CN103328956B - 鉴别核酸分子多态性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种鉴别样品溶液中的核酸多态性的方法，所述溶液中的观察对象即核酸的浓度或数密度比常规光学分析技术更低。即，本发明涉及鉴别核酸分子多态性的方法，所述方法具有制备包含第一核酸探针和分析对象的核酸的样品溶液，并在变性该样品溶液中的核酸分子后，使其结合的步骤，所述第一核酸探针被荧光物质标记、且与具有多态性序列中的第一型的碱基序列的单链核酸分子特异性杂交；制备包含第二核酸探针和上述分析对象的核酸的样品溶液，使该样品溶液中的核酸分子结合的步骤，所述第二核酸探针被荧光物质标记、且与第一核酸探针的碱基序列不同；通过扫描分子计数法，计算各样品溶液中的、包含第一核酸探针的结合体的分子数和包含第二核酸探针的结合体的分子数的步骤；和根据计算结果，鉴别分析对象的核酸的多态性的步骤。

Description

鉴别核酸分子多态性的方法
技术领域
本发明涉及使用能够检测来自溶液中微小区域的光的光学系统（如共聚焦显微镜或多光子显微镜（multiphoton microscope）的光学系统等），鉴别体细胞突变或单核苷酸多态性等基因多态性这类碱基序列类似的核酸的方法。
本申请要求基于2011年1月26日在日本提交的特愿2011-014063号的优先权，本文援引其内容。
背景技术
对于检测具有特定碱基序列的核酸的方法，已大量报道了使用探针或引物等人工合成的短链寡核苷酸，研究核酸的碱基序列的方法。特别的是，在体细胞突变或单核苷酸多态性等基因分析中，由于检测灵敏度好，因此研发了使用荧光的各种手段。
使用FRET（荧光共振能量转移）探针鉴别核酸的方法之一是例如所谓的分子信标法（例如，参见非专利文献1），其使用在5’端和3’端具有彼此互补的碱基序列，且两个末端分别被荧光物质和猝灭物质标记的单链核酸（分子信标探针）。分子信标在单独存在时，由于两个末端结合形成分子内环，而处于猝灭状态，而通过与靶核酸分子杂交，分子内环消失而发出荧光。可以使用与基因多态性中的特定基因型特异性杂交的分子信标，鉴别基因多态性（例如，参见非专利文献2）。
此外，有使用基于荧光性嵌入剂和荧光探针的FRET检测核酸的方法（例如，参见非专利文献3）。被荧光物质标记的荧光探针与其他的单链核酸杂交时，在形成的双链核酸的碱基对之间插入荧光性嵌入剂。利用在该荧光性嵌入剂和标记有荧光探针的荧光物质之间产生的FRET，可以鉴别单独存在的荧光探针和形成了双链核酸的荧光探针。利用该原理，例如，用不同的荧光物质，分别标记与基因多态性中的特定基因型特异性杂交的探针、和与其他基因型特异性杂交的探针，通过检测在相应的荧光物质和荧光性嵌入剂之间产生的FRET，可以鉴别基因多态性（例如，参见非专利文献4）。
另一方面，随着近年来光学测量技术的发展，使用共聚焦显微镜的光学系统和能够光子计数（单光子检测）的超高灵敏度的光检测技术，可以检测/测定单光子或荧光单分子水平的微弱光。提出了使用这类微弱光检测技术检测生物体分子等分子间相互作用或结合/解离反应的各种装置或方法。例如，对于荧光相关光谱分析（Fluorescence Correlation Spectroscopy：FCS。例如，参见专利文献1、2、非专利文献5～7。），使用激光共聚焦显微镜的光学系统和光子计数技术，测量来自在样品溶液中的微小区域（显微镜的激光聚光而成的焦点区域。被称为共焦体积（confocal volume）。）中出入的荧光分子或进行了荧光标记的分子的荧光强度。根据由上述测量的荧光强度的自相关函数的值所确定的、荧光分子在微小区域中等的平均滞留时间（平移扩散时间）和滞留分子数的平均值，获得荧光分子等的移动速度或大小、浓度等信息，或者检测分子的结构或大小的变化、分子的结合/解离反应或分散/凝聚等各种现象。此外，利用荧光强度分布分析（Fluorescence-Intensity DistributionAnalysis：FIDA。例如，参见专利文献3。）或光子计数直方图（Photon CountingHistogram：PCH。例如，参见专利文献4。），生成与FCS同样计算出的在共焦体积内部出入的荧光分子等的荧光强度的直方图，通过统计学公式拟合该直方图的分布，计算出荧光分子等本身亮度的平均值和滞留在共焦体积内部的分子数的平均值。根据上述信息，推测分子结构或大小的变化、结合/解离状态、分散/凝聚状态等。此外，专利文献5、6提出了：基于使用共聚焦显微镜的光学系统测定出的试样溶液的荧光信号时程，检测荧光性物质的方法。专利文献7提出了使用光子计数技术，测量在流式细胞仪内流过的荧光粒子或固定在基板上的荧光粒子发出的微弱光，用于检测液流中或基板上存在的荧光粒子的信号演算处理技术。
特别的是，通过使用FCS、FIDA等的、使用了共聚焦显微镜的光学系统和光子计数技术的微小区域的荧光测量技术的方法，测量所必需的样品浓度比以前低得多，且可以是微量（一次测量使用的量最多数十μL左右。），测量时间大幅减少（每次测量时间仅几秒的测量可重复几次）。因此，这些技术特别是在医学、生物学的研发领域针对经常使用的稀少或高价的样品进行分析的情况下，或在用于疾病的临床诊断或筛选生理活性物质等这类检查材料数量多的情况下，可以比以前的生物化学方法更廉价或快速地进行实验或检测，预期是强效的工具。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2005-098876号公报
专利文献2:日本特开2008-292371号公报
专利文献3:日本专利第4023523号公报
专利文献4:国际公开第2008/080417号
专利文献5:日本特开2007-20565号公报
专利文献6:日本特开2008-116440号公报
专利文献7:日本特开平4-337446号公报
非专利文献
非专利文献1:Tyagi等1人，Nature Biotechnology、1996年、第14卷、第303～308页。
非专利文献2:Giesendorf等5人，Clinical Chemistry、1998年、第44卷、第3号、482～486页。
非专利文献3:Howell等2人，Genome Research、2002年、第12卷、第1401～1407页。
非专利文献4:Takatsu等3人，Nucleic Acid Research、2004年、第32卷、第19号、e156。
非专利文献5:金城政孝、《蛋白質核酸酵素》、1999年、第44卷、第9号、第1431～1438页。
非专利文献6:Meyer-Alms、Fluorescence Correlation Spectroscopy、R.Rigler、Springer、Berlin、2000年、第204～224页。
非专利文献7:加藤则子等4人，《遺伝子医学》、2002年、第6卷、第2号、第271～277页。
发明内容
发明要解决的问题
上述FCS、FIDA、PCH等光分析技术简而言之是通过统计学处理计算出所测量的荧光强度随时间波动的幅度，根据该波动的幅度，确定在样品溶液中的微小区域内部出入的荧光分子等的各种特性。因此，为了在上述光分析技术中获得有意义的结果，就样品溶液中作为观察对象的荧光分子等的浓度或数密度而言，优选制备成平衡状态下使出入于微小区域内部的荧光分子等的数量能够在每次长度为秒数量级的测量时间内进行统计学处理，适合的是，制备成平衡状态下在微小区域内部通常存在一个左右的荧光分子等（代表性的共焦体积为1fL左右，因此荧光分子等的浓度优选为1nM左右，或1nM以上）。换言之，当样品溶液中的所观察的对象粒子的浓度或数密度与能够统计学处理时相比大幅下降时（例如，大幅低于1nM时），通过如上所述的基于荧光强度的统计学波动的光分析技术，无法获得有意义的或精度良好的分析结果。其原因在于，出现了观察对象物在测量时间内很少进入微小区域内部的情况，在荧光强度的测量结果中长时间地包含在微小区域内部完全不存在观察对象物的情况并且显著的荧光强度的观察量也减少。
在专利文献5、6中记载的使用共聚焦显微镜的光学系统检测荧光物质的方法中，公开了不进行如上所述的关于荧光强度波动的统计学处理，通过持续数秒的测量时间中有无产生显著强度的荧光信号，可以查清样品中有无作为观察对象的荧光分子等，获得显著强度的荧光信号的频率与样品中的荧光分子等粒子数的相关性。特别是在专利文献6中，提出了搅拌样品溶液，使其发生随机流动，提高检测灵敏度。然而，这些方法局限于检测由于扩散或随机流动而存在的概率性进入微小区域内部的荧光分子等，而不能掌握荧光分子等粒子在微小区域内部的行为，例如不能实现粒子计数、定量计算粒子的浓度或数密度。此外，专利文献7中记载的技术是逐个检测流式细胞仪的液流中的荧光微粒或固定在基质上的荧光微粒的存在的方案，而不是用于检测样品溶液中通常处于溶解或分散状态的分子或胶体等的粒子、即在样品溶液中随机运动的粒子的技术，因此，不能实现定量计算溶解或分散在样品溶液中的粒子的浓度或数密度。此外，专利文献7的技术包括了流式细胞仪中的测量或荧光粒子在基板上的固定处理的过程，因此，检测所需的样品量远大于FCS、FIDA、PCH等光分析技术的情况，同时需要实施者有复杂的高难度操作技术。
另一方面，作为基因多态性的检测对象的基因组样品在多数情况下是微量的，如临床检测中的检查材料等。因此，需要研发鉴别样品中仅含极微量的核酸的方法。一般而言，基因型的鉴别使用特异性识别特定基因型的核酸探针，通过研究作为检查对象的基因组DNA是否与该核酸探针形成结合体而进行。当样品溶液中的核酸探针和基因组DNA的结合体的浓度非常低时也能够高精度的检测所述结合体的方法在临床检测上是非常有益的。
然而，在例如非专利文献2中实施的基因突变分析使用300nM分子信标，不能认为是在稀薄的状态下测量。
此外，在非专利文献4中，也是针对数十～数百nM左右的较高浓度的核酸进行碱基序列鉴别。一般而言，如上所述难以鉴别pM数量级的较低浓度的核酸检查材料的多态性。
由此一来，本发明不包括利用FCS、FIDA、PCH等光分析技术实施的统计学处理，因此，其目的是通过新型光分析技术，提供鉴别具有基因多态性等多态性序列的核酸的方法，所述新型光分析技术能够检测所观察的对象粒子的浓度或数密度低于上述光分析技术的可操作水平的样品溶液中的所观察的对象粒子的状态或特性。
用于解决问题的方案
本发明人等为了解决上述问题进行了深入研究，结果发现：在使用与多态性序列中的1种型的核酸分子特异性杂交的核酸探针、通过是否与所述核酸探针形成结合体来鉴别样品中的核酸分子的多态性的方法中，通过使用具有彼此不同的碱基序列的2种标记核酸探针，且使用扫描分子计数法检测包含核酸探针的结合体，即使在样品中的分析对象的核酸分子浓度非常低的情况下，也能够以良好的精度鉴别多态性，从而完成本发明。
在本文中，扫描分子计数法是日本特愿2010-044714中由本申请的申请人提交的新型光分析技术。
即，本发明的鉴别核酸分子多态性的方法是下述（1）～（19）。
（1）一种鉴别核酸分子多态性的方法，其特征在于，其具有以下步骤：
（a）制备包含第一核酸探针和分析对象的核酸分子的样品溶液的步骤，所述第一核酸探针被荧光物质标记、且与具有多态性序列中的第一型的碱基序列的单链核酸分子特异性杂交，
（b）使所述步骤（a）中制备的样品溶液中的核酸分子结合的步骤，
（c）在所述步骤（b）之后，如下计算所述步骤（a）中制备的样品溶液中的、包含第一核酸探针的结合体的分子数的步骤，
使用共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统，在所述样品溶液内部移动所述光学系统的光检测区域的位置的步骤，
一边在所述样品溶液内部移动所述光学系统的光检测区域的位置，一边检测该光检测区域中的由所述结合体发出的荧光的步骤，
根据所述检测到的光逐个检测来自每个结合体的光信号而逐个检测结合体的步骤，
计数所述逐个检测的结合体的数量，并计数在所述光检测区域的位置移动中检测到的所述粒子的数量的步骤，
（d）制备包含第二核酸探针和所述分析对象的核酸分子的样品溶液的步骤，所述第二核酸探针被荧光物质标记、且与所述第一核酸探针的碱基序列不同，
（e）使所述步骤（d）中制备的样品溶液中的核酸分子结合的步骤，
（f）在所述步骤（e）之后，如下计算所述步骤（d）中制备的样品溶液中的、包含第二核酸探针的结合体的分子数的步骤，
使用共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统，在所述样品溶液内部移动所述光学系统的光检测区域的位置的步骤，
一边在所述样品溶液内部移动所述光学系统的光检测区域的位置，一边检测该光检测区域中的由所述结合体发出的荧光的步骤，
根据所述检测到的光逐个检测来自每个结合体的光信号而逐个检测结合体的步骤，
计数所述逐个检测的结合体的数量，并计数在所述光检测区域的位置移动中检测到的所述粒子的数量的步骤，
（g）根据所述步骤（c）和（f）的结果，鉴别所述分析对象的核酸分子的多态性的步骤。
（2）根据上述（1）的鉴别核酸分子多态性的方法，其特征在于，在移动所述光检测区域的位置的步骤中，以规定速度移动所述光检测区域的位置。
（3）根据上述（1）或（2）所述的鉴别核酸分子多态性的方法，其特征在于，在移动所述光检测区域的位置的步骤中，以比所述结合体的扩散移动速度更快的速度移动所述光检测区域的位置。
（4）根据上述（1）～（3）的任一项所述的鉴别核酸分子多态性的方法，其特征在于，在根据所述检测到的光逐个检测来自每个结合体的光信号而逐个检测结合体的步骤中，根据检测到的按照时间顺序的光信号形状，检测1个结合体进入了所述光检测区域。
（5）根据上述（1）～（4）的任一项所述的鉴别核酸分子多态性的方法，其特征在于，所述样品溶液包含选自由表面活性剂、甲酰胺、二甲亚砜和尿素组成的组中的一种以上。
（6）根据上述（1）～（5）的任一项所述的鉴别核酸分子多态性的方法，其特征在于，所述第一核酸探针和所述第二核酸探针中的至少一种是作为能量供体的荧光物质与作为能量受体的物质按照在单独存在的状态下发生荧光共振能量转移、且在与其他单链核酸分子形成结合体的状态下不发生荧光共振能量转移的方式结合而成的。
（7）根据上述（1）～（6）的任一项所述的鉴别核酸分子多态性的方法，其特征在于，在所述步骤（a）中，所述样品溶液中还含有荧光性双链核酸结合物质，
标记了所述第一核酸探针的荧光物质和所述荧光性双链核酸结合物质中的任一种为作为荧光共振能量转移现象中的能量供体的荧光物质，另一种为作为所述荧光共振能量转移现象中的能量受体的物质，
在所述步骤（c）中，从包含所述第一核酸探针的结合体发出的荧光是由于在标记了所述第一核酸探针的荧光物质与所述荧光性双链核酸结合物质之间发生的荧光共振能量转移现象而发出的荧光。
（8）根据上述（1）～（7）的任一项所述的鉴别核酸分子多态性的方法，其特征在于，在所述步骤（d）中，所述样品溶液中还含有荧光性双链核酸结合物质，
标记了所述第二核酸探针的荧光物质和所述荧光性双链核酸结合物质中的任一种为作为荧光共振能量转移现象中的能量供体的荧光物质，另一种为作为所述荧光共振能量转移现象中的能量受体的物质，
在所述步骤（f）中，从包含所述第二核酸探针的结合体发出的荧光是由于在标记了所述第二核酸探针的荧光物质与所述荧光性双链核酸结合物质之间发生的荧光共振能量转移现象而发出的荧光。
（9）根据上述（1）～（8）的任一项所述的鉴别核酸分子多态性的方法，其特征在于，从包含第一核酸探针的结合体发出的光与包含第二核酸探针的结合体发出的光相互之间的光学特性不同。
（10）根据上述（1）～（9）的任一项所述的鉴别核酸分子多态性的方法，其特征在于，在所述步骤（a）中，向所述样品溶液中添加核酸分子，所述核酸分子具有与所述多态性序列中除所述第一型以外的型的碱基序列互补的碱基序列。
（11）根据上述（1）～（10）的任一项所述的鉴别核酸分子多态性的方法，其特征在于，所述第二核酸探针与具有所述多态性序列中的第二型的碱基序列的单链核酸分子特异性杂交。
（12）根据上述（11）所述的鉴别核酸分子多态性的方法，其特征在于，在所述步骤（d）中，向所述样品溶液中添加核酸分子，所述核酸分子具有与所述多态性序列中除所述第二型以外的型的碱基序列互补的碱基序列。
（13）根据上述（1）～（12）的任一项所述的鉴别核酸分子多态性的方法，其特征在于，在同一样品溶液中进行所述步骤（a）和（d）。
（14）根据上述（1）～（9）的任一项所述的鉴别核酸分子多态性的方法，其特征在于，所述第二核酸探针与具有所述多态性序列中的第二型的碱基序列的单链核酸分子特异性杂交，
在同一样品溶液中进行所述步骤（a）和（d），
向所述样品溶液中添加：具有与所述第一型的碱基序列互补的碱基序列的核酸分子，和具有与所述第二型的碱基序列互补的碱基序列的核酸分子。
（15）根据上述（1）～（10）的任一项所述的鉴别核酸分子多态性的方法，其特征在于，所述第二核酸探针与包含所述第一型的碱基序列的单链核酸分子、或具有与所述单链核酸分子互补的碱基序列的单链核酸分子特异性杂交，
在同一样品溶液中进行所述步骤（a）和（d）。
（16）根据上述（1）～（15）的任一项所述的鉴别核酸分子多态性的方法，其特征在于，所述步骤（b）或（e）是如下进行的：通过将所述步骤（a）或（d）中制备的样品溶液的温度升至70℃以上而使该样品溶液中的核酸分子变性后，按0.05℃/秒以上的降温速度降低该样品溶液的液温，由此使该样品溶液中的核酸分子结合。
（17）根据上述（1）～（16）的任一项所述的鉴别核酸分子多态性的方法，其特征在于，所述第一核酸探针和所述第二核酸探针是由选自由DNA、RNA和核酸类似物组成的组中的2种以上的分子结合形成的。
（18）根据上述（1）～（17）的任一项所述的鉴别核酸分子多态性的方法，其特征在于，所述多态性序列是包含基因多态性的多态性位点的碱基序列、或包含体细胞突变的突变位点的碱基序列。
（19）根据上述（18）所述的鉴别核酸分子多态性的方法，其特征在于，所述体细胞突变是K-ras基因的突变。
发明的效果
用于本发明的鉴别核酸分子多态性的方法中的扫描分子计数法不实施计算荧光强度波动之类的统计学处理。因此，即使当样品中仅存在极微量的具有作为分析对象的多态性序列的核酸分子时，通过本发明的鉴别核酸分子多态性的方法，也能够鉴别多态性。
附图说明
图1A是用于扫描分子计数法的光分析装置内部结构的模式图。
图1B是共焦体积（共聚焦显微镜的观察区域）的模式图。
图1C是改变镜子7的方向，在样品溶液内部移动光检测区域的位置的机构的模式图。
图2A是说明用于扫描分子计数法的基于光分析技术的光检测原理的模式图。
图2B是用于扫描分子计数法的基于光分析技术测量的光强度的时间变化的模式图。
图3A是所观察的对象粒子一边进行布朗运动一边横穿光检测区域时的模式图。
图3B是显示所观察的对象粒子一边进行布朗运动一边横穿光检测区域时的光子计数（光强度）的时间变化实例的图。
图4A是以比所观察的对象粒子的扩散移动速度更快的速度移动样品溶液内部的光检测区域的位置、从而所观察的对象粒子从而横穿光检测区域时的模式图。
图4B是显示：以比所观察的对象粒子的扩散移动速度更快的速度移动样品溶液内部的光检测区域的位置、从而所观察的对象粒子横穿光检测区域时的光子计数（光强度）的时间变化实例的图。
图5是以流程图的形式显示根据扫描分子计数法测量的光子计数（光强度）的时间变化来计数粒子数的处理工序的图。
图6A是模式性显示了通过扫描分子计数法测量的光子计数（光强度）的时间变化的图。
图6B是说明在根据通过扫描分子计数法测量的光子计数（光强度）的时间变化计数粒子数的处理工序中，检测信号的信号处理步骤的例子的图。
图7显示了通过扫描分子计数法测量的光子计数数据的实测例（柱状图），和将数据平滑化后获得的曲线（虚线），和峰存在区域所拟合的高斯函数（实线）。在图中，标注“噪音”的信号是由噪音或异物产生的信号，无视。
图8是模式性显示了由多态性和结合体分子数聚类的一个例子的图。
图9是显示参考例1中按照添加在样品溶液中的分析对象的核酸分子中的GTT突变率分类的、所计数的峰数的值的图。
图10A是显示参考例2中按照向未添加诱饵核酸的样品溶液中添加的分析对象的核酸分子中的GTT突变率分类的、所计数的峰数的值的图。
图10B是显示参考例2中按照向添加了诱饵核酸的样品溶液中添加的分析对象的核酸分子中的GTT突变率分类的、所计数的峰数的值的图。
图11是在实施例1中以包含突变型（GTT）分子信标探针的结合体的分子数（突变型（GTT）峰数）为纵轴、以包含野生型（GGT）分子信标探针的结合体的分子数（野生型（GGT）峰数）为横轴来显示按照添加在样品溶液中的分析对象的核酸分子中的突变率分类的、所计数的峰数的值的图。
图12是在实施例2中以包含突变型（GTT）分子信标探针的结合体的分子数（突变型（GTT）峰数）为纵轴、以包含野生型（GGT）分子信标探针的结合体的分子数（野生型（GGT）峰数）为横轴来显示按照添加在样品溶液中的分析对象的核酸分子中的突变率分类的、所计数的峰数的值的图。
图13A是显示实施例3中按照添加在样品溶液中的分析对象的核酸分子中的GTT突变率分类的、所计数的包含突变型（GTT）分子信标探针的结合体的峰数的值的图。
图13B是显示实施例3中按照添加在样品溶液中的分析对象的核酸分子中的GTT突变率分类的、所计数的包含共同分子信标探针的结合体的峰数的值的图。
图14是显示参考例3中按照添加在样品溶液中的分析对象的核酸分子中的突变率分类的、所计数的峰数的值的图。
图15是显示实施例4中按照添加在样品溶液中的分析对象的核酸分子中的突变率分类的、所计数的包含突变型（GTT）探针的结合体和包含野生型（GGT）探针的结合体的峰数的值的图。
具体实施方式
首先说明扫描分子计数法。扫描分子计数法是如下技术：一边通过微小区域扫描样品溶液内部，一边在当分散在样品溶液中随机运动的发光粒子（下文称为“发光粒子”）横穿微小区域内部时，检测微小区域中的发光粒子所发出的光，以此一个一个逐个检测样品溶液中的发光粒子，从而能够获得与发光粒子的计数、样品溶液中的发光粒子的浓度或数密度相关的信息。与FIDA等光分析技术相同，检测所需的样品可以是微量（例如，数十μL左右），检测时间也短。并且，与FIDA等光分析技术的情况相比，可以定量检测更低浓度或数密度的发光粒子的浓度或数密度等特性。
发光粒子是指作为观察对象的粒子与发光探针缔合或结合的粒子。“发光探针”是指具有与作为观察对象的粒子缔合或结合的性质，且发光的物质（通常是分子或其凝聚物），典型的是荧光性粒子，也可以是磷光、化学发光、生物发光、通过光散射等发光的粒子。用于本发明的鉴别核酸分子多态性的方法中的第一核酸探针和第二核酸探针都相当于发光探针。
在本发明和本申请说明书中，共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的“光检测区域”是指在这些显微镜中检测到光的微小区域，当从物镜提供照明光时，相当于该照明光聚光的区域。而在共聚焦显微镜中，相关区域尤其根据物镜与小孔（pinhole）之间的位置关系确定。
一边在样品溶液内部移动光检测区域的位置、即一边利用光检测区域扫描样品溶液内部，一边逐次进行光检测。当移动的光检测区域包括了与随机运动的粒子缔合或结合的发光探针时，检测来自发光探针的光，以此检测到一个粒子的存在（根据实验方式，也存在如下情况：发光探针与希望检测的粒子暂时结合后，在进行光的检测时与粒子解离）。并且，在逐次检测到的光中，逐个检测来自发光探针的光信号，以此每次一个地逐个逐次检测（与发光探针结合的）粒子的存在，获得与粒子在溶液内部的状态相关的各种信息。具体而言，例如，在上述方案中，计数逐个检测到的粒子数，从而计数在光检测区域的位置移动中检测到的粒子数（粒子的计数）。根据所述方案，通过组合粒子数与光检测区域的位置的移动量，可以获得与样品溶液中的粒子的数密度或浓度相关的信息。特别是在通过任意手段、例如以规定速度移动光检测区域的位置等确定了光检测区域的位置移动轨迹的总体积时，可以具体计算粒子的数密度或浓度。当然并不是直接确定绝对数密度值或浓度值，但可以算出相对于多个样品溶液、或者相对于成为浓度或数密度基准的标准样品溶液的相对的数密度或浓度之比。此外，在扫描分子计数法中，通过采取改变光学系统的光路而移动光检测区域的位置的构成，光检测区域的移动快速且实质上不在样品溶液中产生机械振动或流体力学的作用。因此，能够在作为检测对象的粒子处于不受力学作用的影响且稳定的状态下进行光测量（样品溶液中一旦发生振动或流动，粒子的物理性质就可能发生变化）。因此，样品溶液的流动不是必需的特征，能够用与FCS、FIDA等情况下同样微量（1～数十μL左右）的样品溶液进行测量和分析。
在逐个检测上述粒子的步骤中，可以根据按照时间顺序检测到的光信号的形状，由逐次检测到的光信号判断与1个粒子结合的发光探针（包括1个发光探针结合1个粒子的情况，多个发光探针结合1个粒子的情况，和根据实验方式与1个粒子结合后从粒子上解离的发光探针的情况。下文的情况相同。）是否进入了光检测区域。在实施方案中，典型的是当检测到具有比规定阈值大的强度的光信号时，可以检测为与1个粒子结合的发光探针进入了光检测区域。
此外，在移动上述光检测区域的位置的步骤中，可以根据与粒子结合的发光探针的特性或样品溶液中的数密度或浓度，恰当改变光检测区域的位置在样品溶液内部的移动速度。如本领域技术人员所理解的，从与粒子结合的发光探针检测到的光的样态，可以随其特性或样品溶液中的数密度或浓度而改变。特别是当光检测区域的移动速度加快时，自与1个粒子结合的发光探针获得的光量减少，为了能够以良好的精度或灵敏度测量自与1个粒子结合的发光探针发出的光，优选恰当的改变光检测区域的移动速度。
进一步的，在移动上述光检测区域的位置的步骤中，恰当的是将光检测区域的位置在样品溶液内部的移动速度设定为高于与作为检测对象的粒子结合的发光探针（即，在本发明的鉴别核酸分子多态性的方法中，包含第一核酸探针的结合体、包含第二核酸探针的结合体）的扩散移动速度（由于布朗运动造成的粒子的平均移动速度）。如上文所述，通过扫描分子计数法，当光检测区域经过与1个粒子结合的发光探针的所在位置时，检测由该发光探针发出的光，逐个检测发光探针。然而，当与粒子结合的发光探针在溶液中由于布朗运动而随机移动，在光检测区域中出入多次时，由于多次的检测到来自1个发光探针的（表明存在希望检测的粒子的）光信号，因此，难以将检测到的光信号与1个希望检测的粒子的存在对应起来。因此，如上所述，将光检测区域的移动速度设定为高于与粒子结合的发光探针的扩散移动速度（具体而言，设定为以比包含第一核酸探针的结合体、或包含第二核酸探针的结合体的扩散移动速度更快的速度移动），藉此可以将与1个粒子结合的发光探针与1个（表面粒子存在的）光信号对应起来。此外，扩散移动速度随与粒子结合的发光探针而改变，因此如上所述，优选根据与粒子结合的发光探针的特性（特别是扩散常数），恰当地改变光检测区域的移动速度。
可以以任意方式，实现用于光检测区域的位置移动的光学系统的光路改变。例如，可以利用激光扫描型光学显微镜中使用的检流计镜（galvanometermirror）改变光路，使光检测区域的位置发生变化。可以任意设定光检测区域的位置的移动轨迹，例如可选自圆形、椭圆形、矩形、直线和曲线。
扫描分子计数法的光检测机构本身，与FIDA等光分析技术的情况相同，采取对来自共聚焦显微镜或多光子显微镜的光检测区域的光进行检测的构成，因此，样品溶液的量同样可以是微量。进一步的，在扫描分子计数法中，由于不实施计算荧光强度波动这一统计学处理，因此，扫描分子计数法的光分析技术可以适用于比FIDA等光分析技术所需的粒子数密度或浓度水平大幅降低的样品溶液。
此外，在扫描分子计数法中，由于可以逐个检测分散或溶解在溶液中的各个粒子，因此利用该信息，能够定量进行粒子计数、计算样品溶液中的粒子的浓度、数密度而获得与浓度或数密度相关的信息。即，通过扫描分子计数法，由于使通过光检测区域的粒子与检测到的光信号一一对应、一个一个地检测粒子，因此能够计数分散在溶液中随机运动的粒子数，与以前相比，可以更精确的确定样品溶液中的粒子的浓度或数密度。实际上，通过本发明的鉴别核酸分子多态性的方法（所述方法逐个检测包含第一核酸探针的结合体等，计数其数目，并确定粒子浓度），即使样品溶液中的这些结合体的浓度是比通过荧光分光光度计或酶标仪测量的荧光强度能够确定的浓度更低的浓度，也可以鉴别多态性核酸。
此外，例如，当样品中发生流动时，通常难以产生均一的流速，并且使装置结构复杂化，大幅的增加了必需的样品量。进一步的，流动造成的流体力学作用可能使溶液中的粒子、发光探针或结合体或其他物质变质或变性。与此相对，在扫描分子计数法中，通过改变光学系统的光路而利用光检测区域扫描样品溶液中的方式，不对样品溶液产生机械振动或流体力学作用，可以在一致的或样品溶液机械上稳定的状态下观察样品溶液内部。因此，相比使样品发生流动的情况，提高了定量检测结果的可信度，此外，可以在对样品溶液中作为检测对象的粒子（在本发明中，包含第一核酸探针的结合体等）无力学作用影响或人为迹象的状态下进行测量。
＜用于扫描分子计数法的光分析装置的构成＞
在基本的组成中，如图1A中模式性的示例，可以通过由能够实施FCS、FIDA等的共聚焦显微镜的光学系统和光检测器组合而成的光分析装置，实施扫描分子计数法。参见同一附图，光分析装置1是由光学系统2～17、和用于控制光学系统的各部分的行为并获得、分析数据的计算机18构成的。光分析装置1的光学系统可以与通常的共聚焦显微镜的光学系统相同，其中，自光源2发散出的在单模光纤3内传播的激光（Ex）在光纤的出射端以固有的由NA规定的角度发散为发散的光，通过准直仪4成为平行光，在分色镜5、反射镜6、7处发生反射，入射至物镜8。在物镜8的上方，通常配置分注了1～数十μL样品溶液的样品容器或排列有孔10的微孔板9，自物镜8射出的激光在样品容器或孔10中的样品溶液中聚集为焦点，形成光强度较强的区域（激发区域）。在样品溶液中分散或溶解有观察对象物的粒子、和与所述粒子结合的发光探针，通常是连接了荧光色素等发光标记的分子，与发光探针缔合或结合的粒子（根据实验方式，与粒子暂时结合后与粒子解离的发光探针）一旦进入激发区域，发光探针就在其中被激发发出光。发出的光（Em）经过物镜8、分色镜5，在镜子11处反射，在聚光镜12处聚光，通过小孔13，透过二次滤片14（在本文中，仅选择在特定波长带宽的光成分），导入到多模光纤15中，到达光检测器16，在转变为按照时间顺序的电信号后，输入到计算机18中，以后述方式进行用于光分析的处理。此外，如本领域技术人员已知的，在上述组成中，小孔13配置在与物镜8的焦点位置共轭的位置上，藉此，仅自如图1B中模式性示出的激光的焦点区域，即激发区域内发出的光通过小孔13，而来自激发区域以外的光则被遮断。图1B示例的激光的焦点区域通常是具有1～10fL左右的实际体积的、位于该光分析装置内的光检测区域（典型的是，光强度呈以区域中心为顶点的高斯分布或洛伦兹型分布。实际体积是以光强度为1/e2的面为界面的椭球体的体积），被称为共焦体积。此外，在扫描分子计数法中，由于检测来自1个粒子和发光探针的结合体或来自发光探针的光，例如，来自一个或数个荧光色素分子的微弱的光，因此，光检测器16优选使用能够光子计数的超高灵敏度的光检测器。此外，在显微镜的平台（图中未显示）中，可以设计用于移动微孔板9的水平方向位置的平台位置变化装置17a，以在观察中改变孔10。可以通过计算机18，控制平台位置变化装置17a的动作。通过所述构成，即使待检材料为多个，也可以实现快速的测量。
进一步的，在上述光分析装置的光学系统中，设计用于改变光学系统的光路、利用光检测区域扫描样品溶液内部的机构，即在样品溶液内部移动焦点区域（即，光检测区域）的位置的机构。所述用于移动光检测区域的位置的机构，例如如图1C模式性示例的，可以利用改变反射镜7的方向的镜转向器17。所述镜转向器17可以与装备在普通的激光扫描型显微镜中的检流计镜装置相同。此外，为了实现预期的光检测区域的位置移动模式，镜转向器17是在计算机18的控制下，与通过光检测器16的光检测协调驱动的。光检测区域的位置的移动轨迹，可任意的选自圆形、椭圆形、矩形、直线、曲线或其组合（在计算机18中的程序中，可以选择各种移动模式）。此外，图中未显示的是，通过上下移动物镜8，可以沿上下方向移动光检测区域的位置。如上所述，不移动样品溶液，通过改变光学系统的光路而移动光检测区域的位置的构成，使样品溶液内部实质上不发生机械振动或流体力学作用，能够排除对观察对象物的力学作用影响，实现稳定的测量。
当粒子和发光探针的结合体或发光探针通过吸收多光子而发光时，上述光学系统作为多光子显微镜使用。在此情况下，仅在激发光的焦点区域（光检测区域）中发出光，因此可以去除小孔13。此外，当粒子和发光探针的结合体或发光探针通过化学发光或生物发光现象而不依赖激发光发光时，可以省略用于产生激发光的光学系统2～5。当粒子和发光探针的结合体或发光探针通过磷光或散射发光时，直接使用上述共聚焦显微镜的光学系统。进一步的，在光分析装置1中，如图所示，可以设置多个激发光源2，可以根据激发粒子和发光探针的结合体或发光探针的光波长，选择恰当的激发光波长。同样的，还可以具备多个光检测器16，当样品中包括波长不同的多种粒子和发光探针的结合体或发光探针时，可以根据波长分别检测来自上述结合体或发光探针的光。
＜扫描分子计数法的光分析技术原理＞
FIDA等分光分析技术与以前的生物化学分析技术相比，其优点是必需的样品量非常少，并且可以快速实施检查。然而，在FIDA等分光分析技术中，原理上根据荧光强度波动计算所观察的对象粒子的浓度或特性，因此，为了获得良好精度的检测结果，要求样品溶液中的所观察的对象粒子的浓度或数密度是如下水平：在荧光强度测量中，在光检测区域CV内总是存在一个左右的所观察的对象粒子，在测量时间内总是检测到显著的光强度（光子计数）。如果当所观察的对象粒子的浓度或数密度低于上述时，例如，当所观察的对象粒子的水平是几乎不进入光检测区域CV内的水平时，在一部分测量时间内不出现显著的光强度（光子计数），因而难以以良好的精度计算光强度的波动。此外，在所观察的对象粒子的浓度比测量中通常在光检测区域内部存在一个左右的所观察的对象粒子时大幅降低的情况下，光强度波动的演算易受背景的影响，为了获得演算中的充分量的显著的光强度数据，测量时间延长。与此相对，即使当所观察的对象粒子的浓度比FIDA等分光分析技术要求的水平低时，用扫描分子计数法也能够检测所观察的对象粒子的数密度或浓度等特性。
在扫描分子计数法的光分析技术中实施的处理，直言不讳的是驱动用于移动光检测区域的位置的机构（镜转向器17），改变光路，如图2中模式性的描述所述，一边在样品溶液内部移动光检测区域CV的位置，即一边利用光检测区域CV扫描样品溶液内部，一边实施光检测。如此一来，例如如图2A所示，在光检测区域CV移动的时间内（图中，时间t0～t2），当通过存在1个粒子（图中，发光探针结合有荧光色素）的区域时（t1），检测到如图2B所述的显著的光强度（Em）。如此一来，实施上述光检测区域CV的位置移动和光检测，通过一个一个地检测在此期间所出现的如图2B示例的显著的光强度，逐个检测出与发光探针结合的粒子，计数其个数，可以以此获得存在于测量区域内的粒子数或其浓度或数密度相关的信息。在所述扫描分子计数法的光分析技术原理中，不进行诸如荧光强度波动的计算这类统计学的演算处理，而是一个一个地检测粒子，因此可以理解，即使对于应观察的粒子的浓度低，而用FIDA等不能进行足够精度分析的样品溶液，也可以获得与粒子的浓度或数密度相关的信息。
此外，通过扫描分子计数法这类对样品溶液中的粒子逐个检测、计数的方法，与由通过荧光分光光度计或酶标仪测量的荧光强度来检测被荧光标记的粒子的浓度时相比，可以以更低的浓度进行测定。当通过荧光分光光度计或酶标仪来检测被荧光标记的粒子的浓度时，通常假设荧光强度与被荧光标记的粒子的浓度成比例。然而，当被荧光标记的粒子的浓度变得非常低时，噪音信号量相对于被荧光标记的粒子发出的光的信号量而言变大（S/N比恶化），被荧光标记的粒子的浓度与光信号量之间的比例关系瓦解，所确定的浓度值的精度恶化。另一方面，通过扫描分子计数法，在自检到的光信号中检测与每个粒子相对应的信号的步骤中，从检测结果排除噪音信号，仅计数与每个粒子相对应的信号来计算浓度，因此，可以检测出比假设荧光强度与被荧光标记的粒子的浓度成比例而检测浓度时更低的浓度。
此外，当1个所观察的对象粒子结合多个发光探针时，通过扫描分子计数法这类对样品溶液中的粒子逐个检测、计数的方法，与传统的在假定荧光强度与被荧光标记的粒子的浓度成比例的条件下确定浓度的方法相比，也可以提高高粒子浓度下的粒子浓度的测量精度。在1个所观察的对象粒子结合多个发光探针的条件下，向样品溶液添加某一量的发光探针时，一旦所观察的对象粒子的浓度升高，则相对而言与粒子结合的发光探针数降低。在此情况下，由于每1个所观察的对象粒子的荧光强度降低，因此，被荧光标记的粒子的浓度与光量之间的比例关系瓦解，所确定的浓度值的精度恶化。另一方面，通过扫描分子计数法，在自检到的光信号中检测与每个粒子相对应的信号的步骤中，由于每个粒子的荧光强度降低的影响减小，和自粒子数计算浓度，因此，可以检测出比假设荧光强度与被荧光标记的粒子的浓度成比例而检测浓度时更高的浓度。
＜通过扫描分子计数法检测样品溶液的光强度＞
就扫描分子计数法的光分析中的光强度的测定而言，除了在检测中驱动镜转向器17，在样品溶液内部移动光检测区域的位置（扫描样品溶液内部）以外，可以以与FCS或FIDA中的光强度检测步骤相同的方式实施光强度检测。在操作处理中，通常在微孔板9的孔10中注入样品溶液，加载在显微镜的平台上，然后，使用者对计算机18输入开始检测的指示，计算机18藉由存储装置（图中未显示）中存储的程序（改变光路以在样品溶液内部移动光检测区域位置的工序，和在光检测区域的位置移动时检测来自光检测区域的光的工序），开始在样品溶液内部的光检测区域中照射激发光和测量光强度。在所述测量中，在计算机18程序对处理行为的控制下，镜转向器17驱动镜子7（检流计镜），在孔10内实施光检测区域的位置移动，同时，光检测器16将逐次检测到的光转变为电信号，传送给计算机18，在计算机18中，从送达的光信号以任意方式生成按照时间顺序的光强度数据并保存。此外，光检测器16典型的是可以检测到单光子抵达的超高灵敏度光检测器，因此，光检测是以如下方式实施的光子计数，即，经过规定时间后，逐次测量每一规定的单位时间（BIN TIME）内（例如，每10μ秒）到达光检测器的光子数，按照时间顺序的光强度数据可以是按照时间顺序的光子计数数据。
光强度测量中的光检测区域的位置移动速度可以是任意设定的适合例如实验或分析目的的规定速度。当根据所检测到的所观察的对象粒子的数量，获得与其数密度或浓度相关的信息时，光检测区域所经过的区域的大小或体积是必需的，因此，以移动距离受掌握的方式实施光检测区域的位置移动。此外，由于测量花费的时间和光检测区域的位置移动距离存在比例关系时，容易解释测量结果，因此，移动速度优选基本上是某一规定的速度，但不限于此。
此外，对于光检测区域的位置移动速度，为了自测量的按照时间顺序的光强度数据逐个检测所观察的对象粒子，或以良好的精度定量实施所观察的对象粒子数的计数，优选将所述移动速度设定为比所观察的对象粒子（更严密的是，粒子和发光探针的结合体或与粒子结合后分解的游离发光探针）的随机运动（即，由于布朗运动造成的移动速度）更快的值。扫描分子计数法的光分析技术的所观察的对象粒子是分散或溶解在溶液中的自由的随机运动粒子，由于布朗运动，其位置随时间而移动。因此，当光检测区域的位置的移动速度比粒子的布朗运动造成的移动更慢时，如图3A中模式性所示，粒子在区域内随机移动，导致光强度如图3B所示随机地改变（如已知的，光检测区域的激发光强度以区域中心为顶点向外降低），难以确定与每个所观察的对象粒子相对应的显著的光强度变化。在本文中，合适的是如图4A所述，粒子略呈直线的横切光检测区域，这样一来，如图4B示例的，在按照时间顺序的光强度数据中，与每个粒子相对应的光强度变化曲线几乎一致（当粒子略呈直线地通过光检测区域时，光强度的变化曲线与激发光强度分布几乎相同），为了容易确定每个所观察的对象粒子与光强度的对应关系，光检测区域的位置移动速度设定为比粒子的布朗运动的平均移动速度（扩散移动速度）更快。
具体而言，由于布朗运动，具有扩散系数D的所观察的对象粒子（更严密的是，粒子与发光探针的结合体，或与粒子结合后再分解的游离发光探针）经过半径Wo的光检测区域（共焦体积）时所需的时间Δt是由均方位移的关系式
（2Wo）2＝6D·Δt    ...（1）
推断出
Δt＝（2Wo）2/6D    ...（2），
因此，所观察的对象粒子由于布朗运动造成的移动的速度（扩散移动速度）Vdif大约是
Vdif＝2Wo/Δt＝3D/Wo    ...（3）。
在本文中，参考所述Vdif，光检测区域的位置的移动速度可以设定为比之更快的值。例如，当预计所观察的对象粒子的扩散系数是D＝2.0×10-10m2/s左右时，Wo就是0.62μm左右、Vdif则是1.0×10-3m/s，因此，光检测区域的位置的移动速度可以设定为约10倍的15mm/s。此外，当所观察的对象粒子的扩散系数未知时，为了发现使在光检测区域的位置移动速度的各种设定下的光强度变化曲线成为预期曲线（典型的是与激发光强度分布几乎相同）的条件，可以重复进行预备实验，确定恰当的光检测区域的位置移动速度。
＜通过扫描分子计数法分析光强度＞
经上述处理获得样品溶液的按照时间顺序的光强度数据，可以在计算机18中，通过存储在存储装置中的程序处理，如下所述实施光强度的分析。
（i）检测一个所观察的对象粒子
在按照时间顺序的光强度数据中，当一个所观察的对象粒子经过光检测区域时的轨迹是如图4A所示的几乎直线状时，与该粒子相对应的光强度变化如图6A中模式性所述，具有反映（由光学系统确定的）光检测区域的光强度分布的曲线（通常略呈钟形）。在本文中，在检测所观察的对象粒子的一种方法中，对光强度设定阈值Io，当超过该阈值的光强度所持续的时间宽度Δτ在规定范围内时，判断该光强度的曲线与经过光检测区域的一个粒子对应，检测到了一个所观察的对象粒子。光强度对应的阈值Io和时间宽度Δτ对应的规定范围，是根据以规定速度相对于光检测区域移动的所观察的对象粒子和发光探针的结合体（或与粒子结合后再分解的游离发光探针）发出的光强度的预想曲线决定的，但其具体值可以在实验中任意地确定，此外，也可以根据所观察的对象粒子和发光探针的结合体（或与粒子结合后再分解的游离发光探针）的特性选择性地确定。
此外，作为检测所观察的对象粒子的其他方法，光检测区域的光强度分布可以假定为高斯分布：
I＝A·exp（-2t2/a2）    ...（4），
此时，对显著的光强度曲线（可以明确判断为非背景的曲线），根据式（4）拟合计算出的强度A和宽度a落入规定范围内时，该光强度曲线可判断为对应一个所观察的对象粒子经过了光检测区域，可以视为检测到一个所观察的对象粒子（当强度A和宽度a落在规定范围之外时，在分析中视为噪音或异物，可以无视）。
（ii）计数所观察的对象粒子
所观察的对象粒子的计数，可以是通过任意方法计数通过上述所观察的对象粒子的检测方法检测到的粒子数。当粒子数较大时，可以通过例如图5和图6B所示例的处理来进行。
参见图5和图6B，在根据按照时间顺序的光强度（光子计数）数据计数粒子数的方法的一个例子中，在通过上述光强度测定、即用光检测区域扫描样品溶液内部和进行光子计数，获得按照时间顺序的光信号数据（光子计数数据）后（步骤100），对所述按照时间顺序的光信号数据（图6B最上部分“检测结果（未处理）”），进行SMOOTHING（平滑化）处理（步骤110，图6B中上部分“SMOOTHING”）。粒子和发光探针的结合体或发光探针发出的光是概率性发出的，在微小的时间内会发生数据值的欠缺，因此，通过所述平滑化处理，可以无视上述数据值的欠缺。平滑化处理可以实施例如移动平均法（moving average method）。此外，根据获得光信号数据时的光检测区域的位置移动速度（扫描速度）、BIN TIME，可以恰当地设定实施平滑化处理时的参数、如移动平均法中每次平均的数据点数或移动平均的次数等。
然后，在平滑化处理后的按照时间顺序的光信号数据中，为了检测存在显著信号的时间区域（峰存在区域），对平滑化处理后的按照时间顺序的光信号数据对时间进行一阶微分值演算（步骤120）。按照时间顺序的光信号数据的时间微分值，如图6B中下部分的“时间微分”所示信号值变化时间点处的值的变化变大，因此通过参考所述时间微分值可以有利地确定显著的信号（峰信号）的起点和终点。
之后，在按照时间顺序的光信号数据中，逐次检测显著的信号（峰信号），判断检测到的峰信号是否是与所观察的对象粒子相对应的信号。具体而言，首先，在按照时间顺序的光信号数据的按照时间顺序的时间微分值数据上，逐次参考时间微分值，搜索并确定一个峰信号的起点和终点，决定峰存在区域（步骤130）。一旦决定了一个峰存在区域，就对该峰存在区域中平滑化的按照时间顺序的光信号数据进行钟形函数拟合（图6B下部分的“钟形函数拟合”），计算钟形函数的峰强度Imax、峰宽度（半高全宽（full width halfmaximum））w、拟合中的（最小二乘法的）相关系数等参数（步骤140）。此外，拟合的钟形函数典型的是高斯函数，也可以是洛伦兹型函数。由此，判断计算出的钟形函数的参数是否落在一个粒子和发光探针的结合体或发光探针经过光检测区域时检测到的光信号所描述的钟形曲线参数的规定范围内，即，峰强度、峰宽度、相关系数是否分别在规定范围内等（步骤150）。如此一来，如图7左侧所示，当计算出的钟形函数的参数被判断为落在与一个粒子和发光探针的结合体或发光探针相应的光信号的规定范围内时，则将该信号判断为与一个所观察的对象粒子相对应的信号，由此检测到一个所观察的对象粒子，计数为一个粒子（粒子数的计数增加。步骤160）。另一方面，如图7右侧所示，将计算出的钟形函数的参数没有落在规定范围内的峰信号作为噪音而无视。
上述步骤130～160处理中的峰信号的搜索和判断是对按照时间顺序的光信号数据的全部区域重复实施的，每检测到一个所观察的对象粒子，就作为粒子而计数。因此，在结束对按照时间顺序的光信号数据全部区域的峰信号搜索后（步骤170），将所获得的粒子计数值作为在按照时间顺序的光信号数据中检测到的所观察的对象粒子的个数。
（iii）确定所观察的对象粒子的数密度或浓度
完成了所观察的对象粒子计数后，使用获得按照时间顺序的光信号数据的过程中光检测区域所经过的区域的总体积，确定所观察的对象粒子的数密度或浓度。然而，光检测区域的实际体积依赖于激发光或检测光的波长、透镜的开口数、光学系统的调整状态而改变，因而一般难以从设计值算出；因此，光检测区域所经过的区域的总体积的计算也不简单。在本文中，典型的是，在与所要检查的样品溶液相同的检测条件下，对已知浓度的溶液（参照溶液）进行上文说明的光强度测定、粒子检测和计数，根据检测到的粒子数和参照溶液的粒子浓度，确定光检测区域所经过的区域的总体积，即确定所观察的对象粒子的检测数和浓度之间的关系。参照溶液的粒子优选可以是与所观察的对象粒子所形成的粒子和发光探针的结合体（或与所观察的对象粒子结合后再游离的发光探针）具有相同波长特性的发光标记（荧光色素等）。具体而言，例如，对于粒子浓度为C的参照溶液，其粒子的检测数为N，光检测区域通过的区域总体积Vt则根据
Vt＝N/C    ...（5）
赋值。此外，准备多个不同浓度的溶液作为参照溶液，分别对其实施测定，将计算出的Vt的平均值作为光检测区域所经过区域的总体积Vt使用。因此，一旦对Vt赋值，粒子的计数结果为n的样品溶液的粒子的数密度c就根据
c＝n/Vt    ...（6）
赋值。此外，可以不通过上述方法，而利用任意方法如FCS、FIDA等对光检测区域的体积、光检测区域所经过区域的总体积进行赋值。此外，在本实施方案的光分析装置中，对于预期的光检测区域的移动模式，将各种标准粒子的浓度C和粒子数N之间的关系（式（5））的信息预先存储在计算机18的存储装置中，装置的使用者在实施光分析时可以恰当利用存储的关系信息。
＜鉴别核酸分子多态性的方法＞
本发明的鉴别核酸分子多态性的方法为使用至少2种核酸探针，即与多态性序列中的特定类型（第一型）的核酸分子特异性结合的核酸探针、和与该核酸探针的碱基序列不同的核酸探针，使各核酸探针分别与分析对象的核酸分子杂交，根据所形成的结合体的量，鉴别分析对象的核酸分子的类型的方法。进一步的，在本发明中，通过上述扫描分子计数法，测定、检测结合体。扫描分子计数法是在分子处于离散状态下，可以按粒测定每一个具有荧光的粒子的检测方法，因此能够检测pM数量级以下的较低浓度的核酸分子。因此，通过本发明的鉴别核酸分子多态性的方法，即使当样品溶液中的分析对象的核酸分子的浓度非常低时，也可以高灵敏度地计数所形成的结合体。
在本发明和本申请说明书中，“多态性序列”是指存在2种以上彼此相似的碱基序列的碱基序列，将具有多态性序列的核酸分子称为多态性核酸。在本文中，“碱基序列相似”是指在例如10～20个核酸碱基中，取代、缺失、插入或重复1～数个核酸碱基而导致的差异。此外，“鉴别多态性”是指区别具有多态性序列中特定类型的碱基序列的核酸分子以及具有所述多态性序列中的所述特定类型以外类型的碱基序列的核酸分子。
在本发明的鉴别核酸分子多态性的方法中，作为分析对象的多态性序列可以是单基因多态性（SNP）等这类基因上的碱基序列，也可以是人工的碱基序列。在本发明中，优选鉴别作为先天多态性的基因多态性的多态性位点，或作为后天生成的多态性的体细胞突变的突变位点。体细胞突变可列举K-ras基因的突变等。
在本发明中，“核酸探针与具有多态性序列中的特定类型的单链核酸分子特异性结合”是指在具有所述多态性序列的单链核酸分子中，相比所述特定类型以外的类型的单链核酸分子，所述核酸探针优先与所述特定类型的单链核酸分子杂交。因此，核酸探针可以具有与特定类型的碱基序列完全互补的碱基序列，也可以具有含错配的碱基序列，所述错配位于多态性位点、即多态性序列间碱基不同的位点以外。
在本发明中，至少使用2种核酸探针，即，被荧光物质标记、且与具有多态性序列中第一型的碱基序列的单链核酸分子特异性杂交的第一核酸探针（下文的第1核酸探针），和被荧光物质标记、且碱基序列与上述第1核酸探针不同的第二核酸探针（下文的第2核酸探针）。
例如，当鉴别已知野生型和突变型这2种类型的单基因多态性时，以突变型作为第一型，设计与突变型单链核酸分子特异性杂交的第1核酸探针，设计与野生型单链核酸分子特异性杂交的第2核酸探针，可以鉴别分析对象的核酸分子是突变型还是野生型。当分析对象的核酸分子是突变型时，由于与第1核酸探针优先形成结合体，因此包含第1核酸探针的结合体的分子数比包含第2核酸探针的结合体显著多。
此外，可以以突变型作为第一型，设计与突变型的单链核酸分子特异性杂交的第1核酸探针，设计与包含所述突变型（第一型）的碱基序列的单链核酸分子特异性杂交的第2核酸探针。第2核酸探针与突变型单链核酸分子在多态性序列以外的区域结合。因此，在样品溶液中存在的分析对象的核酸分子是突变型的情况下，向所述样品溶液中添加第1核酸探针和第2核酸探针两者，进行下述步骤（a）、（b）、（d）和（e），由此在所述样品溶液中形成包含第1核酸探针和第2核酸探针的结合体。另一方面，野生型单链核酸分子不与第1核酸探针形成结合体，而与第2核酸探针结合。如此设计的第2核酸探针与具有多态性序列的核酸分子在多态性序列以外的区域结合，与具有多态性序列中除第一型以外的基因型的核酸分子也形成结合体。即，当分析对象的核酸分子是野生型时，所述样品溶液中虽然形成了包含第2核酸探针的结合体，但不形成包含第1核酸探针和第2核酸探针的结合体。因此，当样品溶液中形成了包含第1核酸探针和第2核酸探针的结合体时，可以鉴别分析对象的核酸分子是第一型（在此情况下是突变型）；当形成了包含第2核酸探针而不包含第1核酸探针的结合体时，可以鉴别分析对象的核酸分子是多态性序列中除第一型以外的类型（在此情况下是野生型）。
当分析对象的核酸分子形成如基因组DNA这类双链核酸分子时，如前所述，可以将第2核酸探针设计为与包含第一型碱基序列的单链核酸分子特异性杂交，也可以设计为同具有与包含第一型碱基序列的单链核酸分子互补的碱基序列的单链核酸分子（即，与具有多态性序列的单链核酸分子结合的单链核酸分子。在下文中，称为具有多态性序列的单链核酸分子的互补链）特异性杂交。在后一情况下，第2核酸探针与具有多态性序列的单链核酸分子的互补链在多态性核酸之间共有的碱基序列区域结合。即，不论多态性序列的类型，第2核酸探针与具有多态性序列的单链核酸分子的互补链形成结合体。因此，在包含第一型碱基序列的单链核酸分子以与所述单链核酸分子的互补链、即双链核酸分子（结合体）形式存在的样品溶液中，添加第1核酸探针和第2核酸探针两者，进行下述步骤（a）、（b）、（d）和（e），由此，包含第一型碱基序列的单链核酸分子与第1核酸探针结合，所述单链核酸分子的互补链与第2核酸探针结合。另一方面，当分析对象的核酸分子是多态性序列中除第一型以外的类型时，通过同样的处理，仅形成包含第2核酸探针的结合体，而不形成包含第1核酸探针的结合体。因此，当样品溶液中同时形成包含第1核酸探针的结合体和包含第2核酸探针的结合体时，可以鉴别分析对象的核酸分子是第一型；形成包含第2核酸探针的结合体，而不形成包含第1核酸探针的结合体时，可以鉴别分析对象的核酸分子是多态性序列中除第一型以外的类型。
不论多态性序列的类型，通过将第2核酸探针设计成与具有多态性序列的单链核酸分子或与所述单链核酸分子的互补链形成结合体，可以计算包含第一型碱基序列的单链核酸分子在存在于样品溶液中的多态性核酸中所占的比例。例如，以具有野生型和突变型2种类型的SNP作为多态性序列，以突变型作为第一型，对包含受试者的基因组DNA的样品溶液实施本发明的鉴别核酸分子多态性的方法的情况下，当包含第1核酸探针的结合体的数量与包含第2核酸探针的结合体的数量几乎相等时，可以鉴别所述受试者的基因型是突变型纯合子。当包含第1核酸探针的结合体的数量显著少于包含第2核酸探针的结合体的数量时，所述受试者的基因型可以鉴别为杂合子；当几乎检测不到包含第1核酸探针的结合体时，所述受试者的基因型可以鉴别为野生型纯合子。
此外，不论多态性序列的类型，通过将第2核酸探针设计成与具有多态性序列的单链核酸分子或与所述单链核酸分子的互补链形成结合体，可以用于评价检测体系的精度。例如，当几乎检测不到包含第2核酸探针的结合体时，暗示所使用的样品溶液中未包含用于检测的足够量的多态性核酸，或检测体系可能功能不佳，未获得可信赖的结果。
在本发明中，使用预先被荧光物质标记的核酸探针，以荧光为指标，通过扫描分子计数法检测核酸探针与其他的单链核酸分子形成的结合体。荧光物质只要是通过特定波长的光照射而发出荧光的物质即可，没有特殊的限制，可以使用从FCS或FIDA等使用的荧光色素中恰当选出的物质。此外，可以使用常规方法标记核酸探针的荧光物质。
此外，在本发明中，使核酸探针单独存在时的状态和与其他的单链核酸分子形成结合体时的状态下的荧光强度不同，从而在扫描分子计数法中将二者区分检测。
例如，可以将分子信标探针作为第1核酸探针、第2核酸探针使用。分子信标探针是在单链核酸分子的状态下形成分子内结构的寡核苷酸，是在荧光共振能量转移（FRET）中作为能量供体的荧光物质和作为能量受体的物质（荧光物质、猝灭物质）按照在单链核酸分子的状态下产生FRET、在与其他单链核酸分子杂交形成结合体的状态下不产生FRET的方式结合而成的探针。从单独存在的第1核酸探针或第2核酸探针中，检测不到由作为能量供体的荧光物质发出的荧光，或所述荧光是减弱的。在本文中，通过检测由作为能量供体的荧光物质发出的荧光，可以将包含第1核酸探针、第2核酸探针的结合体与单独存在的核酸探针区别地检测。
作为第1核酸探针、第2核酸探针使用的分子信标探针可列举：具有能够与多态性序列的特定类型杂交的碱基序列、且在3’端区域和5’端区域具有彼此互补的碱基序列的寡核苷酸。在本发明中，优选：3’端结合了作为能量供体的荧光物质或作为能量受体的物质，5’端结合了剩余的另一种，且3’端区域和5’端具有彼此互补的碱基序列，通过在这些碱基序列中形成碱基对，形成分子内结构（所谓的茎-环结构）。此外，分子信标探针中形成分子内碱基对的彼此互补的区域可以按照夹持与多态性序列中的特定类型的核酸分子特异性结合的区域（例如，由与多态性序列互补的碱基序列组成的区域）的方式存在，3’端区域和5’端区域可以是分别包含3’末端或5’末端的区域，也可以是不包含3’末端或5’末端的区域。此外，形成碱基对的区域的碱基数或碱基序列所形成的碱基对的稳定性可以是以下程度：比与具有作为靶的多态性序列的核酸分子的结合体的稳定性更低，且在检测条件下能够形成碱基对。
当将第1核酸探针设为由FRET中作为能量供体的荧光物质和作为能量受体的物质结合而成的分子信标探针时，第2核酸探针可以设为结合了与第1核酸探针同种的2种荧光物质的分子信标探针，也可以设为结合了与第1核酸探针的组合不同的作为能量供体的荧光物质和作为能量受体的物质的分子信标探针。将标记第2核酸探针的、作为能量供体的荧光物质和作为能量受体的物质，设为与第1核酸探针不同的组合，使由包含第1核酸探针的结合体发出的光和由包含第2核酸探针的结合体发出的光的光学特性彼此不同，从而可以根据发出的光，区别检测包含第1核酸探针的结合体和包含第2核酸探针的结合体。
此外，使用特异性结合在双链结构中的荧光性双链核酸结合物质，通过所述荧光性双链核酸结合物质与标记核酸探针的荧光物质之间产生FRET，可以区别单独存在的核酸探针与结合体。即，荧光性双链核酸结合物质和标记核酸探针的荧光物质中任一种作为FRET的能量供体，另一种作为所述FRET的能量受体。自单独存在的第1核酸探针、第2核酸探针中，检测到由标记所述核酸探针的荧光物质发出的荧光。与此相对，结合体中由于结合了荧光性双链核酸结合物质，自结合体中检测到基于FRET而发出的荧光，其结果是可以与单独存在的核酸探针区别检测。
与双链结构特异性结合的荧光性双链核酸结合物质可列举荧光性嵌入剂或结合了荧光物质的沟结合剂（groove binder）等。此外，当进入结合体的碱基对之间的荧光性嵌入剂的量过多时，检测基于FRET而发出的荧光时的背景变得太高，会有影响检测精度之虞。因此，优选按照在结合体中形成双链的区域在400bp以下的方式设计第1核酸探针、第2核酸探针。
当用在与荧光性双链核酸结合物质之间产生的FRET中作为能量供体的荧光物质标记第1核酸探针时，第2核酸探针可以用与第1核酸探针同类的荧光物质标记，也可以用在与所述荧光性双链核酸结合物质之间产生的FRET中作为能量供体、且与第1核酸探针种类不同的荧光物质标记，也可以用在与所述荧光性双链核酸结合物质之间产生的FRET中作为能量受体的荧光物质标记。
此外，可以将第1核酸探针和第2核酸探针中的任一种设为分子信标探针，将另一种设为被与荧光性双链核酸结合物质产生FRET的荧光物质标记的探针。
此外，还可以将第2核酸探针设计为在与第一核酸探针相邻的状态下与包含第一型碱基序列的单链核酸分子特异性杂交，且标记第1核酸探针的荧光物质和标记第2核酸探针的荧光物质中的任一种为形成FRET中的能量供体的荧光物质，另一种形成所述FRET中的能量受体的物质。在此情况下，由于具有第一型碱基序列的单链核酸分子与第1核酸探针和第2核酸探针彼此相邻杂交，在由这3者组成的结合体中，标记第1核酸探针的荧光物质与标记第2核酸探针的荧光物质之间产生FRET。因此，通过检测自所述FRET发出的荧光，可以检测包含第1核酸探针和第2核酸探针的结合体。
用于本发明中的第1核酸探针和第2核酸探针可以是由DNA组成的寡核苷酸，也可以是由RNA组成的寡核苷酸，也可以是由DNA和RNA组成的嵌合寡核苷酸，也可以包括部分或全部的核酸类似物，所述核酸类似物能够形成与天然核酸碱基相同的核苷酸链或碱基对。核酸类似物可列举DNA或RNA这类天然类型核苷酸（天然存在的核苷酸）的侧链等被氨基等官能团修饰的物质、用蛋白质或低分子化合物等标记的物质，等等。更具体而言，例如，桥式核酸（BNA）、天然型核苷酸的4’位氧原子被硫原子取代的核苷酸、天然型核糖核苷酸的2’位羟基被甲氧基取代的核苷酸或己糖醇核酸（HNA）、肽核酸（PNA）等。此外，作为分析对象的核酸可以是DNA，也可以是RNA，还可以是cDNA这类人为扩增的核酸。
具体而言，本发明的鉴别核酸分子多态性的方法具有以下步骤。
（a）制备包含第一核酸探针（第1核酸探针）和分析对象的核酸分子的样品溶液的步骤，所述第一核酸探针被荧光物质标记、且与具有多态性序列中的第一型的碱基序列的单链核酸分子特异性杂交，
（b）使上述步骤（a）中制备的样品溶液中的核酸分子结合的步骤，
（c）在上述步骤（b）之后，计算上述步骤（a）中制备的样品溶液中的、包含第1核酸探针的结合体的分子数的步骤，
（d）制备包含第二核酸探针（第2核酸探针）和上述分析对象的核酸分子的样品溶液的步骤，所述第二核酸探针被荧光物质标记、且与上述第1核酸探针的碱基序列不同，
（e）使上述步骤（d）中制备的样品溶液中的核酸分子结合的步骤，
（f）在上述步骤（e）之后，计算上述步骤（d）中制备的样品溶液中的、包含第2核酸探针的结合体的分子数的步骤，
（g）根据上述步骤（c）和（f）的结果，鉴别上述分析对象的核酸分子的多态性的步骤。
首先，作为步骤（a），制备包含第1核酸探针和分析对象的核酸分子的样品溶液。具体而言，将第1核酸探针和分析对象的核酸分子添加到合适的溶剂中，制备样品溶液。该溶剂只要是不抑制对第1核酸探针发出的荧光的检测和通过扫描分子计数法对结合体的检测的溶剂即可，没有特殊的限制，可以从本技术领域中常用的缓冲液中恰当的选择。所述缓冲液可以是例如，PBS（磷酸盐缓冲生理盐水，pH7.4）等磷酸缓冲液或Tris缓冲液等。
其次，作为步骤（b），使步骤（a）中制备的样品溶液中的核酸分子结合。当样品溶液中的核酸分子是双链核酸分子时，优选在结合前使其变性。在本发明中，“使核酸分子变性”是指使碱基对解离，例如，使分子信标探针中由彼此互补的碱基序列形成的碱基对解离，解开分子内结构成为单链结构，或使双链核酸分子成为单链核酸分子。此外，当核酸探针是包含PNA等核酸类似物的寡核苷酸时，即使核酸分子是双链核酸分子，即使不进行特别的变性处理，也可以形成包含所述核酸探针的结合体。
在本发明中，由于对荧光物质的影响较小，优选通过高温处理变性（热变性）或通过低盐浓度处理进行变性。其中，由于操作简单，热变性是优选的。具体而言，热变性是通过高温处理所述样品溶液，可以使所述样品溶液中的核酸分子变性。一般而言，DNA是在90℃下、RNA是在70℃下保温数秒至2分钟左右，可以使其变性，但变性温度根据核酸分子的碱基长度等千差万别，只要能够变性，对该温度就没有限制。另一方面，通过低盐浓度处理进行变性可以是例如通过纯水稀释，将所述样品溶液的盐浓度调整至足够低而进行。
在根据需要变性后，使上述样品溶液中的核酸分子结合。当进行热变性时，在高温处理后，使所述样品溶液的温度降至第1核酸探针可以与具有第一型碱基序列的单链核酸分子特异性杂交的温度以下，可以使所述样品溶液中的核酸分子恰当地结合。此外，当通过低盐浓度处理进行变性时，通过添加盐溶液等，使所述样品溶液的盐浓度升高至第1核酸探针可以与具有第一型碱基序列的单链核酸分子特异性杂交的浓度，可以使所述样品溶液中的核酸分子恰当地结合。
此外，可以根据具有第一型碱基序列的单链核酸分子与核酸探针组成的结合体的融解曲线，计算第1核酸探针可以与具有第一型碱基序列的单链核酸分子特异性杂交的温度。可以例如，使仅含有第1核酸探针和具有第一型碱基序列的单链核酸分子的溶液的温度从高温向低温变化，通过测量所述溶液的吸光度或荧光强度来计算融解曲线。根据所获得的融解曲线，从变性的第1核酸探针和具有第一型碱基序列的单链核酸分子开始形成结合体的温度，至几乎全部成为结合体的温度这一范围内的温度，都可以作为第1核酸探针可以与具有第一型碱基序列的单链核酸分子特异性杂交的温度。也可以用使溶液中的盐浓度自低浓度向高浓度变化来代替温度，同样确定融解曲线，可以计算第1核酸探针可以与具有第一型碱基序列的单链核酸分子特异性杂交的浓度。
一般可以用Tm值（融解温度），代替第1核酸探针可以与具有第一型碱基序列的单链核酸分子特异性杂交的温度。例如，利用普遍使用的引物/探针设计软件等，根据第1核酸探针的碱基序列信息，可以计算出与具有第一型碱基序列的单链核酸分子杂交的区域的Tm值（50%的双链DNA解离为单链DNA的温度）。在本发明中，优选使样品溶液的温度降低至第1核酸探针中具有与含第一型碱基序列的单链核酸分子互补的碱基序列的区域的Tm值±3℃的温度左右。
此外，为了抑制非特异性杂交，在形成结合体时，优选使样品溶液的温度较缓慢地下降。例如，使样品溶液温度为70℃以上而使核酸分子变性后，可以按0.05℃/秒或更慢的降温速度，降低所述样品溶液的液温。
之后，作为步骤（c），通过扫描分子计数法计算样品溶液中的、包含第1核酸探针的结合体的分子数。具体而言，将形成结合体后的样品溶液设置在用于上述扫描分子计数法的光分析装置中，通过上述方法，检测、分析自结合体发出的荧光，计算结合体的分子数。
此外，当在比具有多态性序列的核酸分子能够与核酸探针特异性杂交的温度更低的温度下，通过扫描分子计数法检测结合体时，为了抑制非特异性杂交，优选预先在样品溶液中添加如下寡核苷酸，所述寡核苷酸具有与分析对象的多态性序列中除与核酸探针特异性杂交的型以外类型的碱基序列互补的碱基序列。由于与具有其他型的核酸分子特异性杂交的寡核苷酸是过量存在的，因此，可以有效抑制所添加的核酸探针与其他型的核酸分子的非特异性杂交。例如，为了鉴别具有野生型和突变型的体细胞突变，当以第一型作为突变型时，优选在添加了第1核酸探针的样品溶液中，添加具有与野生型碱基序列互补的碱基序列的寡核苷酸。同样的，当将第2核酸探针设计为与野生型单链核酸分子特异性杂交时，优选向添加了第2核酸探针的样品溶液中，添加具有与突变型碱基序列互补的碱基序列的寡核苷酸。此外，所述寡核苷酸可以在形成结合体前添加到样品溶液中，也可以与第1核酸探针、第2核酸探针同时添加到样品溶液，当进行变性处理时，可以在变性后添加。
此外，为了抑制非特异性杂交，优选预先在样品溶液中添加表面活性剂、甲酰胺、二甲亚砜或尿素等。这些化合物可以只添加一种，也可以添加2种以上的组合。通过预先添加这些化合物，可以在较低温度环境下也不易发生非特异性杂交。
步骤（d）～（f）除使用第2核酸探针代替第1核酸探针以外，可以与上述步骤（a）～（c）同样进行。此外，当分析对象的多态性序列存在3种以上类型时，对于除第一型和第二型以外的类型，也可以使用分别与具有各类型的碱基序列的单链核酸分子特异性结合的核酸探针，同样进行上述步骤（a）～（c），鉴别所有类型。
步骤（a）～（c）和步骤（d）～（f）可以实质上同时进行，也可以分别独立进行。例如，可以在制备添加了第1核酸探针和分析对象的核酸分子的样品溶液，与添加了第2核酸探针和分析对象的核酸分子的样品溶液之后，使两种样品溶液的温度同时升高，再慢慢降低，使得溶液内的核酸分子的结合体同时形成，然后，将各样品溶液设置在光分析装置中，依次分析。
此外，可以在同一样品溶液中进行上述步骤（a）和（d）。具体而言，在同一样品溶液中，制备添加了第1核酸探针和第2核酸探针和分析对象的核酸分子的样品溶液，然后使所述样品溶液中的核酸分子结合。之后，通过扫描分子计数法，计算所述样品溶液中的包含第1核酸探针的结合体的分子数和包含第2核酸探针的结合体的分子数。
特别的是，当将第2核酸探针设计成与包含第一型的碱基序列的单链核酸分子特异性杂交、或与具有与所述单链核酸分子互补的碱基序列的单链核酸分子特异性杂交时，在同一样品溶液中，制备添加了第1核酸探针和第2核酸探针和分析对象的核酸分子的样品溶液，然后使所述样品溶液中的核酸分子结合。之后，通过扫描分子计数法，计算所述样品溶液中的包含第1核酸探针和第2核酸探针的结合体的分子数。
作为最后的步骤（g），根据包含第1核酸探针的结合体的分子数的计数结果，和包含第2核酸探针的结合体的分子数的计数结果，鉴别分析对象的核酸分子是分析对象的多态性中的第一型，还是其他类型（例如，第二型）。
例如，当鉴别单核苷酸多态性时，使用已知多态性序列的对照用单链核酸分子代替分析对象的核酸分子，计算：添加与野生型核酸分子特异性杂交的野生型探针（Wt探针）时所形成的包含野生型探针的结合体的分子数、添加与突变型核酸分子特异性杂交的突变型探针（Mt探针）时所形成的包含突变型探针的结合体的分子数。分别使用野生型核酸分子、突变型核酸分子或等摩尔量混合的野生型核酸分子和突变型核酸分子的混合物作为对照用单链核酸分子，进而作为阴性对照仅添加核酸探针。根据各检测结果，可以获得用于将对照用单链核酸分子的多态性和结合体的分子数之间的关系进行聚类（clustering）所必需的信息。
图8模式性显示了由多态性和结合体的分子数进行聚类的一个例子。在仅添加核酸探针的样品溶液中，包含野生型探针的结合体和包含突变型探针的结合体都很少（图8中的类组1）。与此相对，在添加了野生型核酸分子的样品溶液中，包含野生型探针的结合体的分子数显著多于包含突变型探针的结合体的分子数（图8中的类组2）。相反，在添加了突变型核酸分子的样品溶液中，包含突变型探针的结合体的分子数显著多于包含野生型探针的结合体的分子数（图8中的类组3）。在添加了等摩尔量混合野生型核酸分子和突变型核酸分子的混合物的样品溶液中，包含野生型探针的结合体的分子数和包含突变型探针的结合体的分子数都增加（图8中的类组4）。比较聚类的结果和添加分析对象的核酸分子时的结果，可以鉴别分析对象的核酸分子对应于何种多态性。
实施例
以下示出实施例等，进一步详细说明本发明，但本发明不限于下列实施例。
［参考例1］
验证使用一种分子信标探针，通过扫描分子计数法，鉴别K-ras基因的密码子12＿GTT突变的可能性。
突变型（GTT）分子信标探针使用具有表1记载的碱基序列（序列编号1）的核酸分子，所示核酸分子的5’末端连接了TAMRA，3’末端连接了BHQ-2。此外，作为分析对象的核酸分子，同样使用仅具有表1记载的碱基序列的野生型（GGT）核酸（序列编号2）（突变率：0%）、按9：1的摩尔比混合的野生型（GGT）核酸和突变型（GTT）核酸（序列编号3）的混合物（突变率：10%），和仅突变型（GTT）核酸（突变率：100%）。进一步的，为了抑制非特异性杂交，使用具有与野生型（GGT）核酸互补的碱基序列的非荧光标记探针（野生型（GGT）诱饵核酸）（序列编号4）。这些寡核苷酸是委托Sigma-Genosys株式会社合成的。在表1中，右栏显示序列编号。此外，在表1中，黑体的碱基是突变位点或与突变位点形成碱基对的碱基。进一步的，突变型（GTT）分子信标探针中添加了下划线的碱基是在形成分子内结构时彼此杂交的区域。
[表1]
上述突变型（GTT）分子信标探针、分析对象的核酸分子、野生型诱饵核酸分别在Tris缓冲液（10mM Tris-HCl、1mM EDTA、400mM NaCl、pH8.0）中溶解为100pM、100nM（野生型与突变型的总浓度）、500nM，配制成样品溶液。
将制备的样品溶液在95℃加热5分钟变性后，使液温逐渐降低至20℃，形成结合体。具体而言，降温速度为0.1℃/秒，实施在90℃下5分钟、80℃下10分钟、70℃下10分钟、60℃下10分钟、50℃下10分钟、40℃下10分钟、30℃下10分钟的降温处理。
通过扫描分子计数法计数降温处理后的样品溶液中的结合体的分子数。具体而言，在测量中，光分析装置使用具有共聚焦荧光显微镜的光学系统和光子计数系统的单分子荧光检测装置MF20（Olympus Corporation），获得上述各样品溶液的按照时间顺序的光子计数数据。此时，激发光使用543nm激光，以300μW照射；使用带通滤波器，以560～620nm作为检测光波长。光检测区域的位置在样品溶液中的移动速度为15mm/秒，BIN TIME为10μ秒，检测时间为2秒。此外，每个样品进行5次检测，计算平均值和标准偏差。在检测了光强度后，根据自各样品溶液获得的按照时间顺序的光子计数数据，计数按照时间顺序的数据中检测到的光信号。在通过移动平均法将数据平滑化时，一次平均的数据点为9个，移动平均处理重复5次。此外，在拟合时，通过最小二乘法将按照时间顺序的数据拟合高斯函数，确定（高斯函数中的）峰强度、峰宽（半高全宽）、相关系数。此外，在峰的判断处理中，仅将满足下列条件：
20μ秒＜峰宽＜400μ秒
峰强度＞1（光子/10μ秒）
相关系数＞0.95
的峰信号判断为与所观察的对象核酸分子对应的光信号；另一方面，不满足上述条件的峰信号是噪音，对其无视，将判断为与所观察的对象核酸分子对应的光信号的信号数计数为“峰数”。
图9中示出按照添加在样品溶液中的分析对象的核酸分子中的GTT突变率分类的、所计数的峰数的值。其结果是，根据峰数依赖于GTT突变率的增加而增加，确定突变型（GTT）分子信标探针与GTT突变序列特异性杂交。
［参考例2］
通过向样品溶液中添加具有与核酸探针特异性结合的类型以外类型的多态性序列互补的碱基序列的核酸分子，研究包含该核酸探针的结合体的检测精度。
具体而言，参考例1中使用的突变型（GTT）分子信标探针、分析对象的核酸分子、野生型（GGT）诱饵核酸分别在Tris缓冲液（10mM Tris-HCl、1mM EDTA、100mM NaCl、pH8.0）中溶解为100pM、100nM（野生型与突变型的总浓度）、1μM，配制成包含野生型（GGT）诱饵核酸的样品溶液。另一方面，除了不添加野生型（GGT）诱饵核酸以外，同样制备不包含野生型（GGT）诱饵核酸的样品溶液。
按与参考例1相同的方式，使这些样品溶液的液温升高和降低，使样品溶液中的核酸分子变性后，形成结合体，进一步的，在与参考例1相同的条件下，计数该样品溶液中的包含突变型（GTT）分子信标探针的结合体的分子数。
图10中示出按照添加在样品溶液中的分析对象的核酸分子中的GTT突变率分类的、所计数的峰数的值。图10A是不添加野生型（GGT）诱饵核酸的样品溶液的结果；图10B是添加了野生型（GGT）诱饵核酸的样品溶液的结果。其结果如图10A所示，在不存在野生型（GGT）诱饵核酸的条件下，突变率为0%时的峰数已经増加。这暗示了突变型（GTT）分子信标探针也与野生型（GGT）核酸非特异性杂交。另一方面，如图10B所示，在存在野生型（GGT）诱饵核酸的条件下，峰数的増加依赖于突变率，暗示了突变型（GTT）分子信标探针与突变型（GTT）核酸特异性杂交。根据上述结果可知，通过向样品溶液中添加诱饵核酸，可以抑制分子信标探针的非特异性杂交。
［实施例1］
使用参考例1中使用的突变型（GTT）分子信标探针和野生型（GGT）分子信标探针，鉴别各基因型。
野生型（GGT）分子信标探针使用具有表2记载的碱基序列（序列编号5）的核酸分子，所述核酸分子的5’末端连接了TAMRA、3’末端连接了BHQ-2。
此外，分析对象的核酸分子除了使用仅参考例1中使用的野生型（GGT）核酸（突变率：0%）、仅突变型（GTT）核酸（GTT突变率：100%）以外，还使用按1：1的摩尔比混合的野生型（GGT）核酸和突变型（GTT）核酸的混合物（GTT突变率：50%）。进一步的，为了抑制非特异性杂交，使用参考例1中使用的野生型（GGT）诱饵核酸，和具有与突变型（GTT）核酸互补的碱基序列的非荧光标记探针（突变型（GTT）诱饵核酸）（序列编号6）。表2显示了突变型（GTT）诱饵核酸的序列。在表2中，右栏显示序列编号，黑体的碱基是突变位点或与突变位点形成碱基对的碱基，添加了下划线的碱基是在形成分子内结构时彼此杂交的区域。此外，本实施例中使用的寡核苷酸是委托Sigma-Genosys株式会社合成的。
[表2]
具体而言，突变型（GTT）分子信标探针、分析对象的核酸分子、野生型（GGT）诱饵核酸分别在Tris缓冲液（10mM Tris-HCl、1mM EDTA、400mM NaCl、pH8.0）中溶解为100pM、100nM（野生型与突变型的总浓度）、500nM，配制成包含突变型（GTT）分子信标探针和野生型（GGT）诱饵核酸的样品溶液。此外，除了不添加分析对象的核酸分子以外，同样制备用于对照的样品溶液。
另一方面，野生型（GGT）分子信标探针、分析对象的核酸分子、突变型（GTT）诱饵核酸分别在上述Tris缓冲液中溶解为100pM、100nM（野生型与突变型的总浓度）、500nM，配制成包含野生型（GGT）分子信标探针和突变型（GTT）诱饵核酸的样品溶液。此外，除了不添加分析对象的核酸分子以外，同样制备用于对照的样品溶液。
按与参考例1相同的方式，分别使这些样品溶液的液温升高和降低，使样品溶液中的核酸分子变性后，形成结合体，进一步的，在与参考例1相同的条件下，分别计数该样品溶液中的、包含突变型（GTT）分子信标探针的结合体的分子数和包含野生型（GGT）分子信标探针的结合体的分子数。
图11中的纵轴显示包含突变型（GTT）分子信标探针的结合体的分子数（突变型（GTT）峰数）（图中的“峰数（GTT）”），横轴显示包含野生型（GGT）分子信标探针的结合体的分子数（野生型（GGT）峰数）（图中的“峰数（GGT）”），示出按照添加在样品溶液中的分析对象的核酸分子中的突变率分类的、所计数的峰数的值。其结果是，在不存在分析对象的核酸分子的对照样品溶液（图中的“N.C.”）中，突变型（GTT）峰数和野生型（GGT）峰数都非常少。另一方面，在GTT突变率0%的样品溶液（图中的“0%”）中，突变型（GTT）峰数与对照样品溶液几乎是相同的，而野生型（GGT）峰数则非常多。相反，在GTT突变率100%的样品溶液（图中的“100%”）中，野生型（GGT）峰数与对照样品溶液几乎是相同的，而突变型（GTT）峰数则非常多。与此相对，在GTT突变率50%的样品溶液（图中的“50%”）中，野生型（GGT）峰数和突变型（GTT）峰数都较多。藉此，根据野生型（GGT）峰数和突变型（GTT）峰数，可以彼此区别GTT突变率不同的3种样品溶液。根据上述结果可知，通过使用本发明的鉴别核酸分子多态性的方法鉴别基因突变，可以鉴别分析对象的核酸分子的突变率，特别是在分析单核苷酸多态性等时，可以容易地将分析对象的基因组DNA的基因型分型为野生型纯合子、杂合子或突变型纯合子。
［实施例2］
在本发明的鉴别核酸分子多态性的方法中，通过在同一样品溶液中进行步骤（a）和步骤（d），鉴别K-ras基因的密码子12＿GTT突变。
突变型（GTT）分子信标探针使用由与表1记载的突变型（GTT）分子信标探针相同的碱基序列（序列编号1）组成的寡核苷酸，在其5’末端连接ATTO（注册商标）647N，在3’末端连接BHQ-3。野生型（GGT）分子信标探针和分析对象的核酸分子使用实施例1中使用的分子。此外，使用记载在表3中的野生型（GGT）诱饵核酸（序列编号7）和突变型（GTT）诱饵核酸（序列编号8）。此外，本实施例中使用的寡核苷酸是委托Sigma-Genosys株式会社合成的。
[表3]
碱基序列
野生型(GGT)诱饵核酸 CCTACGCC ACC AGCTCCAACTA 7
突变型(GTT)诱饵核酸 CCTACGCC AAC AGCTCCAACTA 8
具体而言，突变型（GTT）分子信标探针、野生型（GGT）分子信标探针、分析对象的核酸分子、野生型（GGT）诱饵核酸和突变型（GTT）诱饵核酸分别在Tris缓冲液（10mM Tris-HCl、1mM EDTA、400mM NaCl、pH8.0）中溶解为100pM、100pM、100nM（野生型与突变型的总浓度）、500nM、500nM，配制成样品溶液。此外，除了不添加分析对象的核酸分子以外，同样制备用于对照的样品溶液。
按与参考例1相同的方式，使这些样品溶液的液温升高和降低，使样品溶液中的核酸分子变性后，形成结合体。通过扫描分子计数法计数降温处理后的样品溶液中的结合体的分子数。具体而言，为了激发用TAMRA标记的野生型（GGT）分子信标探针，激发光使用543nm的激光，以300μW照射；使用带通滤波器，以565～595nm作为检测光波长。为了激发用ATTO647N标记的突变型（GTT）分子信标探针，激发光使用633nm的激光，以300μW照射；使用带通滤波器，以650～690nm作为检测光波长。除此以外，在与实施例1相同的条件下，进行扫描分子计数法测量，解析。
图12中的纵轴显示包含突变型（GTT）分子信标探针的结合体的分子数（突变型（GTT）峰数）（图中的“峰数（GTT）”），横轴显示包含野生型（GGT）分子信标探针的结合体的分子数（野生型（GGT）峰数）（图中的“峰数（GGT）”），示出按照添加在样品溶液中的分析对象的核酸分子中的突变率分类的、所计数的峰数的值。其结果是，在不存在分析对象的核酸分子的对照样品溶液中，突变型（GTT）峰数和野生型（GGT）峰数都非常少。另一方面，在GTT突变率0%的样品溶液中，突变型（GTT）峰数与对照样品溶液几乎是相同的，而野生型（GGT）峰数则非常多。相反，在GTT突变率100%的样品溶液中，野生型（GGT）峰数与对照样品溶液几乎是相同的，而突变型（GTT）峰数则非常多。与此相对，在GTT突变率50%的样品溶液中，野生型（GGT）峰数和突变型（GTT）峰数都较多。藉此，在本实施例中，与实施例1的情况相同，根据野生型（GGT）峰数和突变型（GTT）峰数，可以彼此区别GTT突变率不同的3种样品溶液。根据上述结果可知，在本发明的鉴别核酸分子多态性的方法中，与在彼此独立的样品溶液中实施步骤（a）和步骤（d）的实施例1的情况相同，在同一样品溶液中实施步骤（a）和步骤（d）时，也可以按照突变率分析对象的核酸分子。
［实施例3］
作为第2核酸探针，使用具有不同于第1核酸探针的碱基序列、且不识别由分析对象的多态性序列组成的多态性位点的核酸探针，鉴别K-ras基因的密码子12＿GTT突变。
具体而言，第2核酸探针使用如下的共同分子信标探针：与K-ras基因中不含密码子12的区域、即野生型和突变型的共有区域的碱基序列（共同序列）（序列编号9）特异性杂交的寡核苷酸（序列编号10），且5’末端连接了ATTO（注册商标）647N，3’末端连接了BHQ-3。此外，使用由上述共同序列组成的寡核苷酸作为共同核酸。表4显示了共同分子信标探针和共同序列的碱基序列。在表4中，右栏显示序列编号。此外，共同分子信标探针中添加了下划线的碱基是在形成分子内结构时彼此杂交的区域。
[表4]
此外，第1核酸探针使用参考例1中使用的突变型（GTT）分子信标探针。此外，分析对象的核酸分子使用参考例1中使用的仅野生型（GGT）核酸（突变率：0%）、仅突变型（GTT）核酸（GTT突变率：100%）。进一步的，为了抑制非特异性杂交，使用参考例1中使用的野生型（GGT）诱饵核酸。此外，本实施例中使用的寡核苷酸是委托Sigma-Genosys株式会社合成的。
具体而言，突变型（GTT）分子信标探针、共同分子信标探针、野生型（GGT）核酸或突变型（GTT）核酸、共同核酸、野生型（GGT）诱饵核酸分别在Tris缓冲液（10mM Tris-HCl、1mM EDTA、400mM NaCl、pH8.0）中溶解为100pM、100pM、100nM、100nM、500nM，配制成样品溶液。此外，除了不添加野生型（GGT）核酸和突变型（GTT）核酸以外，同样制备用于对照的样品溶液。
按与参考例1相同的方式，使这些样品溶液的液温升高和降低，使样品溶液中的核酸分子变性后，形成结合体，进一步的，在与实施例2相同的条件下，分别计数该样品溶液中的、包含突变型（GTT）分子信标探针的结合体的分子数和包含野生型（GGT）分子信标探针的结合体的分子数。
图13显示按照添加在样品溶液中的分析对象的核酸分子中的GTT突变率分类的、所计数的峰数的值。图13A是包含突变型（GTT）分子信标探针的结合体的计数结果；图13B是包含共同分子信标探针的结合体的计数结果。在检测用543nm激发的TAMRA荧光的情况下，突变率0%（仅添加野生型（GGT）核酸）和突变率100%（仅添加突变型（GTT）核酸）的包含突变型（GTT）分子信标探针的结合体数的计数存在显著差异，可以鉴别二者。此外，在检测用633nm激发的ATTO647N荧光的情况下，突变率0%和突变率100%，与未添加分析对象的核酸分子的对照样品溶液（图中的“N.C.”）的结果相比，存在显著差异。
虽然在本实施例中，与野生型（GGT）核酸和突变型（GTT）核酸分开地向样品溶液中添加共同核酸，但当分析对象的核酸分子是基因组DNA或由基因组DNA通过PCR等扩增的DNA时，共同序列和多态性序列存在于同一单链核酸分子或该单链核酸分子的互补链上。因此，如本实施例所示，当以第2核酸探针作为与多态性核酸间共有的区域杂交的探针时，通过有无包含该第2核酸探针的结合体，可以确定样品溶液中是否存在包含分析对象的多态性序列的核酸分子。此外，通过包含第2核酸探针的结合体的检测量，可以修正基于PCR的扩增量波动的核酸分子的量，提高多态性的鉴别精度。
［参考例3］
使用一种核酸探针和荧光性嵌入剂，通过扫描分子计数法验证鉴别K-ras基因的密码子12＿GTT突变的可能性。
突变型（GTT）探针使用具有在5’末端连接了ROX的、表5记载的碱基序列（序列编号11）的核酸分子。在表5中，右栏显示序列编号，黑体的碱基是突变位点或与突变位点形成碱基对的碱基。此外，分析对象的核酸分子分别使用用于参考例1的野生型（GGT）核酸和突变型（GTT）核酸。
[表5]
碱基序列
突变型(GTT)探针 ROX-CCTACGCC AAC AGCTCCAACTAC 11
具体而言，突变型（GTT）探针、野生型（GGT）核酸或突变型（GTT）核酸、野生型（GGT）诱饵核酸分别在Tris缓冲液（10mM Tris-HCl、1mMEDTA、100mM NaCl、pH8.0）中溶解为100pM、100pM、1nM，配制成含有野生型（GGT）诱饵核酸的样品溶液。另一方面，除不添加野生型（GGT）诱饵核酸以外，同样制备不含野生型（GGT）诱饵核酸的样品溶液。
在94℃加热所制备的样品溶液5分钟，使其变性后，按0.1℃/秒降温，在68.8℃进行5分钟的恒温处理，使其形成结合体。
向这些浓缩样品溶液中分别添加用上述Tris缓冲液稀释PicoGreen（Molecular Probe公司生产）1000倍后的溶液，制备该浓缩样品溶液的10倍稀释液，作为上述样品溶液。
在添加PicoGreen稀释液后，将上述样品溶液放置30分钟以上。
之后，通过扫描分子计数法计数样品溶液中的结合体的分子数。具体而言，测量中使用具有共聚焦荧光显微镜的光学系统和光子计数系统的单分子荧光测量装置MF20（Olympus Corporation）作为光分析装置，获得上述各样品溶液的按照时间顺序的光子计数数据。此时，激发光使用488nm激光，旋转速度6000rpm，以100μW照射；使用带通滤波器，以560～620nm作为检测光波长。从雪崩光电二极管获得的信号的BIN TIME为10μ秒，测量时间为2秒。
用Savinzky-Golay算法将测量获得的按照时间顺序的数据平滑化以后，通过微分进行峰检测。从视为峰的区域中，提取可以拟合为高斯函数的区域作为信号。比较从添加了野生型（GGT）诱饵核酸的样品溶液和未添加野生型（GGT）诱饵核酸的样品中获得的峰数。
图14显示按照添加在样品溶液中的分析对象的核酸分子分类的、所计数的峰数的值。其结果是，在添加了突变型（GTT）核酸的样品溶液（图中的“GTT核酸”）中，不论是否添加了野生型（GGT）诱饵核酸，峰数几乎没有差异；但在添加了野生型（GGT）核酸的样品溶液（图中的“GGT核酸”）中，没有添加野生型（GGT）诱饵核酸的样品溶液的峰数显著多于添加了野生型（GGT）诱饵核酸的样品溶液的峰数。该结果被认为是由于野生型（GGT）诱饵核酸通过与野生型（GGT）核酸特异性结合，抑制突变型（GTT）探针与野生型（GGT）核酸的非特异性结合，从而促进序列特异性结合。即，根据上述结果可知，向样品溶液中添加具有如下碱基序列的核酸分子可以提高核酸探针的鉴别灵敏度，所述碱基序列为与多态性序列中的、核酸探针所特异性结合的类型以外的其他类型的碱基序列互补的碱基序列。
［实施例4］
使用参考例3中使用的突变型（GTT）探针、野生型（GGT）探针和荧光性嵌入剂，通过扫描分子计数法，鉴别K-ras基因的密码子12＿GTT突变。
野生型（GGT）探针使用在5’末端连接了ROX的、具有表6记载的碱基序列（序列编号12）的核酸分子。在表6中、右栏显示序列编号，黑体的碱基是突变（多态性）位点或与突变位点形成碱基对的碱基。此外，分析对象的核酸分子使用仅具有表1记载的碱基序列的野生型（GGT）核酸（序列编号2）（突变率：0%）、按9：1的摩尔比混合野生型（GGT）核酸和突变型（GTT）核酸（序列编号3）的混合物（突变率：10%）、按1：1的摩尔比混合野生型（GGT）核酸和突变型（GTT）核酸（序列编号3）的混合物（突变率：50%）和仅突变型（GTT）核酸（突变率：100%）。进一步的，为了抑制非特异性杂交，使用实施例1中使用的突变型（GTT）诱饵核酸。
[表6]
碱基序列
野生型(GGT)探针 ROX-CCTACGCC ACCAGCTCCAACTAC    12
具体而言，突变型（GTT）探针、分析对象的核酸分子、野生型（GGT）诱饵核酸分别在Tris缓冲液（10mM Tris-HCl、1mM EDTA、100mMNaCl、pH8.0）中溶解为100pM、100pM、1nM，配制成含有突变型（GTT）探针和野生型（GGT）诱饵核酸的样品溶液。另一方面，野生型（GGT）探针、分析对象的核酸分子、突变型（GTT）诱饵核酸分别在上述Tris缓冲液中溶解为100pM、100pM、1nM，配制成含有野生型（GGT）探针和突变型（GTT）诱饵核酸的样品溶液。
在94℃加热所制备的样品溶液5分钟，使其变性后，按0.1℃/秒降温，在68.8℃进行5分钟的恒温处理，使其形成结合体。
向这些浓缩样品溶液中分别添加用上述Tris缓冲液稀释PicoGreen（Molecular Probe公司生产）1000倍后的溶液，制备该浓缩样品溶液的10倍稀释液，作为上述样品溶液。
在添加PicoGreen稀释液后，将上述样品溶液放置30分钟以上。
对于上述样品溶液，按与参考例3相同的条件，计数该样品溶液中的包含突变型（GTT）探针的结合体或包含野生型（GGT）探针的结合体的分子数。图15显示按照添加在样品溶液中的分析对象的核酸分子的突变率分类的、包含突变型（GTT）探针的结合体数的所计数的峰数的值（图中的“GTT探针”）和包含野生型（GGT）探针的结合体数的所计数的峰数的值（图中的“GGT探针”）。其结果是，在含有突变型（GTT）探针和野生型（GGT）诱饵核酸的样品溶液中，突变率越高（即，样品溶液中的突变型（GTT）核酸浓度越高），所获得的峰数就越多，可知包含突变型（GTT）探针的结合体的数量增多。同样地，在含有野生型（GGT）探针和突变型（GTT）诱饵核酸的样品溶液中，突变率越低（即，样品溶液中的野生型（GGT）核酸浓度越高），所获得的峰数就越多，可知包含野生型（GGT）探针的结合体的数量增多。根据上述结果可知，通过本发明的鉴别核酸分子多态性的方法，即使是仅一个碱基不同的非常相似的核酸分子，也可以鉴别多态性。
［参考例4］
研究当利用核酸探针和荧光性嵌入剂，通过扫描分子计数法计数包含该核酸探针的结合体时，结合体中的双链结构的碱基对长度所产生的影响。
首先，以质粒pUC19（TAKARA BIO INC.生产）为模板，使用5’末端被Rox修饰过的寡核苷酸、未标记的寡核苷酸和AmpliTaq Gold（AppliedBiosystems公司生产），制备100bp、200bp、400bp、800bp和1.5kbp链长度不同的PCR产物。从这些PCR产物中，使用Wizard V Gel and PCRClean-Up System(Promega公司生产)去除引物，使用Bioanalyzer（Agilent公司生产），通过电泳测量PCR产物的有无和浓度。这些PCR产物（荧光标记）是5’末端被Rox标记过的单链核酸分子与未标记的单链核酸分子的结合体。
除了使用5’末端未经修饰的寡核苷酸代替上述使用的5’末端被Rox修饰过的寡核苷酸以外，按与上述相同的方法获得PCR产物（非标记）、即未标记的单链核酸分子同类之间的结合体。
之后，使用Tris缓冲液（10mM Tris-HCl、1mM EDTA、100mM NaCl、pH8.0），将各PCR产物配制成100pM。将该制备好的PCR产物的溶液按任意浓度加入到用上述Tris缓冲液稀释10000倍的PicoGreen（invitrogen公司生产)溶液中，作为样品溶液。
在添加PicoGreen稀释液后，将这些样品溶液放置30分钟以上。
之后，按与参考例3相同的条件，通过扫描分子计数法计数样品溶液中的PCR产物的分子数。其结果是，根据PCR产物的链长度，从被荧光标记的PCR产物中测量的峰数与从未标记的PCR产物中测量的峰数之间形成了差异。伴随PCR产物的链长度增长，所获得的峰数差也变小。其结果是，链长度越长，嵌入剂的脉冲强度越强，即使在比原始嵌入剂的荧光波长更长的波长区域，也形成了非特异性信号的峰。反而言之，链长度短的一方非特异性信号变少。根据上述结果，发现在大约400bp左右的链长度以下，可以实现充分的降低非特异信号。
产业上的可利用性
通过本发明的鉴别核酸分子多态性的方法，可以使用被荧光标记的核酸探针，鉴别样品溶液中仅存在非常低浓度的多态性核酸，并通过扫描分子计数法进行计数，因此，可用于鉴别基因多态性或体细胞突变等临床检查等领域。
附图标记说明
1…光分析装置（共聚焦显微镜）
2…光源
3…单模光纤
4…准直仪透镜
5…分色镜
6、7、11…反射镜
8…物镜
9…微孔板
10…孔（样品溶液容器）
12…聚光镜
13…小孔
14…二次滤片
15…多模光纤
16…光检测器
17…镜转向器
17a…平台位置变化装置
18…计算机

Claims (18)

1.一种鉴别核酸分子多态性的方法，其特征在于，其具有以下步骤：
(a)制备包含第一核酸探针和分析对象的核酸分子的样品溶液的步骤，所述第一核酸探针被荧光物质标记、且与具有多态性序列中的第一型的碱基序列的单链核酸分子特异性杂交，
(b)使所述步骤(a)中制备的样品溶液中的核酸分子结合的步骤，
(c)在所述步骤(b)之后，如下计算所述步骤(a)中制备的样品溶液中的、包含第一核酸探针的结合体的分子数的步骤，
使用共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统，在所述样品溶液内部移动所述光学系统的光检测区域的位置的步骤，
一边在所述样品溶液内部移动所述光学系统的光检测区域的位置，一边检测该光检测区域中的由所述结合体发出的荧光、获得按照时间顺序的光强度数据的步骤，
根据检测到的所述按照时间顺序的光强度数据，逐个检测来自一个结合体的光中具有预想曲线的光强度的时间变化作为一个结合体的光信号而逐个检测所述结合体的步骤，
计数所述逐个检测的结合体的数量，并计数在所述光检测区域的位置移动中检测到的所述分析对象的核酸分子的数量的步骤，
(d)制备包含第二核酸探针和所述分析对象的核酸分子的样品溶液的步骤，所述第二核酸探针被荧光物质标记、且与所述第一核酸探针的碱基序列不同，
(e)使所述步骤(d)中制备的样品溶液中的核酸分子结合的步骤，
(f)在所述步骤(e)之后，如下计算所述步骤(d)中制备的样品溶液中的、包含第二核酸探针的结合体的分子数的步骤，
使用共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统，在所述样品溶液内部移动所述光学系统的光检测区域的位置的步骤，
一边在所述样品溶液内部移动所述光学系统的光检测区域的位置，一边检测该光检测区域中的由所述结合体发出的荧光、获得按照时间顺序的光强度数据的步骤，
根据检测到的所述按照时间顺序的光强度数据，逐个检测来自一个结合体的光中具有预想曲线的光强度的时间变化作为一个结合体的光信号而逐个检测所述结合体的步骤，
计数所述逐个检测的结合体的数量，并计数在所述光检测区域的位置移动中检测到的所述分析对象的核酸分子的数量的步骤，
(g)根据所述步骤(c)和(f)的结果，鉴别所述分析对象的核酸分子的多态性的步骤。
2.根据权利要求1所述的鉴别核酸分子多态性的方法，其特征在于，在移动所述光检测区域的位置的步骤中，以规定速度移动所述光检测区域的位置。
3.根据权利要求1所述的鉴别核酸分子多态性的方法，其特征在于，在移动所述光检测区域的位置的步骤中，以比所述结合体的扩散移动速度更快的速度移动所述光检测区域的位置。
4.根据权利要求1所述的鉴别核酸分子多态性的方法，其特征在于，所述样品溶液包含选自由表面活性剂、甲酰胺、二甲亚砜和尿素组成的组中的一种以上。
5.根据权利要求1所述的鉴别核酸分子多态性的方法，其特征在于，所述第一核酸探针和所述第二核酸探针中的至少一种是作为能量供体的荧光物质与作为能量受体的物质按照在单独存在的状态下发生荧光共振能量转移、且在与其他单链核酸分子形成结合体的状态下不发生荧光共振能量转移的方式结合而成的，
从包含该核酸探针的结合体发出的荧光是从作为所述能量供体的荧光物质发出的荧光。
6.根据权利要求1所述的鉴别核酸分子多态性的方法，其特征在于，在所述步骤(a)中，所述样品溶液中还含有荧光性双链核酸结合物质，
标记了所述第一核酸探针的荧光物质和所述荧光性双链核酸结合物质中的任一种为作为荧光共振能量转移现象中的能量供体的荧光物质，另一种为作为所述荧光共振能量转移现象中的能量受体的物质，
在所述步骤(c)中，从包含所述第一核酸探针的结合体发出的荧光是由于在标记了所述第一核酸探针的荧光物质与所述荧光性双链核酸结合物质之间发生的荧光共振能量转移现象而发出的荧光。
7.根据权利要求1所述的鉴别核酸分子多态性的方法，其特征在于，在所述步骤(d)中，所述样品溶液中还含有荧光性双链核酸结合物质，
标记了所述第二核酸探针的荧光物质和所述荧光性双链核酸结合物质中的任一种为作为荧光共振能量转移现象中的能量供体的荧光物质，另一种为作为所述荧光共振能量转移现象中的能量受体的物质，
在所述步骤(f)中，从包含所述第二核酸探针的结合体发出的荧光是由于在标记了所述第二核酸探针的荧光物质与所述荧光性双链核酸结合物质之间发生的荧光共振能量转移现象而发出的荧光。
8.根据权利要求1所述的鉴别核酸分子多态性的方法，其特征在于，从包含第一核酸探针的结合体发出的光与包含第二核酸探针的结合体发出的光相互之间的光学特性不同。
9.根据权利要求1所述的鉴别核酸分子多态性的方法，其特征在于，在所述步骤(a)中，向所述样品溶液中添加核酸分子，所述核酸分子具有与所述多态性序列中除所述第一型以外的型的碱基序列互补的碱基序列。
10.根据权利要求1所述的鉴别核酸分子多态性的方法，其特征在于，所述第二核酸探针与具有所述多态性序列中的第二型的碱基序列的单链核酸分子特异性杂交。
11.根据权利要求10所述的鉴别核酸分子多态性的方法，其特征在于，在所述步骤(d)中，向所述样品溶液中添加核酸分子，所述核酸分子具有与所述多态性序列中除所述第二型以外的型的碱基序列互补的碱基序列。
12.根据权利要求1所述的鉴别核酸分子多态性的方法，其特征在于，在同一样品溶液中进行所述步骤(a)和(d)。
13.根据权利要求1所述的鉴别核酸分子多态性的方法，其特征在于，所述第二核酸探针与具有所述多态性序列中的第二型的碱基序列的单链核酸分子特异性杂交，
在同一样品溶液中进行所述步骤(a)和(d)，
向所述样品溶液中添加：具有与所述第一型的碱基序列互补的碱基序列的核酸分子，和具有与所述第二型的碱基序列互补的碱基序列的核酸分子。
14.根据权利要求1所述的鉴别核酸分子多态性的方法，其特征在于，所述第二核酸探针与包含所述第一型的碱基序列的单链核酸分子、或具有与所述单链核酸分子互补的碱基序列的单链核酸分子特异性杂交，
在同一样品溶液中进行所述步骤(a)和(d)。
15.权利要求1所述的鉴别核酸分子多态性的方法，其特征在于，所述步骤(b)或(e)是如下进行的：通过将所述步骤(a)或(d)中制备的样品溶液的温度升至70℃以上而使该样品溶液中的核酸分子变性后，按0.05℃/秒以上的降温速度降低该样品溶液的液温，由此使该样品溶液中的核酸分子结合。
16.根据权利要求1所述的鉴别核酸分子多态性的方法，其特征在于，所述第一核酸探针和所述第二核酸探针是由选自由DNA、RNA和核酸类似物组成的组中的2种以上的分子结合形成的。
17.根据权利要求1所述的鉴别核酸分子多态性的方法，其特征在于，所述多态性序列是包含基因多态性的多态性位点的碱基序列、或包含体细胞突变的突变位点的碱基序列。
18.根据权利要求17所述的鉴别核酸分子多态性的方法，其特征在于，所述体细胞突变是K-ras基因的突变。
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