WO2007125822A1

WO2007125822A1 - 薬剤スクリーニングのための複合体

Info

Publication number: WO2007125822A1
Application number: PCT/JP2007/058582
Authority: WO
Inventors: Hiroshi Handa; Chika Sawa; Yasuaki Kabe; Satoshi Sakamoto; Kousuke Nishio; Tetsu Mau Chit Yung; Chikanori Kuramori; Shoichiro Furukawa; Satoshi Inoue
Original assignee: Tokyo Institute Of Technology; Chisso Corporation
Priority date: 2006-04-28
Filing date: 2007-04-20
Publication date: 2007-11-08
Also published as: JPWO2007125822A1

Abstract

　担体、生理活性物質、及びタンパク質を含む複合体であって、担体は生理活性物質と結合しており、生理活性物質はタンパク質と親和性を持ち、その親和性によってタンパク質と結合しており、タンパク質は発光物質又は蛍光物質で標識されている複合体、並びにこの複合体を用いた薬剤のスクリーニング方法を提供する。このスクリーニング方法は、病気の原因となるタンパク質に作用するが、強い副作用を持つことから、医薬品として利用できない化合物を有効に利用して、薬剤の効率的な探索を可能にする。

Description

明細書

薬剤スクリーニングのための複合体

技術分野

[0001] 本発明は、生理活性物質のスクリーニングに有効な複合体、およびそれを用いた薬剤スクリーニング方法に関する。

背景技術

[0002] 製薬会社を中心に行われている従来の薬剤探索方法は、標的とする酵素の活性の測定あるいは標的レセプターとの結合定数の測定、さらには様々な生細胞系での応答反応による生化学的な指標による評価で行われている。そのため、中には詳細な作用機構がわからないことにより、強い副作用、毒性がみられるなどの問題が起きている。また、病気の原因となるタンパク質に作用しつつも強い副作用により開発途中でドロップアウトし、臨床に進めない化合物が数多存在する。すなわち、標的酵素' レセプタータンパク質等に対する薬剤の効率的な探索方法が望まれている。

[0003] ところで、本発明者らは、フェライトナノ微粒子を有機ポリマーで被覆した磁性ビーズを開発している（特許文献 1)。この磁性ビーズは、磁気力によって分離、回収が可能なので、タンパク質などの高速、自動スクリーニングを可能にするものとして期待されている。

[0004] 特許文献 1 :特開 2006-88131号公報

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0005] 本発明は生理活性物質のスクリーニングに有効な複合体、およびそれを用いた薬剤のスクリーニング方法を提供するものである。本発明によれば、例えば、病気の原因となるタンパク質に作用するが、強い副作用を持つことから、医薬品として利用できない数多の化合物およびその化合物の誘導体を有効に利用し、薬剤の候補となる化合物を効率的に探索することが可能になる。本発明の複合体を用いてスクリーニングを行うことにより、新しい医薬等の効率的な開発が可能になる。

課題を解決するための手段 [0006] 本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた。その結果、標的とするタンパク質を、そのタンパク質と結合する生理活性物質を介して担体と固定しておくと、そこに標的タンパク質と結合する別の生理活性物質が存在する場合には、標的タンパク質が担体力競合的に遊離することに着目し、標的タンパク質を発光能を有する物質 (発光物質及び蛍光物質)等によって標識することにより、標的タンパク質の遊離 (即ち、タンパク質と結合する別の生理活性物質の存在）を光学的に検出できることを見出し、この知見に基づき、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、以下の（1)〜（： 16)を提供するものである。

[0007] (1)担体、生理活性物質、及びタンパク質を含む複合体であって、担体は生理活性物質と結合しており、生理活性物質はタンパク質と親和性を持ち、その親和性によつてタンパク質と結合しており、タンパク質は発光物質又は蛍光物質で標識されている複合体。

(2)担体が、有機ポリマーの被膜を有するフェライト粒子である、（1)に記載の複合体

(3)担体が消光性を有する、（1)又は（2)に記載の複合体。

(4)担体が、クェンチヤ一物質と結合した粒子である、（3)に記載の複合体。

(5)タンパク質が生理活性物質のレセプター又は生理活性物質を基質とする酵素であり、生理活性物質が疾病用の薬剤である、（1)乃至 (4)のいずれかに記載の複合体。

[0008] (6)発光物質が、発光能を有するタンパク質又は化学発光を触媒するタンパク質であるである、（1)乃至（5)のいずれかに記載の複合体。

(7)蛍光物質が、蛍光能を有する低分子有機化合物、又は蛍光能を有するタンパク質である、（1)乃至（5)のレ、ずれかに記載の複合体。

(8) (1)乃至（7)のレ、ずれかに記載の複合体を使用することを特徴とする薬剤のスクリーユング方法。

(9)被検化合物と（1)乃至（7)のレ、ずれかに記載の複合体とを溶媒中で共存させる工程、この溶媒から前記複合体を分離する工程、さらに、溶媒の発光強度又は蛍光強度を測定する工程を有する、（8)に記載の薬剤のスクリーニング方法。 [0009] (10)少なくとも、発光物質又は蛍光物質で標識されているタンパク質と、前記タンパク質と親和性を持つ生理活性物質と結合した担体と、被検化合物とを溶媒中に共存させる工程、この溶媒から担体を分離する工程、さらに、溶媒の発光強度又は蛍光強度を測定する工程を有する薬剤のスクリーニング方法。

(11)少なくとも、発光物質又は蛍光物質で標識されているタンパク質と、前記タンパク質と親和性を持つ生理活性物質と結合し且つ消光性を有する担体と、被検化合物とを溶媒中に共存させる工程、さらに、溶媒の発光強度又は蛍光強度を測定するェ程を有する薬剤のスクリーニング方法。

(12)担体が、有機ポリマーの被膜を有するフヱライト粒子である、（10)又は（11)に記載の薬剤のスクリーニング方法。

[0010] (13)担体力クェンチヤ一物質と結合した粒子である、（12)に記載の薬剤のスクリ一ユング方法。

(14)タンパク質が生理活性物質のレセプター又は生理活性物質を基質とする酵素であり、生理活性物質が疾病用の薬剤である、（10)乃至（13)のいずれかに記載の薬剤のスクリーニング方法。

(15)発光物質が、発光能を有するタンパク質又は化学発光を触媒するタンパク質である、（10)乃至（14)のレ、ずれかに記載の薬剤のスクリーニング方法。

(16)蛍光物質が、蛍光能を有する低分子有機化合物、又は蛍光能を有するタンパク質である、（10)乃至（14)のいずれかに記載の薬剤のスクリーニング方法。

発明の効果

[0011] 担体、生理活性物質、及びタンパク質を含む本発明の複合体を利用することにより、この複合体に使用されている生理活性物質とは異なる、前記タンパク質との親和性を有する生理活性物質を見つけ出すことができる。現在、病気の原因タンパク質と結合するが、副作用を持つことから医薬として利用できない生理活性物質が数多く存在する。このような生理活性物質を用いて、本発明のスクリーニング方法を実施することにより、標的タンパク質との結合性を維持しつつも改良された生理活性物質を効率的に取得することができる。

図面の簡単な説明 [0012] [図 1]本発明の第一のスクリーニング方法を模式的に表した図。 Aは被検物質がタンパク質と結合する場合、 Bは被検物質がタンパク質と結合しない場合をそれぞれ示す

[図 2]本発明の第二のスクリーニング方法を模式的に表した図。 Aは被検物質がタンパク質と結合する場合、 Bは被検物質がタンパク質と結合しない場合をそれぞれ示す

[図 3]磁性を持つ担体を使用したスクリーニング方法の一例を示した図（1)。 a :担体 -生理活性物質—タンパク質複合体、 b：競合作用によるスクリーニングと競合阻害によるタンパク質の遊離。

[図 4]磁性を持つ担体を使用したスクリーニング方法の一例を示した図（2)。 c：担体 —生理活性物質—タンパク質複合体、 d :競合作用によるスクリーニングと競合阻害によるタンパク質の遊離、 e :被検化合物とタンパク質との結合を検出。

[図 5]参考例 2で行った実験の結果を示す図。

[図 6]参考例 3で行った実験の結果を示す図。

[図 7]実施例 1で行った実験の結果を示す図。 *は rHis-DHFR-AQを示し、 * *は r His-DHFR-AQ分解産物を示す。

[図 8]実施例 3で行った実験 (タンパク質の検出）の結果を示す図。 MTXはメトトレキセート、 SRMはストレプトマイシン、 PNCはペニシリンをそれぞれ表す。

[図 9]実施例 3で行った実験 (発光強度測定）の結果を示す図。 MTXはメトトレキセート、 SRMはストレプトマイシン、 PNCはペニシリンをそれぞれ表す。

符号の説明

[0013] 1 消光性を持つ担体

2 生理活性物質

3 タンパク質

4 発光物質又は蛍光物質（白色は発光等している場合、黒色は発光等していない場合を示す。 )

5 被検化合物

6 磁性を持つ担体 (磁性ビーズ） 7 生理活性物質

8 タンパク質

9 イクオリン（白色は発光している場合、黒色は発光していない場合を示す。） 10 ケミカルライブラリー又は菌培液ライブラリー（被検化合物）

11 96ゥヱルプレート

12 リング状磁石

13 円筒

発明を実施するための最良の形態

[0014] 以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の複合体は、担体、生理活性物質、及びタンパク質を含むものであって、担体は生理活性物質と結合しており、生理活性物質はタンパク質と親和性を持ち、その親和性によってタンパク質と結合しており、タンパク質は発光物質又は蛍光物質で標識されているものである。

担体と生理活性物質間の結合の形態は特に限定されないが、本発明の複合体をスクリーニングに用いた際に、解離しないような比較的強固な結合であることが好ましレ、。

[0015] 生理活性物質とタンパク質間の結合は、両者の親和性によって結合できるものであれば特に限定されないが、本発明の複合体をスクリーニングに用いた際に、タンパク質と親和性を持つ別の生理活性物質が存在する場合には解離するような比較的弱い結合であることが好ましい。このような結合としては、受容体タンパク質とリガンド間の結合、酵素タンパク質とその基質間の結合などを例示できる。

[0016] 担体としては、通常、粒子状のものを使用するが、生理活性物質と結合し得るものであれば特に限定されず、例えば、基板のようなものを担体としてもよい。また、担体は溶媒中から容易に分離できる性質を持つもの、例えば、磁性を持つ担体などであることが好ましい。磁性を持つ担体としては、本発明者らによって開発された有機ポリマーの被膜を有するフェライト粒子を例示できる。有機ポリマーの被膜を有するフェライト粒子は、例えば、以下のようにして作製することができる。

[0017] 水溶液プロセスによって合成されるフェライト粒子表面を界面活性剤の二重膜によつて被覆をおこなう。表面を界面活性剤ミセルによって覆うことによってフェライト粒子表面での疎水性高分子の導入を容易にすることが可能である。二重膜によって被覆されたフェライト粒子存在下、ビュルモノマーの乳化重合を行なうことでフェライト粒子表面の高分子による被覆を行なうことが可能である。

[0018] 有機ポリマーの被膜を有するフェライト粒子の粒径は特に限定されないが、 5-300n mの範囲内であることが好ましレ、。被覆する有機ポリマーとしては、スチレンをベースとしたビュルモノマーとの共重合体、もしくはポリアクリル酸、ポリビュルアルコールなどの親水性高分子などが挙げられる。粒子表面に薬剤を固定化することが可能であればよいので、ほ力、には PEG、デキストラン、リン脂質、核酸、タンパク質などを被覆材料として使用してもよい。

[0019] 担体として、消光性を持つ担体を使用してもよい。消光性を持つ担体を使用することにより、後述のように、遊離したタンパク質と複合体とを分離する工程を持たないスクリーニング方法（図 1及び図 2)を行うことができる。消光性を持つ担体としては、上述した有機ポリマーの被膜を有するフェライト粒子を例示できるが、クェンチヤ一物質が結合した粒子やクェンチヤ一物質そのものを使用してもよレ、。クェンチヤ一物質としては、 Dabcyl、 BHQ1、 BHQ2、 Eclipse™ Dark Quencherなどを例示できる。なお、有機ポリマーの被膜を有するフェライト粒子にクェンチヤ一物質を結合させ、更に消光性を高めてもよい。

[0020] タンパク質は特に限定されるものではないが、例えば、生理活性物質のレセプターや生理活性物質を基質とする酵素などである。これらは生理活性物質が疾病用の薬剤である場合に好ましく用いられる。本発明の複合体の用途が薬剤のスクリーニング方法である場合、タンパク質は病気の原因物質となっているタンパク質であることが好ましレ、。このようなタンパク質としては、例えば、酵素としてジヒドロ葉酸還元酵素（D HFR)、アミロイドタンパク質としてアミロイド（A j3 )、レセプターとしてパエル受容体（P ael Rec印 tor)などを挙げることができる。

[0021] 使用する生理活性物質は特に限定されないが、本発明の複合体の用途が薬剤のスクリーニング方法である場合には、病気の原因となっているタンパク質と結合するが

、副作用が強いため医薬として使用できない物質、例えば、サリドマイド、種々の抗がん剤、製薬会社でドロップアウトした薬などが好ましい。

標識に用いる蛍光物質は特に限定されず、 FITC、 TRITC, TAMRA、 Cy3、 Cy5などの蛍光能を有する低分子有機化合物、蛍光能を有する蛍光タンパク質である緑色蛍光タンパク質（GFP)などを使用することができる。

[0022] 標識に用いる発光物質も特に限定されず、発光生物由来のカルシウム結合型発光タンパク質、ルシフェラーゼなどの発光能を有するタンパク質を使用できる。さらに、アルカリフォスファターゼまたは西洋ヮサビペルォキシダーゼなどを利用した化学発光反応系を触媒するタンパク質も発光物質として使用できる。

[0023] これらの発光及び蛍光物質の中では、感度が最も高ぐ毒性のないカルシウム結合型発光タンパク質のひとつであるイクオリンを使用するのが最も好ましい。イクオリンはカルシウム結合型発光タンパク質で、微量のカルシウムイオン（10— iole/liter以上 )と接触するだけで瞬間発光する。発光感度も市販の検出装置においての検出限界力 S0.1ピコグラム以下と非常に高いものである。

[0024] 本発明の複合体は、薬剤のスクリーニング方法に利用できる。具体的な方法は特に限定されないが、被検化合物と本発明の複合体とを溶媒中で共存させる工程、この溶媒から本発明の複合体を分離する工程、さらに、溶媒の発光強度又は蛍光強度を測定する工程を有する、方法を一例として挙げることができる（以下、このスクリーニング方法を「第一の方法」という場合がある。）。

[0025] 第一の方法において使用する溶媒は特に限定されず、例えば、適当な緩衝剤を含む水などを例示できる。共存させる時間も特に限定されないが、通常、 1時間程度である。溶媒から本発明の複合体を分離する方法は特に限定されず、溶媒から担体を除去してもよぐ溶媒中の特定の場所に担体を集めてもよい。担体が磁性を持つ場合は、例えば、後述するように、溶媒の入っているゥエルの周囲に磁石を配置し、担体をゥエルの周辺部分に移動させ、筒状の仕切りをゥエルに入れる方法などを示すことができる。

[0026] 第一の方法と同様に被検化合物と生理活性物質との競合作用を利用した薬剤のスクリーニング方法として、少なくとも、発光物質又は蛍光物質で標識されているタンパク質と、前記タンパク質と親和性を持つ生理活性物質と結合した担体と、被検化合物とを溶媒中に共存させる工程、この溶媒から担体を分離する工程、さらに、溶媒の発光強度又は蛍光強度を測定する工程を有する方法を例示できる（以下、このスクリーニング方法を「第二の方法」という場合がある。）。

[0027] 第二の方法において、使用する担体、生理活性物質、タンパク質、蛍光物質、発光物質等は、第一の方法と同様のものでよい。

上記第一の方法及び第二方法によって、特定のタンパク質と相互作用をする生理活性物質を得ることができる。このような生理活性物質は、新規な薬剤の候補物質となり得る。

第一の方法であって、磁性を持つ担体を使用したスクリーニング方法の一例を図 3 及び図 4を用いて説明する。

[0028] 磁性を持つ担体〔6〕、生理活性物質〔7〕、及び発光タンパク質イクオリン〔9〕で標識された標的とするタンパク質〔8〕を含む複合体を 96ゥエルプレート〔11〕に分注する（図 3A)。ケミカルライブラリー又は菌培養ライブラリー〔10〕（これらのライブラリーに含まれる物質が被検化合物になる。）をそれぞれゥエルに加える（図 3B)。 96ゥエルプレート〔11〕を撹拌台の上に乗せ、 30分〜 1時間、競合阻害反応をさせる。ゥエルの大きさに合ったリング状磁石〔12〕プレートを 96ゥエルプレート〔11〕の下に置く（図 3C)。磁性を持つ担体〔6〕は、ゥエルの外側に集まり、遊離したイクオリン標識タンパク質〔8 〕は外側へは移動しない（図 3D、図 4E)。（簡易には、ここで遊離しているイクオリン標識タンパク質〔8〕の一部を分取し、 CaCl溶液を注入し、発光強度をプレートリーダ

2

一で測定することも可能である。）次に、競合阻害反応した 96ゥエルプレート〔11〕へ、リング状磁石〔12〕より直径が小さい円筒〔13〕をはめる（図 4F)。これにより磁性を持つ担体〔6〕と遊離した標的タンパク質〔8〕が分離できる。ィクオリンの場合は円筒〔13 〕の中に CaCl溶液を注入し、発光強度をプレートリーダーで測定する（図 4G)。

2

[0029] 上記のように、リング状磁石〔12〕を用いることにより、磁性を持つ担体〔6〕を外側に集めることができ、さらに円筒〔13〕を揷入することにより担体〔6〕と遊離したタンパク質〔8〕とを分離すること力できる。このように担体〔6〕と遊離したタンパク質〔8〕を分離させることにより、遊離したタンパク質〔8〕のみ CaCl溶液と反応させ、担体〔6〕に付い

2

ているタンパク質〔8〕と CaCl溶液を反応させないようにすることができる。つまり、競合阻害によって遊離したタンパク質〔8〕のみを測定対象することができる。このような方法により、スクリーニングを自動的に進めることができるようになる。

第二の方法であって、消光性を持つ担体を使用する方法の原理を図 2を用いて説明する。

[0030] 消光性を持つ担体〔1〕には生理活性物質〔2〕が結合している。この担体〔1〕と発光物質又は蛍光物質〔4〕で標識されてレ、るタンパク質〔3〕と被検化合物〔5〕の三者を共存させると、被検化合物〔5〕がタンパク質〔3〕と結合する場合には、タンパク質〔3〕は生理活性物質〔2〕だけでなぐ被検化合物〔5〕とも結合するため、担体〔1〕に固定される数は少なくなり、逆に遊離状態のタンパク質〔3〕は多くなる。このため、担体によって消光されない発光物質等（図中の白い星）が多くなり、溶媒中の発光強度等は強い状態で維持される。一方、被検化合物〔5〕がタンパク質〔3〕と結合しない場合には、タンパク質〔3〕は生理活性物質〔2〕にのみ結合するので、担体〔1〕に固定される数は多くなり、逆に遊離状態のタンパク質〔3〕は少なくなる。このため、担体によって消光される発光物質等（図中の黒い星）が多くなり、溶媒中の発光強度等は弱くなる

[0031] 担体が消光性を持つ担体である複合体を使用する薬剤のスクリーニング方法の原理を図 1を用いて説明する。

発光物質又は蛍光物質〔4〕で標識されたタンパク質〔3〕は、消光性を持つ担体〔1〕と生理活性物質〔2〕を介して固定されてレ、る。このタンパク質〔3〕が固定されてレ、る担体〔1〕を被検化合物〔5〕と共存させると、被検化合物〔5〕がタンパク質〔3〕と結合する場合には、競合作用により、タンパク質〔3〕は担体〔1〕から遊離する。発光物質又は蛍光物質〔4〕は、消光性を持つ担体〔1〕と近接しない場合には強く光るが（図中の白い星）、消光性を持つ担体〔1〕と近接すると光は弱くなる（図中の黒い星)。従って、タンパク質〔3〕が遊離することにより、強い光を放つ。一方、被検化合物〔5〕がタンパク質〔3〕と結合しない場合には、タンパク質〔3〕は担体〔1〕に固定されたままであり、発光物質又は蛍光物質〔4〕の光も弱レ、ままである。

実施例

[0032] 以下、実施例等により本発明を更に詳細に説明する。 [0033] 〔参考例 1〕

特開 2006-88131号公報の記載に従い、以下のように有機ポリマーの被膜を有するフェライト粒子を作製した。

水溶液中力析出させた平均粒径が 40nmのフヱライト粒子 150mgにゥンデセン酸を飽和吸着させ、疎水化フェライト粒子を得た。

この疎水化フヱライト粒子に、 PE〇鎖を有する非イオン性界面活性剤 Emulgen 1 150S - 70 (花王株式会社製） 0. 4gを溶解した水溶液をカ卩えてソニケーシヨンすることにより、この非イオン性界面活性剤を疎水化フェライト粒子の表面に吸着させて粒子を再親水化し水に分散させた再親水化フェライト粒子のコロイド溶液を得た。

次に、このコロイド溶液に、スチレン 2. 7g、 GMA (グリシジルメタタリレート） 0. 3g、 DVB (ジビュルベンゼン、架橋剤） 0. 08gを有するモノマーミックスを添加し全量が 1 25gになるように水を添加した後、 200rpmで攪拌を続けながら加熱し、 20〜30分後に 70°Cに達したところで水溶性開始剤 V— 50 (和光純薬工業 (株)製) 50mgを純水 5mlに溶力た水溶液を添加し、重合反応を 12時間行なった。

こうして得られた乳化重合粒子を洗浄して有機ポリマーの被膜を有するフェライト粒子 (以下、「磁性ビーズ」という場合がある。）を得た。透過型電子顕微鏡を用い、得られたポリマー被覆フェライト粒子を観察した結果、粒子は平均粒径が 200nmの単分散粒子であり、粒子内部にフェライト粒子を有していることがわかった。

[0034] 〔参考例 2〕

( 1 ) FITC固定化磁性ビーズの調製

10 mg/ml磁性ビーズ懸濁液（溶媒： 100 mM Hepes-NaOH pH7.0)、 25 mM FITC 溶液（溶媒： DMF)、及び 100 mM Hepes-NaOH pH7.0を表 1に示す組成になるように混合し、室温で 2時間静置し、磁性ビーズに FITCを固定した。磁性ビーズは、参考例 1で作製したものにジスルフイド結合を含むリンカ一を付けている（磁性ビーズ CH -S-

S-CH -NH )。

[表 1] Final FITC cone 磁性ビーズ FITC 100 mM Hepes Final volume

10 mM 40 l 320 ii\ 440 \ 800 ul

5 mM 40 ill 160 l 600 UL\ 800 1

2.5 mM 40 l 80 Ml 680 l 800 l

1.25 mM 40 u\ 40 \ 720 ul 800 l

0.675 mM 40 u\ 20 \ 740 l 800 l

0 mM 40 ul 0 l 760 ul 800 ul 遠心分離によって上清を除去し、 200 μΐの 100 mM H印 es_NaOHを加えて磁性ビーズを再分散させた。この操作を 8回繰り返し、磁性ビーズを洗浄した。

(2) FITC固定化磁性ビーズのジチオスレィトール（DTT)によるリンカ一切除

FITC固定化磁性ビーズ懸濁液（0.4 mg/200 μΙ)50μ 1と 0.1M DTT溶液 50 μ 1を混合し、 45分後に蛍光強度を測定した。蛍光強度の測定は、磁性ビーズ懸濁液（DTT + )、懸濁液から磁性ビーズ除去後の溶液 (磁気分離後（DTT + ) )、及び 0.1M DTT 溶液をカ卩えなかった磁性ビーズ懸濁液 (DTT—）の 3種類に対して行なった。結果を図 5に示す。

図 5に示すように、 DTTにより磁性ビーズから FITCを遊離させることにより、蛍光強度が上昇し、また、液中力磁性ビーズを除去することにより、蛍光強度は更に上昇した。

〔参考例 3〕

( 1 )ダブシノレ修飾磁性ビーズの調製

50 mgのダブシル酸（Promega P4281)を 1500 μ 1の DMFに溶かし、 66.7mg/mlのダブシル酸溶液を調製した。また、参考例 2で作製した FITC固定化磁性ビーズを 1000 μ 1 の DMFに懸濁させ、 1000 μΐの FITC固定化磁性ビーズ懸濁液を調製した。この懸濁液とダブシノレ溶液及び DMFを混合し、表 2に示す組成の磁性ビーズ懸濁液を調製した。

[表 2]

磁性ビーズの分散している溶媒を DMFから超純水へ置換し、最終的に 500 μ 1の 0.1 M Hepes-NaOH, pH 7で洗浄した後、 ΙΟΟ μ Ιの 0.1M Hepes-NaOH, pH 7に懸濁させ、ダブシノレ修飾 FITC固定化磁性ビーズを得た。

(2)蛍光強度の測定

50 のダブシル修飾 FITC固定化磁性ビーズを、 0.1M DTTを含む 0.1M Hepes-Na OH, ρΗ7 (50 μ 1)と混合し、 15分又は 30分反応させた後、 FITCの蛍光強度を測定した。比較のため、 DTTを含まなレ、 Η印 es_NaOH， pH7と混合した場合の蛍光強度も同様に測定した。この結果を図 6に示す。図中の 1、 2、 3、 4、 5で示されるバーは、それぞれダブシル修飾時のダブシル量が 0 mg、 0.01 mg、 0.1 mg、 1 mg、 10 mgであった場合の蛍光強度比（DTT処理をした場合の蛍光強度 ZDTT処理をしなかった場合の蛍光強度）を示す。また、左側のバーが DTT処理時間が 15分の場合、右側のバー力 SDTT処理時間が 30分の場合を示す。

図 6に示すように、 DTTによって FITCが磁性ビーズから遊離することにより、蛍光強度は増大するが、その増大の割合は、ほぼ修飾したダブシルの量に依存して大きくなった。即ち、ダブシル修飾しな力た場合（図中のバー 1)は、 DTT処理をした場合の蛍光強度は、 DTT処理をしなかった場合の蛍光強度の 15倍程度であった力 10 m gのダブシノレで処理した場合（図中のバー 5)は 30倍程度であった。

[0036] 〔実施例 1〕

(1)組換えヒスチジンタグジヒドロ葉酸還元酵素アポイクオリン融合タンパク質 (rHis- DHFR-apoAQ)の発現

rHis-DHFR-apoAQの発現ベクター（pColdn-DHFR- AQ)を組み込んだ大腸菌 BL2 1(DE3)を 37°Cで 2L培養した。吸光度 600nm=0.3の時点で培養温度を 15°Cに下げ、引き続き 30分培養した。最終濃度 O.lmMになるように IPTGをカ卩え、更に 15°Cで 24時間培養を続け、 rHis-DHFR_AQを発現させた。なお、この低温によって発現を誘導するシステムは宝酒造で市販されてレ、る。発現ベクター pColdllに含まれる大腸菌コ一ルドショック遺伝子 cspAプロモーターにより発現する。 cspAプロモーターの下流には発現を厳密に制御するための lac operatorが揷入されている。

[0037] (2)ヒスチジンタグによる精製

rHis-DHFR-apoAQを発現した大腸菌を遠心により回収し、 PBSで洗浄した。大腸菌を 50mlの溶解溶液（20mM Tris_HCl(pH 7.9), 300mM NaCl、 lOmM Imidazole, 0.1 % NP-40)に懸濁し、超音波により大腸菌及びゲノムを破壊した。遠心により不溶性画分を分離し、可溶性画分をニッケルァガロースゲル（Ni-NTA Agarose; QIAGEN)と混合した。 4。Cで 1時間、回転させ、 rHis-DHFR-apoAQをニッケルァガロースゲルに結合させた。結合反応後、カラム（Poly- =Prep Chromatography Columns 0.8 X 4cm, BIORAD)に移し濾過した。カラムに前述した溶解溶液 10ml、次いで、洗浄溶液 1 (20 mM Tris-HCl(pH 7.9)、 300mM NaCl、 20mM Imidazole, 0.1% NP-40) 10ml、更に洗浄溶液 2 (20mM Tris-HCl(pH 7.9)、 300mM NaCl、 20mM Imidazole) 10mlを添加し、ニッケルァガロースゲルを洗浄した。その後、カラムに溶出溶液（20mM Tris-HCl(pH 7.9), 300mM NaCl、 lOOmM Imidazole) 5mlを添加しニッケルァガロースゲルから rHis -DHFR-apoAQを溶出させた。溶出フラクションを 500 μ 1ずつ分注して回収した。 rHis -DHFR-apoAQは二本目のフラクションで回収できた。

[0038] (3) rHis-DHFR-apoAQ力らィクオリン（AQ)への再生

ニッケルカラムにより精製された rHis-DHFR-apoAQを活性のあるイクオリン (AQ)に再生させるため、以下の処理を行なった。

再生反応液 (500 μ 1 rHis-DHFR-apoAQ, 10 μ 1 0.5Μ EDTAヽ 2 μ 1 2_メルカプトェタノール、 40 μ gセレントラジン、 4.5ml TEdOmM Tris-HCl(pH7.9), lOmM EDTA))を 15mlチューブに入れ、 4°Cで 3時間回転させた。 30分ごとに反応チューブの蓋を開けて酸素を供給した。セレントラジンは市販のものではなぐ井上の方法（ Inoue, S.， Su giura, S., Kakoi, H.， Hasizume, K., Goto, T., and no, H. (197ο Chem Lett.丄 41—14 4)に従って合成したものを使用した。 4°Cで 3時間回転させた後、一晩 4°Cで静置した。

[0039] (4) rHis-DHFR_AQのイオン交換カラムによる精製

再生反応後、未反応のセレントラジンと rHis-DHFR-AQの分解物を除去するため以下の処理を行った。反応は全て 4°Cで行った。

陽イオンカラムの Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech)2mlをカラム (Poly-Pre p Chromatography Columns 0.8 X 4cm, BIORAD)に充填した。 20ml TE(10mM Tris- HCl(pH7.9), lOmM EDTA)を添加し、カラムを洗浄、平衡化した。再生反応溶液を静力にゆっくりとカラムに添カロした。 10ml TE(10mM Tris-HCl(pH7.9), lOmM EDTA), 10 ml洗浄 TEl(10mM Tris-HCl(pH7.9), lOmM EDTA, 50mM NaCl)、 10ml洗浄 TE2(1 OmM Tris-HCl(pH7.9), lOmM EDTA, lOOmM NaCl)をそれぞれ静かにゆっくりと添加し、カラムを洗浄した。 10ml溶出 TE(10mM Tris-HCl(pH7.9), lOmM EDTA, 400mM NaCl)を静カにゆっくりと添カロし、 rHis_DHFR-AQを溶出した。溶出フラクションを 500 μ 1ずつ分注して回収した。この溶出フラクション及び洗浄時に回収されたフラクション中に含まれるタンパク質を SDS-PAGEで分離し、クマシ一ブリリアントブルーによつて染色した。この結果を図 7に示す。

図 7に示すように、 rHis_DHFR-AQは 4-5本目のフラクションで回収できた。精製された rHis- DHFR-AQは 1.5mlエツペンチューブに 100 z 1ずつ分注し、 _80。Cで保存した。

[0040] 〔実施例 2〕

( 1 )カルボキシルイ匕磁性ビーズの作製

磁性ビーズ（10mg/tube)を 500 μ 1の水で 2回洗浄し、次いで、水と DMFの混合液（水： DMF= 1:4)で 1回洗浄し、更に、 DMFで 4回洗浄した後、 300 /i 1の DMFに懸濁した。この懸濁液に 100 /i lのトリエチルァミンを添加し、更に 600 /i lの 500mM無水コハク酸の DMF溶液を加え、室温でー晚インキュベートした。

インキュベートした後の磁性ビーズを DMFで一回洗浄した後、 430 μ 1の DMFに懸濁した。この懸濁液に 50 /i lのトリエチルァミンと 20 μ ΐの無水酢酸を添加を添カ卩し、室温で 2時間インキュベートした。水で 1回洗浄した後、 450 /i lの水に懸濁した。この懸濁液に 50 μ 1の IN NaOHを添力 Qし、室温で 30分インキュベートした後、磁性ビーズを水で 5回洗浄し、水 500 μ 1に懸濁して保存した。

[0041] (2)アミノ基誘導体 ΜΤΧ固定化ビーズ作製

カルボキシル化磁性ビーズ 5mgを 500 μ 1の milliQで 1回洗浄した後、 500 μ 1のメタノールで 1回洗浄した。洗浄した磁性ビーズを 100 μ ΐのメタノールに分散させた後、 500 μ 1のジォキサンを添加した。

磁性ビーズをジォキサンで 2回洗浄した後、 800 μ ΐのジォキサンを添加し、更に、 20 0〃1の1\4 HOSu及び 38.4mgの EDCを添加し、室温で 2時間インキュベートした。磁性ビーズを 500 μ 1の DMFで 5回洗浄した後、 100 μ 1の DMFに懸濁し、 50 /i 1 (各 2. 5mg)ずつ分注し、表 3に示す組成の MTX含有磁性ビーズ懸濁液を調製し、室温で 7 0分静置した。

[表 3]

懸濁液を遠心分離によって上清を除去した後、 1Mエタノールァミン DMF溶液を添加し、室温で 2時間静置した。再度、上清を遠心分離によって除去し、磁性ビーズを回収した。磁性ビーズを 50%メタノール水溶液で 3回洗浄した後、 50%メタノール水溶液で保存した。

[0042] 〔実施例 3〕

( l ) MTX固定化磁性ビーズと rHis-DHFR-AQ融合タンパク質の結合

実施例 2で製造した MTX固定化ビーズ（50%メタノール保存） 0.2 mgを 500 μ 1の Bindi ng Buffer ( 10mM HEPES, 150mM KC1, 5mM EDTA, 10%Glycerol, 0· 1%ΝΡ40)で 3回洗浄した後、 rHis-DHFR-AQ (lOOng/100 μ 1)と混合し、 4°Cで 3時間反応させ、結合させた。

rHis-DHFR-AQを結合させた MTX固定化磁性ビーズを、 500 μ 1の Binding Bufferで 3回洗浄した後、 30 μ 1の薬剤（100 /i M MTX, 100 μ Μストレプトマイシン、又は 100 β Μペニシリン）と混合し、 4°Cで 1時間反応させた。反応後の溶液の上清 (Drug Elut ion)を採取、保存した。上清採取後の残渣に 1 X Dye 40 μ 1を加え、 98°Cで 5分間加熱し、上清（Boil Elution after Drug Elution)を採取、保存した。

[0043] (2)上清中のタンパク質の検出

結合反応後の上清及び加熱後の上清中に含まれるタンパク質を SDS-PAGEで分離し、銀染色法により染色した。結果を図 8に示す。なお、図中の（―）及び（+ + +) は、それぞれ前述した MTX固定液 A及び MTX固定液 Dによつて MTXを固定した磁性ビーズを用いている。

図 8に示すように、結合反応後の上清では、 MTXと混合した場合にのみ、 rHis-DH FR-AQを示すバンドが検出され、ストレプトマイシン（SRM)及びペニシリン（PNC)と混合した場合にはそのようなバンドは検出されなかった。

加熱後の上清では、いずれの薬剤と混合した場合にも、 rHis-DHFR-AQを示すバンドが検出された。

これらの結果から、磁性ビーズと結合していた rHis-DHFR-AQは、 MTXと混合した場合にのみ競合反応によって遊離し、他の薬剤と混合した場合には結合した状態のままであったと考えられる。

[0044] (3) Drug Elutionの発光測定

市販のアツセィ用プレート（96 Well Assay Plates, MATRIX)のゥエルを 5mM EDTA で洗浄した後、 9 μ 1の Binding Bufferを加え、更に上清（Drug Elution)を 1 μ 1カロえ、ゥエルの中を全量を 10 μ ΐとした。プレートをプレートリーダー（WALLAC 1420 Multilabe 1 Counter, PerkinElmer)にセットし、ゥエルに 500mM CaCl (30mM HCト Tris(pH7.9))

2

を 50 μ ΐ添カ卩し、発光強度を測定した。この結果を図 9に示す。なお、図中の（―）、 ( + )、（+ +)及び（+ + +)は、それぞれ前述した ΜΤΧ固定液 A、 MTX固定液 Β、 ΜΤ X固定液 C及び MTX固定液 Dによって MTXを固定した磁性ビーズを用いている。図 9に示すように、ストレプトマイシン（SRM)及びペニシリン (PNC)と混合した場合には、ほとんど発光しなかったのに対し、 MTXと混合した場合には強い発光が確認された。 MTXと混合した場合の強い発光は、消光性を持つ磁性ビーズ力 rHis-DHFR-A Q力 S遊離したことによるものと考えられる。この結果は、上述した電気泳動の結果と一致する。

[0045] 本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願（特願 2006-125348号）の明細書および Zまたは図面に記載されている内容を包含する。また、本発明で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲

[I] 担体、生理活性物質、及びタンパク質を含む複合体であって、担体は生理活性物質と結合しており、生理活性物質はタンパク質と親和性を持ち、その親和性によってタンパク質と結合しており、タンパク質は発光物質又は蛍光物質で標識されている複合体。

[2] 担体が、有機ポリマーの被膜を有するフェライト粒子である、請求項 1に記載の複合体。

[3] 担体が消光性を有する、請求項 1又は 2に記載の複合体。

[4] 担体が、クェンチヤ一物質と結合した粒子である、請求項 3に記載の複合体。

[5] タンパク質が生理活性物質のレセプター又は生理活性物質を基質とする酵素であり、生理活性物質が疾病用の薬剤である、請求項 1乃至 4のいずれか一項に記載の複合体。

[6] 発光物質が、発光能を有するタンパク質又は化学発光を触媒するタンパク質である

、請求項 1乃至 5のいずれか一項に記載の複合体。

[7] 蛍光物質が、蛍光能を有する低分子有機化合物、又は蛍光能を有するタンパク質である、請求項 1乃至 5のいずれか一項に記載の複合体。

[8] 請求項 1乃至 7のいずれか一項に記載の複合体を使用することを特徴とする薬剤のスクリーニング方法。

[9] 被検化合物と請求項 1乃至 7のいずれか一項に記載の複合体とを溶媒中で共存させる工程、この溶媒から前記複合体を分離する工程、さらに、溶媒の発光強度又は蛍光強度を測定する工程を有する、請求項 8に記載の薬剤のスクリーニング方法。

[10] 少なくとも、発光物質又は蛍光物質で標識されているタンパク質と、前記タンパク質と親和性を持つ生理活性物質と結合した担体と、被検化合物とを溶媒中に共存させる工程、この溶媒から担体を分離する工程、さらに、溶媒の発光強度又は蛍光強度を測定する工程を有する薬剤のスクリーニング方法。

[II] 少なくとも、発光物質又は蛍光物質で標識されているタンパク質と、前記タンパク質と親和性を持つ生理活性物質と結合し且つ消光性を有する担体と、被検化合物とを溶媒中に共存させる工程、さらに、溶媒の発光強度又は蛍光強度を測定する工程を有する薬剤のスクリーニング方法。

[12] 担体が、有機ポリマーの被膜を有するフェライト粒子である、請求項 10又は 11に記載の薬剤のスクリーニング方法。

[13] 担体が、クェンチヤ一物質と結合した粒子である、請求項 12に記載の薬剤のスクリ一ユング方法。

[14] タンパク質が生理活性物質のレセプター又は生理活性物質を基質とする酵素であり、生理活性物質が疾病用の薬剤である、請求項 10乃至 13のいずれか一項に記載の薬剤のスクリーニング方法。

[15] 発光物質が、発光能を有するタンパク質又は化学発光を触媒するタンパク質である

、請求項 10乃至 14のいずれか一項に記載の薬剤のスクリーニング方法。

[16] 蛍光物質が、蛍光能を有する低分子有機化合物、又は蛍光能を有するタンパク質である、請求項 10乃至 14のいずれか一項に記載の薬剤のスクリーニング方法。