JP6786618B2 - 標的核酸分子の検出方法 - Google Patents

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Description

本発明は、蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＦＲＥＴ）を利用して、標的核酸分子を高感度に検出する方法に関する。
特定の塩基配列を有する核酸を検出する方法として、プローブやプライマー等の人工合成した短鎖のオリゴヌクレオチドを用いて核酸の塩基配列を調べる方法が多数報告されている。特に、体細胞変異や一塩基多型などの遺伝子解析では、検出感度に優れていることから、蛍光を用いた様々な手法が開発されている。
例えば、ＦＲＥＴを利用することにより、標的核酸分子を検出する方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。当該方法では、ＦＲＥＴのエネルギー・ドナーと成る蛍光物質（ドナー色素）が結合したドナープローブと、エネルギー・アクセプターと成る蛍光物質（アクセプター色素）が結合したアクセプタープローブとを、標的核酸分子の隣接する２領域にそれぞれ会合（ハイブリダイズ）させる。ドナープローブとアクセプタープローブの両者が標的核酸分子と会合した会合体では、アクセプター色素とドナー色素が近接しているため、当該会合体にドナー色素の励起波長の光を照射すると、励起されたドナー色素からＦＲＥＴが起こりアクセプター色素からの蛍光が発生する。一方で、どちらかのプローブが結合していない標的核酸分子ではＦＲＥＴが起こらず、アクセプター色素からの蛍光は得られない。このように、検出対象である標的核酸分子が存在する場合のみ、アクセプター色素からの蛍光を観測できるため、当該方法は標的核酸分子の検出や定量に用いられる。
その他、ＦＲＥＴを利用せず、１種類のプローブのみで標的核酸分子を検出する方法として、特許文献２及び３には、エキシトン効果（exciton coupling）を示す蛍光性原子団で標識された核酸プローブを用いる方法が開示されている。エキシトン効果とは、例えば、複数の色素が並行に集合し、Ｈ会合体（H−aggregate）を形成することにより、ほとんど蛍光発光を示さなくなる効果である。エキシトン効果を有するプローブ（Ｅプローブ）は、遊離の状態ではほとんど蛍光を放出しないが、標的核酸分子と会合することによりＨ会合体が解離するため、蛍光を発するようになる。
特許第４１１８９３２号公報 特開２０１３−１８３７３６号公報 国際公開第２０１４／０３４８１８号
核酸分子の検出をＦＲＥＴプローブを用いて行う場合では、通常の単一の蛍光色素で標識されたプローブを用いて検出する場合よりも、検出される蛍光の光量が大幅に小さくなり、標的核酸分子の検出効率が低下する。
本発明は、ＦＲＥＴを利用して、標的核酸分子を高感度に検出する方法、及び当該方法に利用するプローブセットを提供することを目的とする。
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、標的核酸分子に、１つのアクセプタープローブを挟む位置に２つのドナープローブが配置されるように会合体を形成させ、１つのアクセプタープローブに対して２つのドナープローブから蛍光共鳴エネルギーを供給させることによって、アクセプタープローブからの蛍光の輝度を増強させられることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明に係る標的核酸分子の検出方法及びプローブセットは下記［１］〜［５］である。
［１］ （ａ）核酸含有試料に、蛍光共鳴エネルギー移動現象に於けるエネルギー・ドナーと成る第１の蛍光物質で標識された第１のプローブ、蛍光共鳴エネルギー移動現象に於けるエネルギー・アクセプターと成る第２の蛍光物質で標識された第２のプローブ、及び前記第１の蛍光物質で標識された第３のプローブを混合し、試料溶液を調製する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において調製された試料溶液中の標的核酸分子を、前記第１のプローブ、前記第２のプローブ、及び前記第３のプローブと会合させて前記第１のプローブと前記第２のプローブと前記第３のプローブと前記標的核酸分子とからなる会合体を形成する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の後、前記試料溶液に、前記第１の蛍光物質の励起波長の光を放射し、前記標的核酸分子を、前記会合体中の前記第２の蛍光物質から放出された蛍光を指標として検出する工程と、
を有し、
前記標的核酸分子中、前記第２のプローブと会合する領域は、前記第１のプローブと会合する領域と前記第３のプローブと会合する領域の間にあり、
前記第１の蛍光物質又は前記第２の蛍光物質が、エキシトン効果を示す蛍光性原子団であり、
前記第１のプローブ中の前記第１の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基と、前記第２のプローブ中の前記第２の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基との距離が、８塩基以下であり、
前記第３のプローブ中の前記第１の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基と、前記第２のプローブ中の前記第２の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基との距離が、８塩基以下である、標的核酸分子の検出方法。
［２］ 前記第２のプローブの塩基長が５〜１７塩基である、前記［１］の標的核酸分子の検出方法。
［３］ 前記核酸含有試料に、前記第１のプローブ、前記第２のプローブ、及び前記第３のプローブと会合する第１の標的核酸分子と、前記第１のプローブと前記第３のプローブのどちらか一方のみと前記第２のプローブと結合する第２の標的核酸分子が含まれており、
前記（ｂ）において、前記第１の標的核酸分子と、前記第１のプローブと、前記第２のプローブと、前記第３のプローブとを会合させた第１の会合体と、前記第２の標的核酸分子と、前記第２のプローブと、前記第１のプローブ及び前記第３のプローブのいずれか一方とを会合させた第２の会合体と、を形成し、
前記工程（ｃ）において、前記試料溶液に、前記第１の蛍光物質の励起波長の光を放射し、一分子の会合体中の前記第２の蛍光物質から放出された蛍光の輝度を指標として、前記第１の標的核酸分子と前記第２の標的核酸分子とを区別して検出し、前記試料溶液中の前記第１の標的核酸分子と前記第２の標的核酸分子の存在比を算出する、前記［１］又は［２］の標的核酸分子の検出方法。
［４］ 標的核酸分子を検出するためのプローブセットであり、
前記標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子が、蛍光共鳴エネルギー移動現象に於けるエネルギー・ドナーと成る第１の蛍光物質で標識された第１のプローブと、
前記標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子が、蛍光共鳴エネルギー移動現象に於けるエネルギー・アクセプターと成る第２の蛍光物質で標識された第２のプローブと、
前記標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子が、前記第１の蛍光物質で標識された第３のプローブと、
を備え、
前記第１の蛍光物質又は前記第２の蛍光物質が、エキシトン効果を示す蛍光性原子団であり、
前記第１のプローブ、前記第２のプローブ、及び前記第３のプローブは、前記標的核酸分子と、前記第３のプローブが前記第２のプローブに対して前記第１のプローブとは反対側に配置されている会合体を形成することができ、
前記第１のプローブ中の前記第１の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基と、前記第２のプローブ中の前記第２の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基との距離が、８塩基以下であり、
前記第３のプローブ中の前記第１の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基と、前記第２のプローブ中の前記第２の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基との距離が、８塩基以下である、標的核酸分子
前記会合体に、前記第１の蛍光物質の励起波長の光を放射すると、前記第１のプローブ中の前記第１の蛍光物質と前記第２のプローブ中の前記第２の蛍光物質との間、及び前記第３のプローブ中の前記第１の蛍光物質と前記第２のプローブ中の前記第２の蛍光物質との間に、蛍光共鳴エネルギー移動が起こり、前記第２の蛍光物質から放出された蛍光が検出される、プローブセット。
［５］ 前記第２のプローブの塩基長が５〜１７塩基である、前記［４］のプローブセット。
本発明に係る標的核酸分子の検出方法は、１つのアクセプタープローブに対して２つのドナープローブから蛍光共鳴エネルギーが供給されるため、アクセプタープローブとドナープローブを１つずつ使用する従来のＦＲＥＴを利用した検出方法に比べて、標的核酸分子とアクセプタープローブとドナープローブとからなる会合体から発される蛍光輝度が大きい。このため、当該検出方法を用いることにより、標的核酸分子の検出効率を高めることができる。
また、本発明に係るプローブセットを用いることにより、当該検出方法を簡便かつ容易に実施することができる。
図１は、従来のＦＲＥＴプローブを利用した検出方法（左）と本発明に係る検出方法（右）の各プローブと標的核酸分子とが形成する会合体の模式図である。 図２は、実施例１において、各試料溶液の蛍光輝度の測定結果を示した図である。 図３は、実施例１において、ＳＳＭＣにより測定された各試料溶液中の会合体の分子数の測定結果を示した図である。 図４は、参考例１において、各試料溶液の蛍光輝度の測定結果を示した図である。 図５は、参考例１において、ＳＳＭＣにより測定された各試料溶液中の会合体の分子数の測定結果を示した図である。 図６は、参考例２において、ＳＳＭＣにより測定された各試料溶液中の会合体の分子数の測定結果を示した図である。
本発明に係る標的核酸分子の検出方法（以後、「本発明に係る検出方法」ということがある。）は、ＦＲＥＴプローブを用いて標的核酸分子を検出する方法であって、ＦＲＥＴ現象に於けるエネルギー・ドナーと成る第１の蛍光物質で標識された第１のプローブ、ＦＲＥＴ現象に於けるエネルギー・アクセプターと成る第２の蛍光物質で標識された第２のプローブ、及び前記第１の蛍光物質で標識された第３のプローブを用いることを特徴とする。以降、「第１の蛍光物質」を「ドナー蛍光物質」、「第２の蛍光物質」を「アクセプター蛍光物質」ということがある。ドナー蛍光物質で標識された第１のプローブと第３のプローブがいわゆるドナープローブであり、アクセプター蛍光物質で標識された第２のプローブがいわゆるアクセプタープローブである。本発明に係る検出方法では、標的核酸分子１分子に対して、１つのアクセプタープローブと２つのドナープローブを、２つのドナープローブがアクセプタープローブを挟むように配置させて会合させる。従来のＦＲＥＴプローブを利用した検出方法と本発明に係る検出方法の各プローブと標的核酸分子とが形成する会合体の模式図を図１に示す。従来の方法では、１分子の標的核酸分子に対して、１つのアクセプタープローブと１つのドナープローブを互いに隣接するように会合させてＦＲＥＴを起こさせる（左図）。これに対して、本発明に係る標的核酸分子の検出方法では、標的核酸分子に対して、２つのドナープローブ（第１のプローブと第３のプローブ）がアクセプタープローブ（第２のプローブ）を挟むように配置させて会合させるため、２つのドナープローブから１つのアクセプタープローブに対して蛍光共鳴エネルギーが供給される（右図）。理論的には、アクセプターに対して供給される蛍光共鳴エネルギー量が、従来方法の２倍程度になり、アクセプターから放出される蛍光の輝度が増強され、当該会合体の検出感度が向上される。
本発明において用いられるドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質は、十分に近接した場合にＦＲＥＴが生じる物質同士の組み合わせであり、かつ会合体の形成を阻害しないものであればよく、ＦＲＥＴプローブにおいて一般的に用いられている物質の中から、適宜選択して用いることができる。例えば、ＰＥ（フィコエリスリン）をドナー蛍光物質として、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ（登録商標） ６１０、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ６４７、及びＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ６８０をアクセプター蛍光物質として、組み合わせて用いることができる。また、ＡＰＣ（アロフィコシアニン）をドナー蛍光物質として、Ｃｙ５．５をアクセプター蛍光物質として、組み合わせて用いることができる。
本発明において用いられる第１のプローブ、第２のプローブ、及び第３のプローブとしては、標的核酸分子と会合している状態と会合していない状態で発光輝度が変化するプローブとすることもできる。例えば、標的核酸分子と会合していない状態では発光強度が小さく、標的核酸分子と会合している状態では発光強度が強くなるようなプローブを用いることにより、ＦＲＥＴの蛍光を検出する際のバックグラウンドやノイズを抑えることができ、標的核酸分子の検出感度をより高めることができる。
例えば、ドナー蛍光物質又はアクセプター蛍光物質として、エキシトン効果を示す蛍光性原子団を用いることにより、標的核酸分子と会合している状態と会合していない状態で発光輝度が変化するプローブとすることができる。ドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質の両方をエキシトン効果を示す蛍光性原子団としてもよく、いずれか一方をエキシトン効果を示す蛍光性原子団としてもよい。いずれか一方とする場合には、より効率的にバックグラウンドやノイズを抑えることができるため、ドナー蛍光物質をエキシトン効果を示す蛍光性原子団とすることが好ましい。
エキシトン効果を示す蛍光性原子団としては、チアゾールオレンジとその誘導体、オキサゾールイエローとその誘導体、シアニンとその誘導体、ヘミシアニンとその誘導体、メチルレッドとその誘導体、ほか一般的にシアニン色素、アゾ色素と呼ばれる色素群が挙げられる。シアニン色素としては、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５等が挙げられる。また、ＤＮＡ等の核酸に結合することによって蛍光強度を変化させる蛍光色素として公知の色素や微視的極性に応じて蛍光強度が変化する蛍光色素、及びこれらから誘導される基も、適宜用いることができる。核酸に結合することによって蛍光強度を変化させる蛍光色素としては、例えば、エチジウムブロミドが挙げられる。微視的極性に応じて蛍光強度が変化する蛍光色素としては、例えば、ピレンカルボキシアミド、プロダンが挙げられる。その他、フルオレセインも用いるエキシトン効果を示す蛍光性原子団として使用することができる。
エキシトン効果を示すプローブは、標的核酸分子と会合するための一本鎖核酸分子に、１つのエキシトン効果を示す蛍光性原子団を直接又は適切なリンカーを介して間接的に結合させてもよく、標的核酸分子と会合するための一本鎖核酸分子に、少なくとも２つのエキシトン効果を示す蛍光性原子団を近接した状態で結合させてもよい。２つのエキシトン効果を示す蛍光性原子団を近接した状態で結合させプローブとしては、例えば、標的核酸分子と会合するための一本鎖核酸分子中の一つの塩基に、下記一般式（１）の構造からなる基を結合させたものを挙げることができる（特許文献２参照。）。
Figure 0006786618
一般式（１）中、Ａは、ＣＲ、Ｎ、Ｐ、ＰＯ、Ｂ若しくはＳｉＲであり、Ｒは、水素原子、アルキル基又は任意の置換基である。
一般式（１）中、Ｂ１、Ｂ２及びＢ３は、リンカー（架橋原子又は原子団）であり、主鎖長は任意である。主鎖中にＣ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｂ、Ｓｉ、Ｓを含んでいてもいなくてもよく、単結合、二重結合、三重結合、アミド結合、エステル結合、ジスルフィド結合、イミノ基、エーテル結合、チオエーテル結合、及びチオエステル結合をそれぞれ含んでいてもいなくてもよい。Ｂ１、Ｂ２及びＢ３はそれぞれの同一でも異なっていてもよい。一般式（１）の構造からなる基は、Ｂ３（式（１）中のアスタリスク）において、一本鎖核酸分子を構成する塩基中の側鎖に結合する。
一般式（１）中、Ｃ１及びＣ２は、エキシトン効果を示す蛍光性原子団であり、それぞれ同一でも異なっていてもよい。エキシトン効果を示す蛍光性原子団としては、前記で列挙したものが挙げられる。また、下記一般式（２）又は一般式（３）で表される原子団とすることもできる。
Figure 0006786618
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一般式（２）及び一般式（３）中、Ｅは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅであり、ｎは、０又は正の整数である。Ｒ１及びＲ２のうち一方は、一般式（１）中のＢ１又はＢ２に結合する連結基であり、他方は、水素原子又は低級アルキル基である。Ｒ３〜Ｒ１２は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基、ニトロ基、シアノ基、カルボニル基、カルボキシル基、アミノ基、シリル基、ボリル基である。ＡＲは、任意の芳香環であり、あってもなくてもよい。一般式（２）又は（３）中においてＲ３が複数存在する場合は、同一でも異なっていてもよく、一般式（２）又は（３）中においてＲ４が複数存在する場合は、同一でも異なっていてもよい。
一般式（１）中のＣ１又はＣ２が一般式（２）又は一般式（３）で表される原子団である場合、Ｃ１中のＥ、ＡＲ、ｎ及びＲ１〜Ｒ１２と、Ｃ２中のＥ、ＡＲ、ｎ及びＲ１〜Ｒ１２とは、互いに同一でも異なっていてもよい。
第１のプローブ及び第３のプローブは、それぞれ、標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子を、ドナー蛍光物質で標識させることにより得られる。同様に、第２のプローブは、標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子を、アクセプター蛍光物質で標識させることにより得られる。各プローブは、ドナー蛍光物質又はアクセプター蛍光物質を、標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子に直接結合させてもよく、リンカーを介して間接的に結合させてもよい。当該リンカーとしては、例えば、１〜１０塩基長の一本鎖核酸分子が挙げられる。ドナー蛍光物質又はアクセプター蛍光物質と標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子又はリンカーとの結合は、常法により行うことができる。
各プローブ中の標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子の塩基配列は、標的核酸分子の塩基配列情報に基づいて設計される。設計には、汎用されているプライマー／プローブ設計ソフトウェア等を用いることもできる。
第１のプローブ、第２のプローブ、及び第３のプローブは、標的核酸分子と、第３のプローブが第２のプローブに対して第１のプローブとは反対側に配置されるように会合体を形成させる。このため、標的核酸分子中、第２のプローブと会合する領域（図１中、「Ｒ２」）が、第１のプローブと会合する領域（図１中、「Ｒ１」）と第３のプローブと会合する領域（図１中、「Ｒ３」）の間になるように、各プローブの標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子の塩基配列を設計する。標的核酸分子中、第２のプローブと会合する領域と第１のプローブと会合する領域は、隣接していてもよく、１〜５塩基離れていてもよい。同様に、標的核酸分子中、第２のプローブと会合する領域と第３のプローブと会合する領域は、隣接していてもよく、１〜５塩基離れていてもよい。
標的核酸分子と３種のプローブとの会合体において、第１のプローブ中のドナー蛍光物質と第２のプローブ中のアクセプター蛍光物質との間、及び第３のプローブ中のドナー蛍光物質と第２のプローブ中のアクセプター蛍光物質との間に、ＦＲＥＴが生じる必要がある。このため、標的核酸分子中、第１のプローブと会合する領域と第２のプローブと会合する領域と第３のプローブと会合する領域は、第１のプローブ中のドナー蛍光物質と第２のプローブ中のアクセプター蛍光物質との間の距離がＦＲＥＴが起こるために充分に短くなるように、かつ第３のプローブ中のドナー蛍光物質と第２のプローブ中のアクセプター蛍光物質との間の距離がＦＲＥＴが起こるために充分に短くなるように、設計する。例えば、標的核酸分子中の第１のプローブと会合する領域と第２のプローブと会合する領域を、第１のプローブ中のドナー蛍光物質が結合している塩基が会合する標的核酸分子中の塩基と、第２のプローブ中のアクセプター蛍光物質が結合している塩基が会合する標的核酸分子中の塩基との距離が、８塩基以下、好ましくは６塩基以下、より好ましくは４塩基以下となるように設計する。同様に、標的核酸分子中の第３のプローブと会合する領域と第２のプローブと会合する領域を、第３のプローブ中のドナー蛍光物質が結合している塩基が会合する標的核酸分子中の塩基と、第２のプローブ中のアクセプター蛍光物質が結合している塩基が会合する標的核酸分子中の塩基との距離が、８塩基以下、好ましくは６塩基以下、より好ましくは４塩基以下となるように設計する。このため、第２のプローブにおいては、アクセプター蛍光物質が結合している塩基はプローブの中央又はその付近にあることが好ましく、塩基長が５〜１７塩基であることが好ましい。
各プローブ中の標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子の塩基配列は、標的核酸分子の目的の領域に特異的に会合可能な配列であればよい。例えば、第１のプローブ中の標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子の塩基配列は、標的核酸分子において設計された第１のプローブと会合する領域と相補的な配列であることが好ましいが、当該領域の塩基配列と相補的な配列に対して１〜５塩基を置換、欠失、又は挿入したミスマッチのある配列であってもよい。同様に、第２のプローブ及び第３のプローブにおいても、標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子の塩基配列は、それぞれ、標的核酸分子において設計された第２のプローブと会合する領域及び第３のプローブと会合する領域と相補的な配列であることが好ましいが、当該領域の塩基配列と相補的な配列に対して１〜５塩基を置換、欠失、又は挿入したミスマッチのある配列であってもよい。
第１のプローブと第３のプローブにおける標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子の塩基長は、標的核酸分子の目的の領域と特異的に会合できる長さであれば特に限定されるものではなく、一般的なプローブと同様とすることができる。具体的には、例えば、１５〜５０塩基とすることができ、１５〜３５塩基とすることが好ましい。
標的核酸分子は、ＤＮＡやＲＮＡ、２'−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ ＲＮＡのような天然型ヌクレオチドのみからなるものであってもよく、人工的ヌクレオチドを一部又は全部に含む人工核酸分子であってもよい。
各プローブにおける標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子は、ＤＮＡやＲＮＡ、２'−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ ＲＮＡのような天然型ヌクレオチドのみからなるものであってもよく、人工的ヌクレオチドを一部又は全部に含む人工核酸分子であってもよい。
「人工的ヌクレオチド」とは、人工的に合成されたヌクレオチドであって、天然型ヌクレオチドとは構造が異なるが、天然型ヌクレオチドと同様に機能し得るものを意味する。ここで、「天然型ヌクレオチドと同様に機能し得る」とは、天然型ヌクレオチドと同様にリン酸ジエステル結合等により核酸分子を形成することができることを意味する。
このような人工的ヌクレオチドとしては、例えば、ＢＮＡ（Bridged nucleic acid）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン−架橋化核酸）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ＨＮＡ（Hexitol Nucleic Acid）等が挙げられる。ＢＮＡは、天然型ヌクレオチドの一部が架橋化された核酸であり、リボース環の２’位の酸素原子と４’位の炭素原子がメチレンを介して結合している架橋された人工的ヌクレオチドであるＬＮＡ（Locked nucleic acid）を含む。
特に、第２のプローブ中の標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子は比較的塩基長が短いため、標的核酸分子の目的の領域と特異的に会合させるために、ＬＮＡやＥＮＡ等のような人工的に認識能を高めた人工的ヌクレオチドを含むことが好ましい。
本発明に係る検出方法は、下記工程（ａ）〜（ｃ）を有する。
（ａ）核酸含有試料に、前記第１のプローブ、前記第２のプローブ、及び前記第３のプローブを混合し、試料溶液を調製する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において調製された試料溶液中の標的核酸分子を、前記第１のプローブ、前記第２のプローブ、及び前記第３のプローブと会合させて前記第１のプローブと前記第２のプローブと前記第３のプローブと前記標的核酸分子とからなる会合体を形成する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の後、前記試料溶液に、前記第１の蛍光物質の励起波長の光を放射し、前記標的核酸分子を、前記会合体中の前記第２の蛍光物質から放出された蛍光を指標として検出する工程。
本発明において標的核酸分子とは、検出の標的である特定の塩基配列（標的塩基配列）を有する核酸分子を意味する。当該標的核酸分子としては、第１のプローブ等の設計が可能な程度に塩基配列情報が明らかになっているものであれば、特に限定されるものではない。例えば、動物や植物の染色体や、細菌やウィルスの遺伝子に存在する塩基配列を有する核酸分子であってもよく、人工的に設計された塩基配列を有する核酸分子であってもよい。なお、本発明において、標的核酸分子としては、二本鎖核酸であってもよく、一本鎖核酸であってもよい。また、ＤＮＡとＲＮＡのいずれであってもよい。該標的核酸分子として、例えば、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＰＣＲ増幅等による合成ＤＮＡ、ＲＮＡから逆転写酵素を用いて合成されたｃＤＮＡ等がある。
また、本発明において核酸含有試料とは、核酸分子を含有する試料であれば、特に限定されるものではない。当該核酸含有試料として、例えば、動物等から採取した生体試料、培養細胞等から調製された試料、核酸合成反応後の反応溶液等が挙げられる。核酸含有試料は、生体試料等そのものであってもよく、生体試料等から抽出・精製した核酸溶液でもよい。
まず、工程（ａ）として、核酸含有試料と３種の前記プローブを混合して試料溶液を調製する。この際、必要に応じて適当な溶媒を添加してもよい。当該溶媒は、ドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質との間のＦＲＥＴやアクセプター蛍光物質から発される蛍光の検出を阻害しない溶媒であれば、特に限定されるものではなく、当該技術分野において一般的に用いられているバッファーの中から、適宜選択して用いることができる。当該バッファーとして、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）等のリン酸バッファーやトリスバッファー等がある。
その他、各プローブと標的核酸分子以外の核酸分子との非特異的な会合を抑制するために、予め試料溶液中に、界面活性剤、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、又は尿素等を添加しておくことも好ましい。これらの化合物は、１種のみを添加してもよく、２種類以上を組み合わせて添加してもよい。これらの化合物を添加しておくことにより、比較的低い温度環境下において、非特異的な会合を起こりにくくすることができる。
次いで工程（ｂ）として、前記工程（ａ）において調製された試料溶液中の標的核酸分子を、前記３種のプローブと会合させて会合体を形成する。標的核酸分子と各プローブを特異的に会合させるために、まず、試料溶液中の核酸分子を全て変性させた後、会合体を形成させる。
本発明において、「核酸分子を変性させる」とは、塩基対を解離させることを意味する。本発明においては、ドナー蛍光物質やアクセプター蛍光物質への影響が比較的小さいことから、高温処理による変性（熱変性）又は低塩濃度処理による変性を行うことが好ましい。中でも、操作が簡便であるため、熱変性を行うことが好ましい。変性条件は、標的核酸分子や各プローブの塩基配列や塩基長に依存する。例えば、熱変性は、一般的には、当該試料溶液を、標的核酸分子やプローブがＤＮＡの場合は９０〜１００℃、ＲＮＡの場合は７０℃で数秒間から２分間程度、保温することによって変性させることができる。一方、低塩濃度処理による変性は、例えば、精製水等により希釈することによって、当該試料溶液の塩濃度が十分に低くなるように調整することによって行うことができる。
熱変性を行った場合には、高温処理後、当該試料溶液の温度を、標的核酸分子と各プローブが会合可能な温度にまで低下させることにより、当該試料溶液中の標的核酸分子と第１のプローブと第２のプローブと第３のプローブとの会合体を形成させることができる。具体的には、各プローブ中の標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子のＴｍ値（二本鎖ＤＮＡの５０％が一本鎖ＤＮＡに解離する温度）±３℃の温度程度まで低下させる。標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子のＴｍ値が各プローブで異なる場合には、最も低温のＴｍ値±３℃の温度程度まで低下させる。一方、低塩濃度処理による変性を行った場合にも、同様に、低塩濃度処理後、塩溶液を添加する等により、当該試料溶液の塩濃度を、標的核酸分子と各プローブが会合可能な濃度にまで上昇させることにより、当該試料溶液中の標的核酸分子と第１のプローブと第２のプローブと第３のプローブとの会合体を形成させることができる。各プローブの標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子のＴｍ値は、汎用されているプライマー／プローブ設計ソフトウェア等を用いることにより算出することができる。
工程（ｂ）の後、工程（ｃ）として、試料溶液にドナー蛍光物質の励起波長の光を放射し、アクセプター蛍光物質の蛍光波長の蛍光を検出する。当該試料溶液中の標的核酸分子と第１のプローブと第２のプローブと第３のプローブとの会合体にドナー蛍光物質の励起波長の光が照射されると、第１のプローブ中のドナー蛍光物質と第２のプローブ中のアクセプター蛍光物質との間及び第３のプローブ中のドナー蛍光物質と第２のプローブ中のアクセプター蛍光物質との間にＦＲＥＴが起こるため、当該会合体からは、アクセプター蛍光物質から蛍光が放出される。つまり、ドナー蛍光物質の励起波長の光を放出して検出されるアクセプター蛍光物質の蛍光波長の蛍光シグナルを測定することにより、標的核酸分子と第１のプローブと第２のプローブと第３のプローブとの会合体を検出することができる。核酸含有試料に標的核酸分子が含まれていた場合には、ドナー蛍光物質の励起波長の光を放射した場合に、アクセプター蛍光物質の蛍光波長の蛍光が検出される。一方で、核酸含有試料に標的核酸分子が含まれていなかった場合には、ドナー蛍光物質の励起波長の光を放射した場合に、アクセプター蛍光物質の蛍光波長の蛍光は検出されない。
試料溶液中の標的核酸分子を含む会合体から放出されるアクセプター蛍光物質の蛍光波長の蛍光シグナルの測定方法は特に限定されるものではなく、試料溶液全体の蛍光強度を測定する方法であってもよく、試料溶液中の蛍光を発する分子を一分子ごとに検出して測定する方法であってもよい。
試料溶液の蛍光強度は、蛍光プレートリーダー等の蛍光分光光度計等を用いて常法により測定することができる。試料溶液のアクセプター蛍光物質の蛍光波長の蛍光強度は、当該試料溶液中に含まれている標的核酸分子と３種のプローブとの会合体の量に依存する。このため、例えば、予め検出対象であるアクセプター蛍光物質の量と蛍光強度との関係を示す検量線を作成しておくことにより、試料溶液中の標的核酸分子を含む会合体の量、すなわち、核酸含有試料中の標的核酸分子の量を定量することができる。
試料溶液中の一分子ごとに蛍光シグナルを測定する方法としては、走査分子計数法（Scanning single-molecule counting,ＳＳＭＣ）（国際公開第２０１２／１０２２６０号）、蛍光相関分光法（Fluorescence Correlation Spectroscopy，ＦＣＳ）、蛍光強度分布解析法（Fluorecscence Intensity Distribution Analysis，ＦＩＤＡ）、及び蛍光偏光強度分布解析法（FIDA polarization，ＦＩＤＡ−ＰＯ）が挙げられる。中でも、１つのドナープローブを用いる従来の方法に比べて標的核酸分子の検出効率をより顕著に高められることから、ＳＳＭＣにより測定することが好ましい。
なお、このような１分子の蛍光シグナルの検出及び解析は、例えば、ＭＦ２０（オリンパス社製）等の公知の一分子蛍光分析システム等を用いて、常法により行うことができる。
また、２つのドナープローブ（第１のプローブと第３のプローブ）と１つのアクセプタープローブ（第２のプローブ）と標的核酸分子とにより形成された会合体は、１つのドナープローブ（第１のプローブ又は第３のプローブ）と１つのアクセプタープローブ（第２のプローブ）と標的核酸分子とにより形成された会合体よりも、ＦＲＥＴによりアクセプターから放出される蛍光の輝度が強い。この輝度の強さの違いを利用して、本発明に係る検出方法では、塩基配列が類似した２種類の標的核酸分子（第１の標的核酸分子と第２の標的核酸分子）を区別して検出することもできる。
具体的には、まず、前記第１のプローブ、前記第２のプローブ、及び前記第３のプローブを、第１の標的核酸分子にはこの３種のプローブが全て会合して会合体を形成し得るが、第２の標的核酸分子は、前記第２のプローブと会合するものの、前記第１のプローブと前記第３のプローブはどちらか一方のみとしか会合しないように設計する。前記工程（ａ）に供される前記核酸含有試料に、第１の標的核酸分子と第２の標的核酸分子が含まれている場合には、前記工程（ｂ）において、工程（ａ）で調製された試料溶液中で、前記第１の標的核酸分子と、前記第１のプローブと、前記第２のプローブと、前記第３のプローブとを会合させた第１の会合体と、前記第２の標的核酸分子と、前記第２のプローブと、前記第１のプローブ及び前記第３のプローブのいずれか一方とを会合させた第２の会合体が、それぞれ形成される。
続いて、工程（ｃ）において、前記試料溶液に、前記第１の蛍光物質の励起波長の光を放射すると、会合体中のアクセプターから放出される蛍光の輝度は、会合体中に１つのドナープローブしか含まれていない第２の会合体よりも、会合体中に２つのドナープローブを含む第１の会合体のほうが強い。そこで、一分子の会合体中のアクセプター（第２の蛍光物質）から放出された蛍光の輝度を指標として、第１の会合体に含まれている第１の標的核酸分子と、第２の会合体に含まれている第２の標的核酸分子を、区別して検出することができる。試料溶液中の一分子ごとに蛍光シグナルを測定した場合、ＦＲＥＴによりアクセプターから放出された蛍光の輝度がより明るい分子が第１の標的核酸分子を含む第１の会合体であり、より暗い分子が第２の標的核酸分子を含む第２の会合体である。アクセプターから放出された蛍光の輝度値を指標として、第１の会合体と第２の会合体を区別して検出した場合には、試料溶液中の第１の標的核酸分子の分子数と第２の標的核酸分子の分子数とから、試料溶液中の第１の標的核酸分子と第２の標的核酸分子の存在比を算出することもできる。
本発明に係る検出方法を遺伝子多型の検出に利用することもできる。例えば、 遺伝子多型のうち、変異型を第１の標的核酸分子とし、野生型を第２の標的核酸分子として、前記第１のプローブと前記第２のプローブを、野生型と変異型で塩基配列が共通する領域に会合するように設計し、第３のプローブを変異型である第１の標的核酸分子とは会合するが、野生型である第２の標的核酸分子とは会合しないように設計する。これにより、野生型の標的核酸分子を含む会合体は蛍光輝度の弱い分子として検出され、変異型の標的核酸分子を含む会合体は蛍光輝度の強い分子として検出される。また、得られた検出結果に基づき、核酸含有試料中の変異型の核酸分子と野生型の核酸分子との存在比を求めることもできる。
前記第１のプローブ、前記第２のプローブ、及び前記第３のプローブをセットにすることも好ましい。これらの３種のプローブを含むプローブセットにより、本発明に係る検出方法をより容易かつ簡便に実施することができる。当該プローブセットに、本発明に係る検出方法に使用する各種試薬や機器等をキット化することも好ましい。当該キットには、前記プローブの他に、試料溶液を調製するために用いられる各種バッファーや、変性処理や会合体形成に使用される恒温装置付インキュベーター等を含ませることができる。
次に実施例等を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
任意の濃度の標的核酸分子を、２つのドナープローブと１つのアクセプタープローブを用いて検出した。
＜１＞ ２つのドナープローブと１つのアクセプタープローブと標的ＤＮＡとの会合体の形成
終濃度０〜１００ｍＭの標的ＤＮＡ（５’−ＡＧＡＧＣＴＡＣＧＡＧＣＴＧＣＣＴＧＡＣＧＧＣＣＡＧＧＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＴＧＧＣＡＡＴＧＡＧＣＧＧＴＴＣ−３’、配列番号１）、終濃度２０ｎＭのドナープローブａ（５’−ＧＡＡＣＣＧＣＴＣＡＴＴＧＣＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧ−３’、配列番号２、２番目のＴに、チアゾールオレンジが２つついた蛍光原子団が修飾されたプローブ）、終濃度２０ｎＭのドナープローブｂ（５’−ＧＴＣＡＧＧＣＡＧＣＴＣＧＴＡＧＣＴＣＴＴＣＴＣＣ−３’、配列番号３、２番目のＴに、チアゾールオレンジが２つついた蛍光原子団が修飾されたプローブ）、終濃度２０ｎＭのアクセプタープローブａ（５’−ＡＣＣＴＧＧＣＣ−３’、配列番号４、４番目のＴに蛍光物質ＡＴＴＯ６３３が修飾されたプローブ。４番目のＴ以外の塩基はＥＮＡである。）となるように反応用バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）に溶解させ、試料溶液（試料溶液１−１）を調製した。調製された試料溶液１−１を、サーマルサイクラーを用いて９５℃で１０秒間インキュベートした後、２５℃まで温度を落とし３０分間インキュベートした。
＜２＞ １つのドナープローブと１つのアクセプタープローブと標的ＤＮＡとの会合体の形成
ドナープローブｂを混合せず、アクセプタープローブとしてアクセプタープローブａに代えてアクセプタープローブｂ（５’−ＡＣＣＴＧＧＣＣＧＴＣＡＧＧＣＡＧＣＴＣＧＴＡＧＣＴＣＴ−３’、配列番号５、５’末端に蛍光物質ＡＴＴＯ６３３が修飾されたプローブ。）を用いた以外は、前記＜１＞と同様にして試料溶液（試料溶液１−２）を調製し、調製された試料溶液１−２を、サーマルサイクラーを用いて９５℃で１０秒間インキュベートした後、２５℃まで温度を落とし３０分間インキュベートした。
＜３＞ ＳＳＭＣによる試料溶液中の会合体の測定
前記＜１＞及び＜２＞で調製した試料溶液中の標的ＤＮＡを含む会合体を、ＳＳＭＣにより測定した。具体的には、各試料溶液に対してそれぞれ、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた一分子蛍光測定装置ＭＦ−２０（オリンパス株式会社）を用いて測定を行い、時系列光強度データ（フォトンカウントデータ）を取得した。試料溶液を、チアゾールオレンジの励起波長である４８８ｎｍ、３００μＷのレーザーで励起し、バンドパスフィルターを用いて、ＡＴＴＯ６３３の蛍光波長である６００〜６６０ｎｍの蛍光を検出した。試料溶液中に於ける光検出領域は、１５ｍｍ／秒の移動速度にて移動させ、２０秒間の測定を行った。また、ＢＩＮ ＴＩＭＥを１０μ秒とし、測定によって得られた時系列光強度データをスムージング後、微分によりピークの検出を行った。ピークとみなされた領域のうち、ガウス関数に近似でき、強度が０．８以上となるもののピーク強度を抽出した。
各試料溶液の蛍光輝度の測定結果を図２に示す。この結果、どちらの試料溶液においても、ＡＴＴＯ６３３の蛍光波長の蛍光輝度は、標的ＤＮＡの濃度依存的に高くなる傾向が観察された。特に、標的ＤＮＡの濃度が３０ｎＭで蛍光輝度が飽和しており、全てのプローブが標的ＤＮＡと会合体を形成したと考えられた。各試料溶液の蛍光輝度を比較すると、飽和点（標的ＤＮＡの濃度が３０ｎＭの試料溶液）において、ドナープローブを２つ用いた試料溶液１−１では、ドナープローブを１つ用いた試料溶液１−２に対して、蛍光輝度が２倍程度となっていた。従って、１つのアクセプタープローブに対してドナープローブを２つ配置することにより、蛍光輝度が増加することが示された。
また、ＳＳＭＣにより測定された各試料溶液中の会合体の分子数の測定結果を図３に示す。ＳＳＭＣにおける検出分子数は、飽和点（標的ＤＮＡの濃度：３０ｎＭ）において、ドナープローブを２つ用いた試料溶液１−１では、ドナープローブを１つ用いた試料溶液１−２に対して、蛍光輝度が１０倍になった。１分子あたりの蛍光強度が増加したことにより、１分子の検出効率が向上したためであると考えられた。
［参考例１］
標的核酸分子を、複数のドナープローブをアクセプタープローブに対して同じ側にタンデムに会合させて検出した。
標的ＤＮＡとして、標的ＤＮＡ−１（５’−ＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＣＧＧＧＣＴＧＡＡ−３’、配列番号６）、標的ＤＮＡ−２（５’−ＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＣＧＧＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＧＡＡ−３’、配列番号７）、標的ＤＮＡ−３（５’−ＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＣＧＧＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＧＡＡ−３’、配列番号８）、標的ＤＮＡ−４（５’−ＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＣＧＧＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＧＡＡ−３’、配列番号９）、標的ＤＮＡ−５（５’−ＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＣＧＧＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＧＡＡ−３’、配列番号１０）を用いた。標的ＤＮＡ−１〜標的ＤＮＡ−５は、それぞれ、ドナープローブが１〜５個、アクセプタープローブに対して同じ方向になるように会合する。
終濃度１０ｍＭの各標的ＤＮＡ、終濃度２０ｎＭのドナープローブ（５’−ＴＴＣＡＧＣＣＣ−３’、配列番号１１、５番目のＴに、チアゾールオレンジが２つついた蛍光原子団が修飾されたプローブ）、終濃度２０ｎＭのアクセプタープローブ（５’−ＧＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴ−３’、配列番号１２、５’末端に蛍光物質ＡＴＴＯ６３３が修飾されたプローブ。）となるように反応用バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）に溶解させ、試料溶液を調製した。標的ＤＮＡ−１〜標的ＤＮＡ−５を含有する試料溶液を、それぞれ試料溶液２−１〜試料溶液２−５とした。対照として、標的ＤＮＡを添加しない以外は同様にして調製した試料溶液を試料溶液２−０とした。次いで、各試料溶液を、サーマルサイクラーを用いて９５℃で１０秒間インキュベートした後、２５℃まで温度を落とし３０分間インキュベートした。
その後、各試料溶液中の標的ＤＮＡを含む会合体を、実施例１の＜３＞と同様にしてＳＳＭＣにより測定した。各試料溶液の蛍光輝度の測定結果を図４に、ＳＳＭＣにより測定された各試料溶液中の会合体の分子数の測定結果を図５に、それぞれ示す。図４及び５中、「Ｎ」は試料溶液２−０の結果を、「１−ｒｅｐｅａｔ」〜「５−ｒｅｐｅａｔ」はそれぞれ試料溶液２−１〜試料溶液２−５の結果を示す。この結果、いずれの標的ＤＮＡを用いた場合でも、標的ＤＮＡ無添加（図中、「Ｎ」）に比べて蛍光輝度が増加していたが、試料溶液２−１〜試料溶液２−５では蛍光輝度に差はなかった（図４）。従って、アクセプタープローブの片側にドナープローブを複数配置しても、会合体から放出される蛍光輝度は増加しないことが示された。また、図５に示すように、検出分子数に関しても同様の挙動が示された。すなわち、実施例１のようにアクセプタープローブの両側にドナープローブを配置しなければ、蛍光輝度増加の効果が得られないことが明らかとなった。
［参考例２］
アクセプター蛍光物質とドナー蛍光物質の距離が、アクセプタープローブとドナープローブと標的核酸分子との会合体におけるＦＲＥＴの効率に与える影響を調べた。
＜１＞ アクセプター蛍光物質とドナー蛍光物質の距離が、標的核酸分子上の１塩基分となる会合体の形成
終濃度２０ｍＭの標的ＤＮＡ−１（５’−ＴＧＡＧＧＴＡＧＴＡＧＧＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴ−３’、配列番号１３）、終濃度２０ｎＭのドナープローブ−１（５’−ＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡ−３’、配列番号１４、２番目のＴに、チアゾールオレンジが２つついた蛍光原子団が修飾されたプローブ）、終濃度２０ｎＭのアクセプタープローブ−１（５’−ＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＣ−３’、配列番号１５、３’末端に蛍光物質ＡＴＴＯ６３３が修飾されたプローブ。）となるように反応用バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）に溶解させ、試料溶液（試料溶液３−１）を調製した。次いで、各試料溶液を、サーマルサイクラーを用いて９５℃で１０秒間インキュベートした後、２５℃まで温度を落とし３０分間インキュベートした。
＜２＞ アクセプター蛍光物質とドナー蛍光物質の距離が、標的核酸分子上の４塩基分となる会合体の形成
ドナープローブとして、ドナープローブ−１に代えてドナープローブ−２（５’−ＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡ−３’、配列番号１４、５番目のＴに、チアゾールオレンジが２つついた蛍光原子団が修飾されたプローブ）を用いた以外は前記＜１＞と同様にして、試料溶液（試料溶液３−２）を調製した。次いで、各試料溶液を、サーマルサイクラーを用いて９５℃で１０秒間インキュベートした後、２５℃まで温度を落とし３０分間インキュベートした。
＜３＞ アクセプター蛍光物質とドナー蛍光物質の距離が、標的核酸分子上の８塩基分となる会合体の形成
ドナープローブとして、ドナープローブ−１に代えてドナープローブ−３（５’−ＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡ−３’、配列番号１４、９番目のＴに、チアゾールオレンジが２つついた蛍光原子団が修飾されたプローブ）を用いた以外は前記＜１＞と同様にして、試料溶液（試料溶液３−３）を調製した。次いで、各試料溶液を、サーマルサイクラーを用いて９５℃で１０秒間インキュベートした後、２５℃まで温度を落とし３０分間インキュベートした。
＜４＞ アクセプター蛍光物質とドナー蛍光物質の距離が、標的核酸分子上の１３塩基分となる会合体の形成
標的核酸分子として、標的ＤＮＡ−１に代えて標的ＤＮＡ−２（５’−ＧＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴＴＧＡＧＧＴＡＧＴＡＧ−３’、配列番号１６）を用いた以外は前記＜３＞と同様にして、試料溶液（試料溶液３−４）を調製した。次いで、各試料溶液を、サーマルサイクラーを用いて９５℃で１０秒間インキュベートした後、２５℃まで温度を落とし３０分間インキュベートした。
＜５＞ アクセプター蛍光物質とドナー蛍光物質の距離が、標的核酸分子上の１７塩基分となる会合体の形成
標的核酸分子として、標的ＤＮＡ−１に代えて標的ＤＮＡ−２を用いた以外は前記＜２＞と同様にして、試料溶液（試料溶液３−５）を調製した。次いで、各試料溶液を、サーマルサイクラーを用いて９５℃で１０秒間インキュベートした後、２５℃まで温度を落とし３０分間インキュベートした。
＜６＞ アクセプター蛍光物質とドナー蛍光物質の距離が、標的核酸分子上の２０塩基分となる会合体の形成
標的核酸分子として、標的ＤＮＡ−１に代えて標的ＤＮＡ−２を用いた以外は前記＜１＞と同様にして、試料溶液（試料溶液３−６）を調製した。次いで、各試料溶液を、サーマルサイクラーを用いて９５℃で１０秒間インキュベートした後、２５℃まで温度を落とし３０分間インキュベートした。
＜７＞ ＳＳＭＣによる試料溶液中の会合体の測定
各試料溶液中の標的ＤＮＡを含む会合体を、実施例１の＜３＞と同様にしてＳＳＭＣにより測定した。
ＳＳＭＣにより測定された各試料溶液中の会合体の分子数の測定結果を図６に示す。図中、「１塩基」、「４塩基」、「８塩基」、「１３塩基」、「１７塩基」、及び「２０塩基」はそれぞれ試料溶液３−１〜試料溶液３−６の結果を示す。図６に示すように、試料溶液３−２で最大の検出分子数を示し、試料溶液３−３では、試料溶液３−２の検出分子数の１０％以上の検出分子数を維持していたが、試料溶液３−４〜試料溶液３−６では検出分子数が明らかに少なかった。これらの結果から、標的ＤＮＡにおいて、ドナープローブ中のドナー蛍光物質が結合している塩基が会合する塩基と、アクセプタープローブ中のアクセプター蛍光物質が結合している塩基が会合する塩基との距離（色素間距離）が標的核酸分子の検出効率に影響すること、色素間距離が長いほど標的核酸分子の検出効率は低下すること、色素間距離が短い分には検出分子数の低下は小さく、ＦＲＥＴの制限はないと考えられること、色素間距離は８塩基以下が好ましいこと、がわかった。
本発明に係る標的核酸分子の検出方法により、試料中に存在する標的核酸分子を、高感度かつ精度よく検出することができるため、試料中の核酸を検出又は定量解析するような生化学、分子生物学、臨床検査等の分野で利用が可能である。
Ｔ…標的核酸分子、ｄ…第１の蛍光物質（ドナー蛍光物質）、ａ…第２の蛍光物質（アクセプター蛍光物質）、１…第１のプローブ、２…第２のプローブ、３…第３のプローブ。

Claims (5)

  1. （ａ）核酸含有試料に、蛍光共鳴エネルギー移動現象に於けるエネルギー・ドナーと成る第１の蛍光物質で標識された第１のプローブ、蛍光共鳴エネルギー移動現象に於けるエネルギー・アクセプターと成る第２の蛍光物質で標識された第２のプローブ、及び前記第１の蛍光物質で標識された第３のプローブを混合し、試料溶液を調製する工程と、
    （ｂ）前記工程（ａ）において調製された試料溶液中の標的核酸分子を、前記第１のプローブ、前記第２のプローブ、及び前記第３のプローブと会合させて前記第１のプローブと前記第２のプローブと前記第３のプローブと前記標的核酸分子とからなる会合体を形成する工程と、
    （ｃ）前記工程（ｂ）の後、前記試料溶液に、前記第１の蛍光物質の励起波長の光を放射し、前記標的核酸分子を、前記会合体中の前記第２の蛍光物質から放出された蛍光を指標として検出する工程と、
    を有し、
    前記標的核酸分子中、前記第２のプローブと会合する領域は、前記第１のプローブと会合する領域と前記第３のプローブと会合する領域の間にあり、
    前記第１の蛍光物質又は前記第２の蛍光物質が、エキシトン効果を示す蛍光性原子団であり、
    前記第１のプローブ中の前記第１の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基と、前記第２のプローブ中の前記第２の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基との距離が、８塩基以下であり、
    前記第３のプローブ中の前記第１の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基と、前記第２のプローブ中の前記第２の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基との距離が、８塩基以下である、標的核酸分子の検出方法。
  2. 前記第２のプローブの塩基長が５〜１７塩基である、請求項１に記載の標的核酸分子の検出方法。
  3. 前記核酸含有試料に、前記第１のプローブ、前記第２のプローブ、及び前記第３のプローブと会合する第１の標的核酸分子と、前記第１のプローブと前記第３のプローブのどちらか一方のみと前記第２のプローブと結合する第２の標的核酸分子が含まれており、
    前記（ｂ）において、前記第１の標的核酸分子と、前記第１のプローブと、前記第２のプローブと、前記第３のプローブとを会合させた第１の会合体と、前記第２の標的核酸分子と、前記第２のプローブと、前記第１のプローブ及び前記第３のプローブのいずれか一方とを会合させた第２の会合体と、を形成し、
    前記工程（ｃ）において、前記試料溶液に、前記第１の蛍光物質の励起波長の光を放射し、一分子の会合体中の前記第２の蛍光物質から放出された蛍光の輝度を指標として、前記第１の標的核酸分子と前記第２の標的核酸分子とを区別して検出し、前記試料溶液中の前記第１の標的核酸分子と前記第２の標的核酸分子の存在比を算出する、請求項１又は２に記載の標的核酸分子の検出方法。
  4. 標的核酸分子を検出するためのプローブセットであり、
    前記標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子が、蛍光共鳴エネルギー移動現象に於けるエネルギー・ドナーと成る第１の蛍光物質で標識された第１のプローブと、
    前記標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子が、蛍光共鳴エネルギー移動現象に於けるエネルギー・アクセプターと成る第２の蛍光物質で標識された第２のプローブと、
    前記標的核酸分子と会合する一本鎖核酸分子が、前記第１の蛍光物質で標識された第３のプローブと、
    を備え、
    前記第１の蛍光物質又は前記第２の蛍光物質が、エキシトン効果を示す蛍光性原子団であり、
    前記第１のプローブ、前記第２のプローブ、及び前記第３のプローブは、前記標的核酸分子と、前記第３のプローブが前記第２のプローブに対して前記第１のプローブとは反対側に配置されている会合体を形成することができ、
    前記第１のプローブ中の前記第１の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基と、前記第２のプローブ中の前記第２の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基との距離が、８塩基以下であり、
    前記第３のプローブ中の前記第１の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基と、前記第２のプローブ中の前記第２の蛍光物質が結合している塩基が会合している前記標的核酸分子中の塩基との距離が、８塩基以下である、標的核酸分子
    前記会合体に、前記第１の蛍光物質の励起波長の光を放射すると、前記第１のプローブ中の前記第１の蛍光物質と前記第２のプローブ中の前記第２の蛍光物質との間、及び前記第３のプローブ中の前記第１の蛍光物質と前記第２のプローブ中の前記第２の蛍光物質との間に、蛍光共鳴エネルギー移動が起こり、前記第２の蛍光物質から放出された蛍光が検出される、プローブセット。
  5. 前記第２のプローブの塩基長が５〜１７塩基である、請求項４に記載のプローブセット。
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