍光プレートリーダー等の蛍光分光光度計等を用いて常法により測定することができる。試料溶液のアクセプター蛍光物質の蛍光波長の蛍光強度は、当該試料溶液中に含まれている標的核酸分子と３種のプローブとの会合体の量に依存する。このため、例えば、予め検出対象であるアクセプター蛍光物質の量と蛍光強度との関係を示す検量線を作成しておくことにより、試料溶液中の標的核酸分子を含む会合体の量、すなわち、核酸含有試料中の標的核酸分子の量を定量することができる。
　試料溶液中の一分子ごとに蛍光シグナルを測定する方法としては、走査分子計数法（Scanning single-molecule counting,ＳＳＭＣ）（国際公開第２０１２／１０２２６０号）、蛍光相関分光法（Fluorescence Correlation Spectroscopy，ＦＣＳ）、蛍光強度分布解析法（Fluorecscence Intensity Distribution Analysis，ＦＩＤＡ）、及び蛍光偏光強度分布解析法（FIDA polarization，ＦＩＤＡ－ＰＯ）が挙げられる。中でも、１つのドナープローブを用いる従来の方法に比べて標的核酸分子の検出効率をより顕著に高められることから、ＳＳＭＣにより測定することが好ましい。
　なお、このような１分子の蛍光シグナルの検出及び解析は、例えば、ＭＦ２０（オリンパス社製）等の公知の一分子蛍光分析システム等を用いて、常法により行うことができる。
　また、２つのドナープローブ（第１のプローブと第３のプローブ）と１つのアクセプタープローブ（第２のプローブ）と標的核酸分子とにより形成された会合体は、１つのドナープローブ（第１のプローブ又は第３のプローブ）と１つのアクセプタープローブ（第２のプローブ）と標的核酸分子とにより形成された会合体よりも、ＦＲＥＴによりアクセプターから放出される蛍光の輝度が強い。この輝度の強さの違いを利用して、本発明に係る検出方法では、塩基配列が類似した２種類の標的核酸分子（第１の標的核酸分子と第２の標的核酸分子）を区別して検出することもできる。
　具体的には、まず、前記第１のプローブ、前記第２のプローブ、及び前記第３のプローブを、第１の標的核酸分子にはこの３種のプローブが全て会合して会合体を形成し得るが、第２の標的核酸分子は、前記第２のプローブと会合するものの、前記第１のプローブと前記第３のプローブはどちらか一方のみとしか会合しないように設計する。前記工程（ａ）に供される前記核酸含有試料に、第１の標的核酸分子と第２の標的核酸分子が含まれている場合には、前記工程（ｂ）において、工程（ａ）で調製された試料溶液中で、前記第１の標的核酸分子と、前記第１のプローブと、前記第２のプローブと、前記第３のプローブとを会合させた第１の会合体と、前記第２の標的核酸分子と、前記第２のプローブと、前記第１のプローブ及び前記第３のプローブのいずれか一方とを会合させた第２の会合体が、それぞれ形成される。
　続いて、工程（ｃ）において、前記試料溶液に、前記第１の蛍光物質の励起波長の光を放射すると、会合体中のアクセプターから放出される蛍光の輝度は、会合体中に１つのドナープローブしか含まれていない第２の会合体よりも、会合体中に２つのドナープローブを含む第１の会合体のほうが強い。そこで、一分子の会合体中のアクセプター（第２の蛍光物質）から放出された蛍光の輝度を指標として、第１の会合体に含まれている第１の標的核酸分子と、第２の会合体に含まれている第２の標的核酸分子を、区別して検出することができる。試料溶液中の一分子ごとに蛍光シグナルを測定した場合、ＦＲＥＴによりアクセプターから放出された蛍光の輝度がより明るい分子が第１の標的核酸分子を含む第１の会合体であり、より暗い分子が第２の標的核酸分子を含む第２の会合体である。アクセプターから放出された蛍光の輝度値を指標として、第１の会合体と第２の会合体を区別して検出した場合には、試料溶液中の第１の標的核酸分子の分子数と第２の標的核酸分子の分子数とから、試料溶液中の第１の標的核酸分子と第２の標的核酸分子の存在比を算出することもできる。
　本発明に係る検出方法を遺伝子多型の検出に利用することもできる。例えば、　遺伝子多型のうち、変異型を第１の標的核酸分子とし、野生型を第２の標的核酸分子として、前記第１のプローブと前記第２のプローブを、野生型と変異型で塩基配列が共通する領域に会合するように設計し、第３のプローブを変異型である第１の標的核酸分子とは会合するが、野生型である第２の標的核酸分子とは会合しないように設計する。これにより、野生型の標的核酸分子を含む会合体は蛍光輝度の弱い分子として検出され、変異型の標的核酸分子を含む会合体は蛍光輝度の強い分子として検出される。また、得られた検出結果に基づき、核酸含有試料中の変異型の核酸分子と野生型の核酸分子との存在比を求めることもできる。
　前記第１のプローブ、前記第２のプローブ、及び前記第３のプローブをセットにすることも好ましい。これらの３種のプローブを含むプローブセットにより、本発明に係る検出方法をより容易かつ簡便に実施することができる。当該プローブセットに、本発明に係る検出方法に使用する各種試薬や機器等をキット化することも好ましい。当該キットには、前記プローブの他に、試料溶液を調製するために用いられる各種バッファーや、変性処理や会合体形成に使用される恒温装置付インキュベーター等を含ませることができる。
　次に実施例等を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
　任意の濃度の標的核酸分子を、２つのドナープローブと１つのアクセプタープローブを用いて検出した。
＜１＞　２つのドナープローブと１つのアクセプタープローブと標的ＤＮＡとの会合体の形成
　終濃度０～１００ｍＭの標的ＤＮＡ（５’－ＡＧＡＧＣＴＡＣＧＡＧＣＴＧＣＣＴＧＡＣＧＧＣＣＡＧＧＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＴＧＧＣＡＡＴＧＡＧＣＧＧＴＴＣ－３’、配列番号１）、終濃度２０ｎＭのドナープローブａ（５’－ＧＡＡＣＣＧＣＴＣＡＴＴＧＣＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧ－３’、配列番号２、２番目のＴに、チアゾールオレンジが２つついた蛍光原子団が修飾されたプローブ）、終濃度２０ｎＭのドナープローブｂ（５’－ＧＴＣＡＧＧＣＡＧＣＴＣＧＴＡＧＣＴＣＴＴＣＴＣＣ－３’、配列番号３、２番目のＴに、チアゾールオレンジが２つついた蛍光原子団が修飾されたプローブ）、終濃度２０ｎＭのアクセプタープローブａ（５’－ＡＣＣＴＧＧＣＣ－３’、配列番号４、４番目のＴに蛍光物質ＡＴＴＯ６３３が修飾されたプローブ。４番目のＴ以外の塩基はＥＮＡである。）となるように反応用バッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、４００ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０５％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００）に溶解させ、試料溶液（試料溶液１－１）を調製した。調製された試料溶液１－１を、サーマルサイクラーを用いて９５℃で１０秒間インキュベートした後、２５℃まで温度を落とし３０分間インキュベートした。
＜２＞　１つのドナープローブと１つのアクセプタープローブと標的ＤＮＡとの会合体の形成
　ドナープローブｂを混合せず、アクセプタープローブとしてアクセプタープローブａに代えてアクセプタープローブｂ（５’－ＡＣＣＴＧＧＣＣＧＴＣＡＧＧＣＡＧＣＴＣＧＴＡＧＣＴＣＴ－３’、配列番号５、５’末端に蛍光物質ＡＴＴＯ６３３が修飾されたプローブ。）を用いた以外は、前記＜１＞と同様にして試料溶液（試料溶液１－２）を調製し、調製された試料溶液１－２を、サーマルサイクラーを用いて９５℃で１０秒間インキュベートした後、２５℃まで温度を落とし３０分間インキュベートした。
＜３＞　ＳＳＭＣによる試料溶液中の会合体の測定
　前記＜１＞及び＜２＞で調製した試料溶液中の標的ＤＮＡを含む会合体を、ＳＳＭＣにより測定した。具体的には、各試料溶液に対してそれぞれ、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた一分子蛍光測定装置ＭＦ－２０（オリンパス株式会社）を用いて測定を行い、時系列光強度データ（フォトンカウントデータ）を取得した。試料溶液を、チアゾールオレンジの励起波長である４８８ｎｍ、３００μＷのレーザーで励起し、バンドパスフィルターを用いて、ＡＴＴＯ６３３の蛍光波長である６００～６６０ｎｍの蛍光を検出した。試料溶液中に於ける光検出領域は、１５ｍｍ／秒の移動速度にて移動させ、２０秒間の測定を行った。また、ＢＩＮ　ＴＩＭＥを１０μ秒とし、測定によって得られた時系列光強度データをスムージング後、微分によりピークの検出を行った。ピークとみなされた領域のうち、ガウス関数に近似でき、強度が０．８以上となるもののピーク強度を抽出した。
　各試料溶液の蛍光輝度の測定結果を図２に示す。この結果、どちらの試料溶液においても、ＡＴＴＯ６３３の蛍光波長の蛍光輝度は、標的ＤＮＡの濃度依存的に高くなる傾向が観察された。特に、標的ＤＮＡの濃度が３０ｎＭで蛍光輝度が飽和しており、全てのプローブが標的ＤＮＡと会合体を形成したと考えられた。各試料溶液の蛍光輝度を比較すると、飽和点（標的ＤＮＡの濃度が３０ｎＭの試料溶液）において、ドナープローブを２つ用いた試料溶液１－１では、ドナープローブを１つ用いた試料溶液１－２に対して、蛍光輝度が２倍程度となっていた。従って、１つのアクセプタープローブに対してドナープローブを２つ配置することにより、蛍光輝度が増加することが示された。
　また、ＳＳＭＣにより測定された各試料溶液中の会合体の分子数の測定結果を図３に示す。ＳＳＭＣにおける検出分子数は、飽和点（標的ＤＮＡの濃度：３０ｎＭ）において、ドナープローブを２つ用いた試料溶液１－１では、ドナープローブを１つ用いた試料溶液１－２に対して、蛍光輝度が１０倍になった。１分子あたりの蛍光強度が増加したことにより、１分子の検出効率が向上したためであると考えられた。
［参考例１］
　標的核酸分子を、複数のドナープローブをアクセプタープローブに対して同じ側にタンデムに会合させて検出した。
　標的ＤＮＡとして、標的ＤＮＡ－１（５’－ＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＣＧＧＧＣＴＧＡＡ－３’、配列番号６）、標的ＤＮＡ－２（５’－ＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＣＧＧＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＧＡＡ－３’、配列番号７）、標的ＤＮＡ－３（５’－ＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＣＧＧＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＧＡＡ－３’、配列番号８）、標的ＤＮＡ－４（５’－ＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＣＧＧＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＧＡＡ－３’、配列番号９）、標的ＤＮＡ－５（５’－ＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＣＧＧＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＧＡＡ－３’、配列番号１０）を用いた。標的ＤＮＡ－１～標的ＤＮＡ－５は、それぞれ、ドナープローブが１～５個、アクセプタープローブに対して同じ方向になるように会合する。
　終濃度１０ｍＭの各標的ＤＮＡ、終濃度２０ｎＭのドナープローブ（５’－ＴＴＣＡＧＣＣＣ－３’、配列番号１１、５番目のＴに、チアゾールオレンジが２つついた蛍光原子団が修飾されたプローブ）、終濃度２０ｎＭのアクセプタープローブ（５’－ＧＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴ－３’、配列番号１２、５’末端に蛍光物質ＡＴＴＯ６３３が修飾されたプローブ。）となるように反応用バッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、４００ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０５％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００）に溶解させ、試料溶液を調製した。標的ＤＮＡ－１～標的ＤＮＡ－５を含有する試料溶液を、それぞれ試料溶液２－１～試料溶液２－５とした。対照として、標的ＤＮＡを添加しない以外は同様にして調製した試料溶液を試料溶液２－０とした。次いで、各試料溶液を、サーマルサイクラーを用いて９５℃で１０秒間インキュベートした後、２５℃まで温度を落とし３０分間インキュベートした。
　その後、各試料溶液中の標的ＤＮＡを含む会合体を、実施例１の＜３＞と同様にしてＳＳＭＣにより測定した。各試料溶液の蛍光輝度の測定結果を図４に、ＳＳＭＣにより測定された各試料溶液中の会合体の分子数の測定結果を図５に、それぞれ示す。図４及び５中、「Ｎ」は試料溶液２－０の結果を、「１－ｒｅｐｅａｔ」～「５－ｒｅｐｅａｔ」はそれぞれ試料溶液２－１～試料溶液２－５の結果を示す。この結果、いずれの標的ＤＮＡを用いた場合でも、標的ＤＮＡ無添加（図中、「Ｎ」）に比べて蛍光輝度が増加していたが、試料溶液２－１～試料溶液２－５では蛍光輝度に差はなかった（図４）。従って、アクセプタープローブの片側にドナープローブを複数配置しても、会合体から放出される蛍光輝度は増加しないことが示された。また、図５に示すように、検出分子数に関しても同様の挙動が示された。すなわち、実施例１のようにアクセプタープローブの両側にドナープローブを配置しなければ、蛍光輝度増加の効果が得られないことが明らかとなった。
［参考例２］
　アクセプター蛍光物質とドナー蛍光物質の距離が、アクセプタープローブとドナープローブと標的核酸分子との会合体におけるＦＲＥＴの効率に与える影響を調べた。
＜１＞　アクセプター蛍光物質とドナー蛍光物質の距離が、標的核酸分子上の１塩基分となる会合体の形成
　終濃度２０ｍＭの標的ＤＮＡ－１（５’－ＴＧＡＧＧＴＡＧＴＡＧＧＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴ－３’、配列番号１３）、終濃度２０ｎＭのドナープローブ－１（５’－ＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡ－３’、配列番号１４、２番目のＴに、チアゾールオレンジが２つついた蛍光原子団が修飾されたプローブ）、終濃度２０ｎＭのアクセプタープローブ－１（５’－ＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＣ－３’、配列番号１５、３’末端に蛍光物質ＡＴＴＯ６３３が修飾されたプローブ。）となるように反応用バッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、４００ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０５％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００）に溶解させ、試料溶液（試料溶液３－１）を調製した。次いで、各試料溶液を、サーマルサイクラーを用いて９５℃で１０秒間インキュベートした後、２５℃まで温度を落とし３０分間インキュベートした。
＜２＞　アクセプター蛍光物質とドナー蛍光物質の距離が、標的核酸分子上の４塩基分となる会合体の形成
　ドナープローブとして、ドナープローブ－１に代えてドナープローブ－２（５’－ＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡ－３’、配列番号１４、５番目のＴに、チアゾールオレンジが２つついた蛍光原子団が修飾されたプローブ）を用いた以外は前記＜１＞と同様にして、試料溶液（試料溶液３－２）を調製した。次いで、各試料溶液を、サーマルサイクラーを用いて９５℃で１０秒間インキュベートした後、２５℃まで温度を落とし３０分間インキュベートした。
＜３＞　アクセプター蛍光物質とドナー蛍光物質の距離が、標的核酸分子上の８塩基分となる会合体の形成
　ドナープローブとして、ドナープローブ－１に代えてドナープローブ－３（５’－ＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡ－３’、配列番号１４、９番目のＴに、チアゾールオレンジが２つついた蛍光原子団が修飾されたプローブ）を用いた以外は前記＜１＞と同様にして、試料溶液（試料溶液３－３）を調製した。次いで、各試料溶液を、サーマルサイクラーを用いて９５℃で１０秒間インキュベートした後、２５℃まで温度を落とし３０分間インキュベートした。
＜４＞　アクセプター蛍光物質とドナー蛍光物質の距離が、標的核酸分子上の１３塩基分となる会合体の形成
　標的核酸分子として、標的ＤＮＡ－１に代えて標的ＤＮＡ－２（５’－ＧＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴＴＧＡＧＧＴＡＧＴＡＧ－３’、配列番号１６）を用いた以外は前記＜３＞と同様にして、試料溶液（試料溶液３－４）を調製した。次いで、各試料溶液を、サーマルサイクラーを用いて９５℃で１０秒間インキュベートした後、２５℃まで温度を落とし３０分間インキュベートした。
＜５＞　アクセプター蛍光物質とドナー蛍光物質の距離が、標的核酸分子上の１７塩基分となる会合体の形成
　標的核酸分子として、標的ＤＮＡ－１に代えて標的ＤＮＡ－２を用いた以外は前記＜２＞と同様にして、試料溶液（試料溶液３－５）を調製した。次いで、各試料溶液を、サーマルサイクラーを用いて９５℃で１０秒間インキュベートした後、２５℃まで温度を落とし３０分間インキュベートした。
＜６＞　アクセプター蛍光物質とドナー蛍光物質の距離が、標的核酸分子上の２０塩基分となる会合体の形成
　標的核酸分子として、標的ＤＮＡ－１に代えて標的ＤＮＡ－２を用いた以外は前記＜１＞と同様にして、試料溶液（試料溶液３－６）を調製した。次いで、各試料溶液を、サーマルサイクラーを用いて９５℃で１０秒間インキュベートした後、２５℃まで温度を落とし３０分間インキュベートした。
＜７＞　ＳＳＭＣによる試料溶液中の会合体の測定
　各試料溶液中の標的ＤＮＡを含む会合体を、実施例１の＜３＞と同様にしてＳＳＭＣにより測定した。
　ＳＳＭＣにより測定された各試料溶液中の会合体の分子数の測定結果を図６に示す。図中、「１塩基」、「４塩基」、「８塩基」、「１３塩基」、「１７塩基」、及び「２０塩基」はそれぞれ試料溶液３－１～試料溶液３－６の結果を示す。図６に示すように、試料溶液３－２で最大の検出分子数を示し、試料溶液３－３では、試料溶液３－２の検出分子数の１０％以上の検出分子数を維持していたが、試料溶液３－４～試料溶液３－６では検出分子数が明らかに少なかった。これらの結果から、標的ＤＮＡにおいて、ドナープローブ中のドナー蛍光物質が結合している塩基が会合する塩基と、アクセプタープローブ中のアクセプター蛍光物質が結合している塩基が会合する塩基との距離（色素間距離）が標的核酸分子の検出効率に影響すること、色素間距離が長いほど標的核酸分子の検出効率は低下すること、色素間距離が短い分には検出分子数の低下は小さく、ＦＲＥＴの制限はないと考えられること、色素間距離は８塩基以下が好ましいこと、がわかった。
　本発明に係る標的核酸分子の検出方法により、試料中に存在する標的核酸分子を、高感度かつ精度よく検出することができるため、試料中の核酸を検出又は定量解析するような生化学、分子生物学、臨床検査等の分野で利用が可能である。
Ｔ…標的核酸分子、ｄ…第１の蛍光物質（ドナー蛍光物質）、ａ…第２の蛍光物質（アクセプター蛍光物質）、１…第１のプローブ、２…第２のプローブ、３…第３のプローブ。

Claims (11)

  1. 　（ａ）核酸含有試料に、蛍光共鳴エネルギー移動現象に於けるエネルギー・ドナーと成る第１の蛍光物質で標識された第１のプローブ、蛍光共鳴エネルギー移動現象に於けるエネルギー・アクセプターと成る第２の蛍光物質で標識された第２のプローブ、及び前記第１の蛍光物質で標識された第３のプローブを混合し、試料溶液を調製する工程と、
    （ｂ）前記工程（ａ）において調製された試料溶液中の標的核酸分子を、前記第１のプローブ、前記第２のプローブ、及び前記第３のプローブと会合させて前記第１のプローブと前記第２のプローブと前記第３のプローブと前記標的核酸分子とからなる会合体を形成する工程と、
    （ｃ）前記工程（ｂ）の後、前記試料溶液に、前記第１の蛍光物質の励起波長の光を放射し、前記標的核酸分子を、前記会合体中の前記第２の蛍光物質から放出された蛍光を指標として検出する工程と、
    を有し、
    　前記標的核酸分子中、前記第２のプローブと会合する領域は、前記第１のプローブと会合する領域と前記第３のプローブと会合する領域の間にある、標的核酸分子の検出方法。
  2. 　前記第１のプローブ、前記第２のプローブ、又は前記第３のプローブが、前記標的核酸分子と会合している状態と会合していない状態で発光輝度が変化するプローブである、請求項１に記載の標的核酸分子の検出方法。
  3. 　前記第１の蛍光物質又は前記第２の蛍光物質が、エキシトン効果を示す蛍光性原子団である、請求項２に記載の標的核酸分子の検出方法。
  4. 　前記第１のプローブ中の前記第１の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基と、前記第２のプローブ中の前記第２の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基との距離が、８塩基以下であり、
    　前記第３のプローブ中の前記第１の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基と、前記第２のプローブ中の前記第２の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基との距離が、８塩基以下である、請求項１～３のいずれか一項に記載の標的核酸分子の検出方法。
  5. 　前記第２のプローブの塩基長が５～１７塩基である、請求項１～４のいずれか一項に記載の標的核酸分子の検出方法。
  6. 　前記核酸含有試料に、前記第１のプローブ、前記第２のプローブ、及び前記第３のプローブと会合する第１の標的核酸分子と、前記第１のプローブと前記第３のプローブのどちらか一方のみと前記第２のプローブと結合する第２の標的核酸分子が含まれており、
    　前記（ｂ）において、前記第１の標的核酸分子と、前記第１のプローブと、前記第２のプローブと、前記第３のプローブとを会合させた第１の会合体と、前記第２の標的核酸分子と、前記第２のプローブと、前記第１のプローブ及び前記第３のプローブのいずれか一方とを会合させた第２の会合体と、を形成し、
    　前記工程（ｃ）において、前記試料溶液に、前記第１の蛍光物質の励起波長の光を放射し、一分子の会合体中の前記第２の蛍光物質から放出された蛍光の輝度を指標として、前記第１の標的核酸分子と前記第２の標的核酸分子とを区別して検出し、前記試料溶液中の前記第１の標的核酸分子と前記第２の標的核酸分子の存在比を算出する、請求項１～５のいずれか一項に記載の標的核酸分子の検出方法。
  7. 　標的核酸分子を検出するためのプローブセットであり、
    　前記標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子が、蛍光共鳴エネルギー移動現象に於けるエネルギー・ドナーと成る第１の蛍光物質で標識された第１のプローブと、
    　前記標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子が、蛍光共鳴エネルギー移動現象に於けるエネルギー・アクセプターと成る第２の蛍光物質で標識された第２のプローブと、
    　前記標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子が、前記第１の蛍光物質で標識された第３のプローブと、
    を備え、
    　前記第１のプローブ、前記第２のプローブ、及び前記第３のプローブは、前記標的核酸分子と、前記第３のプローブが前記第２のプローブに対して前記第１のプローブとは反対側に配置されている会合体を形成することができ、
    　前記会合体に、前記第１の蛍光物質の励起波長の光を放射すると、前記第１のプローブ中の前記第１の蛍光物質と前記第２のプローブ中の前記第２の蛍光物質との間、及び前記第３のプローブ中の前記第１の蛍光物質と前記第２のプローブ中の前記第２の蛍光物質との間に、蛍光共鳴エネルギー移動が起こり、前記第２の蛍光物質から放出された蛍光が検出される、プローブセット。
  8. 　前記第１のプローブ、前記第２のプローブ、又は前記第３のプローブが、前記標的核酸分子と会合している状態と会合していない状態で発光輝度が変化するプローブである、請求項７に記載のプローブセット。
  9. 　前記第１の蛍光物質又は前記第２の蛍光物質が、エキシトン効果を示す蛍光性原子団である、請求項８に記載のプローブセット。
  10. 　前記会合体が、
    　前記第１のプローブ中の前記第１の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基と、前記第２のプローブ中の前記第２の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基との距離が、８塩基以下であり、
    　前記第３のプローブ中の前記第１の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基と、前記第２のプローブ中の前記第２の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基との距離が、８塩基以下である、請求項７～９のいずれか一項に記載のプローブセット。
  11. 　前記第２のプローブの塩基長が５～１７塩基である、請求項７～１０のいずれか一項に記載のプローブセット。
     
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