JPH11155598A - 蛍光消光による核酸の検出 - Google Patents
蛍光消光による核酸の検出Info
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- JPH11155598A JPH11155598A JP10267492A JP26749298A JPH11155598A JP H11155598 A JPH11155598 A JP H11155598A JP 10267492 A JP10267492 A JP 10267492A JP 26749298 A JP26749298 A JP 26749298A JP H11155598 A JPH11155598 A JP H11155598A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、核酸および標的配列の検出方法、
特に蛍光消光を用いる検出方法に関する。 【解決手段】 蛍光消光システムによる核酸の標的配列
の検出に、検出用核酸が使用される。検出用核酸は少な
くとも２本のオリゴヌクレオチドを含み、部分的に一本
鎖で、部分的に二本鎖である。ドナー／アクセプター染
料対は、ドナー／アクセプター染料対の２つの染料の一
方は第一のオリゴヌクレオチドに、もう一方は第二のオ
リゴヌクレオチドに結合され、第一および第二のオリゴ
ヌクレオチドが塩基対合している時には近接して、ドナ
ー蛍光が消光される。標的が存在しない場合には、検出
オリゴヌクレオチドは、その一部は一本鎖、一部は二本
鎖の形態を保持している。しかし、標的が存在する場合
には、検出用核酸は第一のオリゴヌクレオチドから置換
され、ドナーおよびアクセプター染料間距離は開き、蛍
光の変化を引き起こす。
特に蛍光消光を用いる検出方法に関する。 【解決手段】 蛍光消光システムによる核酸の標的配列
の検出に、検出用核酸が使用される。検出用核酸は少な
くとも２本のオリゴヌクレオチドを含み、部分的に一本
鎖で、部分的に二本鎖である。ドナー／アクセプター染
料対は、ドナー／アクセプター染料対の２つの染料の一
方は第一のオリゴヌクレオチドに、もう一方は第二のオ
リゴヌクレオチドに結合され、第一および第二のオリゴ
ヌクレオチドが塩基対合している時には近接して、ドナ
ー蛍光が消光される。標的が存在しない場合には、検出
オリゴヌクレオチドは、その一部は一本鎖、一部は二本
鎖の形態を保持している。しかし、標的が存在する場合
には、検出用核酸は第一のオリゴヌクレオチドから置換
され、ドナーおよびアクセプター染料間距離は開き、蛍
光の変化を引き起こす。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸および標的配
列の検出方法、特に蛍光消光を用いる検出方法に関す
る。
列の検出方法、特に蛍光消光を用いる検出方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】オリゴヌクレオチドプローブの配列に特
異的なハイブリッド形成は、選択された核酸配列の検出
および同定手段として長い間利用されており、また蛍光
標識によるこの様なプローブのラベリングは、プローブ
のハイブリッド形成を検出し易くするための比較的鋭敏
な非放射能性の手段を提供してきた。最近開発された検
出方法は、プローブのハイブリッド形成を検出するため
に、蛍光強度を直接検出するのではなく、蛍光エネルギ
ー移動（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔ
ｒａｎｓｆｅｒ；ＦＥＴ）の方法を利用している。蛍光
エネルギー移動は、一方（アクセプター）の吸収スペク
トルがもう一方（ドナー）の発光スペクトルと重なり、
２つの染料が極めて接近した位置にある場合、ドナー発
蛍光団とアクセプター染料（発蛍光団でも、発蛍光団で
なくてもよい。）の間に発生する。これらの特性を有す
る染料は、ドナー／アクセプター染料対又はエネルギー
移動染料対と呼ばれる。ドナー発蛍光団の励起状態エネ
ルギーは、共鳴双極子により引き起こされる双極子の相
互作用により隣接するアクセプターに移動される。これ
により、ドナーの蛍光消光が引き起こされる。場合によ
っては、アクセプターも発蛍光団であれば、その蛍光強
度が増強される。エネルギー移動効率は、ドナーとアク
セプターの距離に高度に依存しており、これらの関係の
予想式がForster (1948. Ann. Phys. 2, 55-75) により
明らかにされている。エネルギー移動効率が５０％であ
るドナー染料とアクセプター染料間の距離は、Ｆｏｒｓ
ｔｅｒ距離（Ｒo ）と呼ばれている。蛍光消光のその他
のメカニズムも公知であり、電荷移動および衝突消光等
が挙げられる。
異的なハイブリッド形成は、選択された核酸配列の検出
および同定手段として長い間利用されており、また蛍光
標識によるこの様なプローブのラベリングは、プローブ
のハイブリッド形成を検出し易くするための比較的鋭敏
な非放射能性の手段を提供してきた。最近開発された検
出方法は、プローブのハイブリッド形成を検出するため
に、蛍光強度を直接検出するのではなく、蛍光エネルギ
ー移動（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔ
ｒａｎｓｆｅｒ；ＦＥＴ）の方法を利用している。蛍光
エネルギー移動は、一方（アクセプター）の吸収スペク
トルがもう一方（ドナー）の発光スペクトルと重なり、
２つの染料が極めて接近した位置にある場合、ドナー発
蛍光団とアクセプター染料（発蛍光団でも、発蛍光団で
なくてもよい。）の間に発生する。これらの特性を有す
る染料は、ドナー／アクセプター染料対又はエネルギー
移動染料対と呼ばれる。ドナー発蛍光団の励起状態エネ
ルギーは、共鳴双極子により引き起こされる双極子の相
互作用により隣接するアクセプターに移動される。これ
により、ドナーの蛍光消光が引き起こされる。場合によ
っては、アクセプターも発蛍光団であれば、その蛍光強
度が増強される。エネルギー移動効率は、ドナーとアク
セプターの距離に高度に依存しており、これらの関係の
予想式がForster (1948. Ann. Phys. 2, 55-75) により
明らかにされている。エネルギー移動効率が５０％であ
るドナー染料とアクセプター染料間の距離は、Ｆｏｒｓ
ｔｅｒ距離（Ｒo ）と呼ばれている。蛍光消光のその他
のメカニズムも公知であり、電荷移動および衝突消光等
が挙げられる。
【０００３】消光を引き起こす極めて近接した２つの染
料の相互作用に依存するエネルギー移動とその他のメカ
ニズムは、核酸のハイブリッド形成を検出または同定す
る興味深い方法である。なぜならば、この様な分析方法
は均一方式で実施できるからである。均一分析方式は、
１種類の発蛍光団標識の蛍光の検出に依存している従来
のプローブハイブリッド形成分析よりも簡単である。な
ぜならば、不均一分析は、一般に、ハイブリッド形成し
た標識をハイブリッド形成していない標識から分離する
ための段階を更に必要とするからである。典型的には、
ＦＥＴおよび関連方法は、２つの相補的オリゴヌクレオ
チドのハイブリッド形成により蛍光特性がもたらされた
とき、一方または両方の染料標識の蛍光特性の変化の監
視に基づいている。この方式において、蛍光特性の変化
は、エネルギー移動量の変化として、あるいは蛍光消光
量の変化として測定でき、典型的には、一方の染料の蛍
光強度の増加として示される。この方法において、目的
のヌクレオチド配列は、ハイブリッド形成していないオ
リゴヌクレオチドとハイブリッド形成したオリゴヌクレ
オチドを分離せずに検出できる。ハイブリッド形成は、
２つの異なる相補的オリゴヌクレオチドの間で生じ、一
方はドナー発蛍光団で標識され、もう一方はアクセプタ
ーで標識される。一本鎖オリゴヌクレオチドと比較する
と、二本鎖形態では、ドナーの蛍光の減少（消光が増
加）および／またはエネルギー移動の増加が生じる。Ｆ
ＥＴハイブリッド形成分析の幾つかの方式が、Nonisoto
pic DNAProbe Techniques (1992. Academic Press In
c., Pgs. 311-352)に概説されている。
料の相互作用に依存するエネルギー移動とその他のメカ
ニズムは、核酸のハイブリッド形成を検出または同定す
る興味深い方法である。なぜならば、この様な分析方法
は均一方式で実施できるからである。均一分析方式は、
１種類の発蛍光団標識の蛍光の検出に依存している従来
のプローブハイブリッド形成分析よりも簡単である。な
ぜならば、不均一分析は、一般に、ハイブリッド形成し
た標識をハイブリッド形成していない標識から分離する
ための段階を更に必要とするからである。典型的には、
ＦＥＴおよび関連方法は、２つの相補的オリゴヌクレオ
チドのハイブリッド形成により蛍光特性がもたらされた
とき、一方または両方の染料標識の蛍光特性の変化の監
視に基づいている。この方式において、蛍光特性の変化
は、エネルギー移動量の変化として、あるいは蛍光消光
量の変化として測定でき、典型的には、一方の染料の蛍
光強度の増加として示される。この方法において、目的
のヌクレオチド配列は、ハイブリッド形成していないオ
リゴヌクレオチドとハイブリッド形成したオリゴヌクレ
オチドを分離せずに検出できる。ハイブリッド形成は、
２つの異なる相補的オリゴヌクレオチドの間で生じ、一
方はドナー発蛍光団で標識され、もう一方はアクセプタ
ーで標識される。一本鎖オリゴヌクレオチドと比較する
と、二本鎖形態では、ドナーの蛍光の減少（消光が増
加）および／またはエネルギー移動の増加が生じる。Ｆ
ＥＴハイブリッド形成分析の幾つかの方式が、Nonisoto
pic DNAProbe Techniques (1992. Academic Press In
c., Pgs. 311-352)に概説されている。
【０００４】あるいは、オリゴヌクレオチドがその相補
的配列とハイブリッド形成した時と、ハイブリッド形成
していない時で、一方または両方の蛍光特性に検出可能
な差が生じるように、１つのオリゴヌクレオチドにドナ
ーとアクセプターを結合することも可能である。この方
式では、オリゴヌクレオチドがハイブリッド形成する
と、典型的にドナーの蛍光は増加し、エネルギーの移動
／消光は減少する。例えば、両端で標識された自己相補
的オリゴヌクレオチドは、エネルギー移動と消光が起こ
り得る様に２つの発蛍光団（すなわち、５’末端と３’
末端）を接近させるヘアピン構造を形成できる。自己相
補的オリゴヌクレオチドと、別のオリゴヌクレオチドの
相補部分がハイブリッド形成すると、ヘアピン構造が崩
壊され、２つの染料間の距離が離れるため、消光は減少
する。ヘアピン構造の欠点は、非常に安定で、消光しな
いハイブリッド形成型への変換が通常遅く、僅かに有利
であるに過ぎない点で、一般に性能は低い。Tyagi and
Kramer (1996. Nature Biotech. 14, 303-308)は、ステ
ムを形成するヘアピンの自己相補的アーム間のループ中
の検出配列により上記の様に標識されるヘアピン構造を
報告している。塩基対ステムは、検出配列が標的にハイ
ブリッド形成して消光の減少を起こすために溶解しなけ
ればならない。「二重不完全ヘアピン」プローブ及びそ
れを用いるがB.Bagwell, et al. (1994. Nucl. Acids R
es. 22, 2424-2425; 米国特許第５，６０７，８３４
号）により報告されている。これらの構造は、ヘアピン
内部に標的結合配列を含んでいるため、標的とヘアピン
の自己相補的配列の間との競合的ハイブリッド形成が関
与している。Bagwell はミスマッチによりヘアピンを不
安定にすることにより、不利なハイブリッド形成速度論
の問題を解決し、それにより標的とのハイブリッド形成
を有利にした。
的配列とハイブリッド形成した時と、ハイブリッド形成
していない時で、一方または両方の蛍光特性に検出可能
な差が生じるように、１つのオリゴヌクレオチドにドナ
ーとアクセプターを結合することも可能である。この方
式では、オリゴヌクレオチドがハイブリッド形成する
と、典型的にドナーの蛍光は増加し、エネルギーの移動
／消光は減少する。例えば、両端で標識された自己相補
的オリゴヌクレオチドは、エネルギー移動と消光が起こ
り得る様に２つの発蛍光団（すなわち、５’末端と３’
末端）を接近させるヘアピン構造を形成できる。自己相
補的オリゴヌクレオチドと、別のオリゴヌクレオチドの
相補部分がハイブリッド形成すると、ヘアピン構造が崩
壊され、２つの染料間の距離が離れるため、消光は減少
する。ヘアピン構造の欠点は、非常に安定で、消光しな
いハイブリッド形成型への変換が通常遅く、僅かに有利
であるに過ぎない点で、一般に性能は低い。Tyagi and
Kramer (1996. Nature Biotech. 14, 303-308)は、ステ
ムを形成するヘアピンの自己相補的アーム間のループ中
の検出配列により上記の様に標識されるヘアピン構造を
報告している。塩基対ステムは、検出配列が標的にハイ
ブリッド形成して消光の減少を起こすために溶解しなけ
ればならない。「二重不完全ヘアピン」プローブ及びそ
れを用いるがB.Bagwell, et al. (1994. Nucl. Acids R
es. 22, 2424-2425; 米国特許第５，６０７，８３４
号）により報告されている。これらの構造は、ヘアピン
内部に標的結合配列を含んでいるため、標的とヘアピン
の自己相補的配列の間との競合的ハイブリッド形成が関
与している。Bagwell はミスマッチによりヘアピンを不
安定にすることにより、不利なハイブリッド形成速度論
の問題を解決し、それにより標的とのハイブリッド形成
を有利にした。
【０００５】核酸増幅を検出するためのエネルギー移動
または蛍光消光を用いる均一方法も報告されている。R.
Higuchi, et al. (1992. Biotechnology 10, 413-417)
は、臭化エチジウムが二本鎖ＤＮＡと結合するにつれ、
臭化エチジウムの蛍光が増加するのを監視することによ
り、リアルタイムでＤＮＡ増幅を検出する方法を開示し
ている。臭化エチジウムの結合は標的特異性でなく、バ
ックグラウンドの増幅生成物も検出されるため、この方
法の鋭敏度は限られている。L.G. Lee, et al.(1993. N
uc. Acids Res. 21, 3761-3766) は、ＰＣＲの間、二重
標識された検出プローブを標的増幅に特異的な方法で切
断するリアルタイムの検出方法を開示している。検出プ
ローブは増幅プライマーの下流でハイブリッド形成さ
れ、その結果Ｔａｑポリメラーゼの５’−３’エキソヌ
クレアーゼ活性が検出プローブを消化し、エネルギー移
動対を形成する２つの蛍光染料を分離する。プローブが
切断されるにつれ、蛍光強度は増大する。公開されてい
るＰＣＴ出願ＷＯ ９６／２１１４４は、酵素により触
媒される核酸の切断により蛍光が増加する、連続蛍光測
定分析を開示している。蛍光エネルギーの移動がこの方
法において使用されていると示唆されているが、標的と
のハイブリッド形成により消光される１種類の蛍光標識
を用いる方法に関してのみである。
または蛍光消光を用いる均一方法も報告されている。R.
Higuchi, et al. (1992. Biotechnology 10, 413-417)
は、臭化エチジウムが二本鎖ＤＮＡと結合するにつれ、
臭化エチジウムの蛍光が増加するのを監視することによ
り、リアルタイムでＤＮＡ増幅を検出する方法を開示し
ている。臭化エチジウムの結合は標的特異性でなく、バ
ックグラウンドの増幅生成物も検出されるため、この方
法の鋭敏度は限られている。L.G. Lee, et al.(1993. N
uc. Acids Res. 21, 3761-3766) は、ＰＣＲの間、二重
標識された検出プローブを標的増幅に特異的な方法で切
断するリアルタイムの検出方法を開示している。検出プ
ローブは増幅プライマーの下流でハイブリッド形成さ
れ、その結果Ｔａｑポリメラーゼの５’−３’エキソヌ
クレアーゼ活性が検出プローブを消化し、エネルギー移
動対を形成する２つの蛍光染料を分離する。プローブが
切断されるにつれ、蛍光強度は増大する。公開されてい
るＰＣＴ出願ＷＯ ９６／２１１４４は、酵素により触
媒される核酸の切断により蛍光が増加する、連続蛍光測
定分析を開示している。蛍光エネルギーの移動がこの方
法において使用されていると示唆されているが、標的と
のハイブリッド形成により消光される１種類の蛍光標識
を用いる方法に関してのみである。
【０００６】エネルギー移動とその他の蛍光消光の検出
方法は、特異的プローブのハイブリッド形成による標的
配列の検出にも応用されている。特公平５−１５４３９
号公報は、エネルギー移動対を形成する２つの標識で標
識された一本鎖ポリヌクレオチドプローブと一本鎖標的
をハイブリッド形成することによるポリヌクレオチドの
測定方法を開示している。二本鎖ハイブリッドは、制限
酵素により標識間で切断され、片方の標識の蛍光が測定
される。この方法の欠点は、プローブ内の制限部位が、
検出される標的配列にも存在しなくてはならない点であ
る。S.S. Ghosh, et al. (1994. Nucl. Acids Res.22,
3155-3159)は、蛍光共鳴エネルギー移動を用いて分析さ
れる発蛍光団標識オリゴヌクレオチドの制限酵素により
触媒される切断反応を報告している。これらの分析方法
において、相補的オリゴヌクレオチドはハイブリッド形
成されて二本鎖制限部位を生じ、発蛍光団標識は二本の
鎖のそれぞれに結合される。S.P. Lee, et al. (1994.
Anal. Biochem. 220, 377-383)は、二本鎖ＤＮＡを切断
するために制限エンドヌクレアーゼを用いる蛍光「脱消
光」技術を報告している。しかし、これらの方法は、第
二の蛍光標識からの蛍光エネルギーの移動によるのでは
なく、ＤＮＡとの相互作用により消光される１つの蛍光
標識のみを用いる分析に関するものである。標識された
オリゴヌクレオチドとその相補物とのハイブリッド形成
と二本鎖制限部位の切断により、標識の非移動性消光は
解消され、消光された蛍光は完全に回復した。
方法は、特異的プローブのハイブリッド形成による標的
配列の検出にも応用されている。特公平５−１５４３９
号公報は、エネルギー移動対を形成する２つの標識で標
識された一本鎖ポリヌクレオチドプローブと一本鎖標的
をハイブリッド形成することによるポリヌクレオチドの
測定方法を開示している。二本鎖ハイブリッドは、制限
酵素により標識間で切断され、片方の標識の蛍光が測定
される。この方法の欠点は、プローブ内の制限部位が、
検出される標的配列にも存在しなくてはならない点であ
る。S.S. Ghosh, et al. (1994. Nucl. Acids Res.22,
3155-3159)は、蛍光共鳴エネルギー移動を用いて分析さ
れる発蛍光団標識オリゴヌクレオチドの制限酵素により
触媒される切断反応を報告している。これらの分析方法
において、相補的オリゴヌクレオチドはハイブリッド形
成されて二本鎖制限部位を生じ、発蛍光団標識は二本の
鎖のそれぞれに結合される。S.P. Lee, et al. (1994.
Anal. Biochem. 220, 377-383)は、二本鎖ＤＮＡを切断
するために制限エンドヌクレアーゼを用いる蛍光「脱消
光」技術を報告している。しかし、これらの方法は、第
二の蛍光標識からの蛍光エネルギーの移動によるのでは
なく、ＤＮＡとの相互作用により消光される１つの蛍光
標識のみを用いる分析に関するものである。標識された
オリゴヌクレオチドとその相補物とのハイブリッド形成
と二本鎖制限部位の切断により、標識の非移動性消光は
解消され、消光された蛍光は完全に回復した。
【０００７】増幅プライマーのハイブリッド形成部位の
下流の標的配列とハイブリッド形成するシグナルプライ
マー（検出プローブとも呼ばれる）を、核酸増幅検出に
おいて利用する方法が報告されている（米国特許第５，
５４７，８６１号）。シグナルプライマーは、増幅プラ
イマーの伸長と同様にポリメラーゼにより伸長される。
増幅プライマーの伸長により、標的増幅依存性にシグナ
ルプライマーの伸長生成物が置換され、標的増幅を示す
ものとして検出される二本鎖二次増幅生成物が生成され
る。シグナルプライマーから生成される二次的増幅生成
物は、種々の標識およびリポーター基、切断されて特徴
的なサイズの断片を生成するシグナルプライマーの制限
部位、捕捉基、三重らせんや二本鎖ＤＮＡ結合蛋白質の
認識部位等の構造的特徴による検出できる。シグナルプ
ライマーを利用する検出方法の実施例は、米国特許第
５，５５０，０２５号（親油性染料と制限部位の組み込
み）および米国特許第５，５９３，８６７号（蛍光偏光
検出）に報告されている。
下流の標的配列とハイブリッド形成するシグナルプライ
マー（検出プローブとも呼ばれる）を、核酸増幅検出に
おいて利用する方法が報告されている（米国特許第５，
５４７，８６１号）。シグナルプライマーは、増幅プラ
イマーの伸長と同様にポリメラーゼにより伸長される。
増幅プライマーの伸長により、標的増幅依存性にシグナ
ルプライマーの伸長生成物が置換され、標的増幅を示す
ものとして検出される二本鎖二次増幅生成物が生成され
る。シグナルプライマーから生成される二次的増幅生成
物は、種々の標識およびリポーター基、切断されて特徴
的なサイズの断片を生成するシグナルプライマーの制限
部位、捕捉基、三重らせんや二本鎖ＤＮＡ結合蛋白質の
認識部位等の構造的特徴による検出できる。シグナルプ
ライマーを利用する検出方法の実施例は、米国特許第
５，５５０，０２５号（親油性染料と制限部位の組み込
み）および米国特許第５，５９３，８６７号（蛍光偏光
検出）に報告されている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】発明の概要 本発明は、蛍光消光メカニズムにより核酸の標的配列を
検出するために、検出用核酸を用いている。検出用核酸
は、少なくとも２本のオリゴヌクレオチドを含み、一部
分は一本鎖で、一部分は二本鎖である。第一のオリゴヌ
クレオチドは、第一のオリゴヌクレオチドの５’末端ま
たは３’末端が、標的配列とハイブリッド形成する一本
鎖尾部領域（標的結合配列と呼ばれる）を形成するよう
に、第一のオリゴヌクレオチドよりも短い少なくとも１
本の相補的第二のオリゴヌクレオチドとハイブリッド形
成している。第一のオリゴヌクレオチドとより短い相補
的第二のオリゴヌクレオチドとは、プライマー伸長また
は標的とのハイブリッド形成のための選択された条件下
でハイブリッド形成し、分子内塩基対合した部分的二本
鎖の検出用核酸を形成する。第一のオリゴヌクレオチド
は、検出用核酸が２本のオリゴヌクレオチドを含むよう
に、１本鎖の第二のオリゴヌクレオチドとハイブリッド
形成することができる。あるいは、より長い第一のオリ
ゴヌクレオチドは、複数のより短い第二のオリゴヌクレ
オチド（典型的には、２〜５本の第二のオリゴヌクレオ
チド）とハイブリッド形成することができる。複数の第
二のオリゴヌクレオチドは第一のオリゴヌクレオチドと
ハイブリッド形成し、また互いにハイブリッド形成し、
検出用核酸の二本鎖部分に３ヶ所、４ヶ所、５ヶ所また
は６ヶ所のオリゴヌクレオチド接合構造が形成される。
検出するために、検出用核酸を用いている。検出用核酸
は、少なくとも２本のオリゴヌクレオチドを含み、一部
分は一本鎖で、一部分は二本鎖である。第一のオリゴヌ
クレオチドは、第一のオリゴヌクレオチドの５’末端ま
たは３’末端が、標的配列とハイブリッド形成する一本
鎖尾部領域（標的結合配列と呼ばれる）を形成するよう
に、第一のオリゴヌクレオチドよりも短い少なくとも１
本の相補的第二のオリゴヌクレオチドとハイブリッド形
成している。第一のオリゴヌクレオチドとより短い相補
的第二のオリゴヌクレオチドとは、プライマー伸長また
は標的とのハイブリッド形成のための選択された条件下
でハイブリッド形成し、分子内塩基対合した部分的二本
鎖の検出用核酸を形成する。第一のオリゴヌクレオチド
は、検出用核酸が２本のオリゴヌクレオチドを含むよう
に、１本鎖の第二のオリゴヌクレオチドとハイブリッド
形成することができる。あるいは、より長い第一のオリ
ゴヌクレオチドは、複数のより短い第二のオリゴヌクレ
オチド（典型的には、２〜５本の第二のオリゴヌクレオ
チド）とハイブリッド形成することができる。複数の第
二のオリゴヌクレオチドは第一のオリゴヌクレオチドと
ハイブリッド形成し、また互いにハイブリッド形成し、
検出用核酸の二本鎖部分に３ヶ所、４ヶ所、５ヶ所また
は６ヶ所のオリゴヌクレオチド接合構造が形成される。
【０００９】検出用核酸は、ドナー／アクセプター染料
対を形成する少なくとも２つの染料に結合することによ
って、更に修飾される。複数のドナー／アクセプター染
料対を２本のオリゴヌクレオチドを含む検出用核酸に結
合することができるが、２本以上のオリゴヌクレオチド
を含む検出用核酸において特に有利である。第一のオリ
ゴヌクレオチドと第二のオリゴヌクレオチドが塩基対合
している時には近接し、ドナー染料発蛍光団の消光が起
こる様に、ドナー／アクセプター染料対の２つの染料の
内一方はより長い第一のオリゴヌクレオチドに、もう一
方は第二のオリゴヌクレオチドに結合される。検出用核
酸中に複数の第二のオリゴヌクレオチドが存在する場合
には、消光が起こるように、更なるドナー／アクセプタ
ー対を、塩基対合した第二のオリゴヌクレオチドの反対
側の鎖に結合することができる。標的が存在しない場
合、検出用核酸は一部は一本鎖で、一部は二本鎖のまま
で、消光された形態を保つ。しかし、標的が存在する場
合には、検出用核酸の第二のオリゴヌクレオチドは第一
のオリゴヌクレオチドから完全に、または部分的に置換
され、ドナー染料とアクセプター染料間の距離は広が
り、蛍光に変化を引き起こす。
対を形成する少なくとも２つの染料に結合することによ
って、更に修飾される。複数のドナー／アクセプター染
料対を２本のオリゴヌクレオチドを含む検出用核酸に結
合することができるが、２本以上のオリゴヌクレオチド
を含む検出用核酸において特に有利である。第一のオリ
ゴヌクレオチドと第二のオリゴヌクレオチドが塩基対合
している時には近接し、ドナー染料発蛍光団の消光が起
こる様に、ドナー／アクセプター染料対の２つの染料の
内一方はより長い第一のオリゴヌクレオチドに、もう一
方は第二のオリゴヌクレオチドに結合される。検出用核
酸中に複数の第二のオリゴヌクレオチドが存在する場合
には、消光が起こるように、更なるドナー／アクセプタ
ー対を、塩基対合した第二のオリゴヌクレオチドの反対
側の鎖に結合することができる。標的が存在しない場
合、検出用核酸は一部は一本鎖で、一部は二本鎖のまま
で、消光された形態を保つ。しかし、標的が存在する場
合には、検出用核酸の第二のオリゴヌクレオチドは第一
のオリゴヌクレオチドから完全に、または部分的に置換
され、ドナー染料とアクセプター染料間の距離は広が
り、蛍光に変化を引き起こす。
【００１０】別の実施例において、本発明は、標的配列
の増幅を検出するための標的増幅反応において、標的配
列を検出するための増幅に基づかないプライマー伸長法
において、標的配列を検出するためのハイブリッド形成
反応において、シグナルプライマーとして検出用核酸を
用いている。
の増幅を検出するための標的増幅反応において、標的配
列を検出するための増幅に基づかないプライマー伸長法
において、標的配列を検出するためのハイブリッド形成
反応において、シグナルプライマーとして検出用核酸を
用いている。
【００１１】本発明は、標的が存在する場合、独立した
フラグメントにドナー染料とアクセプター染料を分離す
るために、従来の公知の制限酵素に基づく方法に代わる
方法を提供する。本発明において、プローブまたはプラ
イマーの中に制限部位を作製する必要はなく、制限酵素
を標的検出反応から削除することができ、分析費用を削
減することができる。
フラグメントにドナー染料とアクセプター染料を分離す
るために、従来の公知の制限酵素に基づく方法に代わる
方法を提供する。本発明において、プローブまたはプラ
イマーの中に制限部位を作製する必要はなく、制限酵素
を標的検出反応から削除することができ、分析費用を削
減することができる。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明は、標的依存性に蛍光消光
の減少を引き起こすための検出用核酸を使用している。
検出用核酸は、標的が存在しない場合には蛍光消光が起
こる様に結合させたドナー／アクセプター染料対を含
む。標的が存在する場合には、検出用核酸中の第一のオ
リゴヌクレオチドと分子間塩基対合した第二のオリゴヌ
クレオチドが完全に、あるいは部分的に置換され、染料
間の距離が増加し、蛍光消光を減少させる。第二のオリ
ゴヌクレオチドを置換するには、第一のオリゴヌクレオ
チドと標的の間にハイブリッド形成が起こる必要があ
る。消光の減少は、標的配列の存在を示す物として監視
される蛍光パラメーター（例えば、ドナー蛍光強度の増
加、アクセプター蛍光強度の減少または展開前後の蛍光
比）の変化を伴う。ドナー蛍光強度の変化を監視するの
が好ましい。なぜならば、この変化はアクセプター蛍光
強度の変化よりも典型的に大きいからである。蛍光寿命
の変化の様なその他の蛍光パラメーターも監視できる。
の減少を引き起こすための検出用核酸を使用している。
検出用核酸は、標的が存在しない場合には蛍光消光が起
こる様に結合させたドナー／アクセプター染料対を含
む。標的が存在する場合には、検出用核酸中の第一のオ
リゴヌクレオチドと分子間塩基対合した第二のオリゴヌ
クレオチドが完全に、あるいは部分的に置換され、染料
間の距離が増加し、蛍光消光を減少させる。第二のオリ
ゴヌクレオチドを置換するには、第一のオリゴヌクレオ
チドと標的の間にハイブリッド形成が起こる必要があ
る。消光の減少は、標的配列の存在を示す物として監視
される蛍光パラメーター（例えば、ドナー蛍光強度の増
加、アクセプター蛍光強度の減少または展開前後の蛍光
比）の変化を伴う。ドナー蛍光強度の変化を監視するの
が好ましい。なぜならば、この変化はアクセプター蛍光
強度の変化よりも典型的に大きいからである。蛍光寿命
の変化の様なその他の蛍光パラメーターも監視できる。
【００１３】本明細書に使用されている言葉を以下の様
に定義する。増幅プライマーは、プライマー伸長による
標的配列増幅のためのプライマーである。鎖置換増幅
（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＳＤＡ）の場合、増幅プライマー
の３’末端（標的結合配列）が標的配列の３’末端に結
合する。増幅プライマーは、その５’末端付近に制限エ
ンドヌクレアーゼの認識部位を含む。米国特許第５，４
５５，１６６号、米国特許第５，２７０，１８４号およ
び、欧州特許第０ ６８４ ３１５号に報告されている
ように、認識部位は、認識部位が半修飾（「ニッキン
グ」）されている場合に、ＤＮＡ二本鎖の内１本の鎖を
切断する制限エンドヌクレアーゼのためのものである。
半修飾されている認識部位は制限エンドヌクレアーゼの
ための二本鎖認識部位で、この内の１本の鎖が、制限エ
ンドヌクレアーゼに認識部位の両方の鎖を切断するので
はなく、プライマー鎖にニックを入れる様な少なくとも
１つの誘導されたヌクレオチドを含んでいる。通常、半
修飾されている認識部位のプライマー鎖は、誘導された
ヌクレオチドを含まず、制限エンドヌクレアーゼにより
ニックを入れられる。あるいは、プライマーが誘導され
たヌクレオチドを含んでいてもよく、これにより、修飾
されていない標的鎖は切断から保護され、一方修飾され
たプライマー鎖はニックを入れられる。この様な制限エ
ンドヌクレアーゼは、誘導されたｄＮＴＰがその酵素の
制限エンドヌクレアーゼ認識部位に組み込まれる、ルー
チンのスクリーニング法で同定することが可能である。
好ましい半修飾された認識部位は、制限エンドヌクレア
ーゼＨｉｎｃＩＩ、ＢｓｏＢＩおよびＢｓｒＩのへミホ
スホロチオエート認識部位である。増幅プライマーは、
増幅プライマーの標的結合配列が標的配列とハイブリッ
ド形成すると、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長可能な
３’−ＯＨ基も含む。大多数のＳＤＡ反応に関して、増
幅プライマーは標的配列の指数関数的増幅に寄与してい
る。
に定義する。増幅プライマーは、プライマー伸長による
標的配列増幅のためのプライマーである。鎖置換増幅
（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＳＤＡ）の場合、増幅プライマー
の３’末端（標的結合配列）が標的配列の３’末端に結
合する。増幅プライマーは、その５’末端付近に制限エ
ンドヌクレアーゼの認識部位を含む。米国特許第５，４
５５，１６６号、米国特許第５，２７０，１８４号およ
び、欧州特許第０ ６８４ ３１５号に報告されている
ように、認識部位は、認識部位が半修飾（「ニッキン
グ」）されている場合に、ＤＮＡ二本鎖の内１本の鎖を
切断する制限エンドヌクレアーゼのためのものである。
半修飾されている認識部位は制限エンドヌクレアーゼの
ための二本鎖認識部位で、この内の１本の鎖が、制限エ
ンドヌクレアーゼに認識部位の両方の鎖を切断するので
はなく、プライマー鎖にニックを入れる様な少なくとも
１つの誘導されたヌクレオチドを含んでいる。通常、半
修飾されている認識部位のプライマー鎖は、誘導された
ヌクレオチドを含まず、制限エンドヌクレアーゼにより
ニックを入れられる。あるいは、プライマーが誘導され
たヌクレオチドを含んでいてもよく、これにより、修飾
されていない標的鎖は切断から保護され、一方修飾され
たプライマー鎖はニックを入れられる。この様な制限エ
ンドヌクレアーゼは、誘導されたｄＮＴＰがその酵素の
制限エンドヌクレアーゼ認識部位に組み込まれる、ルー
チンのスクリーニング法で同定することが可能である。
好ましい半修飾された認識部位は、制限エンドヌクレア
ーゼＨｉｎｃＩＩ、ＢｓｏＢＩおよびＢｓｒＩのへミホ
スホロチオエート認識部位である。増幅プライマーは、
増幅プライマーの標的結合配列が標的配列とハイブリッ
ド形成すると、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長可能な
３’−ＯＨ基も含む。大多数のＳＤＡ反応に関して、増
幅プライマーは標的配列の指数関数的増幅に寄与してい
る。
【００１４】増幅反応を開始させるために特別な配列ま
たは構造は不要なので、ＰＣＲの増幅プライマーは標的
結合配列だけを含めばよい。これに反して、３ＳＲおよ
びＮＡＳＢＡの増幅プライマーは５’末端付近にＲＮＡ
ポリメラーゼプロモーターを含む。このプロモーター
は、標的配列に付着され、標的の複数のＲＮＡコピーの
転写を指示することにより増幅反応を開始させる働きを
する。
たは構造は不要なので、ＰＣＲの増幅プライマーは標的
結合配列だけを含めばよい。これに反して、３ＳＲおよ
びＮＡＳＢＡの増幅プライマーは５’末端付近にＲＮＡ
ポリメラーゼプロモーターを含む。このプロモーター
は、標的配列に付着され、標的の複数のＲＮＡコピーの
転写を指示することにより増幅反応を開始させる働きを
する。
【００１５】伸長生成物は、プライマーまたはプライマ
ーの一部とプライマー結合部位下流の標的配列に相補的
な新しく合成された鎖を含む。伸長生成物は、標的配列
とプライマーのハイブリッド形成と、鋳型として標的配
列を用いるポリメラーゼによりプライマーの伸長の結果
生じた生成物である。
ーの一部とプライマー結合部位下流の標的配列に相補的
な新しく合成された鎖を含む。伸長生成物は、標的配列
とプライマーのハイブリッド形成と、鋳型として標的配
列を用いるポリメラーゼによりプライマーの伸長の結果
生じた生成物である。
【００１６】標的または標的配列という言葉は、増幅ま
たは検出される核酸配列を意味する。これらには、増幅
される元の核酸配列、その相補的第二の鎖および複製ま
たは増幅により生産される元の配列のコピーのいずれも
含まれる。標的配列は、ハイブリッド形成したプライマ
ーの伸長のための鋳型としての意味を持つこともある。
たは検出される核酸配列を意味する。これらには、増幅
される元の核酸配列、その相補的第二の鎖および複製ま
たは増幅により生産される元の配列のコピーのいずれも
含まれる。標的配列は、ハイブリッド形成したプライマ
ーの伸長のための鋳型としての意味を持つこともある。
【００１７】検出用核酸は、少なくとも２本のオリゴヌ
クレオチドを含み、第一のオリゴヌクレオチドはもう１
本のオリゴヌクレオチドよりも長い。オリゴヌクレオチ
ドは、検出用核酸中でハイブリッド形成され、より長い
オリゴヌクレオチドが、標的配列とハイブリッド形成す
る５’または３’「尾部」（標的結合配列）を形成する
少なくとも１本のより短い第二のオリゴヌクレオチド
が、標的結合配列に隣接するより長いオリゴヌクレオチ
ドと塩基対合している（すなわちハイブリッド形成して
いる）。更に他のより短い第二のオリゴヌクレオチドも
互いに、および／またはより長い第一のオリゴヌクレオ
チドと塩基対合し、本技術において公知の様に、オリゴ
ヌクレオチド接合構造を形成することも可能である。本
発明の検出用核酸は、少なくとも１対のドナー／アクセ
プター染料対を更に含む。染料は、オリゴヌクレオチド
が分子間塩基対合している時にはドナー蛍光が消光し、
第一のオリゴヌクレオチドから第二のオリゴヌクレオチ
ドが置換すると、蛍光消光が減少するように、検出用核
酸のオリゴヌクレオチドに結合されている。
クレオチドを含み、第一のオリゴヌクレオチドはもう１
本のオリゴヌクレオチドよりも長い。オリゴヌクレオチ
ドは、検出用核酸中でハイブリッド形成され、より長い
オリゴヌクレオチドが、標的配列とハイブリッド形成す
る５’または３’「尾部」（標的結合配列）を形成する
少なくとも１本のより短い第二のオリゴヌクレオチド
が、標的結合配列に隣接するより長いオリゴヌクレオチ
ドと塩基対合している（すなわちハイブリッド形成して
いる）。更に他のより短い第二のオリゴヌクレオチドも
互いに、および／またはより長い第一のオリゴヌクレオ
チドと塩基対合し、本技術において公知の様に、オリゴ
ヌクレオチド接合構造を形成することも可能である。本
発明の検出用核酸は、少なくとも１対のドナー／アクセ
プター染料対を更に含む。染料は、オリゴヌクレオチド
が分子間塩基対合している時にはドナー蛍光が消光し、
第一のオリゴヌクレオチドから第二のオリゴヌクレオチ
ドが置換すると、蛍光消光が減少するように、検出用核
酸のオリゴヌクレオチドに結合されている。
【００１８】本発明の検出用核酸は、プライマー伸長ま
たはハイブリッド形成のための選択された条件で、一部
二本鎖で、一部一本鎖の核酸分子を形成する、２本以上
のオリゴヌクレオチド（典型的には、約２から６本のオ
リゴヌクレオチド）を含んで成る。好ましい実施例にお
いて、標的結合配列の少なくとも一部が一本鎖３’また
は５’尾部を形成するように、一本鎖のより短い第二の
オリゴヌクレオチドは、第一のオリゴヌクレオチドの標
的結合配列に隣接する位置でより長い第一のオリゴヌク
レオチドと分子間塩基対合されている。この種の検出用
核酸は２本のオリゴヌクレオチドを含む。あるいは、複
数のより短い第二のオリゴヌクレオチドは、より長い第
一のオリゴヌクレオチドと、分子間塩基対合され、また
互いに標的結合配列に隣接して実質的に二本鎖オリゴヌ
クレオチド接合構造を形成する。オリゴヌクレオチド接
合部は本技術において公知であり、例えば、D.M.J. Lil
ley and R.M. Clegg (1993. Annu. Rev. Biophys. Biom
ol. Struct. 22, 299-328), M. Yang and D.P. Millar
(1996. Biochem. 35, 7959-7967), J.E. Ladbury,et a
l. (1994). Biochem. 33, 6828-6833), Y. Wang, et a
l. (1991. Biochem.30, 5667-5674)およびJ.L. Kadrma
s, et al. (1995. Nucl. Acids Res. 23, 2212-2222)
により説明されている。本発明の検出用核酸において、
接合構造に関わっていない第一のオリゴヌクレオチドの
一部が、一本鎖３’または５’尾部を形成している。こ
れらの検出用核酸は、典型的には、３から６本のオリゴ
ヌクレオチドを含むが、より多数のオリゴヌクレオチド
を含むより複雑な接合構造も本発明の使用に可能であ
る。本明細書に使用されているように、「標的結合配列
に隣接する」という言葉は、標的結合配列の全てまたは
一部が、５’または３’尾部中に標的とのハイブリッド
形成に利用可能な一本鎖として残っていることを意味す
る。すなわち、検出用核酸の二本鎖部分が標的結合配列
を全て含んでいるのではない。標的結合配列の一部が隣
接する二本鎖部分の分子間塩基対合に関与することも、
あるいは標的結合配列全体が検出用核酸において一本鎖
５’または３’尾部を形成することもある。検出用核酸
の二本鎖部分の残りは標的と相補的ではない。検出用核
酸の分子間塩基対合部分におけるミスマッチにより、標
的が存在する時の蛍光の変化度を減じる可能性がある
が、分析の鋭敏度が重要でない場合には許容可能であ
る。一本鎖末端の標的結合配列におけるミスマッチも許
容可能であるが、同様に分析の鋭敏度および／または特
異性を減じる可能性がある。しかし、二本鎖部分と標的
結合配列の両者において塩基対合が完璧であることによ
り、反応が障害されないことが本発明の特徴である。し
かし、ハイブリッド形成に関与している配列が完璧にマ
ッチしていれば、反応速度論に大きなマイナス効果を及
ぼさずに分析の特異性が改善される。
たはハイブリッド形成のための選択された条件で、一部
二本鎖で、一部一本鎖の核酸分子を形成する、２本以上
のオリゴヌクレオチド（典型的には、約２から６本のオ
リゴヌクレオチド）を含んで成る。好ましい実施例にお
いて、標的結合配列の少なくとも一部が一本鎖３’また
は５’尾部を形成するように、一本鎖のより短い第二の
オリゴヌクレオチドは、第一のオリゴヌクレオチドの標
的結合配列に隣接する位置でより長い第一のオリゴヌク
レオチドと分子間塩基対合されている。この種の検出用
核酸は２本のオリゴヌクレオチドを含む。あるいは、複
数のより短い第二のオリゴヌクレオチドは、より長い第
一のオリゴヌクレオチドと、分子間塩基対合され、また
互いに標的結合配列に隣接して実質的に二本鎖オリゴヌ
クレオチド接合構造を形成する。オリゴヌクレオチド接
合部は本技術において公知であり、例えば、D.M.J. Lil
ley and R.M. Clegg (1993. Annu. Rev. Biophys. Biom
ol. Struct. 22, 299-328), M. Yang and D.P. Millar
(1996. Biochem. 35, 7959-7967), J.E. Ladbury,et a
l. (1994). Biochem. 33, 6828-6833), Y. Wang, et a
l. (1991. Biochem.30, 5667-5674)およびJ.L. Kadrma
s, et al. (1995. Nucl. Acids Res. 23, 2212-2222)
により説明されている。本発明の検出用核酸において、
接合構造に関わっていない第一のオリゴヌクレオチドの
一部が、一本鎖３’または５’尾部を形成している。こ
れらの検出用核酸は、典型的には、３から６本のオリゴ
ヌクレオチドを含むが、より多数のオリゴヌクレオチド
を含むより複雑な接合構造も本発明の使用に可能であ
る。本明細書に使用されているように、「標的結合配列
に隣接する」という言葉は、標的結合配列の全てまたは
一部が、５’または３’尾部中に標的とのハイブリッド
形成に利用可能な一本鎖として残っていることを意味す
る。すなわち、検出用核酸の二本鎖部分が標的結合配列
を全て含んでいるのではない。標的結合配列の一部が隣
接する二本鎖部分の分子間塩基対合に関与することも、
あるいは標的結合配列全体が検出用核酸において一本鎖
５’または３’尾部を形成することもある。検出用核酸
の二本鎖部分の残りは標的と相補的ではない。検出用核
酸の分子間塩基対合部分におけるミスマッチにより、標
的が存在する時の蛍光の変化度を減じる可能性がある
が、分析の鋭敏度が重要でない場合には許容可能であ
る。一本鎖末端の標的結合配列におけるミスマッチも許
容可能であるが、同様に分析の鋭敏度および／または特
異性を減じる可能性がある。しかし、二本鎖部分と標的
結合配列の両者において塩基対合が完璧であることによ
り、反応が障害されないことが本発明の特徴である。し
かし、ハイブリッド形成に関与している配列が完璧にマ
ッチしていれば、反応速度論に大きなマイナス効果を及
ぼさずに分析の特異性が改善される。
【００１９】検出用核酸は更に発蛍光団であるドナー染
料と、ドナー発蛍光団のアクセプターを含む。２つのオ
リゴヌクレオチド検出用核酸において、ドナー／アクセ
プター染料対の２つの染料のうちの一つは、２本のオリ
ゴヌクレオチド間の分子間塩基対合により染料が接近
し、蛍光消光が生じる様に、検出用核酸を含むそれぞれ
のオリゴヌクレオチドに結合されている。検出用核酸中
に２本以上の第二のオリゴヌクレオチドが存在し、オリ
ゴヌクレオチド接合部を形成する場合には、接合構造に
おいて各ドナーの蛍光が対応するアクセプターにより消
光され、接合が崩壊された場合には、消光が減少するよ
うに、複数のドナー／アクセプター染料対を第一および
第二のオリゴヌクレオチドに結合することができる。即
ち、各ドナー／アクセプター染料対の２つの構成要素
は、好ましくは、検出用核酸中の異なるオリゴヌクレオ
チドに結合される。例えば、図３を参照。ＤＮＡ接合部
は、従来の技術における蛍光共鳴エネルギー移動を用い
て、標識され、分析されてきたが、これらの研究は接合
部の立体化学的コンフォメーションを分析することが目
的で、選択された標的を検出するためのものではないの
で、接合部は一本鎖尾部中に標的結合配列を含んでいな
かった（例えば、P.S. Eis and D.P. Millar. 1993. Bi
ochem. 32, 13852-13860; M. Yang and D.P. Millar. 1
996. Biochem. 35, 7959-7967; R.M. Clegg, et al. 19
94. Biophys. J. 66, 99-109; R.M. Clegg, et al. 199
3. Br. J. Med. Res. 26, 405-416; R.M. Clegg, et a
l. 1992. Biochem. 31, 4846-4856) 。
料と、ドナー発蛍光団のアクセプターを含む。２つのオ
リゴヌクレオチド検出用核酸において、ドナー／アクセ
プター染料対の２つの染料のうちの一つは、２本のオリ
ゴヌクレオチド間の分子間塩基対合により染料が接近
し、蛍光消光が生じる様に、検出用核酸を含むそれぞれ
のオリゴヌクレオチドに結合されている。検出用核酸中
に２本以上の第二のオリゴヌクレオチドが存在し、オリ
ゴヌクレオチド接合部を形成する場合には、接合構造に
おいて各ドナーの蛍光が対応するアクセプターにより消
光され、接合が崩壊された場合には、消光が減少するよ
うに、複数のドナー／アクセプター染料対を第一および
第二のオリゴヌクレオチドに結合することができる。即
ち、各ドナー／アクセプター染料対の２つの構成要素
は、好ましくは、検出用核酸中の異なるオリゴヌクレオ
チドに結合される。例えば、図３を参照。ＤＮＡ接合部
は、従来の技術における蛍光共鳴エネルギー移動を用い
て、標識され、分析されてきたが、これらの研究は接合
部の立体化学的コンフォメーションを分析することが目
的で、選択された標的を検出するためのものではないの
で、接合部は一本鎖尾部中に標的結合配列を含んでいな
かった（例えば、P.S. Eis and D.P. Millar. 1993. Bi
ochem. 32, 13852-13860; M. Yang and D.P. Millar. 1
996. Biochem. 35, 7959-7967; R.M. Clegg, et al. 19
94. Biophys. J. 66, 99-109; R.M. Clegg, et al. 199
3. Br. J. Med. Res. 26, 405-416; R.M. Clegg, et a
l. 1992. Biochem. 31, 4846-4856) 。
【００２０】好ましくは、ドナー／アクセプター対のど
ちらの染料も、検出用核酸をプライマーとして使用する
場合には、検出用核酸の一本鎖末端の３’末端には結合
させない。なぜならば、３’尾部標識がオリゴヌクレオ
チドのハイブリッド形成および／または伸長を障害する
ことがあるからである。しかし、選択されたドナー発蛍
光団とその対応するアクセプターは、ハイブリッド形成
および／または伸長を阻害しないそれぞれのオリゴヌク
レオチドのどの位置にでも結合することができ、それに
よって一部二本鎖の検出用核酸分子においてドナーの消
光が引き起こされ、より短いオリゴヌクレオチドが完全
に、あるいは部分的に置換されると蛍光パラメーターに
変化が引き起こされる。
ちらの染料も、検出用核酸をプライマーとして使用する
場合には、検出用核酸の一本鎖末端の３’末端には結合
させない。なぜならば、３’尾部標識がオリゴヌクレオ
チドのハイブリッド形成および／または伸長を障害する
ことがあるからである。しかし、選択されたドナー発蛍
光団とその対応するアクセプターは、ハイブリッド形成
および／または伸長を阻害しないそれぞれのオリゴヌク
レオチドのどの位置にでも結合することができ、それに
よって一部二本鎖の検出用核酸分子においてドナーの消
光が引き起こされ、より短いオリゴヌクレオチドが完全
に、あるいは部分的に置換されると蛍光パラメーターに
変化が引き起こされる。
【００２１】ドナーとアクセプターは、第一のオリゴヌ
クレオチドと第二のオリゴヌクレオチドまたは第二のオ
リゴヌクレオチドの相補的部分が分子間塩基対合する
と、ドナー蛍光が完全あるいはいつ部消光するように、
検出用核酸中のそれぞれのオリゴヌクレオチドに結合さ
れる。一部二本鎖の検出用核酸において、２つの染料が
十分接近すると、消光が起こる。２つの染料のうちの一
つににそれぞれ結合された、塩基対合オリゴヌクレオチ
ドの分離を伴う、標的による二本鎖の崩壊が起こると、
ドナー／アクセプター染料対間の距離が開き、消光が減
じることによるドナーまたはアクセプターの蛍光パラメ
ーターに検出可能な変化が生じる。染料対のどちらの染
料も、検出用核酸二本鎖部分の分子間水素結合形成に関
与している配列に結合可能である。あるいは、染料対の
一方を第二のより短いオリゴヌクレオチドの塩基対合配
列の中に、もう一方をそれとハイブリッド形成している
より長い第一のオリゴヌクレオチドの標的と結合する一
本鎖配列に結合できる。好ましくは、どちらの染料も検
出用核酸の分子間塩基対合配列の中に組み入れる様に、
両染料を結合させる（すなわち、分子間塩基対合に関与
している２つの相補的配列のそれぞれの中、あるいは付
近に１つの染料が存在する）。
クレオチドと第二のオリゴヌクレオチドまたは第二のオ
リゴヌクレオチドの相補的部分が分子間塩基対合する
と、ドナー蛍光が完全あるいはいつ部消光するように、
検出用核酸中のそれぞれのオリゴヌクレオチドに結合さ
れる。一部二本鎖の検出用核酸において、２つの染料が
十分接近すると、消光が起こる。２つの染料のうちの一
つににそれぞれ結合された、塩基対合オリゴヌクレオチ
ドの分離を伴う、標的による二本鎖の崩壊が起こると、
ドナー／アクセプター染料対間の距離が開き、消光が減
じることによるドナーまたはアクセプターの蛍光パラメ
ーターに検出可能な変化が生じる。染料対のどちらの染
料も、検出用核酸二本鎖部分の分子間水素結合形成に関
与している配列に結合可能である。あるいは、染料対の
一方を第二のより短いオリゴヌクレオチドの塩基対合配
列の中に、もう一方をそれとハイブリッド形成している
より長い第一のオリゴヌクレオチドの標的と結合する一
本鎖配列に結合できる。好ましくは、どちらの染料も検
出用核酸の分子間塩基対合配列の中に組み入れる様に、
両染料を結合させる（すなわち、分子間塩基対合に関与
している２つの相補的配列のそれぞれの中、あるいは付
近に１つの染料が存在する）。
【００２２】一般に、検出用核酸中の第一のオリゴヌク
レオチドと第二のオリゴヌクレオチド分子間塩基対合に
関与している配列の全長は重要ではない。適切な長さ
は、選択された反応条件において一部二本鎖分子を維持
するために安定した塩基対合に必要なヌクレオチド数に
より決定される。好都合には、第一のオリゴヌクレオチ
ド／第二のオリゴヌクレオチド塩基対合に関与している
配列は、典型的には、約８から７５ヌクレオチド長であ
る。最大の長さは、オリゴヌクレオチド合成および回収
の容易さと効率の様な実際的な問題によってのみ制限さ
れる。接合構造における第二のオリゴヌクレオチド間の
分子間塩基対合に関与する配列の長さは、第一のオリゴ
ヌクレオチドからオリゴヌクレオチド接合構造が置換さ
れる時の反応条件下に、第二のオリゴヌクレオチドを互
いに解離させ、一本鎖にするのに十分な位Ｔm が低くな
るように選択される。従って、第二のオリゴヌクレオチ
ド間の塩基対合に関与する配列は、典型的には、比較的
短い（例えば、約２〜１０ヌクレオチド）。
レオチドと第二のオリゴヌクレオチド分子間塩基対合に
関与している配列の全長は重要ではない。適切な長さ
は、選択された反応条件において一部二本鎖分子を維持
するために安定した塩基対合に必要なヌクレオチド数に
より決定される。好都合には、第一のオリゴヌクレオチ
ド／第二のオリゴヌクレオチド塩基対合に関与している
配列は、典型的には、約８から７５ヌクレオチド長であ
る。最大の長さは、オリゴヌクレオチド合成および回収
の容易さと効率の様な実際的な問題によってのみ制限さ
れる。接合構造における第二のオリゴヌクレオチド間の
分子間塩基対合に関与する配列の長さは、第一のオリゴ
ヌクレオチドからオリゴヌクレオチド接合構造が置換さ
れる時の反応条件下に、第二のオリゴヌクレオチドを互
いに解離させ、一本鎖にするのに十分な位Ｔm が低くな
るように選択される。従って、第二のオリゴヌクレオチ
ド間の塩基対合に関与する配列は、典型的には、比較的
短い（例えば、約２〜１０ヌクレオチド）。
【００２３】検出用核酸の二本鎖部分の配列も、少なく
ともその一部は標的と相補的でなく、それを崩壊する反
応温度で比較的安定であるように選択される。しかし、
標的とのハイブリッド形成が許容不可能な程遅くなる位
安定であったり、あるいは相補的鎖を合成するために、
第一のオリゴヌクレオチドから第二のオリゴヌクレオチ
ドを置換できないほど安定であってはならない。好まし
くは、第一のオリゴヌクレオチドと第二のオリゴヌクレ
オチドのハイブリッド形成に関与する検出用核酸の二本
鎖部分のＴm は、置換反応が起こる温度と等しいか、そ
れ以上であるが、それ以下であってはならない。この断
片のＴm が反応温度よりも低いと、検出用核酸分子の半
分以上が標的の存在と無関係に完全に一本鎖となってし
まう。これは分析の鋭敏度を低下させるが、標的が比較
的大量に存在する場合には許容可能である。典型的に
は、第一のオリゴヌクレオチドと第二のオリゴヌクレオ
チドのハイブリッド形成に関与する検出用核酸の二本鎖
部分のＴm は、第二のオリゴヌクレオチドを置換する反
応温度と等しいか、それよりも約３０℃まで高温となる
ように選択される。最も好ましくは、Ｔm は第二のオリ
ゴヌクレオチドを置換する温度よりも約１０〜２０℃高
い。
ともその一部は標的と相補的でなく、それを崩壊する反
応温度で比較的安定であるように選択される。しかし、
標的とのハイブリッド形成が許容不可能な程遅くなる位
安定であったり、あるいは相補的鎖を合成するために、
第一のオリゴヌクレオチドから第二のオリゴヌクレオチ
ドを置換できないほど安定であってはならない。好まし
くは、第一のオリゴヌクレオチドと第二のオリゴヌクレ
オチドのハイブリッド形成に関与する検出用核酸の二本
鎖部分のＴm は、置換反応が起こる温度と等しいか、そ
れ以上であるが、それ以下であってはならない。この断
片のＴm が反応温度よりも低いと、検出用核酸分子の半
分以上が標的の存在と無関係に完全に一本鎖となってし
まう。これは分析の鋭敏度を低下させるが、標的が比較
的大量に存在する場合には許容可能である。典型的に
は、第一のオリゴヌクレオチドと第二のオリゴヌクレオ
チドのハイブリッド形成に関与する検出用核酸の二本鎖
部分のＴm は、第二のオリゴヌクレオチドを置換する反
応温度と等しいか、それよりも約３０℃まで高温となる
ように選択される。最も好ましくは、Ｔm は第二のオリ
ゴヌクレオチドを置換する温度よりも約１０〜２０℃高
い。
【００２４】オリゴヌクレオチド接合部において、第二
のオリゴヌクレオチド間の塩基対合に関与する配列は、
接合部が第一のオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成
している場合には、選択された反応条件で第二のオリゴ
ヌクレオチド間でハイブリッド形成が安定する様に、ま
たオリゴヌクレオチド接合部が第一のオリゴヌクレオチ
ドとハイブリッド形成していない場合には、選択された
条件でハイブリッドが不安定化され、少なくとも一部は
解離する様に選択される。第二のオリゴヌクレオチド間
のハイブリッドのＴm は、本技術において公知のよう
に、この様な結果を得るために第二のオリゴヌクレオチ
ドを調節するために使用され、一般に反応温度と等しい
かそれよりも低くなるように選択される。塩基対合に関
与する配列の長さとヌクレオチド組成は、Ｔm に影響す
る一因子で、配列が短い程、比較的ＡＴに富む配列程一
般にＴm の低下に寄与する。幾つかの分析においてはポ
リメラーゼが存在すると、分子の二本鎖部分の安定性が
高くなり、温度上昇の影響を一部代償する。
のオリゴヌクレオチド間の塩基対合に関与する配列は、
接合部が第一のオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成
している場合には、選択された反応条件で第二のオリゴ
ヌクレオチド間でハイブリッド形成が安定する様に、ま
たオリゴヌクレオチド接合部が第一のオリゴヌクレオチ
ドとハイブリッド形成していない場合には、選択された
条件でハイブリッドが不安定化され、少なくとも一部は
解離する様に選択される。第二のオリゴヌクレオチド間
のハイブリッドのＴm は、本技術において公知のよう
に、この様な結果を得るために第二のオリゴヌクレオチ
ドを調節するために使用され、一般に反応温度と等しい
かそれよりも低くなるように選択される。塩基対合に関
与する配列の長さとヌクレオチド組成は、Ｔm に影響す
る一因子で、配列が短い程、比較的ＡＴに富む配列程一
般にＴm の低下に寄与する。幾つかの分析においてはポ
リメラーゼが存在すると、分子の二本鎖部分の安定性が
高くなり、温度上昇の影響を一部代償する。
【００２５】第二のオリゴヌクレオチドは、それがハイ
ブリッド形成する第一のオリゴヌクレオチドよりも短い
ので、第二のオリゴヌクレオチドと分子間塩基対合して
いない第一のオリゴヌクレオチド部分は５’または３’
一本鎖尾部を形成する。検出用核酸の一本鎖尾部部分は
検出される標的配列と相補的で、検出用核酸を標的配列
とハイブリッド形成させる働きをする。標的配列との相
補性以外の特徴は、尾部の配列が、好ましくは選択され
た条件で標的との安定した二本鎖を形成し、本技術にお
いて公知の所望の検出鋭敏度を提供する様に選択される
ことを除けば、一般に重要でない。標的とのハイブリッ
ド形成を有利にするために、第一のオリゴヌクレオチド
の一本鎖標的結合尾部領域の配列も好ましくは、標的結
合配列／標的二本鎖のＴm が反応温度と等しいか、それ
以上となる様選択される。標的結合領域の配列は、検出
されるべき標的の配列により決定されるが、検出用核酸
の標的結合配列のＴm の調節は、例えばその長さを調節
することにより可能である。
ブリッド形成する第一のオリゴヌクレオチドよりも短い
ので、第二のオリゴヌクレオチドと分子間塩基対合して
いない第一のオリゴヌクレオチド部分は５’または３’
一本鎖尾部を形成する。検出用核酸の一本鎖尾部部分は
検出される標的配列と相補的で、検出用核酸を標的配列
とハイブリッド形成させる働きをする。標的配列との相
補性以外の特徴は、尾部の配列が、好ましくは選択され
た条件で標的との安定した二本鎖を形成し、本技術にお
いて公知の所望の検出鋭敏度を提供する様に選択される
ことを除けば、一般に重要でない。標的とのハイブリッ
ド形成を有利にするために、第一のオリゴヌクレオチド
の一本鎖標的結合尾部領域の配列も好ましくは、標的結
合配列／標的二本鎖のＴm が反応温度と等しいか、それ
以上となる様選択される。標的結合領域の配列は、検出
されるべき標的の配列により決定されるが、検出用核酸
の標的結合配列のＴm の調節は、例えばその長さを調節
することにより可能である。
【００２６】第一の実施例において、本発明の検出用核
酸は、蛍光パラメーターの変化を伴う二次増幅生成物を
生じる増幅反応においてシグナルプライマーとして使用
できる。核酸増幅反応においてシグナルプライマーとし
て使用する場合、検出用核酸の一本鎖尾部はプライマー
伸長を可能にするために第一のオリゴヌクレオチドの
３’末端を含んで成る。従って、検出用核酸の二本鎖部
分は、検出用核酸がシグナルプライマーとして使用され
る場合には、標的結合配列の５’末端になる。「標的結
合配列の５’末端に」という言葉は、標的結合配列の全
てまたは一部が、一本鎖３’尾部として存在することを
意味する。すなわち、第二のオリゴヌクレオチドとの分
子間塩基対合に関与する第一のオリゴヌクレオチドの断
片は、標的結合配列の一部を含み、または標的結合配列
全体が一本鎖３’尾部に存在することが可能である。２
本のオリゴヌクレオチドを含む検出用核酸シグナルプラ
イマー反応を例を挙げて図１に示す。これは、また以下
の様に要約することができる。第一のオリゴヌクレオチ
ドの一本鎖尾部を介して、検出用核酸シグナルプライマ
ーは増幅プライマー下流の標的配列の１本の鎖とハイブ
リッド形成する。増幅プライマーと第一のオリゴヌクレ
オチドの両者は、標的配列を鋳型として使用して、ＤＮ
Ａポリメラーゼにより伸長される。第二のオリゴヌクレ
オチドとまだハイブリッド形成している第一のオリゴヌ
クレオチド伸長生成物は、上流の増幅プライマーの伸長
により鋳型から置換される。第一のオリゴヌクレオチド
伸長生成物が標的から分離された後も、検出用核酸はま
だ部分的に二本鎖のままである。伸長され、置換された
検出用核酸は順に第二の増幅プライマーのハイブリッド
形成と伸長のための鋳型として働き、検出用核酸伸長生
成物の一本鎖部分を二本鎖にする。第一のオリゴヌクレ
オチドと相補的な新しい鎖の重合によっても、ポリメラ
ーゼの鎖置換活性により第二のオリゴヌクレオチドが置
換され、第一のオリゴヌクレオチドに結合されているド
ナー／アクセプター対の構成要素と第二のオリゴヌクレ
オチドに結合されているドナー／アクセプター対の構成
要素は分離される。複数の第二のオリゴヌクレオチドが
検出用核酸シグナルプライマーのオリゴヌクレオチド接
合構造において互いにハイブリッド形成している場合に
は（例として図３に示す）、第一のオリゴヌクレオチド
と相補的な鎖の合成により、第一のオリゴヌクレオチド
から接合構造が置換される。オリゴヌクレオチド接合部
の第二のオリゴヌクレオチド間の塩基対合領域は十分短
いため、第一のオリゴヌクレオチドから分離されると一
本鎖に解離し、それぞれのドナー／アクセプター対の構
成要素は別々の一本鎖に分離される。
酸は、蛍光パラメーターの変化を伴う二次増幅生成物を
生じる増幅反応においてシグナルプライマーとして使用
できる。核酸増幅反応においてシグナルプライマーとし
て使用する場合、検出用核酸の一本鎖尾部はプライマー
伸長を可能にするために第一のオリゴヌクレオチドの
３’末端を含んで成る。従って、検出用核酸の二本鎖部
分は、検出用核酸がシグナルプライマーとして使用され
る場合には、標的結合配列の５’末端になる。「標的結
合配列の５’末端に」という言葉は、標的結合配列の全
てまたは一部が、一本鎖３’尾部として存在することを
意味する。すなわち、第二のオリゴヌクレオチドとの分
子間塩基対合に関与する第一のオリゴヌクレオチドの断
片は、標的結合配列の一部を含み、または標的結合配列
全体が一本鎖３’尾部に存在することが可能である。２
本のオリゴヌクレオチドを含む検出用核酸シグナルプラ
イマー反応を例を挙げて図１に示す。これは、また以下
の様に要約することができる。第一のオリゴヌクレオチ
ドの一本鎖尾部を介して、検出用核酸シグナルプライマ
ーは増幅プライマー下流の標的配列の１本の鎖とハイブ
リッド形成する。増幅プライマーと第一のオリゴヌクレ
オチドの両者は、標的配列を鋳型として使用して、ＤＮ
Ａポリメラーゼにより伸長される。第二のオリゴヌクレ
オチドとまだハイブリッド形成している第一のオリゴヌ
クレオチド伸長生成物は、上流の増幅プライマーの伸長
により鋳型から置換される。第一のオリゴヌクレオチド
伸長生成物が標的から分離された後も、検出用核酸はま
だ部分的に二本鎖のままである。伸長され、置換された
検出用核酸は順に第二の増幅プライマーのハイブリッド
形成と伸長のための鋳型として働き、検出用核酸伸長生
成物の一本鎖部分を二本鎖にする。第一のオリゴヌクレ
オチドと相補的な新しい鎖の重合によっても、ポリメラ
ーゼの鎖置換活性により第二のオリゴヌクレオチドが置
換され、第一のオリゴヌクレオチドに結合されているド
ナー／アクセプター対の構成要素と第二のオリゴヌクレ
オチドに結合されているドナー／アクセプター対の構成
要素は分離される。複数の第二のオリゴヌクレオチドが
検出用核酸シグナルプライマーのオリゴヌクレオチド接
合構造において互いにハイブリッド形成している場合に
は（例として図３に示す）、第一のオリゴヌクレオチド
と相補的な鎖の合成により、第一のオリゴヌクレオチド
から接合構造が置換される。オリゴヌクレオチド接合部
の第二のオリゴヌクレオチド間の塩基対合領域は十分短
いため、第一のオリゴヌクレオチドから分離されると一
本鎖に解離し、それぞれのドナー／アクセプター対の構
成要素は別々の一本鎖に分離される。
【００２７】二本鎖標的配列の第二の相補的鎖とハイブ
リッド形成するもう１つの第二の検出用核酸を選択によ
り反応に含めることができる（図１および３には示され
ていない。）。第二の検出用核酸は、第二の増幅プライ
マー下流の標的配列の第二の鎖とハイブリッド形成し、
第二の増幅プライマーの伸長により分離される。第二の
検出用核酸の伸長生成物の一本鎖部分は、第一の増幅プ
ライマーのハイブリッド形成と伸長により、第二のオリ
ゴヌクレオチドあるいは接合が置換された状態で二本鎖
にされる。所望により、標的の鎖１本につき複数の検出
用核酸を使用でき、それぞれ同じ鎖上の別の標的配列の
下流の標的配列とハイブリッド形成し、全ての検出用核
酸は増幅プライマーの下流でハイブリッド形成される。
この方法において、それぞれの検出用核酸は、上流の検
出用核酸の伸長により置換され、最も５’末端にある検
出用核酸は増幅プライマーにより置換される。複数の検
出用核酸は、標的１つにつき生じるシグナルを増大また
は増幅し、分析の鋭敏度を高めるという利点を有する。
リッド形成するもう１つの第二の検出用核酸を選択によ
り反応に含めることができる（図１および３には示され
ていない。）。第二の検出用核酸は、第二の増幅プライ
マー下流の標的配列の第二の鎖とハイブリッド形成し、
第二の増幅プライマーの伸長により分離される。第二の
検出用核酸の伸長生成物の一本鎖部分は、第一の増幅プ
ライマーのハイブリッド形成と伸長により、第二のオリ
ゴヌクレオチドあるいは接合が置換された状態で二本鎖
にされる。所望により、標的の鎖１本につき複数の検出
用核酸を使用でき、それぞれ同じ鎖上の別の標的配列の
下流の標的配列とハイブリッド形成し、全ての検出用核
酸は増幅プライマーの下流でハイブリッド形成される。
この方法において、それぞれの検出用核酸は、上流の検
出用核酸の伸長により置換され、最も５’末端にある検
出用核酸は増幅プライマーにより置換される。複数の検
出用核酸は、標的１つにつき生じるシグナルを増大また
は増幅し、分析の鋭敏度を高めるという利点を有する。
【００２８】図１および３に示すように、検出用核酸の
一本鎖部分は、増幅プライマーのハイブリッド形成と伸
長により二本鎖形態に変換される。ポリメラーゼによる
鎖置換により、ポリメラーゼが第一のオリゴヌクレオチ
ドの相補体を合成するにつれ、第一のオリゴヌクレオチ
ドから第二のオリゴヌクレオチドが置換される。ポリメ
ラーゼの鎖置換活性により、ドナー／アクセプター対の
一要素に結合された第二のオリゴヌクレオチドが、対の
対応する一要素に結合された第一のオリゴヌクレオチド
から分離されるため、ドナー染料とアクセプター染料間
距離が開き、これによってドナー蛍光の消光が減少す
る。すなわち、この様にして生成された一本鎖の置換さ
れた第二のオリゴヌクレオチドと二本鎖の第一のオリゴ
ヌクレオチドは、それぞれ２つの染料のどちらかに結合
されており、反応溶液中に互いに無関係に拡散する。更
なるドナー／アクセプター対が、第一のオリゴヌクレオ
チドとハイブリッド形成しているか、互いにハイブリッ
ド形成した更なる第二のオリゴヌクレオチドと結合する
と、消光の減少は高まる。分離されたオリゴヌクレオチ
ド接合構造は一本鎖に解離するため、各ドナー発蛍光団
の消光の減少は蛍光の全体的な増加に寄与する。それに
伴うドナー染料またはアクセプター染料の蛍光の変化
を、標的配列の増幅の指標として監視または検出するこ
とができる。ドナー蛍光強度の増加またはアクセプター
蛍光強度の減少を、標的増幅が発生している、あるいは
発生した指標として検出および／または監視してもよい
し、ドナー／アクセプター染料対の接近度により影響さ
れるその他の蛍光パラメーター（例えば、蛍光寿命）も
監視してもよい。ドナーまたはアクセプターの蛍光強度
の変化は、ドナーおよび／またはアクセプター蛍光強度
の比の変化としても検出できる。例えば、蛍光強度の変
化は、ａ）第二のオリゴヌクレオチドが置換された後の
ドナー発蛍光団の蛍光と第二のオリゴヌクレオチドが置
換される前の検出用核酸中のドナー発蛍光団の蛍光の比
の増加、またはｂ）アクセプターが発蛍光団の場合、第
二のオリゴヌクレオチドが置換された後のアクセプター
の蛍光と第二のオリゴヌクレオチドが置換される前の検
出用核酸中のアクセプターの蛍光の比の減少として検出
される。
一本鎖部分は、増幅プライマーのハイブリッド形成と伸
長により二本鎖形態に変換される。ポリメラーゼによる
鎖置換により、ポリメラーゼが第一のオリゴヌクレオチ
ドの相補体を合成するにつれ、第一のオリゴヌクレオチ
ドから第二のオリゴヌクレオチドが置換される。ポリメ
ラーゼの鎖置換活性により、ドナー／アクセプター対の
一要素に結合された第二のオリゴヌクレオチドが、対の
対応する一要素に結合された第一のオリゴヌクレオチド
から分離されるため、ドナー染料とアクセプター染料間
距離が開き、これによってドナー蛍光の消光が減少す
る。すなわち、この様にして生成された一本鎖の置換さ
れた第二のオリゴヌクレオチドと二本鎖の第一のオリゴ
ヌクレオチドは、それぞれ２つの染料のどちらかに結合
されており、反応溶液中に互いに無関係に拡散する。更
なるドナー／アクセプター対が、第一のオリゴヌクレオ
チドとハイブリッド形成しているか、互いにハイブリッ
ド形成した更なる第二のオリゴヌクレオチドと結合する
と、消光の減少は高まる。分離されたオリゴヌクレオチ
ド接合構造は一本鎖に解離するため、各ドナー発蛍光団
の消光の減少は蛍光の全体的な増加に寄与する。それに
伴うドナー染料またはアクセプター染料の蛍光の変化
を、標的配列の増幅の指標として監視または検出するこ
とができる。ドナー蛍光強度の増加またはアクセプター
蛍光強度の減少を、標的増幅が発生している、あるいは
発生した指標として検出および／または監視してもよい
し、ドナー／アクセプター染料対の接近度により影響さ
れるその他の蛍光パラメーター（例えば、蛍光寿命）も
監視してもよい。ドナーまたはアクセプターの蛍光強度
の変化は、ドナーおよび／またはアクセプター蛍光強度
の比の変化としても検出できる。例えば、蛍光強度の変
化は、ａ）第二のオリゴヌクレオチドが置換された後の
ドナー発蛍光団の蛍光と第二のオリゴヌクレオチドが置
換される前の検出用核酸中のドナー発蛍光団の蛍光の比
の増加、またはｂ）アクセプターが発蛍光団の場合、第
二のオリゴヌクレオチドが置換された後のアクセプター
の蛍光と第二のオリゴヌクレオチドが置換される前の検
出用核酸中のアクセプターの蛍光の比の減少として検出
される。
【００２９】ＳＤＡの他に、本発明の検出用核酸を他の
プライマー伸長増幅法（例えば、ＰＣＲ、３ＳＲ、ＴＭ
ＡまたはＮＡＳＢＡ）にシグナルプライマーとして使用
するために適合させることが可能であることは明らかで
ある。例えば、ＰＣＲにおいてＰＣＲ増幅プライマー
と、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した鎖置
換ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＳ
ｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｇｒａｄｅ ＴａｑまたはＮｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社のｅｘｏ-Ｖｅｎ
ｔまたはｅｘｏ- Ｄｅｅｐ）を使用することにより、Ｐ
ＣＲにおいて使用するように方法を適合させることがで
きる。検出用核酸シグナルプライマーは、ＰＣＲ増幅プ
ライマーの下流の標的とハイブリッド形成する。これら
は、ＳＤＡに関して説明されているように本質的に、伸
長され、標的から置換され、第二のオリゴヌクレオチド
またはオリゴヌクレオチド接合部を置換された状態で二
本鎖にされる。ＳＤＡシステムの場合と同様に、第二の
オリゴヌクレオチドが置換され、ドナー／アクセプター
染料対が分離されることにより、蛍光消光が減少し、標
的増幅の指標となる蛍光強度の様な蛍光パラメーターが
変化する。
プライマー伸長増幅法（例えば、ＰＣＲ、３ＳＲ、ＴＭ
ＡまたはＮＡＳＢＡ）にシグナルプライマーとして使用
するために適合させることが可能であることは明らかで
ある。例えば、ＰＣＲにおいてＰＣＲ増幅プライマー
と、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した鎖置
換ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＳ
ｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｇｒａｄｅ ＴａｑまたはＮｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社のｅｘｏ-Ｖｅｎ
ｔまたはｅｘｏ- Ｄｅｅｐ）を使用することにより、Ｐ
ＣＲにおいて使用するように方法を適合させることがで
きる。検出用核酸シグナルプライマーは、ＰＣＲ増幅プ
ライマーの下流の標的とハイブリッド形成する。これら
は、ＳＤＡに関して説明されているように本質的に、伸
長され、標的から置換され、第二のオリゴヌクレオチド
またはオリゴヌクレオチド接合部を置換された状態で二
本鎖にされる。ＳＤＡシステムの場合と同様に、第二の
オリゴヌクレオチドが置換され、ドナー／アクセプター
染料対が分離されることにより、蛍光消光が減少し、標
的増幅の指標となる蛍光強度の様な蛍光パラメーターが
変化する。
【００３０】発明の方法を３ＳＲ、ＴＭＡまたはＮＡＳ
ＢＡに適合させるために、鎖置換活性を有するが、５’
→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した逆転写酵素が
使用され、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む増幅
プライマーの下流のＲＮＡ標的と検出用核酸のハイブリ
ッド形成される。前述の反応法式と類似の反応法式にお
いて、ハイブリッド形成された第二のオリゴヌクレオチ
ドを含むハイブリッド形成された検出用核酸は、１）伸
長され、２）上流の増幅プライマーの伸長により置換さ
れる。置換された伸長生成物は次に第二の増幅プライマ
ーのハイブリッド形成と伸長により全体的に二本鎖にさ
れる。これによって検出用核酸の第一のオリゴヌクレオ
チドから第二のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレ
オチド接合部が置換され、ドナー染料とアクセプター染
料間距離が開き、ドナー発蛍光団の蛍光消光が減少す
る。３ＳＲまたはＮＡＳＢＡの検出用核酸シグナルプラ
イマーはＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含ま
ず、従って、増幅プライマーとして機能できず、非特異
的バックグラウンドシグナルは減少する。これは、ニッ
キング可能なＲＥＲＳを含まないため、非特異的標的の
指数関数的バックグラウンドの増幅に大きく寄与しな
い、ＳＤＡにおけるシグナルプライマーと類似してい
る。
ＢＡに適合させるために、鎖置換活性を有するが、５’
→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した逆転写酵素が
使用され、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む増幅
プライマーの下流のＲＮＡ標的と検出用核酸のハイブリ
ッド形成される。前述の反応法式と類似の反応法式にお
いて、ハイブリッド形成された第二のオリゴヌクレオチ
ドを含むハイブリッド形成された検出用核酸は、１）伸
長され、２）上流の増幅プライマーの伸長により置換さ
れる。置換された伸長生成物は次に第二の増幅プライマ
ーのハイブリッド形成と伸長により全体的に二本鎖にさ
れる。これによって検出用核酸の第一のオリゴヌクレオ
チドから第二のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレ
オチド接合部が置換され、ドナー染料とアクセプター染
料間距離が開き、ドナー発蛍光団の蛍光消光が減少す
る。３ＳＲまたはＮＡＳＢＡの検出用核酸シグナルプラ
イマーはＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含ま
ず、従って、増幅プライマーとして機能できず、非特異
的バックグラウンドシグナルは減少する。これは、ニッ
キング可能なＲＥＲＳを含まないため、非特異的標的の
指数関数的バックグラウンドの増幅に大きく寄与しな
い、ＳＤＡにおけるシグナルプライマーと類似してい
る。
【００３１】バックグラウンドを減少させるため、本発
明の方法において、検出用核酸の伸長生成物を上流の増
幅プライマーの伸長による置換により標的配列から分離
して、検出用核酸をシグナルプライマーとして使用する
のが好ましい。しかし、検出用核酸シグナルプライマー
に関して説明されているように、種々の核酸増幅反応に
使用される事が公知の増幅プライマーを、５’分子間塩
基対合配列の付加により、修飾できることも明らかであ
る。この実施例において、５’二本鎖部分を持つ増幅プ
ライマー伸長生成物は、上流の非増幅プライマー（ＳＤ
Ａの場合の様にバンパープライマー）の伸長による置
換、変性（例えば、ＰＣＲの場合の様に加熱）または標
的鎖の酵素による消化（例えば、３ＳＲの場合のように
ＲＮａｓｅＨ）により、標的配列から分離することが可
能である。５’二本鎖部分とドナー／アクセプター染料
対を含む増幅プライマーにより、反応に更なる検出用核
酸を使用する必要はなくなるが、この実施例ではバック
グラウンドがより高く、そのため分析の鋭敏度が低くな
る可能性がある。ＰＣＲに関しては、第二のオリゴヌク
レオチドと相補的な配列を標的結合配列の５’に付加す
ることにより増幅プライマーが修飾される。次に、第二
のオリゴヌクレオチドは、付加された５’配列とハイブ
リッド形成される。このプライマーは、上記のＰＣＲ検
出用核酸シグナルプライマーと構造的に同一である。し
かし、機能的には、伸長され、置換される下流のプライ
マーが存在せず、増幅プライマー自体が蛍光に変化を引
き起こす点で差がある。３ＳＲ、ＴＭＡまたはＮＡＳＢ
Ａに関しては、第二のオリゴヌクレオチドと相補的な配
列を増幅プライマーのプロモーターの５’に配置され、
第二のオリゴヌクレオチドはそれとハイブリッド形成さ
れる。その結果、第二のオリゴヌクレオチドまたはオリ
ゴヌクレオチド接合部は置換され、第一のオリゴヌクレ
オチドは増幅サイルの二本鎖ＤＮＡ部分で全体的に二本
鎖とされる。プロモーター配列を含まない第二の増幅プ
ライマー（例えば、ＮＡＳＢＡの場合の様に）も、ある
いは代わりに、標的結合配列の５’にハイブリッド形成
された第二のオリゴヌクレオチドと相補的な配列を含む
ことができる。
明の方法において、検出用核酸の伸長生成物を上流の増
幅プライマーの伸長による置換により標的配列から分離
して、検出用核酸をシグナルプライマーとして使用する
のが好ましい。しかし、検出用核酸シグナルプライマー
に関して説明されているように、種々の核酸増幅反応に
使用される事が公知の増幅プライマーを、５’分子間塩
基対合配列の付加により、修飾できることも明らかであ
る。この実施例において、５’二本鎖部分を持つ増幅プ
ライマー伸長生成物は、上流の非増幅プライマー（ＳＤ
Ａの場合の様にバンパープライマー）の伸長による置
換、変性（例えば、ＰＣＲの場合の様に加熱）または標
的鎖の酵素による消化（例えば、３ＳＲの場合のように
ＲＮａｓｅＨ）により、標的配列から分離することが可
能である。５’二本鎖部分とドナー／アクセプター染料
対を含む増幅プライマーにより、反応に更なる検出用核
酸を使用する必要はなくなるが、この実施例ではバック
グラウンドがより高く、そのため分析の鋭敏度が低くな
る可能性がある。ＰＣＲに関しては、第二のオリゴヌク
レオチドと相補的な配列を標的結合配列の５’に付加す
ることにより増幅プライマーが修飾される。次に、第二
のオリゴヌクレオチドは、付加された５’配列とハイブ
リッド形成される。このプライマーは、上記のＰＣＲ検
出用核酸シグナルプライマーと構造的に同一である。し
かし、機能的には、伸長され、置換される下流のプライ
マーが存在せず、増幅プライマー自体が蛍光に変化を引
き起こす点で差がある。３ＳＲ、ＴＭＡまたはＮＡＳＢ
Ａに関しては、第二のオリゴヌクレオチドと相補的な配
列を増幅プライマーのプロモーターの５’に配置され、
第二のオリゴヌクレオチドはそれとハイブリッド形成さ
れる。その結果、第二のオリゴヌクレオチドまたはオリ
ゴヌクレオチド接合部は置換され、第一のオリゴヌクレ
オチドは増幅サイルの二本鎖ＤＮＡ部分で全体的に二本
鎖とされる。プロモーター配列を含まない第二の増幅プ
ライマー（例えば、ＮＡＳＢＡの場合の様に）も、ある
いは代わりに、標的結合配列の５’にハイブリッド形成
された第二のオリゴヌクレオチドと相補的な配列を含む
ことができる。
【００３２】別の実施例において、検出用核酸は、標的
オリゴヌクレオチドを検出するための非増幅に基づく分
析方式において使用できる。第一の非増幅に基づく実施
例において、検出用核酸の塩基対合二本鎖部分が５’に
突出部分を形成するように、検出用核酸の第一のオリゴ
ヌクレオチドの３’標的と結合する一本鎖配列は標的オ
リゴヌクレオチドの３’末端とハイブリッド形成する。
標的配列は、プライマー伸長反応においてプライマーと
して機能し、鋳型として５’突出部（すなわち第二のオ
リゴヌクレオチドと塩基対合している第一のオリゴヌク
レオチドの配列）を使用して標的配列を伸長する鎖置換
ポリメラーゼを使用して、第一のオリゴヌクレオチドを
相補的な鎖を合成する。検出用核酸の標的結合配列が標
的配列の一部とのみハイブリッド形成する場合には、標
的配列も５’突出部分を形成し、検出用核酸の第一のオ
リゴヌクレオチドは鋳型として標的の５’突出部分を使
用して同様に伸長される。検出用核酸の標的結合配列
が、標的配列の全長と相補的な場合には、標的だけが伸
長される。いずれの場合も、検出用核酸の第二のオリゴ
ヌクレオチドはこの様にして第一のオリゴヌクレオチド
から置換され、同時に蛍光パラメーターの変化を伴う。
蛍光の変化を引き起こす第二のオリゴヌクレオチドの伸
長と置換は、標的が存在する場合に限り起こり得る。
オリゴヌクレオチドを検出するための非増幅に基づく分
析方式において使用できる。第一の非増幅に基づく実施
例において、検出用核酸の塩基対合二本鎖部分が５’に
突出部分を形成するように、検出用核酸の第一のオリゴ
ヌクレオチドの３’標的と結合する一本鎖配列は標的オ
リゴヌクレオチドの３’末端とハイブリッド形成する。
標的配列は、プライマー伸長反応においてプライマーと
して機能し、鋳型として５’突出部（すなわち第二のオ
リゴヌクレオチドと塩基対合している第一のオリゴヌク
レオチドの配列）を使用して標的配列を伸長する鎖置換
ポリメラーゼを使用して、第一のオリゴヌクレオチドを
相補的な鎖を合成する。検出用核酸の標的結合配列が標
的配列の一部とのみハイブリッド形成する場合には、標
的配列も５’突出部分を形成し、検出用核酸の第一のオ
リゴヌクレオチドは鋳型として標的の５’突出部分を使
用して同様に伸長される。検出用核酸の標的結合配列
が、標的配列の全長と相補的な場合には、標的だけが伸
長される。いずれの場合も、検出用核酸の第二のオリゴ
ヌクレオチドはこの様にして第一のオリゴヌクレオチド
から置換され、同時に蛍光パラメーターの変化を伴う。
蛍光の変化を引き起こす第二のオリゴヌクレオチドの伸
長と置換は、標的が存在する場合に限り起こり得る。
【００３３】第二の非増幅に基づく本発明の実施例にお
いて、検出用核酸の第一のオリゴヌクレオチドは、ハイ
ブリッド形成時に蛍光に変化が生じるように、標的配列
にハイブリッド形成される。従って、検出用核酸がハイ
ブリッド形成プローブとして使用される場合には、標的
と結合する一本鎖配列は第一のオリゴヌクレオチドの
５’末端または３’末端のいずれにあってもよい。即
ち、プライマー伸長は必要ないため、検出用核酸の二本
鎖部分は、任意で標的結合配列の一部を含む一本鎖尾部
の５’または３のいずれにあってもよい。この実施例に
おいて、検出用核酸の分子間塩基対合部分は好ましく
は、標的結合配列部分を含み、３’または５’一本鎖尾
部に標的との非競合的ハイブリッド形成に利用可能な残
りの標的結合配列が存在する。これによって、ハイブリ
ッド形成が起こると検出用核酸の二本鎖部分が部分的ま
たは完全に崩壊され、第二のオリゴヌクレオチドの一部
又はすべてに置換が起きて、２つの染料間距離が開き、
蛍光消光が減少する。しかし、結合配列が全て検出用核
酸の一本鎖尾部に存在し、標的と第二のオリゴヌクレオ
チドとの塩基対合に関わる第一のオリゴヌクレオチドの
配列との間に塩基対合が不可能な場合でも、ハイブリッ
ド形成時にも蛍光の変化は観察できる。
いて、検出用核酸の第一のオリゴヌクレオチドは、ハイ
ブリッド形成時に蛍光に変化が生じるように、標的配列
にハイブリッド形成される。従って、検出用核酸がハイ
ブリッド形成プローブとして使用される場合には、標的
と結合する一本鎖配列は第一のオリゴヌクレオチドの
５’末端または３’末端のいずれにあってもよい。即
ち、プライマー伸長は必要ないため、検出用核酸の二本
鎖部分は、任意で標的結合配列の一部を含む一本鎖尾部
の５’または３のいずれにあってもよい。この実施例に
おいて、検出用核酸の分子間塩基対合部分は好ましく
は、標的結合配列部分を含み、３’または５’一本鎖尾
部に標的との非競合的ハイブリッド形成に利用可能な残
りの標的結合配列が存在する。これによって、ハイブリ
ッド形成が起こると検出用核酸の二本鎖部分が部分的ま
たは完全に崩壊され、第二のオリゴヌクレオチドの一部
又はすべてに置換が起きて、２つの染料間距離が開き、
蛍光消光が減少する。しかし、結合配列が全て検出用核
酸の一本鎖尾部に存在し、標的と第二のオリゴヌクレオ
チドとの塩基対合に関わる第一のオリゴヌクレオチドの
配列との間に塩基対合が不可能な場合でも、ハイブリッ
ド形成時にも蛍光の変化は観察できる。
【００３４】標的が存在する場合、検出用核酸のハイブ
リッド形成プローブは、まず一本鎖尾部を介して、標的
と非競合的にハイブリッド形成する。これによって、検
出用核酸の二本鎖部分に存在する第一のオリゴヌクレオ
チドの標的と相補的な配列は全て、標的のそれらと相補
的な配列と接近する。二本鎖部分にある第一のオリゴヌ
クレオチドの標的結合配列は、標的のそれと相補的な配
列とハイブリッド形成し、それによって検出用核酸の分
子内塩基対合を崩壊し、競合的ハイブリッド形成により
第一のオリゴヌクレオチドから第二のオリゴヌクレオチ
ドが部分的、または完全に分離されるにつれ、ドナーお
よびアクセプター染料間距離が開く。その結果生じる蛍
光パラメーターの変化は、標的配列の存在の指標として
検出される。第一のオリゴヌクレオチドの一本鎖５’ま
たは３’尾部と標的配列との結合は、標的の相補的配列
と第一のオリゴヌクレオチドの塩基対合部分を接近さ
せ、第一のオリゴヌクレオチドと標的の分子間塩基対合
に有利となることにより、検出用核酸二本鎖の崩壊を促
進するものと考えられる。この様な協同的結合により、
標的は第一のオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成
に関して、第二のオリゴヌクレオチドの対応する配列に
対し、より効果的に競合する。第一のオリゴヌクレオチ
ドの３’または５’尾部にある標的と結合する一本鎖配
列による協同的結合がない場合、検出用核酸の二本鎖部
分はそのままの状態を維持する傾向を示し、標的が存在
しても蛍光に変化は全くあるいは殆ど観察されない。
リッド形成プローブは、まず一本鎖尾部を介して、標的
と非競合的にハイブリッド形成する。これによって、検
出用核酸の二本鎖部分に存在する第一のオリゴヌクレオ
チドの標的と相補的な配列は全て、標的のそれらと相補
的な配列と接近する。二本鎖部分にある第一のオリゴヌ
クレオチドの標的結合配列は、標的のそれと相補的な配
列とハイブリッド形成し、それによって検出用核酸の分
子内塩基対合を崩壊し、競合的ハイブリッド形成により
第一のオリゴヌクレオチドから第二のオリゴヌクレオチ
ドが部分的、または完全に分離されるにつれ、ドナーお
よびアクセプター染料間距離が開く。その結果生じる蛍
光パラメーターの変化は、標的配列の存在の指標として
検出される。第一のオリゴヌクレオチドの一本鎖５’ま
たは３’尾部と標的配列との結合は、標的の相補的配列
と第一のオリゴヌクレオチドの塩基対合部分を接近さ
せ、第一のオリゴヌクレオチドと標的の分子間塩基対合
に有利となることにより、検出用核酸二本鎖の崩壊を促
進するものと考えられる。この様な協同的結合により、
標的は第一のオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成
に関して、第二のオリゴヌクレオチドの対応する配列に
対し、より効果的に競合する。第一のオリゴヌクレオチ
ドの３’または５’尾部にある標的と結合する一本鎖配
列による協同的結合がない場合、検出用核酸の二本鎖部
分はそのままの状態を維持する傾向を示し、標的が存在
しても蛍光に変化は全くあるいは殆ど観察されない。
【００３５】従って、最初に標的が検出用核酸の塩基対
合配列とハイブリッド形成する必要がない点が本発明の
特徴である。最初に競合的ハイブリッド形成を行う場合
には、標的に対するプローブまたはプライマーの親和性
は低くなり、分析の鋭敏度は低くなる。これに反して、
本発明の最初に非競合的結合を生じる方法は、その後の
競合的ハイブリッド形成反応における分子間ハイブリッ
ド形成により有利である。一本鎖３’または５’尾部の
長さは、検出用核酸二本鎖の熱力学的特性に影響せずに
調節することができ、従って、検出用核酸の二本鎖を再
デザインする必要なく、標的のハイブリッド形成を至適
化できる。これによって、従来の技術と比較するとプロ
ーブとプライマーのデザインが大幅に簡素化される。
合配列とハイブリッド形成する必要がない点が本発明の
特徴である。最初に競合的ハイブリッド形成を行う場合
には、標的に対するプローブまたはプライマーの親和性
は低くなり、分析の鋭敏度は低くなる。これに反して、
本発明の最初に非競合的結合を生じる方法は、その後の
競合的ハイブリッド形成反応における分子間ハイブリッ
ド形成により有利である。一本鎖３’または５’尾部の
長さは、検出用核酸二本鎖の熱力学的特性に影響せずに
調節することができ、従って、検出用核酸の二本鎖を再
デザインする必要なく、標的のハイブリッド形成を至適
化できる。これによって、従来の技術と比較するとプロ
ーブとプライマーのデザインが大幅に簡素化される。
【００３６】標的の存在の有無の検出および標的の増幅
の検出に加えて、本発明の核酸は１つまたはそれ以上の
ヌクレオチドが異なる標的を識別するためのプライマー
またはハイブリッド形成プローブとして使用できる。こ
の様な分析を行うために、検出用核酸の一本鎖尾部の標
的結合配列は、検出用核酸二本鎖部分の分子間塩基対合
に関与する第一のオリゴヌクレオチドの１つ以上のヌク
レオチドと標的の塩基対合によりハイブリッド形成が増
強される場合に限り、標的との安定したハイブリッド形
成が起こるように選択される。検出用核酸は更に、検出
すべき１つ以上ヌクレオチドに差がある標的とのハイブ
リッド形成により、尾部配列または第二のオリゴヌクレ
オチドとハイブリッド形成する第一のオリゴヌクレオチ
ドの配列に、１つ以上のミスマッチが生じるようにデザ
インされる。第一のオリゴヌクレオチドと第二のオリゴ
ヌクレオチドの再ハイブリッド形成による競合と相まっ
て、ミスマッチによる安定性の低下により、ヌクレオチ
ドに差がある標的とのハイブリッド形成は減少するた
め、完全にマッチした標的（即ちヌクレオチドに差がな
い標的）と比較すると、蛍光の変化の大きさは減少す
る。ミスマッチの数が少ないほど、蛍光の変化は大きく
なる。ミスマッチの数が減少するにつれ、蛍光の変化の
大きさは完全にマッチした配列に観察される程度まで近
づくが、１つのヌクレオチドの違いを識別することは可
能である。同様の方法を使用してフレームシフト突然変
異を検出することができる。
の検出に加えて、本発明の核酸は１つまたはそれ以上の
ヌクレオチドが異なる標的を識別するためのプライマー
またはハイブリッド形成プローブとして使用できる。こ
の様な分析を行うために、検出用核酸の一本鎖尾部の標
的結合配列は、検出用核酸二本鎖部分の分子間塩基対合
に関与する第一のオリゴヌクレオチドの１つ以上のヌク
レオチドと標的の塩基対合によりハイブリッド形成が増
強される場合に限り、標的との安定したハイブリッド形
成が起こるように選択される。検出用核酸は更に、検出
すべき１つ以上ヌクレオチドに差がある標的とのハイブ
リッド形成により、尾部配列または第二のオリゴヌクレ
オチドとハイブリッド形成する第一のオリゴヌクレオチ
ドの配列に、１つ以上のミスマッチが生じるようにデザ
インされる。第一のオリゴヌクレオチドと第二のオリゴ
ヌクレオチドの再ハイブリッド形成による競合と相まっ
て、ミスマッチによる安定性の低下により、ヌクレオチ
ドに差がある標的とのハイブリッド形成は減少するた
め、完全にマッチした標的（即ちヌクレオチドに差がな
い標的）と比較すると、蛍光の変化の大きさは減少す
る。ミスマッチの数が少ないほど、蛍光の変化は大きく
なる。ミスマッチの数が減少するにつれ、蛍光の変化の
大きさは完全にマッチした配列に観察される程度まで近
づくが、１つのヌクレオチドの違いを識別することは可
能である。同様の方法を使用してフレームシフト突然変
異を検出することができる。
【００３７】第二のオリゴヌクレオチドの完全または部
分的な置換により生じる蛍光の変化は、反応の選択され
た終点において検出できる。しかし、完全または部分的
に置換された第二のオリゴヌクレオチドは、ハイブリッ
ド形成またはプライマー伸長と同時に生成されるため、
蛍光の変化も反応と同時に、即ち「リアルタイム」で監
視できる。この均一系リアルタイム分析様式は、存在す
る標的の初期量に関して半定量的または定量的情報を提
供するために使用できる。例えば、第二のオリゴヌクレ
オチドの置換反応（標的増幅の一部として、あるいは非
増幅検出法において）中の蛍光強度の変化速度は、初期
標的量の指標となる。その結果、標的配列の初期コピー
がより多く存在するほど、ドナー蛍光はより迅速に選択
された閾値に到達する（すなわち陽性となるまでの時間
が短い）。アクセプター蛍光の減少も同様に、選択され
た最小値に到達するために必要な時間として検出され
る、陽性までの時間は短くなる。更に、第二のオリゴヌ
クレオチドの置換反応過程における蛍光パラメーターの
変化速度は、初期標的量が少ない試料よりも、初期標的
量が多い試料によいてより迅速である（即ち、蛍光曲線
の勾配が高い）。本技術において公知のこれらの測定値
またはその他の測定値を、標的の存在の指標として、ま
たは標的の増幅の指標とすることができる。初期標的量
は、典型的には、既知の標的量に関する結果と実験結果
を比較することにより決定される。本発明の方法による
選択された標的配列の存在に関する分析は、溶液中また
は固相上で実施できる。検出用核酸がプライマーとして
作用するリアルタイムまたは終点均一系分析は、典型的
には、溶液中で実施できる。本発明の検出用核酸を使用
するハイブリッド形成分析も溶液中で実施できるが（例
えば、均一系リアルタイム分析の様に）、標的のリアル
タイムまたは終点検出のための固相分析にも特に適して
いる。固相分析において、検出用核酸は本技術において
公知の方法を用いて内部または末端標識を介して固相
（例えば、ビーズ、膜または反応容器）に固定できる。
例えば、ビオチンで標識された検出用核酸は、適切なハ
イブリッド形成条件において標的に曝露されると蛍光に
変化を生じる、アビジンで修飾された固相に固定され
る。この方法による標的の捕捉により、試料からの標的
の分離が促進され、シグナルまたはその他の要素の分析
を障害する可能性がある試料中の物質を除去することが
できる。
分的な置換により生じる蛍光の変化は、反応の選択され
た終点において検出できる。しかし、完全または部分的
に置換された第二のオリゴヌクレオチドは、ハイブリッ
ド形成またはプライマー伸長と同時に生成されるため、
蛍光の変化も反応と同時に、即ち「リアルタイム」で監
視できる。この均一系リアルタイム分析様式は、存在す
る標的の初期量に関して半定量的または定量的情報を提
供するために使用できる。例えば、第二のオリゴヌクレ
オチドの置換反応（標的増幅の一部として、あるいは非
増幅検出法において）中の蛍光強度の変化速度は、初期
標的量の指標となる。その結果、標的配列の初期コピー
がより多く存在するほど、ドナー蛍光はより迅速に選択
された閾値に到達する（すなわち陽性となるまでの時間
が短い）。アクセプター蛍光の減少も同様に、選択され
た最小値に到達するために必要な時間として検出され
る、陽性までの時間は短くなる。更に、第二のオリゴヌ
クレオチドの置換反応過程における蛍光パラメーターの
変化速度は、初期標的量が少ない試料よりも、初期標的
量が多い試料によいてより迅速である（即ち、蛍光曲線
の勾配が高い）。本技術において公知のこれらの測定値
またはその他の測定値を、標的の存在の指標として、ま
たは標的の増幅の指標とすることができる。初期標的量
は、典型的には、既知の標的量に関する結果と実験結果
を比較することにより決定される。本発明の方法による
選択された標的配列の存在に関する分析は、溶液中また
は固相上で実施できる。検出用核酸がプライマーとして
作用するリアルタイムまたは終点均一系分析は、典型的
には、溶液中で実施できる。本発明の検出用核酸を使用
するハイブリッド形成分析も溶液中で実施できるが（例
えば、均一系リアルタイム分析の様に）、標的のリアル
タイムまたは終点検出のための固相分析にも特に適して
いる。固相分析において、検出用核酸は本技術において
公知の方法を用いて内部または末端標識を介して固相
（例えば、ビーズ、膜または反応容器）に固定できる。
例えば、ビオチンで標識された検出用核酸は、適切なハ
イブリッド形成条件において標的に曝露されると蛍光に
変化を生じる、アビジンで修飾された固相に固定され
る。この方法による標的の捕捉により、試料からの標的
の分離が促進され、シグナルまたはその他の要素の分析
を障害する可能性がある試料中の物質を除去することが
できる。
【００３８】本技術において公知の多くのドナー／アク
セプター染料が本発明において有用である。これらに
は、例えば、フルオレセインイソシアナート（ＦＩＴ
Ｃ）／テトラメチルローダミンイソシアナート（ＴＲＩ
ＴＣ）、ＦＩＴＣ／テキサスレッドTM（モレキュラープ
ローブス）、ＦＩＴＣ／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジ
ル１−ピレンブチレート（ＰＹＢ）、ＦＩＴＣ／エオシ
ンイソシアナート（ＥＩＴＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミジル １−ピレンスルホネート（ＰＹＳ）／ＦＩ
ＴＣ 、ＦＩＴＣ／ローダミンＸ、ＦＩＴＣ／テトラメ
チルローダミン（ＴＡＭＲＡ）等が含まれる。特定のド
ナー／アクセプター発蛍光団対を選択することは重要で
はない。エネルギー移動消光機序にとって、ドナー発蛍
光団の放射波長がアクセプター発蛍光団の励起波長と重
なることだけが必要である。すなわち２つの染料間のス
ペクトルが十分に重なっており、十分なエネルギー移
動、電荷移動または蛍光消光が可能でなくてはならな
い。Ｐ−（ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（Ｄ
ＡＢＣＹＬ）は、フルオレセインまたは５−（２’−ア
ミノエチル）アミノナフタレン（ＥＤＡＮＳ）等の隣接
する発蛍光団から蛍光を有効に消光する非蛍光アクセプ
ター染料である。特定のドナー／アクセプター対は上記
と以下の実施例に例示されているが、その他も本発明に
おいて有用であることは、本技術に精通する者にとって
明らかである。本発明のシグナルプライマーにおいて蛍
光消光を生じる染料対はいずれも、消光発生機序に関わ
りなく、本発明の方法における使用に適している。末端
および内部標識法も本技術において公知であり、シグナ
ルプライマーのそれぞれの部位においてドナーおよびア
クセプター染料を結合するためにルーチンに利用でき
る。
セプター染料が本発明において有用である。これらに
は、例えば、フルオレセインイソシアナート（ＦＩＴ
Ｃ）／テトラメチルローダミンイソシアナート（ＴＲＩ
ＴＣ）、ＦＩＴＣ／テキサスレッドTM（モレキュラープ
ローブス）、ＦＩＴＣ／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジ
ル１−ピレンブチレート（ＰＹＢ）、ＦＩＴＣ／エオシ
ンイソシアナート（ＥＩＴＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミジル １−ピレンスルホネート（ＰＹＳ）／ＦＩ
ＴＣ 、ＦＩＴＣ／ローダミンＸ、ＦＩＴＣ／テトラメ
チルローダミン（ＴＡＭＲＡ）等が含まれる。特定のド
ナー／アクセプター発蛍光団対を選択することは重要で
はない。エネルギー移動消光機序にとって、ドナー発蛍
光団の放射波長がアクセプター発蛍光団の励起波長と重
なることだけが必要である。すなわち２つの染料間のス
ペクトルが十分に重なっており、十分なエネルギー移
動、電荷移動または蛍光消光が可能でなくてはならな
い。Ｐ−（ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（Ｄ
ＡＢＣＹＬ）は、フルオレセインまたは５−（２’−ア
ミノエチル）アミノナフタレン（ＥＤＡＮＳ）等の隣接
する発蛍光団から蛍光を有効に消光する非蛍光アクセプ
ター染料である。特定のドナー／アクセプター対は上記
と以下の実施例に例示されているが、その他も本発明に
おいて有用であることは、本技術に精通する者にとって
明らかである。本発明のシグナルプライマーにおいて蛍
光消光を生じる染料対はいずれも、消光発生機序に関わ
りなく、本発明の方法における使用に適している。末端
および内部標識法も本技術において公知であり、シグナ
ルプライマーのそれぞれの部位においてドナーおよびア
クセプター染料を結合するためにルーチンに利用でき
る。
【００３９】以下の実験の実施例の標的ＤＮＡは、５０
％グリセロールに１０6 基本小体（ＥＢ）／μＬの濃度
で保存されたトラコーマクラミジアの基本小体（ＥＢ）
の原液から調製された。ＥＢ原液を１：１０で水に希釈
し、１５分間煮沸し、１０ｎｇ／μＬヒト胎盤ＤＮＡで
希釈した１０倍連続希釈液を調製した。ドナー発蛍光団
を５’リン酸に結合した。試料コンパートメントの温度
を維持するための循環浴、キセノンアークランプ、励起
および放射波長を調節するための格子モノクロメーター
を装備したＳＬＭ８１００研究グレード蛍光計により測
定値が得られた。ドナーとしてフルオレセイン（ＦＡ
Ｍ）を用いる実験では、励起波長に４８８ｎｍを、放射
波長に５２５ｎｍを使用した。
％グリセロールに１０6 基本小体（ＥＢ）／μＬの濃度
で保存されたトラコーマクラミジアの基本小体（ＥＢ）
の原液から調製された。ＥＢ原液を１：１０で水に希釈
し、１５分間煮沸し、１０ｎｇ／μＬヒト胎盤ＤＮＡで
希釈した１０倍連続希釈液を調製した。ドナー発蛍光団
を５’リン酸に結合した。試料コンパートメントの温度
を維持するための循環浴、キセノンアークランプ、励起
および放射波長を調節するための格子モノクロメーター
を装備したＳＬＭ８１００研究グレード蛍光計により測
定値が得られた。ドナーとしてフルオレセイン（ＦＡ
Ｍ）を用いる実験では、励起波長に４８８ｎｍを、放射
波長に５２５ｎｍを使用した。
【００４０】
【実施例】実施例１ ＳＤＡは、一般に欧州特許第０６８４３１５号に記載さ
れているように実施し、第一のオリゴヌクレオチドの
５’末端をＦＡＭで、第二のオリゴヌクレオチドをＤａ
ｂｃｙｌで標識された検出用核酸シグナルプライマーを
加えた。各１００μＬの反応液中の最終成分濃度は、４
０ｍＭのＫｉＰＯ4 （ｐＨ７．５）、６ｍＭのＭｇＯＡ
ｃ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、１．
４ｍＭのｄＣＴＰαＳ、２０μｇ／μＬのアセチル化Ｂ
ＳＡ、３％のＤＭＳＯ、８％（ｖ／ｖ）のグリセロー
ル、１００ｎｇのヒト胎盤ＤＮＡ、２５単位Ｂｓｔのポ
リメラーゼ（ｅｘｏ- クレノウフラグメント、Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、１５０単位のＡｖ
ａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，ベバ
リー、マサチューセッツ州）、０個、１０個、１００個
または１０００個のトラコーマクラミジアＤＮＡであっ
た。各試料は更に表示された濃度で以下の４種類のプラ
イマーを含んでいた。
れているように実施し、第一のオリゴヌクレオチドの
５’末端をＦＡＭで、第二のオリゴヌクレオチドをＤａ
ｂｃｙｌで標識された検出用核酸シグナルプライマーを
加えた。各１００μＬの反応液中の最終成分濃度は、４
０ｍＭのＫｉＰＯ4 （ｐＨ７．５）、６ｍＭのＭｇＯＡ
ｃ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、１．
４ｍＭのｄＣＴＰαＳ、２０μｇ／μＬのアセチル化Ｂ
ＳＡ、３％のＤＭＳＯ、８％（ｖ／ｖ）のグリセロー
ル、１００ｎｇのヒト胎盤ＤＮＡ、２５単位Ｂｓｔのポ
リメラーゼ（ｅｘｏ- クレノウフラグメント、Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、１５０単位のＡｖ
ａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，ベバ
リー、マサチューセッツ州）、０個、１０個、１００個
または１０００個のトラコーマクラミジアＤＮＡであっ
た。各試料は更に表示された濃度で以下の４種類のプラ
イマーを含んでいた。
【００４１】検出用核酸（第一のオリゴヌクレオチド、
配列番号１、２００ｎＭ） ＴＡＧＣＣＧＡＣＧＴＧＣＧＡＧＣＣＧＡＴＡＧＡＧＴ
ＣＴＴＣＡＡＡＴＡＴＣＡＧＡＧＣＴＴＴＡＣＣＴＡＡ
ＣＡＡ 検出用核酸（第二のオリゴヌクレオチド、配列番号２、
４００ｎＭ） ＡＣＴＣＴＡＴＣＧＧＣＴＣＧＣＡＣＧＴＣＧＧＣＴＡ 増幅プライマーＳ１．１（配列番号３、７５０ｎＭ） ＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＡＴＣＧＡＴＧＴＣＴＣＧＧＧＴ
ＡＧＡＡＡＡＴＣＧＣＡＴＧＣＡＡＧＡＴＡ 増幅プライマーＳ２．１（配列番号４、１８８ｎＭ） ＣＧＡＴＴＣＣＧＣＴＣＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＧＧＧＡ
ＧＣＴＧＣＣＴＣＡＧＡＡＴＡＴＡＣＴＣＡＧ バンパープライマーＢ１（配列番号５、７５ｎＭ） ＴＡＡＡＣＡＴＧＡＡＡＡＣＴＣＧＴＴＣＣＧ バンパープライマーＢ２（配列番号６、７５ｎＭ） ＴＴＴＴＡＴＧＡＴＧＡＧＡＡＣＡＣＴＴＡＡＡＣＴＣ
Ａ
配列番号１、２００ｎＭ） ＴＡＧＣＣＧＡＣＧＴＧＣＧＡＧＣＣＧＡＴＡＧＡＧＴ
ＣＴＴＣＡＡＡＴＡＴＣＡＧＡＧＣＴＴＴＡＣＣＴＡＡ
ＣＡＡ 検出用核酸（第二のオリゴヌクレオチド、配列番号２、
４００ｎＭ） ＡＣＴＣＴＡＴＣＧＧＣＴＣＧＣＡＣＧＴＣＧＧＣＴＡ 増幅プライマーＳ１．１（配列番号３、７５０ｎＭ） ＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＡＴＣＧＡＴＧＴＣＴＣＧＧＧＴ
ＡＧＡＡＡＡＴＣＧＣＡＴＧＣＡＡＧＡＴＡ 増幅プライマーＳ２．１（配列番号４、１８８ｎＭ） ＣＧＡＴＴＣＣＧＣＴＣＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＧＧＧＡ
ＧＣＴＧＣＣＴＣＡＧＡＡＴＡＴＡＣＴＣＡＧ バンパープライマーＢ１（配列番号５、７５ｎＭ） ＴＡＡＡＣＡＴＧＡＡＡＡＣＴＣＧＴＴＣＣＧ バンパープライマーＢ２（配列番号６、７５ｎＭ） ＴＴＴＴＡＴＧＡＴＧＡＧＡＡＣＡＣＴＴＡＡＡＣＴＣ
Ａ
【００４２】検出用核酸は、標的と第二のオリゴヌクレ
オチドの両者に相補的な配列（下線で表示）を含んでい
た。標的を含まない試料はＳＤＡ反応を不可能にするた
めに、５ｍＭのＥＤＴＡも含んでいた。各反応は、Ｂｓ
ｔとＡｖａＩを除いて全ての試薬を含むように組み立て
られ、次に試料は９５℃で２分間加熱された。これらを
５３℃の水浴に３〜５分間移し、総量１００μＬの試料
に酵素を加えた。次に試料を２２５μＬのキュベットに
移し、研究グレードＳＬＭ ８１００蛍光計（Ｓｐｅｃ
ｔｒｏｎｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ロチェスタ
ー、ニューヨーク州）の中に入れた。キュベットの温度
を循環水浴により５３〜５４℃に維持し、５２０ｎｍ
（λ励起＝４８８ｎｍ）における各キュベットの蛍光放
射を８秒毎に記録した。典型的に、反応はその後６０〜
９０分間続いた。
オチドの両者に相補的な配列（下線で表示）を含んでい
た。標的を含まない試料はＳＤＡ反応を不可能にするた
めに、５ｍＭのＥＤＴＡも含んでいた。各反応は、Ｂｓ
ｔとＡｖａＩを除いて全ての試薬を含むように組み立て
られ、次に試料は９５℃で２分間加熱された。これらを
５３℃の水浴に３〜５分間移し、総量１００μＬの試料
に酵素を加えた。次に試料を２２５μＬのキュベットに
移し、研究グレードＳＬＭ ８１００蛍光計（Ｓｐｅｃ
ｔｒｏｎｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ロチェスタ
ー、ニューヨーク州）の中に入れた。キュベットの温度
を循環水浴により５３〜５４℃に維持し、５２０ｎｍ
（λ励起＝４８８ｎｍ）における各キュベットの蛍光放
射を８秒毎に記録した。典型的に、反応はその後６０〜
９０分間続いた。
【００４３】図２に結果を示す。増幅反応を不可能にし
た標的を含まない対照反応においては、蛍光は低いまま
であったが（消光）、１０、１００、１０００の標的を
含む反応においては、標的増幅の特異的検出を示した。
更に、ドナー蛍光強度の増加速度（ドナーの消光減少速
度の測定値）は、初期標的数が多い試料よりも迅速であ
った。従って、ドナー蛍光の増加速度は、リアルタイム
の増幅の検出だけでなく、初期標的量の半定量的または
相対的測定も可能にする。未知量の標的を含む試料の蛍
光の増加速度を、種々の既知量の標的を含む一連の反応
溶液の蛍光の増加と比較することにより（本技術におい
て公知の方法で標準曲線を作製する）、未知試料の標的
の定量測定値も得られる。あるいは、予め決定した閾値
を超える蛍光強度の増加の検出は、簡単な陽性／陰性分
析方式において標的が存在し、増幅されたことを示すも
のとして使用できる。
た標的を含まない対照反応においては、蛍光は低いまま
であったが（消光）、１０、１００、１０００の標的を
含む反応においては、標的増幅の特異的検出を示した。
更に、ドナー蛍光強度の増加速度（ドナーの消光減少速
度の測定値）は、初期標的数が多い試料よりも迅速であ
った。従って、ドナー蛍光の増加速度は、リアルタイム
の増幅の検出だけでなく、初期標的量の半定量的または
相対的測定も可能にする。未知量の標的を含む試料の蛍
光の増加速度を、種々の既知量の標的を含む一連の反応
溶液の蛍光の増加と比較することにより（本技術におい
て公知の方法で標準曲線を作製する）、未知試料の標的
の定量測定値も得られる。あるいは、予め決定した閾値
を超える蛍光強度の増加の検出は、簡単な陽性／陰性分
析方式において標的が存在し、増幅されたことを示すも
のとして使用できる。
【００４４】実施例２ 第一のオリゴヌクレオチドの標的結合配列がが分子の二
本鎖部分の中にまで伸びていない検出用核酸（配列番号
７、５’末端をフルオレセインで標識）を代わりに用い
て、実施例１の実験を繰り返した。
本鎖部分の中にまで伸びていない検出用核酸（配列番号
７、５’末端をフルオレセインで標識）を代わりに用い
て、実施例１の実験を繰り返した。
【００４５】ＴＡＧＡＣＧＴＧＣＧＡＧＣＧＧＡＣＴＣ
ＡＧＴＣＴＴＣＡＡＡＴＡＴＣＡＧＡＧＣＴＴＴＡＣＣ
ＴＡＡＣＡＡ
ＡＧＴＣＴＴＣＡＡＡＴＡＴＣＡＧＡＧＣＴＴＴＡＣＣ
ＴＡＡＣＡＡ
【００４６】３’末端をＤａｂｃｙｌまたはＲＯＸで標
識した配列番号８を検出用核酸の第二のオリゴヌクレオ
チドとして使用し、配列番号７の３倍過量を反応液中に
含めた。この実験において０対照試料には標的を全く含
めなかった。結果を図４に示す。標的を含まない対照反
応液においては、蛍光は低いままであったが（消光）、
１０、１００、１０００の標的を含む反応においては、
測定可能に増加し、標的増幅の特異的検出を示した。前
記の様に、ドナー蛍光強度の増加速度は、初期標的数が
多い試料よりも迅速であり、未知試料の標的量の定量だ
けでなく、初期標的量の半定量的または相対的測定も可
能にする。
識した配列番号８を検出用核酸の第二のオリゴヌクレオ
チドとして使用し、配列番号７の３倍過量を反応液中に
含めた。この実験において０対照試料には標的を全く含
めなかった。結果を図４に示す。標的を含まない対照反
応液においては、蛍光は低いままであったが（消光）、
１０、１００、１０００の標的を含む反応においては、
測定可能に増加し、標的増幅の特異的検出を示した。前
記の様に、ドナー蛍光強度の増加速度は、初期標的数が
多い試料よりも迅速であり、未知試料の標的量の定量だ
けでなく、初期標的量の半定量的または相対的測定も可
能にする。
【００４７】実施例３ 以下のオリゴヌクレオチドを用いて、３ヶ所のオリゴヌ
クレオチド接合構造と２つのドナー／アクセプター染料
対を含む検出用核酸をデザインした。
クレオチド接合構造と２つのドナー／アクセプター染料
対を含む検出用核酸をデザインした。
【００４８】第一のオリゴヌクレオチド（配列番号８、
５’末端をフルオレセインで標識） ＧＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＡＧＴＧＴＣＣＴＧＧＣＴＡＧ
ＡＧＴＣＴＴＣＡＡＡＴＡＴＣＡＧＡＧＣＴＴＴＡＣＣ
ＴＡＡＣＡＡ 第二のオリゴヌクレオチド＃１（配列番号９、３’末端
をフルオレセインで標識） ＧＣＣＡＧＧＡＣＡＣＧＧＡＧＡＧＧ 第二のオリゴヌクレオチド＃２（配列番号１０、５’末
端と３’末端をＤａｂｃｙｌで標識） ＣＣＴＣＴＣＣＣＧＣＴＣＧＣＴＣＣ
５’末端をフルオレセインで標識） ＧＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＡＧＴＧＴＣＣＴＧＧＣＴＡＧ
ＡＧＴＣＴＴＣＡＡＡＴＡＴＣＡＧＡＧＣＴＴＴＡＣＣ
ＴＡＡＣＡＡ 第二のオリゴヌクレオチド＃１（配列番号９、３’末端
をフルオレセインで標識） ＧＣＣＡＧＧＡＣＡＣＧＧＡＧＡＧＧ 第二のオリゴヌクレオチド＃２（配列番号１０、５’末
端と３’末端をＤａｂｃｙｌで標識） ＣＣＴＣＴＣＣＣＧＣＴＣＧＣＴＣＣ
【００４９】５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１
０ｍＭのＭｇＣｌ2 、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭの
ｄＴＴＰ、１０ｍＭのｄＣＴＰ、１０ｍＭのｄＧＴＰ、
１０ｍＭのｄＡＴＰ、５単位ｅｘｏ- クレノウ、および
種々の量の３ヶ所の接合を持つ検出用核酸（５０ｎＭ
配列番号８、５０ｎＭ配列番号９および１００ｎＭ配列
番号１０）を含む２つの１００μＬのキュベットを調製
し、３７℃に予め加熱した試料箱付きＳＬＭ ８１００
の中に入れた。対照反応液には、第一のオリゴヌクレオ
チド（５０ｎＭ 配列番号８）と１本の第二のオリゴヌ
クレオチド（１００ｎＭ 配列番号１０）を含め、１組
の染料対を有する検出用核酸が生成された。初期放射ス
キャンを測定した（励起４８８ｎｍ、スリット１ｎｍ／
１ｎｍ；放射５２０ｎｍ、スリット５ｎｍ／５ｎｍ）。
光退色がないことを確認するために、蛍光強度を経時的
に監視した。数分後、配列番号８の３’末端と相補的な
５００ｎＭのプライマー（ＪＢＰ５９，ＴＴＧＴＴＡＧ
ＧＴＡＡＡＧＣＴＣＴＧＡＴＡＴＴＴＧＡＡＧ、配列番
号１１）を各キュベットに加え、ポリメラーゼ伸長反応
を開始した。蛍光シグナル強度がプラトーに達したら、
放射スキャンが繰り返された。結果を以下の表に示す。
０ｍＭのＭｇＣｌ2 、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭの
ｄＴＴＰ、１０ｍＭのｄＣＴＰ、１０ｍＭのｄＧＴＰ、
１０ｍＭのｄＡＴＰ、５単位ｅｘｏ- クレノウ、および
種々の量の３ヶ所の接合を持つ検出用核酸（５０ｎＭ
配列番号８、５０ｎＭ配列番号９および１００ｎＭ配列
番号１０）を含む２つの１００μＬのキュベットを調製
し、３７℃に予め加熱した試料箱付きＳＬＭ ８１００
の中に入れた。対照反応液には、第一のオリゴヌクレオ
チド（５０ｎＭ 配列番号８）と１本の第二のオリゴヌ
クレオチド（１００ｎＭ 配列番号１０）を含め、１組
の染料対を有する検出用核酸が生成された。初期放射ス
キャンを測定した（励起４８８ｎｍ、スリット１ｎｍ／
１ｎｍ；放射５２０ｎｍ、スリット５ｎｍ／５ｎｍ）。
光退色がないことを確認するために、蛍光強度を経時的
に監視した。数分後、配列番号８の３’末端と相補的な
５００ｎＭのプライマー（ＪＢＰ５９，ＴＴＧＴＴＡＧ
ＧＴＡＡＡＧＣＴＣＴＧＡＴＡＴＴＴＧＡＡＧ、配列番
号１１）を各キュベットに加え、ポリメラーゼ伸長反応
を開始した。蛍光シグナル強度がプラトーに達したら、
放射スキャンが繰り返された。結果を以下の表に示す。
【００５０】
【表１】
【００５１】これらの結果は、１本の第二のオリゴヌク
レオチドと１組の染料対のみから成る検出用核酸より
も、３ヶ所接合構造を持つ検出用核酸が、標的が存在す
る場合の蛍光強度の増加が大きいことを証明している。
即ち、オリゴヌクレオチド接合構造により提供される、
検出用核酸の二本鎖部分に更なる「アーム」が存在する
ことにより、更に蛍光ドナー／アクセプター対の結合が
可能となり、標的存在下における蛍光シグナルの変化が
増大する。
レオチドと１組の染料対のみから成る検出用核酸より
も、３ヶ所接合構造を持つ検出用核酸が、標的が存在す
る場合の蛍光強度の増加が大きいことを証明している。
即ち、オリゴヌクレオチド接合構造により提供される、
検出用核酸の二本鎖部分に更なる「アーム」が存在する
ことにより、更に蛍光ドナー／アクセプター対の結合が
可能となり、標的存在下における蛍光シグナルの変化が
増大する。
SEQUENCE LISTING <110> Becton Dickinson and Company <120> Detection of Nucleic Acids by Fluorescence Q
uenching <130> P98784 <140> JP 10-267492 <141> 1998-09-22 <150> US 08/933749 <151> 1997-09-23 <160> 10 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Detector
nucleic acid <400> 1 tagccgacgt gcgagccgat agagtcttca aatatcagag ctttacctaa caa 53 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Detector
nucleic acid <400> 2 actctatcgg ctcgcacgtc ggcta 25 <210> 3 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Amplifica
tion primer <400> 3 accgcatcga atcgatgtct cgggtagaaa atcgcatgca agata 45 <210> 4 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Amplification primer <400> 4 cgattccgct ccagacttct cgggagctgc ctcagaatat actcag 46 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Bumper pr
imer <400> 5 taaacatgaa aactcgttcc g 21 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Bumper pr
imer <400> 6 ttttatgatg agaacactta aactca 26 <210> 7 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Detector
nucleic acid <400> 7 tagacgtgcg agcggactca gtcttcaaat atcagagctt tacctaacaa 50 <210> 8 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:First Oli
gonucleotide <400> 8 ggagcgagcg aagtgtcctg gctagagtct tcaaatatca gagctttacc taacaa 56 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence＜２２０＞ <223> Description of Artificial Sequence:Second Ol
igonucleotide <400> 9 gccaggacac ggagagg 17 <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Second Ol
igonucleotide <400> 10 cctctcccgc tcgctcc 17
uenching <130> P98784 <140> JP 10-267492 <141> 1998-09-22 <150> US 08/933749 <151> 1997-09-23 <160> 10 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Detector
nucleic acid <400> 1 tagccgacgt gcgagccgat agagtcttca aatatcagag ctttacctaa caa 53 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Detector
nucleic acid <400> 2 actctatcgg ctcgcacgtc ggcta 25 <210> 3 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Amplifica
tion primer <400> 3 accgcatcga atcgatgtct cgggtagaaa atcgcatgca agata 45 <210> 4 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Amplification primer <400> 4 cgattccgct ccagacttct cgggagctgc ctcagaatat actcag 46 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Bumper pr
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igonucleotide <400> 10 cctctcccgc tcgctcc 17
【図１】図１は、２本のオリゴヌクレオチドを含む検出
用核酸が、本発明のシグナルプライマーとして使用され
ている反応図を示す。
用核酸が、本発明のシグナルプライマーとして使用され
ている反応図を示す。
【図２】図２は、シグナルプライマーとして本発明の検
出用核酸を使用して標的が増幅されるにつれて、リアル
タイムで生じる蛍光強度の変化を示している。
出用核酸を使用して標的が増幅されるにつれて、リアル
タイムで生じる蛍光強度の変化を示している。
【図３】図３は、３ヶ所接合構造を例として、オリゴヌ
クレオチド接合構造を含む検出用核酸が、本発明のシグ
ナルプライマーとして使用されている反応図を示す。
クレオチド接合構造を含む検出用核酸が、本発明のシグ
ナルプライマーとして使用されている反応図を示す。
【図４】図４は、シグナルプライマーとして本発明の検
出用核酸を使用して標的が増幅されるにつれて、リアル
タイムで生じる蛍光強度の変化を示す。
出用核酸を使用して標的が増幅されるにつれて、リアル
タイムで生じる蛍光強度の変化を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (71)出願人 595117091 １ ＢＥＣＴＯＮ ＤＲＩＶＥ， ＦＲＡ ＮＫＬＩＮ ＬＡＫＥＳ， ＮＥＷ ＪＥ ＲＳＥＹ 07417−1880， ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ (72)発明者 ヘレン・ヴイ・シー アメリカ合衆国ノースカロライナ州27713, ダーラム，エイバークロンビー・ドライヴ 3602 (72)発明者 ジェイ・ブルース・ピトナー アメリカ合衆国ノースカロライナ州27712, ダーラム，クインスムーア・ロード 2903 (72)発明者 シー・プレストン・リン アメリカ合衆国ノースカロライナ州27707, ダーラム，トロッター・リッジ・ロード 4110
Claims (11)
- 【請求項１】 ａ）核酸の標的配列を検出用核酸とハイ
ブリッド形成させるステップと、ここで、該検出用核酸
は、 ｉ）該検出用核酸が分子間塩基対合部分と、標的と結合
する一本鎖配列とを含むように、第一のオリゴヌクレオ
チドよりも短い第二のオリゴヌクレオチドとハイブリッ
ド形成した第一のオリゴヌクレオチドと、 ｉｉ）第一または第二の染料の蛍光が消光されるよう
に、該検出用核酸に結合された蛍光ドナー／アクセプタ
ー染料対を形成する第一および第二の染料とを含んでな
り、 ｂ）プライマー伸長反応において、第一のオリゴヌクレ
オチドに対して相補的な鎖を合成し、これによって第一
のオリゴヌクレオチドから第二のオリゴヌクレオチドを
置換し、蛍光パラメーターを変化させるステップと、 ｃ）蛍光パラメーターの変化を、標的配列の存在の指標
として検出するステップとを含む核酸の標的配列の存在
を検出する方法。 - 【請求項２】 相補鎖が標的増幅反応において合成され
る請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 相補鎖が、鋳型として第一のオリゴヌク
レオチドを使用する標的配列の伸長により合成される請
求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 ａ）核酸の標的配列を検出用核酸とハイ
ブリッド形成させるステップと、ここで、該検出用核酸
は、 ｉ）該検出用核酸が分子間塩基対合部分と、標的と結合
する一本鎖配列とを含むように、第一のオリゴヌクレオ
チドよりも短い第二のオリゴヌクレオチドとハイブリッ
ド形成した第一のオリゴヌクレオチドと、 ｉｉ）第一または第二の染料の蛍光が消光されるよう
に、該検出用核酸に結合された蛍光ドナー／アクセプタ
ー染料対を形成する第一および第二の染料とを含んでな
り、 ｂ）該検出用核酸の伸長生成物を生成させるために、ポ
リメラーゼを用いて、標的配列上で該検出用核酸の第一
のオリゴヌクレオチドを伸長させ、標的配列から該検出
用核酸の伸長生成物を分離するステップと、 ｃ）プライマーを、該検出用核酸の伸長生成物の伸長さ
れた第一のオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成さ
せ、ポリメラーゼを用いてプライマーを伸長し、これに
よって伸長された第一のオリゴヌクレオチドから、第二
のオリゴヌクレオチドを置換して、蛍光パラメーターに
変化を引き起こすステップと、 ｄ）標的配列の増幅の指標として蛍光パラメーターの変
化を検出するステップとを含む増幅反応における標的配
列の増幅の検出方法。 - 【請求項５】 標的配列が、鎖置換増幅、ポリメラーゼ
連鎖反応、３５Ｒ、ＴＭＡまたはＮＡＳＢＡにより増幅
される請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 蛍光強度の変化がリアルタイムで検出さ
れる請求項４に記載の方法。 - 【請求項７】 ａ）核酸の標的配列を検出用核酸とハイ
ブリッド形成させるステップと、ここで、該検出用核酸
は、 ｉ）該検出用核酸が分子間塩基対合部分と、標的と結合
する一本鎖配列とを含むように、第一のオリゴヌクレオ
チドよりも短い第二のオリゴヌクレオチドとハイブリッ
ド形成した第一のオリゴヌクレオチドと、 ｉｉ）第一または第二の染料の蛍光が消光されるよう
に、該検出用核酸に結合された蛍光ドナー／アクセプタ
ー染料対を一緒になって形成する第一および第二の染料
とを含んでなり、 ｂ）標的と結合する該一本鎖配列により、標的配列に検
出用核酸をハイブリッド形成させ、これによって第一ま
たは第二の染料の消光を減少させ、蛍光パラメーターに
変化を引き起こすステップと、 ｃ）標的配列の存在の指標として蛍光パラメーターの変
化を検出するステップとを含む核酸の標的配列の検出方
法。 - 【請求項８】 検出用核酸の分子間塩基対合部分が標的
と結合する配列の一部を含む請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 検出用核酸であって、 ａ）該検出用核酸が分子間塩基対合部分と、標的と結合
する一本鎖配列とを含むように、第一のオリゴヌクレオ
チドよりも短い第二のオリゴヌクレオチドとハイブリッ
ド形成した第一のオリゴヌクレオチドと、ここで、分子
間塩基対結合部分における第一のオリゴヌクレオチド配
列は、選択された標的と少なくとも部分的に非相補的で
あり、 ｂ）第一または第二の染料が消光され、該検出用核酸の
分離により第一または第二の染料の消光が減少するよう
に、検出用核酸に結合された蛍光ドナー／アクセプター
染料対を形成する第一および第二の染料とを含んで成る
検出用核酸。 - 【請求項１０】 上記検出用核酸の分子間塩基対合部分
が標的と結合する配列の一部を含む請求項９に記載の検
出用核酸。 - 【請求項１１】 上記検出用核酸の分子間塩基対合部分
がオリゴヌクレオチド接合構造を形成するように、複数
の第二のオリゴヌクレオチドが上記第一のオリゴヌクレ
オチドと、そして第二のオリゴヌクレオチド相互間でハ
イブリッド形成する請求項９に記載の検出用核酸。
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