JP2007512837A - 二本鎖直鎖核酸プローブ及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は以下の実施例によってさらに明確になるが、実施例は本発明を説明することを意図するものにすぎず、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
Claims (22)
- 第一のオリゴ核酸と第二のオリゴ核酸を含む核酸プローブであって、
(a)前記第一のオリゴ核酸が、
(i)対象核酸に対して実質的に相補的であり、及び
(ii)フルオロフォアを含み、
(b)前記第二のオリゴ核酸が消光基質を含み、
(c)前記第一のオリゴ核酸及び第二のオリゴ核酸が一緒に結合して二本鎖核酸を形成できるように、前記第一のオリゴ核酸及び第二のオリゴ核酸が互いに対して実質的に相補的であり、
(d)前記第一のオリゴ核酸が前記第二のオリゴ核酸に結合されたときに、前記第一のオリゴ核酸に付着された前記フルオロフォアの蛍光放射が、前記第一のオリゴ核酸及び第二のオリゴ核酸が二本鎖核酸中で一緒に結合されないときの同じフルオロフォアの放射より検出可能に小さく、
(e)前記核酸プローブが、
(i)前記第二のオリゴ核酸が前記第一のオリゴ核酸に対して実質的に相補的である「n」個の核酸塩基を含み、前記第一のオリゴ核酸が対象核酸に対して実質的に相補的で「m」個の核酸塩基を含み、「m」及び「n」が、独立に選択される整数であり、並びに
(ii)mが25未満であるときには、nはm/2以下であり;mが26ないし29であるときには、nは8ないし13であり;mが30ないし34であるときには、nは8ないし15であり;mが35ないし39であるときには、nは8ないし20であり;mが40ないし44であるときには、nは9ないし25であり;mが45ないし49であるときには、nは10ないし30であり;mが50ないし54であるときには、nは10ないし35であり;mが55ないし59であるときには、nは10ないし40であり;mが60ないし64であるときには、nは11ないし45であり;mが65ないし69であるときには、nは11ないし50であり;mが70ないし75であるときには、nは15ないし55である、
ことを特徴とする、
前記核酸プローブ。 - 第一及び第二のオリゴ核酸が、対象核酸及び第一のオリゴヌクレオチドに対して相補的でないさらなる核酸塩基を、それぞれ5’及び3’末端にさらに含む、請求項1に記載の核酸。
- 第一のオリゴ核酸に対する第二のオリゴ核酸の比が1.1を超える、請求項1に記載の核酸プローブ。
- 第一のオリゴ核酸に対する第二のオリゴ核酸の比が0.1を超え及び0.9未満である、請求項1に記載の核酸プローブ。
- 第一のオリゴ核酸が消光基質をさらに含む、請求項1に記載の核酸プローブ。
- 第一のオリゴ核酸に対する第二のオリゴ核酸の比が0.1を超え及び0.9未満である、請求項5に記載の核酸プローブ。
- 第一のオリゴ核酸に対する第二のオリゴ核酸の比が1.1を超える、請求項5に記載の核酸プローブ。
- 対象核酸に結合されたときに2個のフルオロフォアを含む第一のオリゴ核酸によって生成される蛍光が、ただ一つのフルオロフォアが存在する場合に生成される蛍光より実質的に大きくなるようにするために、前記第一のオリゴ核酸が少なくとも2個のフルオロフォアを含む、請求項1に記載の核酸プローブ。
- 第一のオリゴ核酸と第二のオリゴ核酸を含む核酸プローブであって、
(a)前記第一のオリゴ核酸が、
(i)対象核酸に対して実質的に相補的であり、及び
(ii)消光基質を含み、
(b)前記第二のオリゴ核酸がフルオロフォアを含み、
(c)前記第一のオリゴ核酸及び第二のオリゴ核酸が一緒に結合して二本鎖核酸を形成できるように、前記第一のオリゴ核酸及び第二のオリゴ核酸が互いに対して実質的に相補的であり、
(d)前記第一のオリゴ核酸が前記第二のオリゴ核酸に結合されるときに、前記第二のオリゴ核酸に付着された前記フルオロフォアの蛍光放射が、前記第一のオリゴ核酸及び第二のオリゴ核酸が二本鎖核酸中で一緒に結合されないときの同じフルオロフォアの放射より検出可能に小さく、
(e)前記核酸プローブが、
(i)前記第二のオリゴ核酸が前記第一のオリゴ核酸に対して実質的に相補的である「n」個の核酸塩基を含み、前記第一のオリゴ核酸が対象核酸に対して実質的に相補的な「m」個の核酸塩基を含み、「m」及び「n」が独立に選択される整数であり、並びに
(ii)mが25未満であるときには、nはm/2以下であり;mが26ないし29であるときには、nは8ないし13であり;mが30ないし34であるときには、nは8ないし15であり;mが35ないし39であるときには、nは8ないし20であり;mが40ないし44であるときには、nは9ないし25であり;mが45ないし49であるときには、nは10ないし30であり;mが50ないし54であるときには、nは10ないし35であり;mが55ないし59であるときには、nは10ないし40であり;mが60ないし64であるときには、nは11ないし45であり;mが65ないし69であるときには、nは11ないし50であり;mが70ないし75であるときには、nは15ないし55である、
ことを特徴とする、
前記核酸プローブ。 - 第一及び第二のオリゴヌクレオチドが、対象核酸及び第一のオリゴヌクレオチドに対して相補的でないさらなる核酸塩基を、それぞれ5’及び3’末端にさらに含む、請求項9に記載の核酸。
- 第二のオリゴ核酸に対する第一のオリゴ核酸の比が1.1を超える、請求項9に記載の核酸プローブ。
- 第二のオリゴ核酸に対する第一のオリゴ核酸の比が0.1を超え及び0.9未満である、請求項9に記載の核酸プローブ。
- 第二のオリゴ核酸が消光基質をさらに含む、請求項9に記載の核酸プローブ。
- 第二のオリゴヌクレオチドに対する第一のオリゴヌクレオチドの比が0.1を超え及び0.9未満である、請求項13に記載の核酸プローブ。
- 第二のオリゴヌクレオチドに対する第一のオリゴヌクレオチドの比が1.1を超える、請求項13に記載の核酸プローブ。
- 検査試料中の対象核酸を検出する方法であって、
a)検査試料を、必要に応じて逆転写試薬と、請求項1に記載の蛍光プローブを含むDNA増幅試薬と混合して反応容器中に混合物を生成させること、
(b)必要に応じて適切な時間及び適切な逆転写条件下で、反応物をインキュベートしてRNAをcDNAに逆転写すること、
(c)適切な時間及び適切なDNA増幅条件下で、反応物をインキュベートして対象核酸の一部を増幅すること、並びに
(d)前記検査試料が対象核酸を含有するかどうかの指標として、前記蛍光プローブからの蛍光を測定すること、を含み、
容器を閉鎖する前に、消光基質を含むオリゴ核酸の追加量を前記容器に添加して、1.1を超え及び20未満である第二のオリゴヌクレオチド及び第一のオリゴヌクレオチド間のモル比を得る前記方法。 - 検査試料中の対象核酸を検出する方法であって、
a)検査試料を、必要に応じて逆転写試薬と、請求項9に記載の蛍光プローブを含むDNA増幅試薬と混合して、反応容器中に混合物を生成させること、
(b)必要に応じて適切な時間及び適切な逆転写条件下で、反応物をインキュベートして、RNAをcDNAに逆転写すること、
(c)適切な時間及び適切なDNA増幅条件下で、反応物をインキュベートして、対象核酸の一部を増幅すること、
(d)前記検査試料が対象核酸を含有するかどうかの指標として、前記蛍光プローブからの蛍光を測定すること、
容器を閉鎖する前に、消光基質を含む前記オリゴ核酸の追加量を前記容器に添加して1.1を超え及び20未満である第一のオリゴヌクレオチド及び第二のオリゴヌクレオチド間のモル比を得る、前記方法。 - 検査試料中のRNAを定量する方法であって、
(A)検査試料を、増幅試薬、逆転写試薬及び第一のオリゴ核酸と第二のオリゴ核酸とを含む請求項1に記載の核酸プローブと混合して、反応容器中に混合物を生成すること、
((a)前記第一のオリゴ核酸は、対象核酸に対して実質的に相補的であり、及びフルオロフォア含み、
(b)前記第二のオリゴ核酸は、消光基質を含み、
(c)前記第一のオリゴ核酸及び第二のオリゴ核酸が一緒に結合して二本鎖核酸を形成できるように、前記第一のオリゴ核酸及び第二のオリゴ核酸は互いに対して実質的に相補的であり、
(d)前記第一のオリゴ核酸が前記第二のオリゴ核酸に結合されるときに、前記第一のオリゴ核酸に付着された前記フルオロフォアの蛍光放射が、前記第一のオリゴ核酸及び第二のオリゴ核酸が二本鎖核酸中で一緒に結合されないときの同じフルオロフォアの放射より検出可能に小さく、
(e)前記核酸プローブは、
(i)前記第二のオリゴ核酸が前記第一のオリゴ核酸に対して実質的に相補的である「n」個の核酸塩基を含み、前記第一のオリゴ核酸が対象核酸に対して実質的に相補的な「m」個の核酸塩基を含み、「m」及び「n」が独立に選択される整数であり、並びに
(ii)mが25未満であるときには、nはm/2以下であり;mが26ないし29であるときには、nは8ないし13であり;mが30ないし34であるときには、nは8ないし15であり;mが35ないし39であるときには、nは8ないし20であり;mが40ないし44であるときには、nは9ないし25であり;mが45ないし49であるときには、nは10ないし30であり;mが50ないし54であるときには、nは10ないし35であり;mが55ないし59であるときには、nは10ないし40であり;mが60ないし64であるときには、nは11ないし45であり;mが65ないし69であるときには、nは11ないし50であり;mが70ないし75であるときには、nは15ないし55である、
ことを特徴とする。)
(B)cDNAが産生されるように、逆転写を許容することができ、必要に応じて増幅を許容することもできる条件下に検査試料を置くこと、
(C)cDNAが増幅されるように、前記検査試料に熱サイクルを行うこと、
(D)前記検査試料中のRNAの量の指標として、前記増幅反応の間に、前記検査混合物の蛍光を測定すること、
を含む、前記方法。 - 検査試料中のRNAを定量する方法であって、
(A)検査試料を、増幅試薬、逆転写試薬及び第一のオリゴ核酸と第二のオリゴ核酸とを含む請求項9に記載の核酸プローブと混合して、反応容器中に混合物を生成すること、
((a)前記第一のオリゴ核酸は、対象核酸に対して実質的に相補的であり、及び消光基質を含み、
(b)前記第二のオリゴ核酸がフルオロフォアを含み、
(c)前記第一のオリゴ核酸及び第二のオリゴ核酸が一緒に結合して、二本鎖核酸を形成できるように、前記第一のオリゴ核酸及び第二のオリゴ核酸が互いに対して実質的に相補的であり、
(d)前記第一のオリゴ核酸が前記第二のオリゴ核酸に結合されるときに、前記第二のオリゴ核酸に付着された前記フルオロフォアの蛍光放射が、前記第一のオリゴ核酸及び第二のオリゴ核酸が二本鎖核酸中で一緒に結合されないときの同じフルオロフォアの放射より検出可能に小さく、
(e)前記核酸プローブは、
(i)前記第二のオリゴ核酸が前記第一のオリゴ核酸に対して実質的に相補的である「n」個の核酸塩基を含み、前記第一のオリゴ核酸が対象核酸に対して実質的に相補的な「m」個の核酸塩基を含み、「m」及び「n」が独立に選択される整数であり、並びに
(ii)mが25未満であるときには、nはm/2以下であり;mが26ないし29であるときには、nは8ないし13であり;mが30ないし34であるときには、nは8ないし15であり;mが35ないし39であるときには、nは8ないし20であり;mが40ないし44であるときには、nは9ないし25であり;mが45ないし49であるときには、nは10ないし30であり;mが50ないし54であるときには、nは10ないし35であり;mが55ないし59であるときには、nは10ないし40であり;mが60ないし64であるときには、nは11ないし45であり;mが65ないし69であるときには、nは11ないし50であり;mが70ないし75であるときには、nは15ないし55である、
ことを特徴とする。)
(B)cDNAが産生されるように、逆転写を許容することができ、必要に応じて増幅を許容することもできる条件下に検査試料を置くこと、
(C)cDNAが増幅されるように、前記検査試料に熱サイクルを行うこと、
(D)前記検査試料中のRNAの量の指標として、前記増幅反応の間に、前記検査混合物の蛍光を測定すること、
を含む、前記方法。 - 核酸プローブの、第一のオリゴ核酸および前記第二のオリゴ核酸が、逆転写温度において、一緒に結合しない、請求項18又は19に記載の方法。
- 第一のオリゴ核酸も第二のオリゴ核酸も、逆転写温度において、対象RNAに実質的に結合しない、請求項18又は19に記載の方法。
- 検査試料中の対象核酸を検出する方法であって、
(i)検査試料をDNA増幅試薬と混合することと、
(ii)適切な時間及び適切なDNA増幅条件下で、反応物をインキュベートして、対象核酸の一部を増幅すること、
(iii)一本鎖であり、並びにフルオロフォア及び消光基質を含む第一のオリゴ核酸を添加すること、
(iv)工程(iii)の前、後又は同時に、消光基質を含む第二のオリゴ核酸を添加すること(溶液中で二本鎖を形成することができるように、第一のオリゴ核酸及び第二のオリゴ核酸は相補的であり、前記検査試料中の前記第一のオリゴ核酸に対する前記第二のオリゴ核酸の比は0.1を超え及び0.9未満である。)、
(v)前記検査試料が対象核酸を含有するかどうかの指標として、蛍光プローブからの蛍光を測定すること、
を含む、前記方法。
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