JP2010284172A - ペプチドアクセプターの連結法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】(a)ヘアピン構造を形成する3’配列を有するRNA分子を提供する段階;(b)核酸リンカー分子に共有結合したペプチドアクセプターを提供する段階;および(c)ペプチドアクセプターとRNA分子間における共有結合の形成が可能な条件下で、該RNA分子と該核酸リンカー分子のハイブリッドを形成させる段階を含むペプチドアクセプターをRNA分子に結合させる方法。
【選択図】なし
Description
一般に本発明は連結法、特にペプチドアクセプターを核酸に連結させる方法に関する。
本明細書では、ペプチドアクセプターをRNA分子に結合させる種々の方法を記載する。RNAは、通常の細胞を用いた合成法、組換え技術、および化学合成を含む標準的なアプローチで生成することができ、RNAには、細胞のRNAライブラリー、mRNAライブラリー、およびランダム合成RNAライブラリーが含まれるがこれらに限定されない。ペプチドアクセプター(例えばピューロマイシン)をDNAリンカーまたはRNAリンカーに通常結合させる。このようなペプチドアクセプター分子は、任意の標準的な方法で生成することができる。これには例えば、ロバーツ(Roberts)およびショステク(Szostak)の論文(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297、1997)、ショステクら(国際公開公報第98/31700号)、およびショステクらによる米国特許出願第09/247,190号に記載される手法がある。本発明の各方法を実施する方法について、特定の実施例を用いて詳細に説明する。特定の例は本発明を説明する目的で提供するものであって、本発明を制約するものと解釈すべきではない。
本発明の特定のアプローチの一つにおいては、T4 DNAリガーゼを使用して、例えば図1に示すヘアピンを含む鋳型を用いてペプチドアクセプターをRNA分子に結合させる。連結反応は、自己鋳型的に進み、副子オリゴ(splint oligo)を使用しない。RNAの3’端の配列、またはペプチドアクセプターのリンカー領域の5’端のいずれかを、ヘアピン構造を形成するように設計する。ペプチドアクセプターのリンカー領域の5’端およびヘアピン構造を形成するRNAの3’端が近接することで、T4 DNAリガーゼによる酵素的連結が促される。これは例えば、サムブロック(Sambrook)、フリッシュ(Fritsch)およびマニアティス(Maniatis)の「分子クローニング(Molecular Cloning)」、Cold Spring Harbor、New York、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989に記載されている。反応物の比はおよそ1:1であるが、いずれかの反応物が若干過剰(1:1.2)であってもよい。最適な連結条件は、反応によって若干変動する場合があるので、当業者に周知の方法で実験的に決定してもよい。
ペプチドアクセプターをRNA分子に結合させる別の酵素的方法では、RNAの3’端を修飾してから、例えば図2に示すように末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)を用いて連結を行う。TdTによる反応は、サムブロック(Sambrook)、フリッシュ(Fritsch)およびマニアティス(Maniatis)の書籍(前記)に一般的に記述されている方法で行う。この酵素は、核酸の3’端にデオキシ(またはジデオキシ)ヌクレオチド三リン酸(NTP)を用いて伸長させる。このような(d/dd)NTPは、塩基成分を化学的に修飾することで所望のリンカー構造をもたせることができる(例えばMeyer、「分子生物学における方法(Methods in Molecular Biology)」、 Agrawal、ed.、第26巻、Totowa:Humana Press、1994、73〜91ページ;Kumarら、Anal. Biochem. 169:376、1988;Rileyら、DNA 5:333、1986;およびSchmitzら、Anal. Biochem. 192:222、1991に記載されている)。図2に示すように、リンカー分子は(d/dd)NTPで開始しなければならない。しかし残りのリンカー組成は変化してもよい。この末端トランスフェラーゼ連結法の特徴は、ペプチドアクセプターのDNAリンカー領域が最短で1残基の(d/dd)NTPでもよいことである。
本発明の方法では、図3に示すように、ペプチドアクセプターはIO4 -酸化を介したRNAの3’端への官能基導入と、それに続くペプチドアクセプターとRNAの化学的連結によってRNA分子に結合させることもできる。IO4 -酸化は下記の方法で、またアグラワル(Agrawal)(「分子生物学における方法(Methods in Molecular Biology)」、 Agrawal編、第26巻、Totowa:Humana Press、1994、93〜120ページ)、プロウドニコフ(Proudnikov)およびミルザベコフ(Mirzabekov)、Nucleic Acids Res. 24:4535、1996;ゴーシュ(Gosh)ら、Anal. Biochem. 178:43、1989;バウマン(Bauman)ら、J. Histochem. Cytochem. 29:227、1981;およびウー(Wu)ら、Nucleic Acids Res. 24:3472、1996、の各論文に記載された方法で実施する。IO4 -酸化段階は反応に1,2-ジオールを厳格に必要とするので、末端ヌクレオチドのみを修飾し、RNA分子の内部にある残基は影響を受けない。結果として生じるジアルデヒドはさらに、アミン、ヒドラジン、カルボ(チオ)ヒドラジド、または(チオ)セミカルバジドなど様々な求核基による反応を受けてシッフ塩基様の構造を生じる。これらの反応は例えばアグラワル(前記)、プロウドニコフおよびミルザベコフ(前記)、ゴーシュら(前記)、バウマンら(前記)、およびウーら(前記)の各論文に記載された通りに進む。それぞれカルボ(チオ)ヒドラジドおよび(チオ)セミカルバジドとの反応後にそれぞれ得られる(チオ)ヒドラジドおよび(チオ)セミカルバゾンは極めて安定であり、アミンまたはヒドラジンを含む初期付加物は通常、その後に図3Bおよびアグラワル(前記)、プロウドニコフおよびミルザベコフ(前記)、ゴーシュら(前記)、バウマンら(前記)、およびウーら(前記)の論文に記載されるように、新規合成された結合を加水分解に対して安定なものとする、その後の還元的アミノ化などの還元段階を必要とする。
)を、20 μlの500 mM NaOAc(pH 5.2)、10 μlの5 mM NaIO4と混合し、水を加えて最終容量を100 μlとした。この反応混合物を室温で15分間インキュベートした。次に、10 μlの10 mM Na2SO3を添加し、反応混合物を再び15分間室温でインキュベートした。40 μlの1 Mリン酸緩衝液(pH 8.0)、1.5 nmoleのペプチドアクセプターリンカーUni-A1/8(配列:
(XはUni-linkアミノ修飾物質[Clontech]、またPuはピューロマイシン-CPG[Glen Research]を意味する)、および20 μlのNaCNBH3を反応混合物に添加した。この混合物を次に18時間室温でインキュベートして沈澱を生じさせ、6%のTBE-尿素ゲルで精製し、一晩破砕・浸漬してRNA-タンパク質融合分子を得た。この反応で230 pmoleの産物が得られた。
ペプチドアクセプターは図6に示すように、RNAの3’端に官能基を結合させた後に化学的に連結させることで、RNA分子に結合させることもできる。上記のプロセスの変法では、還元的アミノ化および関連反応によってRNAの3’端に官能基を結合させる。新しく導入したこれらの官能基を次に、ペプチドアクセプターの適切に修飾したリンカーとさらに反応させて、RNAとペプチドアクセプター間に共有結合を形成させる。例示的な反応基には、チオール(ジスルフィド形成、またはピリジルジスルフィドなどのチオール親和性(thiolphilic)試薬との反応用;図6の反応A)またはマレイミド(図6の反応B)などがある。
ペプチドアクセプターは、図7A〜7Hに示すような光化学的な方法でRNA分子に結合させることもできる。ソラレン基を有するペプチドアクセプターリンカー分子は、長波長のUV光照射を受けて相補的RNA鎖に架橋を導入することができる。この手法は通常、ピーレス(Pieles)およびイングリッシュ(Englisch)の論文(Nucleic Acids Res. 17:285、1989);およびゴダール(Godard)ら(Nucleic Acids Res. 22:4789、1994)の記述にしたがって実施される。ペプチドアクセプターのリンカー領域の5’端へのソラレン部分の結合は、市販のソラレンアミダイト、2’-OMe-RNA ホスホラミダイト、ソラレンC6ホスホラミダイト、およびトリエチレングリコール(TEG)ホスホラミダイト(Glen Research、スターリング、バージニア州)を用いて、標準的なDNA合成装置を用いて達成できる。
)をコードするRNA転写物からなる1 nmoleのRNA、標準的な製造業者プロトコル通りに合成された1.2 nmoleのPhotolinker 30/10(配列:
)(PsoはソラレンC2アミダイト[Glen Research]、Puはピューロマイシン-CPG [Glen Research]を意味する)、または光リンカー30/15(配列:
)(PsoはソラレンC2アミダイト、Puはピューロマイシン-CPGを意味する)、10×緩衝液(250 mM Tris pH 7.0;1 M NaCl)、および水(最終容量を360 μlにする)を混合して80℃で2分間加熱した。次に反応混合物を緩やかに室温まで冷却した。次にこの反応混合物に、石英浸漬用ウェル(ACE Glass、カタログ番号7854-25)に入れたPyrex製吸収用スリーブ(ACE Glass、カタログ番号7835-44)を備えた450 Wの浸漬型ランプ(中圧;ACE Glass、カタログ番号7825-34番)を用いて、0℃で15分間、310 nm以上の波長で照射した。この際、試料は浸漬用ウェルに固定化した微小遠心用チューブに入れて氷中で冷却した。次に試料に40 μlの3 M NaOAcと1000 μlのエタノールを添加して沈澱を生じさせ、75 μlの水に再懸濁した。次いで75 μlの2×ローディング緩衝液(Novex)を試料に添加し、プレキャストタイプの6% TBE尿素ゲル(Novex)で試料を精製した。産物を破砕・浸漬法(0.3 M NaOAc、室温で一晩)で回収した後にエタノールで沈澱させた。この光架橋法により、Photolinker 10/30を用いて272 pmoleのRNA-タンパク質融合産物を得た。および、Photolinker 15/30を用いて227 pmoleのRNA-タンパク質融合産物を得た。
(下線部の配列がソラレンリンカーの標的となる)に変えたところ、産物の収率は大きく減少した(15〜20%の減少)。このことから、RNA標的配列が重要であることがわかった。次に産物の収率が、反応過程にあらかじめ不活性化しておいたソラレンリンカーを繰り返し置換することで上昇しうることを確認した。この実験は以下の手順で実施した。RNA、リンカー、および10×緩衝液を混合して80℃で2分間加熱した。次に反応混合物を緩やかに室温に冷却し、上述の通りに紫外線を照射した。次にさらに1 nmoleのリンカーと1 μlの緩衝液を添加した。リンカーをRNAとアニーリングさせて紫外線を照射した。このプロセスを、2 nmoleのリンカーと2 μlの緩衝液を添加して紫外線照射を繰り返し行った。この手順を採用することで、産物の収率を、ある特定の配列について20%から40%を超えて増大させることができた。
(アミノ酸配列ASAをコードする)、およびソラレン光架橋用のジヌクレオチド配列5’-UA(不変)を末端に有する。これらは、シンデン(Sinden)およびヘイガーマン(Hagerman)(Biochemistry、23:6299〜6303、198)、およびガンパー(Gamper)ら(Photochem. Photobiol.、40:29〜34、1984)の論文に記載されている。さらに一種のmRNA(mRNA 1)は、FlagエピトープDYKDDDDK(Hoppら、Biotechnology、6:1205〜1210、1988)と、それに続くStrep-Tag II配列WSHPQFEK(Schmidtら、J. Mol. Biol.、255:753〜66、1996)を含む。他のmRNA分子(mRNA 2、3、および4)は、4-4-20 scFv、抗フルオレセイン一本鎖抗体鋳型を含む。これらは、ベドジク(Bedzyk)ら(J. Biol. Chem.、265:18615〜20、1990)、およびマレンデール(Mallender)らの論文(J. Biol. Chem.、271:5338〜46、1996)に記載されている。さらにmRNA 3および4は、残存する非架橋鋳型の翻訳後にリボソームからのmRNAの遊離を誘導する下流の停止コドン(UAA)を含む(下記参照)。オリゴdTによる精製用のポリAテールもmRNA 4に結合させた。
(Puはピューロマイシン-CPG[Glen Research];CおよびAは標準的な3’-アミダイト[Glen Research];a、t、c、およびgは5’-ホスホラミダイト[Glen Research];Xは非対称性の分枝状アミダイト[Clontech]を意味する)であるリンカーを、標準的な製造業者プロトコル通りに合成した後に、分枝点Xの選択的脱保護(Clontechの指示書による)と、それに続くソラレンC6アミダイト(Glen Research)のカップリングを行った。次にこのリンカーは、標的配列
をもつRNAに、上述の光架橋法で光架橋した。このRNA-リンカーコンストラクトを次に、RNA-タンパク質融合体の合成に問題なく使用することができた。
の標的配列をもつRNAに、上述の光架橋法で光架橋した。このRNA-リンカーコンストラクト(事前にRNase Hによる処理を任意で行う)は後に、RNA-タンパク質融合体の合成に問題なく使用することができた。
必要に応じて、親和性を利用したRNA精製段階を、上述の光化学的連結法と組み合わせる(図7H)。適切なリンカー分子を、ピューロマイシン末端で光切断可能なビオチン成分(例えば、EZ-Link(商標) NHS-PC-LC-Biotin、Pierce、ロックフォード、イリノイ州)で修飾する。次に標的RNA(例えば粗転写反応で得られる)と一定量のリンカーとの間でハイブリッドを形成させ、得られた二本鎖を、ストレプトアビジン(または関連する)樹脂などの固相支持体上に補足する。次に、十分な洗浄を行って過剰なRNAならびに転写反応成分を除去する。長波長の紫外光を同時に照射することで光架橋が形成され、産物が樹脂から遊離する。連結したRNAは次に、さらに精製を行うことなく翻訳および融合形成反応に直接使用することができる。
を含む)を使用する。この転写反応で約2〜5 nmolの粗RNA産物が得られる。次の工程に進む前に精製(フェノール抽出、NAP-5カラム、またはRNeasyカラム)は必要ない。
ペプチドアクセプターをRNA分子に結合させる共有結合形成法の別法として、強固な複合体形成にのみ依存する方法も可能であり、これもまた本発明の一部である。一つの方法では、図8Aに示すように、ペプチド核酸(PNA)を使用してRNAの認識および結合を行う。PNAはDNAの模倣体であり、アキラルおよび無電荷のN-(2-アミノエチル)グリシンのユニットから構成される主鎖をもつ(KnudsenおよびNielsen、Nucleic Acids Res. 24:494、1996)。PNAは、配列特異的かつ高い親和力で相補的な一本鎖DNAおよびRNAとハイブリッドを形成することが知られている。特に、RNAに結合してクランプを形成する2個のPNA分子を含む三本鎖形成コンストラクトは、RNAに強固に結合する効率のよい手法を提供することができる。というのは、このようなコンストラクトは、熱変性および、インビトロ翻訳の条件に対して極めて耐性が強いためである(図8)(Hanveyら、Science、258:1481、1992)。
上述のすべての方法では、リンカーコンストラクトを最適化することが好ましい。考慮対象となる諸因子には例えば、鋳型/標的認識エレメントを含めること、および結合させた官能基の空間的な接近のしやすさがある。特に、核酸のハイブリッド形成を介した鋳型または標的の認識が関与する場合は、好ましくはリンカーの標的配列および化学的性質を含む諸因子を最適化する。例えばRNAのハイブリッド形成強度およびその結果としての連結効率は、DNAではなく2-OMe RNAまたはプロピンで修飾した核酸塩基を使用することで上昇することが知られている(例えばInoue ら、Nucleic Acids Res. 15:6131、1987;Kibler-Herzogら、Nucleic Acids Res. 19:2979、1991;およびWagnerら、Science 260:1510、1993に記載)。
Claims (44)
- 以下の段階を含む、ペプチドアクセプターをRNA分子に結合させる方法:
(a)ヘアピン構造を形成する3’配列を有するRNA分子を提供する段階;
(b)核酸リンカー分子に共有結合したペプチドアクセプターを提供する段階;および
(c)ペプチドアクセプターとRNA分子間における共有結合の形成が可能な条件下で、該RNA分子と該核酸リンカー分子のハイブリッドを形成させる段階。 - 共有結合形成がT4 DNAリガーゼで触媒される、請求項1記載の方法。
- 以下の段階を含む、ペプチドアクセプターをRNA分子に結合させる方法:
(a)RNA分子を提供する段階;
(b)5’配列がヘアピン構造を形成する核酸リンカー分子に、共有結合したペプチドアクセプターを提供する段階:および
(c)ペプチドアクセプターとRNA分子間における共有結合の形成が可能な条件下で、該RNA分子と該核酸リンカー分子のハイブリッドを形成させる段階。 - 共有結合形成がT4 DNAリガーゼで触媒される、請求項3記載の方法。
- 以下の段階を含む、ペプチドアクセプターをRNA分子に結合させる方法:
(a)RNA分子を提供する段階;
(b)デオキシヌクレオチド三リン酸またはジデオキシヌクレオチド三リン酸から開始するリンカー分子に共有結合したペプチドアクセプターを提供する段階;および
(c)RNA分子およびペプチドアクセプターを末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼと接触させて、ペプチドアクセプターを該RNA分子に共有結合させる段階。 - 以下の段階を含む、ペプチドアクセプターをRNA分子に結合させる方法:
(a)RNA 分子を提供する段階;および
(b)ペプチドアクセプターをRNA分子に化学的に連結する段階。 - ペプチドアクセプターをソラレン部分に連結し、化学的連結段階が、ソラレン部分を介して該ペプチドアクセプターをRNA分子に架橋させる段階を含む、請求項6記載の方法。
- ソラレン部分をリンカーを介してペプチドアクセプターに結合させる、請求項7記載の方法。
- ソラレン部分がリンカーの5’末端に位置する、請求項8記載の方法。
- ソラレン部分がリンカーの3’末端に位置する、請求項8記載の方法。
- ソラレン部分がリンカーの内部に位置する、請求項8記載の方法。
- リンカーがC6アルキル鎖を含む、請求項8記載の方法。
- RNA分子が、その3’端の近傍に停止コドンを含む、請求項8記載の方法。
- リンカーの長さが25〜40ヌクレオチド単位である、請求項8記載の方法。
- 架橋が紫外光の照射で達成される、請求項7記載の方法。
- 架橋に先立ち、さらに光切断可能な部分を含むリンカーとRNAのハイブリッドを形成させ、該ハイブリッド形成RNAを光切断可能な部分を介して固相支持体に固定化する、請求項8記載の方法。
- 光切断可能な部分がビオチンである、請求項16記載の方法。
- ペプチドアクセプターに結合する官能基をRNA分子に導入する、請求項6記載の方法。
- IO4 -酸化によりRNA分子に官能基を導入する、請求項18記載の方法。
- 化学的連結を外部鋳型の非存在下で行う、請求項18記載の方法。
- ペプチドアクセプターをリンカー分子に共有結合させ、化学的連結段階前に、外部鋳型、RNA分子の3’端およびリンカー分子の5’端とハイブリッドを形成する外部鋳型を用いて該RNA分子と該ペプチドアクセプターを整列させる、請求項18記載の方法。
- ペプチドアクセプターをリンカー分子と共有結合させ、化学的連結段階前に、リンカー分子とRNAの3’端のハイブリッドを形成させることで該RNA分子と該ペプチドアクセプターを整列させる、請求項18記載の方法。
- ペプチドアクセプターの官能基がリンカー分子の5’端に位置する、請求項22記載の方法。
- ペプチドアクセプターの官能基が、片側でRNA分子とハイブリッドを形成する領域に隣接し、もう片側で該ペプチドアクセプターに隣接する、請求項22記載の方法。
- ペプチドアクセプターの官能基が、アミン、ヒドラジン、(チオ)ヒドラジド、および(チオ)セミカルバゾンからなる群より選択される、請求項18記載の方法。
- 化学的連結段階が以下の段階を含む、請求項6記載の方法:
(a)還元的アミノ化により、RNA分子に官能基を結合させる段階;
(b)RNA分子の官能基と反応するようにペプチドアクセプターを修飾する段階;および
(c)共有結合の形成を可能とする条件下で、ペプチドアクセプターを該RNA分子に接触させる段階。 - 官能基がチオール、マレイミド、またはアミンである、請求項26記載の方法。
- 以下の段階を含む、インビトロでペプチドアクセプターをRNA分子に結合させる方法:
(a)RNA分子を提供する段階;および
(b)ペプチドアクセプターをRNA分子に非共有結合的に結合させる段階。 - ペプチドアクセプターをPNAに共有結合させ、該ペプチドアクセプターとRNA分子の非共有結合がPNAを介して生じる、請求項28記載の方法。
- RNA分子が停止コドンを含む、請求項29記載の方法。
- RNA分子が、タンパク質コード配列に使用可能に連結させた翻訳開始配列および開始コドンを含む、請求項1、3、5、6、または27記載の方法。
- ペプチドアクセプターがピューロマイシンである、請求項1、3、5、6、または27記載の方法。
- ペプチドアクセプターを非ヌクレオチドリンカー分子に共有結合させる、請求項1、3、5、6、または27記載の方法。
- リンカーがトリエチレングリコールスペーサーを含む、請求項1、3、5、または8記載の方法。
- リンカーが2’-OMe-RNAホスホラミダイトを含む、請求項1、3、5、または8記載の方法。
- RNAまたはリンカーが、アフィニティー精製用の配列を含み、該RNAを精製する段階をさらに含む、請求項1、3、5、6、8、または27記載の方法。
- アフィニティー精製用の配列がポリ(A)配列を含む、請求項36記載の方法。
- ペプチドアクセプターに化学的に連結させたRNA分子。
- RNAが、その光架橋部位に位置する停止コドンを含む、請求項38記載のRNA分子。
- 非共有結合的にペプチドアクセプターに結合させるRNA分子であって、ペプチドアクセプターをリンカー分子およびPNA分子に結合させ、非共有結合がPNA分子とRNA分子間に形成されるRNA分子。
- ペプチドアクセプターをRNA分子の3’端に連結させる、請求項38または40記載の分子。
- RNA分子が、タンパク質コード配列に使用可能に連結させた翻訳開始配列および開始コドンを含む、請求項38または40記載の分子。
- ペプチドアクセプターがピューロマイシンである、請求項38または40記載の分子。
- 以下の段階を含む、RNA-タンパク質融合体を作製する方法:
(a)光切断可能な部分、ソラレン部分、およびペプチドアクセプターを含むリンカーとハイブリッドを形成するRNA分子を提供する段階;
(b)固定化されていないRNAが固相支持体から実質的に除去される条件下で、RNAを固相支持体に固定化する段階;
(c)ペプチドアクセプターを該RNAに、ソラレン部分を介して架橋させ、それによって架橋が固相支持体から架橋RNAを同時に遊離させる段階;および
(d)段階(c)で形成された架橋RNAを翻訳して、RNA融合タンパク質を生成させる段階。
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