JP2010178716A - 標的核酸分子の定量方法及び標的核酸分子定量キット - Google Patents

Abstract

【課題】試料中に存在する核酸分子を、高感度に精度良く定量する方法の提供。
【解決手段】（ａ）核酸含有試料、第１マーカーが結合された標的核酸分子と相補的な塩基配列を有する第１核酸分子プローブ、及び第２マーカーが結合された第１核酸分子プローブと相補的な塩基配列を有する第２核酸分子プローブを添加した試料溶液を調製する工程と、（ｂ）工程（ａ）において調製された試料溶液中の核酸分子を変性させた後、会合させる工程と、（ｃ）工程（ｂ）の後、前記試料溶液中の第１マーカー又は第２マーカーの光学的特性の時間変化を検出することにより、前記標的核酸分子を定量する工程とを有し、第１マーカーと第２マーカーの少なくともいずれか一方が、第１核酸分子プローブと第２核酸分子プローブとが会合している場合と会合していない場合とにおいて、光学的特性が変化する物質である、核酸含有試料中の標的核酸分子の定量方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＦＲＥＴ）を利用して、核酸含有試料中の標的核酸分子を定量する方法に関する。

試料中に存在する核酸分子の高感度定量方法としては、ポリメラーゼによる酵素反応により標的核酸分子を増幅することにより、又は得られた増幅産物を分解することにより蛍光シグナルを得る方法、いわゆる定量的ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を利用した方法が知られている。定量的ＰＣＲ法を利用した方法は幾つかあるが、中でも、標的核酸分子に対してＦＲＥＴを利用したプローブを用いる、いわゆるＴａｑｍａｎ法が広く行われている。例えば、マイクロＲＮＡ（例えば、非特許文献１参照。）やＲＮＡ干渉に用いられるｓｉＲＮＡ等のように２２ｍｅｒ程度の短いＲＮＡ分子を定量する方法としても、ＦＲＥＴプローブを用いた定量的ＰＣＲが開発されている（例えば、非特許文献２参照。）。

ＦＲＥＴプローブを用いた核酸検出方法の１つとして、例えば、蛍光共鳴エネルギーのドナーである蛍光物質が結合したドナープローブと、アクセプターである消光物質が結合したアクセプタープローブとを、標的核酸分子の隣接する２領域にそれぞれ会合（ハイブリダイズ）させ、生じるＦＲＥＴを検出することにより、標的核酸分子を検出する方法が開示されている（例えば、特許文献１〜３参照。）。また、蛍光物質と消光物質の両物質を結合させたプローブを、標的核酸分子と会合させた後、２本鎖ＤＮＡ特異的なヌクレアーゼにより分解し、この結果生じた蛍光を検出する方法も開示されている（例えば、特許文献４参照。）。５’末端側と３’末端側が互いに相補的な塩基配列を有しており、かつ両末端が蛍光物質と消光物質を用いてそれぞれラベルされている１本鎖核酸を用いる、いわゆる分子トーチによる方法も開示されている（例えば、特許文献５参照。）。この方法では、当該１本鎖核酸は、単独で存在している場合には、両末端が会合して分子内ループを形成しているため消光状態であるが、標的核酸分子とハイブリダイズすることにより、分子内ループが解消されて蛍光を発する。

その他、互いに塩基配列が相違する核酸分子を識別して検出する方法として、参照となる２本鎖ＤＮＡβと検出対象となる２本鎖ＤＮＡβｘとを用意し、参照となる２本鎖ＤＮＡの第１のマーカーとして蛍光物質を付与し、第２のマーカーとして第１のマーカーの第２のマーカーの間でエネルギー移動が生じ、新たなピーク波長の蛍光を得るようにすることにより、検出ＤＮＡβｘと参照ＤＮＡβとの塩基の相違を検出する方法が開示されている（例えば、特許文献６参照。）。

特許第４００８９９６号公報

国際公開第９８／１３５２４号パンフレット

特許第３１８８３０３号公報

国際公開第０３／０３５８６４号パンフレット

特表２００２−５１９０７３号公報

特開２００２−１７１９７４号公報

アルバーツ（Alberts）、外１名、モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・セル第５版（Molecular Biology of the Cell, 5th edition）、Garland Science社、２００８年、第４９３〜４９５ページ。ヌクレイック・アシッズ・リサーチ

チェン（Chen）、外１２名、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research）、２００５年、第３３巻第２０号、ｅ１７９ページ。

従来の定量的ＰＣＲ法においては、ポリメラーゼによる増幅特性は、増幅対象である核酸の塩基配列の種類ごとに異なるため、標的核酸分子の濃度を定量的に測定するためには、標的核酸分子ごとに検量線を作成する必要があり、検出に要する工程が増え、煩雑であるという問題がある。一方、ＦＲＥＴプローブを用いた方法においては、ＦＲＥＴにより生じる蛍光を検出することにより、標的核酸分子を検出することができるが、蛍光分子の組み合わせによっては完全に消光されない等により、検出される蛍光には一定の蛍光強度のバックグラウンドがあり、このため、特に標的核酸分子が低濃度の場合に定量性に劣るという問題がある。

本発明は、試料中に存在する核酸分子を、高感度に、かつ精度良く定量し得る方法を提供することを目的とする。

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ＦＲＥＴプローブを用いて標的核酸分子を定量する方法において、ＦＲＥＴによるエネルギー移動の蛍光強度解析を、一分子ごとに検出し、解析することにより、試料中の標的核酸分子を直接的に定量解析し得ることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、
（１）核酸含有試料中の標的核酸分子を定量する方法であって、（ａ）核酸含有試料、第１マーカーが結合された第１核酸分子プローブ、及び第２マーカーが結合された第２核酸分子プローブを添加した試料溶液を調製する工程と、（ｂ）前記工程（ａ）において調製された試料溶液中の核酸分子を変性させた後、会合させる工程と、（ｃ）前記工程（ｂ）の後、前記試料溶液中の第１マーカー又は第２マーカーの光学的特性の時間変化を検出することにより、前記標的核酸分子を定量する工程と、を有し、前記第１核酸分子プローブは、前記標的核酸分子と相補的な塩基配列を有しており、前記第２核酸分子プローブは、前記第１核酸分子プローブと相補的な塩基配列を有しており、前記第１マーカーと前記第２マーカーの少なくともいずれか一方が、前記第１核酸分子プローブと前記第２核酸分子プローブとが会合している場合と会合していない場合とにおいて、光学的特性が変化する物質であることを特徴とする、標的核酸分子の定量方法、
（２） 前記第１マーカーと前記第２マーカーの少なくともいずれか一方が蛍光色素であり、前記光学的特性の検出を、前記第１マーカー又は第２マーカーの発する蛍光強度の時間変化を検出することにより行うことを特徴とする前記（１）記載の標的核酸分子の定量方法、
（３） 共焦点光学系における焦点領域に存在している分子の蛍光強度変化を検出した後、統計解析を行い、前記標的核酸分子と会合している第１核酸分子プローブ又は第２核酸分子プローブの分子数を算出することにより、前記標的核酸分子を定量することを特徴とする前記（２）記載の標的核酸分子の定量方法、
（４） 共焦点光学系における焦点領域に存在している分子の蛍光強度の揺らぎを検出した後、統計解析を行い、前記標的核酸分子と会合している第１核酸分子プローブ又は第２核酸分子プローブの分子数を算出することにより、前記標的核酸分子を定量することを特徴とする前記（２）記載の標的核酸分子の定量方法、
（５） 蛍光強度の揺らぎの解析を、自己相関解析により行うことを特徴とする前記（４）記載の標的核酸分子の定量方法、
（６） 前記第１マーカーが蛍光物質であり、前記第２マーカーが前記蛍光物質から発される蛍光を消光する消光物質であることを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれか記載の標的核酸分子の定量方法、
（７） 前記第２マーカーが蛍光物質であり、前記第１マーカーが前記蛍光物質から発される蛍光を消光する消光物質であることを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれか記載の標的核酸分子の定量方法、
（８） 前記第１マーカー及び前記第２マーカーが蛍光色素であることを特徴とする請求項２〜７のいずれか記載の標的核酸分子の定量方法、
（９） 前記標的核酸分子がマイクロＲＮＡであることを特徴とする前記（１）〜（８）のいずれか記載の標的核酸分子の定量方法、
（１０） 前記標的核酸分子がｓｉＲＮＡであることを特徴とする前記（１）〜（８）のいずれか記載の標的核酸分子の定量方法、
（１１） 核酸含有試料中の標的核酸分子を定量するために用いられるキットであって、
標的核酸分子と相補的な塩基配列を有しており、かつ、第１マーカーが結合された第１核酸分子プローブと、前記第１核酸分子プローブと相補的な塩基配列を有しており、かつ、第２マーカーが結合された第２核酸分子プローブとを有しており、前記第１マーカーと前記第２マーカーの少なくともいずれか一方が、前記第１核酸分子プローブと前記第２核酸分子プローブとが会合している場合と会合していない場合とにおいて、光学的特性が変化する分子であることを特徴とする、標的核酸分子定量キット、
を提供するものである。

本発明の標的核酸分子の定量方法を用いることにより、第１マーカーが結合されたプローブと、当該第１マーカーと近接することにより光学的特性が変化する第２マーカーが結合されたプローブとを用いたＦＲＥＴを利用し、試料中の一分子ごとに、ＦＲＥＴによるエネルギー移動の蛍光強度解析を行うことにより、標的核酸分子を直接的に定量することができる。このため、本発明の標的核酸分子の定量方法を用いることにより、標的核酸分子の塩基配列の特性や核酸含有試料中の濃度等の条件を考慮することなく、精度よく標的核酸分子を定量することができる。

第１マーカーとして蛍光色素を、第２マーカーとしてダーククエンチャーを用いた場合の本発明の標的核酸分子の定量方法の一態様を示した図である。 第１マーカー及び第２マーカーとして蛍光色素を用いた場合の本発明の標的核酸分子の定量方法の一態様を示した図である。 実施例１において、ＦＩＤＡ解析の結果を示した図である。 実施例２において、ＦＣＳ解析の結果を示した図である。

本発明の標的核酸分子の定量方法は、核酸含有試料中の標的核酸分子を定量する方法であって、ＦＲＥＴによるエネルギー移動の蛍光強度解析を一分子ごとに検出し、解析することを特徴とする。具体的には、標的核酸分子と相補的な塩基配列を有している第１核酸分子プローブと、第１核酸分子プローブと相補的な塩基配列を有している第２核酸分子プローブとを用いる方法であって、第１核酸分子プローブに対して、標的核酸分子と第２核酸分子プローブとを競合的に会合させ、標的核酸分子と第１核酸分子プローブとの会合体を精度よく検出することにより、標的核酸分子を定量する。

標的核酸分子と第１核酸分子プローブとの会合体は、第１核酸分子プローブに結合させた第１マーカーと第２核酸分子プローブに結合させた第２マーカーとの間に生じるＦＲＥＴを利用して検出する。第２核酸分子プローブに結合させた第２マーカーは、第１核酸分子プローブに結合させた第１マーカーと近接することにより光学的特性が変化する物質とする。具体的は、本発明における第１マーカー及び第２マーカーとしては、第１マーカーと第２マーカーの少なくともいずれか一方が、第１核酸分子プローブと第２核酸分子プローブとが会合している場合と、第１核酸分子プローブと第２核酸分子プローブとが会合していない場合とにおいて、光学的特性が変化する物質であることを要する。

ここで、「物質の光学的特性が変化する」とは、当該物質から発される蛍光の波長や強度が変化することを意味する。また、本発明において、「マーカーの光学的特性を検出する」とは、当該マーカーから発される特定の波長の蛍光シグナルを検出することを意味する。当該蛍光シグナルとしては、蛍光強度や蛍光偏光等がある。本発明においては、蛍光強度であることが好ましい。

つまり、第１マーカーが結合された第１核酸分子プローブと第２マーカーが結合された第２核酸分子プローブとが会合した場合には、当該第１マーカーと第２マーカーとの間でＦＲＥＴによるエネルギー移動が生じる。一方、両者が会合せず、解離している場合には、当該第１マーカーと第２マーカーとの間でＦＲＥＴは生じない。このため、第１核酸分子プローブと第２核酸分子プローブとが会合している場合と、会合していない場合とでは、第１マーカーと第２マーカーの少なくとも一方の光学的特性は異なる。ここで、第１核酸分子プローブと第２核酸分子プローブと標的核酸分子とが存在している試料溶液中においては、第２核酸分子プローブと会合していない第１核酸分子プローブは、標的核酸分子と会合すると考えられることから、第１マーカー又は第２マーカーの光学的特性の時間変化を検出することにより、標的核酸分子を検出することができる。

本発明において、第１マーカー及び第２マーカーは、十分に近接した場合に、すなわち、第１核酸分子プローブと第２マーカーとが会合した場合にＦＲＥＴが生じる物質同士の組み合わせであればよく、ＦＲＥＴにおいて一般的に用いられている物質の中から、適宜選択して用いることができる。例えば、第１マーカー及び第２マーカーの両方が蛍光色素であってもよく、いずれか一方が蛍光色素であり、他方が当該蛍光色素から受け取ったエネルギーを熱エネルギーとして放出する物質（いわゆる、ダーククエンチャー）であってもよい。

また、本発明の標的核酸分子の定量方法においては、第１マーカーと第２マーカーのいずれが蛍光物質であってもよい。すなわち、第１マーカーが蛍光物質であり、第２マーカーが当該蛍光物質から発される蛍光を消光する消光物質であってもよく、第２マーカーが蛍光物質であり、第１マーカーが当該蛍光物質から発される蛍光を消光する消光物質であってもよい。

なお、本発明及び本願明細書において、「蛍光色素」とは、蛍光を発する性質を有する色素を意味する。一方、「蛍光物質」とは、ＦＲＥＴにおいてドナーとなる物質を意味し、［消光物質］とは、アクセプターとなる物質を意味する。

また、第１核酸分子プローブ及び第２核酸分子プローブは、標的核酸分子の塩基配列情報に基づいて、塩基配列を設計し、合成した核酸プローブに、マーカーを結合させることにより作製されるが、核酸分子プローブの設計や合成、核酸分子プローブとマーカーとの結合反応は、常法により行うことができる。

本発明の標的核酸分子の定量方法は、具体的には、下記工程（ａ）〜（ｃ）を有する。
（ａ）核酸含有試料、第１マーカーと結合した第１核酸分子プローブ、及び第２マーカーと結合した第２核酸分子プローブを添加した試料溶液を調製する工程。
（ｂ）前記工程（ａ）において調製された試料溶液中の核酸分子を変性させた後、会合させる工程。
（ｃ）前記工程（ｂ）の後、前記試料溶液中の第１マーカー又は第２マーカーの光学的特性の時間変化を検出することにより、前記標的核酸分子を定量する工程。

本発明において標的核酸分子とは、検出及び定量の標的である特定の塩基配列を有する核酸分子を意味する。当該標的核酸分子としては、第１核酸分子プローブ等の設計が可能な程度に塩基配列が明らかになっているものであれば、特に限定されるものではない。例えば、動物や植物の染色体や、細菌やウィルスの遺伝子に存在する塩基配列を有する核酸分子であってもよく、人工的に設計された塩基配列を有する核酸分子であってもよい。なお、本発明において、標的核酸分子としては、２本鎖核酸であってもよく、１本鎖核酸であってもよい。また、ＤＮＡとＲＮＡのいずれであってもよい。該標的核酸分子として、例えば、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＰＣＲ増幅等による合成ＤＮＡ、ＲＮＡから逆転写酵素を用いて合成されたｃＤＮＡ等がある。本発明の標的核酸分子の定量方法としては、マイクロＲＮＡやｓｉＲＮＡであることが好ましい。なお、本発明において、標的核酸分子の長さは特に限定されるものではないが、１０塩基以上であることが好ましく、１０〜５００塩基程度であることがより好ましく、１０〜５０塩基程度であることがさらに好ましい。中でも、１０〜３０塩基程度の長さのマイクロＲＮＡやｓｉＲＮＡであることが特に好ましい。

また、本発明において核酸含有試料とは、核酸分子を含有する試料であれば、特に限定されるものではない。該核酸含有試料として、例えば、動物等から採取した生体試料、培養細胞等から調製された試料、核酸合成反応後の反応溶液等が挙げられる。生体試料等そのものであってもよく、生体試料等から抽出・精製した核酸溶液でもよい。

まず、工程（ａ）として、核酸含有試料、第１核酸分子プローブ、及び第２核酸分子プローブを、適当な溶媒に添加して、試料溶液を調製する。該溶媒は、第１マーカー又は第２マーカーから発される蛍光の検出、及び、両マーカー間で生じるＦＲＥＴを阻害しない溶媒であれば、特に限定されるものではなく、当該技術分野において一般的に用いられているバッファーの中から、適宜選択して用いることができる。該バッファーとして、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）等のリン酸バッファーやトリスバッファー等がある。

一般的に、工程（ａ）における試料溶液の調製を、第１核酸分子プローブと第２核酸分子プローブのＴｍ値以下の温度で行った場合には、両プローブは会合し、２本鎖核酸の状態で存在している。このため、第１マーカーを蛍光物質、第２マーカーを消光物質とした場合には、第１マーカーと第２マーカーとの間に生じるＦＲＥＴにより、第１マーカーから発される蛍光は消光されており、検出されないか、もしくは減弱している。

次に、工程（ｂ）として、調製された試料溶液中の核酸分子を変性させた後、会合させる。本発明において、「核酸分子を変性させる」とは、２本鎖核酸を１本鎖核酸とすることを意味する。具体的には、当該試料溶液を、高温処理（例えば９０℃以上）をすることにより、当該試料溶液中の核酸分子を変性することができる。変性させることにより、試料溶液中の各核酸分子プローブを、解離した１本鎖の状態とする。また、標的核酸分子が２本鎖核酸の場合には、同様に１本鎖核酸となる。

高温処理後、当該試料溶液の温度を低下させることにより、当該試料溶液中の核酸分子を適宜会合させることができる。好ましくは、試料溶液の温度を第１核酸分子プローブのＴｍ値以下の温度程度まで低下させる。これにより、第１核酸分子プローブを会合させるが、このとき、第１核酸分子プローブは、第２核酸分子プローブと標的核酸分子のいずれとも会合し得るため、核酸含有試料中に標的核酸分子が存在していた場合には、工程（ｂ）後の試料溶液中には、第１核酸分子プローブと標的核酸分子との会合体と、第１核酸分子プローブと第２核酸分子プローブとの会合体とが存在する。

さらに、工程（ｃ）として、当該記試料溶液中の第１マーカー又は第２マーカーの光学的特性の時間変化を検出することにより、標的核酸分子を定量することができる。例えば、第２核酸分子プローブと会合した第１核酸分子プローブは消光状態となるが、標的核酸分子と会合した第１核酸分子プローブでは、近傍に消光物質が存在しないため、蛍光エネルギー移動による消光状態にならず、第１マーカーから発される蛍光が検出される。したがって、第１マーカーの分光特性に最適な波長の光を照射し、第１マーカーから発される蛍光の蛍光強度の揺らぎ（時間変化）を測定することにより、当該記試料溶液中の第１マーカーが、標的核酸分子と会合している分子か、第２核酸分子プローブ会合している分子かを、分子ごとに検出することができ、標的核酸分子を定量することができる。

なお、工程（ｃ）において、試料溶液中の第１マーカー又は第２マーカーの光学的特性の時間変化の検出方法は、溶液中の分子の蛍光シグナルの時間変化（揺らぎ）を検出し解析し得る方法であれば、特に限定されるものではない。例えば、共焦点光学系における焦点領域に存在している分子の蛍光シグナルを検出し、解析することにより、溶液中の分子の蛍光シグナルの時間変化を測定・解析することができる。該方法として、例えば、蛍光強度分布解析法（Ｆｌｕｏｒｅｃｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ， ＦＩＤＡ）、蛍光相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，ＦＣＳ）、蛍光相互相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｒｏｓｓ−Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，ＦＣＣＳ）、蛍光偏光解析法（ＦＩＤＡ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ，ＦＩＤＡ−ＰＯ）等がある。なお、このような分子の蛍光シグナルの時間変化の検出及び解析は、例えば、ＭＦ２０（オリンパス社製）等の公知の一分子蛍光分析システム等を用いて行うことができる。

本発明の標的核酸分子の定量方法においては、ＦＲＥＴにより生じる光学的特性の変化を検出していることから、各マーカーの光学的特性の時間変化を検出し解析する方法として、蛍光強度を解析するＦＩＤＡ、ＦＣＳ、ＦＣＣＳを行うことが好ましく、ＦＩＤＡ又はＦＣＳを行うことがより好ましく、ＦＩＤＡを行うことがさらに好ましい。

また、これらの一分子蛍光分析法では、試料溶液中の分子ごとの蛍光シグナルを検出し、統計解析を行うことにより、ＦＲＥＴが生じている核酸分子プローブと、ＦＲＥＴが生じていない核酸分子プローブとを識別することができる。ここで、ＦＲＥＴが生じていない第１核酸分子プローブの数が、標的核酸分子と会合している第１核酸分子プローブの数と理論的に等しくなるため、直接的に標的核酸分子数を計測することができる。

例えば、ＦＩＤＡにより、共焦点光学系における焦点領域に存在している分子の蛍光強度の揺らぎを検出した後、統計解析を行うことによって、標的核酸分子と会合している第１核酸分子プローブの分子数を算出することにより、標的核酸分子を定量することができる。また、標的核酸分子が２本鎖核酸であった場合には、標的核酸分子から解離した２本鎖のうちの１本は第１核酸分子プローブと会合し、他方は第２核酸分子プローブと会合する。このため、標的核酸分子と会合している第２核酸分子プローブの分子数を算出することによっても、標的核酸分子を定量することができる。

同様に、共焦点光学系における焦点領域に存在している分子の蛍光強度の揺らぎを、自己相関解析（ＦＣＳ）又は相互相関解析（ＦＣＣＳ）によって検出した後、統計解析を行い、標的核酸分子と会合している第１核酸分子プローブ又は第２核酸分子プローブの分子数を算出することによっても、標的核酸分子を定量することができる。なお、ＦＣＳやＦＣＣＳの場合には、消光物質としてダーククエンチャーを用いることにより、より精度よく標的核酸分子を定量することができる。

このように、本発明の標的核酸分子の定量方法は、いわゆる、ＦＲＥＴによるエネルギー移動による蛍光強度等の光学的特性の時間変化を、ＦＩＤＡやＦＣＳ等の一分子蛍光分析法を用いて、個々の分子に対して検出し解析することにより、標的核酸分子と核酸分子プローブとの会合を、直接的かつ精度よく検出する方法であり、標的核酸分子の濃度を定量することができる。

図１は、第１マーカーとして蛍光色素を、第２マーカーとしてダーククエンチャーを用いた場合の本発明の標的核酸分子の定量方法の一態様を示した図である。図１（Ａ）は、試料溶液調製前、すなわち、標的核酸分子Ｔａｒｇｅｔ ＮＡ（Ｔａｒｇｅｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ）（３）と混合される前の第１マーカーである蛍光色素ＴＡＭＲＡ（１ａ）を結合させた第１核酸分子プローブ（１）と、ＴＡＭＲＡの消光物質である第２マーカーＢＨＱ−２（２ａ）を結合させた第２核酸分子プローブ（２）とが会合した状態を示したものである。一方、図１（Ｂ）は、これらの核酸分子プローブに対して、標的核酸分子（Ｔａｒｇｅｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ、図中、「Ｔａｒｇｅｔ ＮＡ」）（３）を含有する核酸含有試料を添加して混合した後、変性し、会合させて得られた会合体等の状態を示したものである。第１核酸分子プローブ（１）の一部は標的核酸分子（３）と会合し、残りの第１核酸分子プローブ（１）は第２核酸分子プローブ（２）と再会合する。第１核酸分子プローブ（１）と再会合しなかった第２核酸分子プローブ（２）は、第２マーカーＢＨＱ−２（２ａ）がダーククレンチャーであるため、蛍光は発しない。一方、標的核酸分子と会合した第１核酸分子プローブ（１）は、近傍に消光物質がないために、蛍光を発する。このため、この試料溶液をＦＩＤＡで計測し、統計解析することにより、図１（Ｃ）に示すように、蛍光強度の異なる２種類の蛍光分子として計測できる。図１（Ｃ）は、解析の結果得られた、試料溶液中の各蛍光強度を有する分子の分布を示している。蛍光強度の小さい分子が、第１核酸分子プローブ（１）と第２核酸分子プローブ（２）とが会合している分子を示し、蛍光強度の大きい分子が、第１核酸分子プローブ（１）と標的核酸分子（３）とが会合している分子を示す。つまり、蛍光強度の大きい分子の分子数が、標的核酸分子（３）の分子数であり、よって、標的核酸分子を定量することができる。

図２は第１マーカー及び第２マーカーとして蛍光色素を用いた場合の本発明の標的核酸分子の定量方法の一態様を示した図である。図２（Ａ）は、試料溶液調製前、すなわち、標的核酸分子Ｔａｒｇｅｔ ＮＡ（Ｔａｒｇｅｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ）（３）と混合される前の第１マーカーである蛍光色素Ｃｙ５（１ｂ）を結合させた第１核酸分子プローブ（１）と、Ｃｙ５の消光物質である第２マーカーである蛍光色素ＴＡＭＲＡ（２ｂ）を結合させた第２核酸分子プローブ（２）とが会合した状態を示したものである。図１に示す態様では、第１核酸分子プローブと第２核酸分子プローブとの会合体は蛍光を発することはなかったが、図２に示す態様では、両者が会合している場合、第２マーカーＣｙ５（２ｂ）は第１マーカーＴＭＲ（１ｂ）と蛍光エネルギー共鳴を起こし、第１マーカーＴＭＲ（１ｂ）の蛍光分子の励起波長で第２マーカーＣｙ５（２ｂ）が励起される。よって、第１マーカーの励起波長を照射し、第２マーカーの蛍光を検出することにより、第１マーカーと第２マーカーが近傍にあること、すなわち第１核酸分子プローブと第２核酸分子プローブとが会合していることがわかる。一方、図２（Ｂ）は、これらの核酸分子プローブに対して、標的核酸分子（Ｔａｒｇｅｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ、図中、「Ｔａｒｇｅｔ ＮＡ」）（３）を含有する核酸含有試料を添加して混合した後、変性し、会合させて得られた会合体等の状態を示したものである。第１核酸分子プローブ（１）の一部は標的核酸分子（３）と会合し、残りの第１核酸分子プローブ（１）は第２核酸分子プローブ（２）と再会合する。図２（Ｃ）は、この試料溶液を、ＴＭＲの励起波長である５４３ｎｍで励起し、かつＴＭＲの蛍光波長で検出し、ＦＩＤＡにより統計解析を行った結果得られた、試料溶液中の各蛍光強度を有する分子の分布を示している。この場合には、標的核酸分子（３）と会合した第１核酸分子プローブ（１）からは強い蛍光シグナルが観察されるが、第２核酸分子プローブと会合した第１核酸分子プローブ（１）又は第２核酸分子プローブ（２）のみからは、弱い蛍光シグナルが観察される。つまり、蛍光強度の大きい分子の分子数が、標的核酸分子（３）の分子数となる。一方、図２（Ｄ）は、この試料溶液にＴＭＲの励起波長である５４３ｎｍで励起し、Ｃｙ５の蛍光波長（６７０ｎｍ）で検出し、ＦＩＤＡにより統計解析を行った結果得られた、試料溶液中の各蛍光強度を有する分子の分布を示している。この場合には、第１核酸分子プローブ（１）と第２核酸分子プローブ（２）との会合体のみから、蛍光エネルギー移動による強い蛍光シグナルを発する分子が分離・検出される。つまり、Ｃｙ５の蛍光波長で検出することにより、ＴＭＲの蛍光波長で検出した場合の裏の反応を確認することができ、精度が向上する。

また、本発明の標的核酸分子の定量方法は、第１核酸分子プローブと第２核酸分子プローブとを含むキットを用いることにより、より簡便に核酸含有試料中の標的核酸分子を定量することができる。当該キットは、これらの核酸分子プローブ以外にも、試料溶液を調製するために用いられるバッファー等の他の試薬等を含んでいてもよい。

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［実施例１］
ヒトのマイクロＲＮＡであるｍｉＲ−２１と相同な配列をもつ１本鎖ＤＮＡを標的核酸分子として、本発明の標的核酸分子の定量方法により、未標識の標的核酸分子の濃度を効率よく測定した。
まず、ｍｉＲ−２１に相補的な塩基配列を有し、５’末端に第１マーカーとしてＴＡＭＲＡを結合させた第１核酸分子プローブと、当該第１核酸分子プローブと相同的な塩基配列を有し、５’末端に第２マーカーとしてＢＨＱ−２を結合させた第２核酸分子プローブとを用意した。各プローブを１０ｎＭとなるように混合した溶液に、標的核酸分子（ｍｉＲ−２１と相同な配列をもつ１本鎖ＤＮＡ）を最終濃度で０．０８〜１０ｎＭとなるように添加して、試料溶液を調製した。各試料溶液を、９０℃で１０分間変性させた後、３０℃まで１℃／分で温度を下げることにより、ハイブリダイゼーション（会合）を行った後、ＴＡＭＲＡの励起波長を照射してＴＡＭＲＡの蛍光波長で検出し、ＦＩＤＡ解析を行った。得られた解析結果を図３に示す。横軸は添加した１本鎖ＤＮＡ（標的核酸分子）の濃度を表し、縦軸は共焦点領域におけるＴＡＭＲＡの蛍光が検出された分子の個数、すなわち、第２核酸分子プローブの代わりに添加した１本鎖ＤＮＡと会合した結果、蛍光が回復した第１核酸分子プローブの個数を表している。添加した１本鎖ＤＮＡの濃度に比例して、蛍光が回復した第１核酸分子プローブの個数が増加していた。
これらの結果から、本発明の標的核酸分子の定量方法により、試料溶液中に存在する標的核酸分子を定量することができることが明らかである。なお、本実施例では添加した核酸（標的核酸分子）はＤＮＡであるが、ＲＮＡでも同様である。

［実施例２］
次に、実施例１で調製し、変性・会合させた試料溶液を、ＴＡＭＲＡの励起波長を照射してＴＡＭＲＡの蛍光波長で検出し、ＦＣＳ解析を行った。得られた解析結果を図４に示す。なお、縦軸及び横軸は、図３と同様である。本実施例のように、消光状態が良くほぼ１００％の消光であれば、ＦＣＳによって、ＦＩＤＡと同様に精度よく測定することができる。

また、第１核酸分子プローブを１０ｎＭとなるように調製した試料溶液の測定結果では、共焦点領域に３０個の第１核酸分子プローブが存在している。このため、実施例１及び２では、添加する１本鎖ＤＮＡ（標的核酸分子）の濃度の上限を１０ｎＭとしたが、より広範囲ダイナミックレンジで測定することが可能である。さらに、ＦＩＤＡやＦＣＳにおいては、原理的に共焦点領域内の蛍光一分子を測定する方法であるから、低濃度領域であっても、測定時間を延ばすことにより、蛍光シグナルを得ることが可能である。試料溶液中の標的核酸分子の濃度がｐＭ濃度であっても精度よく定量することが可能である。

本発明の標的核酸分子の定量方法により、ＦＲＥＴによるエネルギー移動を一分子ごとに検出し、解析することによって、試料中に存在する標的核酸分子を、高感度に、かつ精度良く定量することができるため、試料中の核酸を定量解析するような生化学、分子生物学、臨床検査等の分野で利用が可能である。

１…第１核酸分子プローブ、１ａ…第１マーカー（ＴＡＭＲＡ）、１ｂ…第１マーカー（ＴＭＲ）、２…第２核酸分子プローブ、２ａ…第２マーカー（ＢＨＱ−２）、２ｂ…第２マーカー（Ｃｙ５）、３…標的核酸分子（Ｔａｒｇｅｔ ＮＡ）。

Claims (11)

1. 核酸含有試料中の標的核酸分子を定量する方法であって、
   （ａ）核酸含有試料、第１マーカーが結合された第１核酸分子プローブ、及び第２マーカーが結合された第２核酸分子プローブを添加した試料溶液を調製する工程と、
   （ｂ）前記工程（ａ）において調製された試料溶液中の核酸分子を変性させた後、会合させる工程と、
   （ｃ）前記工程（ｂ）の後、前記試料溶液中の第１マーカー又は第２マーカーの光学的特性の時間変化を検出することにより、前記標的核酸分子を定量する工程と、
   を有し、
   前記第１核酸分子プローブは、前記標的核酸分子と相補的な塩基配列を有しており、
   前記第２核酸分子プローブは、前記第１核酸分子プローブと相補的な塩基配列を有しており、
   前記第１マーカーと前記第２マーカーの少なくともいずれか一方が、前記第１核酸分子プローブと前記第２核酸分子プローブとが会合している場合と会合していない場合とにおいて、光学的特性が変化する物質であることを特徴とする、標的核酸分子の定量方法。
2. 前記第１マーカーと前記第２マーカーの少なくともいずれか一方が蛍光色素であり、
   前記光学的特性の検出を、前記第１マーカー又は第２マーカーの発する蛍光強度の時間変化を検出することにより行うことを特徴とする請求項１記載の標的核酸分子の定量方法。
3. 共焦点光学系における焦点領域に存在している分子の蛍光強度変化を検出した後、統計解析を行い、前記標的核酸分子と会合している第１核酸分子プローブ又は第２核酸分子プローブの分子数を算出することにより、前記標的核酸分子を定量することを特徴とする請求項２記載の標的核酸分子の定量方法。
4. 共焦点光学系における焦点領域に存在している分子の蛍光強度の揺らぎを検出した後、統計解析を行い、前記標的核酸分子と会合している第１核酸分子プローブ又は第２核酸分子プローブの分子数を算出することにより、前記標的核酸分子を定量することを特徴とする請求項２記載の標的核酸分子の定量方法。
5. 蛍光強度の揺らぎの解析を、自己相関解析により行うことを特徴とする請求項４記載の標的核酸分子の定量方法。
6. 前記第１マーカーが蛍光物質であり、前記第２マーカーが前記蛍光物質から発される蛍光を消光する消光物質であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の標的核酸分子の定量方法。
7. 前記第２マーカーが蛍光物質であり、前記第１マーカーが前記蛍光物質から発される蛍光を消光する消光物質であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の標的核酸分子の定量方法。
8. 前記第１マーカー及び前記第２マーカーが蛍光色素であることを特徴とする請求項２〜７のいずれか記載の標的核酸分子の定量方法。
9. 前記標的核酸分子がマイクロＲＮＡであることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の標的核酸分子の定量方法。
10. 前記標的核酸分子がｓｉＲＮＡであることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の標的核酸分子の定量方法。
11. 核酸含有試料中の標的核酸分子を定量するために用いられるキットであって、
    標的核酸分子と相補的な塩基配列を有しており、かつ、第１マーカーが結合された第１核酸分子プローブと、
    前記第１核酸分子プローブと相補的な塩基配列を有しており、かつ、第２マーカーが結合された第２核酸分子プローブとを有しており、
    前記第１マーカーと前記第２マーカーの少なくともいずれか一方が、前記第１核酸分子プローブと前記第２核酸分子プローブとが会合している場合と会合していない場合とにおいて、光学的特性が変化する分子であることを特徴とする、標的核酸分子定量キット。

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