JP5284112B2 - 核酸、メチル化状態及び核酸の突然変異体を検出するための、シグナリングペア及び疎水性ヌクレオチドを含んだオリゴヌクレオチド、ステムレスビーコン - Google Patents

核酸、メチル化状態及び核酸の突然変異体を検出するための、シグナリングペア及び疎水性ヌクレオチドを含んだオリゴヌクレオチド、ステムレスビーコン Download PDF

Info

Publication number
JP5284112B2
JP5284112B2 JP2008558640A JP2008558640A JP5284112B2 JP 5284112 B2 JP5284112 B2 JP 5284112B2 JP 2008558640 A JP2008558640 A JP 2008558640A JP 2008558640 A JP2008558640 A JP 2008558640A JP 5284112 B2 JP5284112 B2 JP 5284112B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
oligonucleotide
hydrophobic
nucleotide
nucleic acid
analog
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2008558640A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2009529337A (ja
JP2009529337A5 (ja
Inventor
クリステンセン，ウルフベック
Original Assignee
ペンタベイス エイピーエス
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ペンタベイス エイピーエス filed Critical ペンタベイス エイピーエス
Publication of JP2009529337A publication Critical patent/JP2009529337A/ja
Publication of JP2009529337A5 publication Critical patent/JP2009529337A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5284112B2 publication Critical patent/JP5284112B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays

Description

発明の分野
本発明は、存在、発現、メチル化及び／又は突然変異、特に単一の点突然変異、等の核酸配列の状態、並びに正しい標的と他の標的との間の差異がわずか１ヌクレオチドほどしか異ならない場合のある他の配列を検出する分野に関する。本発明は、シグナリングペア（例えばフルオロフォア及びクエンチャー）及び少なくとも１個の疎水性ヌクレオチドを含んだオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドアナログに関する。本発明はまた、オリゴヌクレオチドアナログ及び容易に入手可能な器具を用いることにより配列の相違の検出と条件の最適化とを行う新たな方法に関する。特に本発明は、シグナリングペア及び少なくとも１個の疎水性ヌクレオチド、例えばインターカレーター（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）を含んだヌクレオチドアナログ、を有するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログを用いて、特異的に標的核酸の量を検出すること又は１ヌクレオチドほどしか異ならない場合のある他の配列に対して１個の配列を検出することに関する。
ＤＮＡ及びＲＮＡ等の核酸、並びにＰＮＡ、ＨＮＡ、ＭＮＡ、ＡＮＡ、ＬＮＡ、ＩＮＡ、ＣＮＡ、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２’−ＮＨ）−ＴＮＡ、（３’−ＮＨ）−ＴＮＡ、α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、α−Ｌ−キシロ−ＬＮＡ、β−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、α−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、［３．２．１］−ＬＮＡ、ビシクロ−ＤＮＡ、６−アミノ−ビシクロ−ＤＮＡ、５−エピ−ビシクロ−ＤＮＡ、α−ビシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］−ＤＮＡ、ビシクロ［３．２．１］−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］アミド−ＤＮＡ、β−Ｄ−リボピラノシル−ＮＡ、α−Ｌ−リキソピラノシル−ＮＡ、２’−Ｒ１−ＲＮＡ、２’−ＯＲ１−ＲＮＡ（Ｒ１は任意の置換基）、α−Ｌ−ＲＮＡ、α−Ｄ−ＲＮＡ、β−Ｄ−ＲＮＡ等の多数の核酸アナログは、相補的な核酸の鎖に特異的にハイブリダイズすることが出来る。この特異的な認識を診断用途等において特定の核酸配列の存在の検出に利用し得る。核酸配列間の小さな相違を検出することが可能である。また、任意の遺伝子のｍＲＮＡの存在量を測定し、それによってこの特定遺伝子の発現量を記述することも可能である。
利用可能な多くのアッセイは相補的検出が可能なプローブによる特定の核酸の検出に依存している。特定の核酸を検出するためには未結合のプローブを結合したプローブから分離することが必要な場合が多く、これには通常、数回の時間のかかる分離工程が必要である。
ＤＮＡ診断は最も急速に成長しつつある研究分野の１つであり、現在、詳細な完全配列を目指して日々利用可能になりつつあるヒトゲノム地図のより詳細な地図とともに、この分野の興味はさらになお拡大すると期待される。１４２万個の一塩基多型（ＳＮＰｓ）の地図が記載されており、少なくとも６０，０００個のＳＮＰｓがヒトエクソンの内部に含まれると推定されている。
興味深いことに、ゲノムＤＮＡ配列は２個体のヒトの間で１０００ヌクレオチドのうち平均にして約１ヌクレオチドが相違している。従って、特異的なＤＮＡ配列は個体の同一性を決定するのに有用であり得る。さらに、突然変異は病態の素因の指標となり得る。遺伝病の古典的な例としては鎌状赤血球貧血が挙げられるが、これは単一遺伝子であるベータ−グロビン遺伝子内の単一塩基の変化によって引き起こされる遺伝的欠陥である（コドン６においてＧＡＧがＧＴＧに変化）。１又は２核酸塩基のみが相違する配列の探索においては、高速で簡便に行うことが出来、費用効果の高い、高性能な核酸配列検出用ツールの必要性が生じている。
生物学の他の主要な分野はゲノムのメチル化である。ゲノム中の「ＣｐＧ」デュプレットのメチル化はエピジェネティックな情報の主要な要素であり、インプリンティングにおいて、また精神障害、癌生物学及びウイルス感染を含む様々な臨床的症状において重要な機能を演じていることが示されている。遺伝子のメチル化状態を鋭敏な様式で検出するのに一般的に用いられるのは、ゲノムＤＮＡを亜硫酸水素ナトリウムで処理し、全ての非メチル化シトシン「Ｃ」をデオキシリボースウラシル「ｄＵｓ」に変換する手法である：この際メチル化シトシン「ＭｅＣ」は非反応性である。これに続けて、増幅反応を行う。ゲノムＤＮＡの亜硫酸水素塩処理により、前記ＤＮＡは「Ａ−Ｔ」リッチな、基本的に３種ヌクレオチドのゲノム（メチル化「ＣｐＧ」デュプレット内に存在する「ＭｅＣ」を除く）に変換され、メチル化又は非メチル化「ＣｐＧ」デュプレットの相違は配列の相違へと形を変える（図５参照）。次いで、該ＤＮＡはシーケンシング、制限酵素消化により、又はメチル化特異的ＰＣＲ、ＭＳＰを用いた場合はゲル電気泳動後のゲル上のバンドの有無により、分析され得る。又は、ＤＮＡはＭＳＰを用いたリアルタイムＰＣＲ及び非特異的色素により分析され得る。
前記亜硫酸水素塩処理ＤＮＡは「Ａ−Ｔ」リッチな性質であることから、増幅アッセイのプライマー及びプローブにおいて特別な課題が生ずる。これは、「Ａ−Ｔ」リッチなＤＮＡは比較的親和性が低く、また単一の「Ｃ」ヌクレオチドと「Ｔ」ヌクレオチドとの間を区別することが難しいためである。
核酸配列中の突然変異を検出するための様々な手法としては、例えば一本鎖高次構造分析、変性勾配ゲル電気泳動、ヘテロデュープレックス分析、化学的ミスマッチ切断及びダイレクトシーケンシング等がある。これらの手法の総説は、非特許文献１により示されている。各種手法のうち、蛍光を基盤とした方法も利用可能である。
リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）の発明は迅速かつ正確な様式で発現（リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）等の遺伝子の状態を決定する方法に革命をもたらしたが、該手法は類似した標的間の識別のためにも用いられる。該手法の多くの進歩にもかかわらず、これらの手法の改良に対しては未だ満たされていない要求が存在する。
今日、最も広く用いられているプローブの一部には、分子ビーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎｓ）、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（ＴａｑＭａｎはＲｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃの登録商標である）、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマー及びデュアルハイブリダイゼーションＦＲＥＴプローブ（最近、Ａｒｙａほかにより概説されている、（非特許文献２）がある。これらの手法はそれぞれ、互いに異なった用途と関連した利点及び欠点を有している。これらの手法全てに共通しているのは、設計が難しく、コンピューターソフトウェア又は専門家の支援と、作業のための長期の最適化とが必要なことである（ソフトウェアの例としては、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（米国）（ｗｗｗ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ）から入手可能なＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）；Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｂｉｏｓｏｆｔ（ｗｗｗ．ｐｒｅｍｉｅｒｂｉｏｓｏｆｔ．ｃｏｍ）から入手可能なＢｅａｃｏｎ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ；及びＰｒｉｍｅｒ３ 著作権（ｃ）１９９６，１９９７，１９９８，１９９９，２０００，２００１，２００４ Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．著作権所有（ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ３／ｐｒｉｍｅｒ３ ｗｗｗ．ｃｇｉ）；のようなプログラムが有る）。
前記ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイではフルオロフォア及びクエンチャーからなるシグナリングペアを含んだＤＮＡを基盤としたプローブが用いられる。該手法では、可能な最大のＳ／Ｎ比を達成するため、好ましくはフルオロフォア及びクエンチャーを前記プローブの互いに反対側の末端に位置させる必要がある。ＰＣＲ反応における増幅の過程で、該プローブは特異的にその増幅されようとしている標的配列にハイブリダイズする。ＴａｑポリメラーゼはＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブに到達するとそのエキソヌクレアーゼ活性を用いて該プローブを分解し、それによってフルオロフォアが自由にクエンチャーから離れてさらに移動するようになり、シグナルが消光されなくなる。このエキソヌクレアーゼ活性により生成した蛍光は存在する標的配列の量と相関している。前記ＰＣＲ反応の効率を知ることにより、該蛍光シグナルを標的配列の出発量の計算に用いることが出来る。
前記ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブでは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイの特異性及び感度を最適化するためのいくつかの変更点が報告されている。これらの変更点には、マイナーグルーブ（副溝）バインダー（Ｍｉｎｏｒ Ｇｒｏｏｖｅ Ｂｉｎｄｅｒ）、及び標的配列への親和性を増加させ、より短いプローブを用いることが出来るように用いられたロックド核酸（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等のヌクレオチドアナログ（下記のさらなる記載及び文献を参照のこと）の導入が含まれる。しかし、報告されている全てのＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイにおいては、無傷のプローブのフルオロフォアの消光はランダムコイルらせん形成（ｒａｎｄｏｍ ｃｏｉｌ ｈｅｌｉｘ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に依存している。
前記分子ビーコン（「ヘアピン」又は「ステム−ループ」プローブ）は２つのステム配列（プローブの各末端に１個ずつ）を含み、これらはこの２つのステム配列を隔てる配列（ループ配列）に対し相補的にハイブリダイゼーションすることが可能な標的配列が無ければ２本鎖を形成し得る。該プローブは通常、互いに反対側の末端に連結したフルオロフォア及びクエンチャーからなるシグナリングペアを含む。ステムが形成されると、従って該フルオロフォア及びクエンチャーは近接し、シグナルが消光される。しかし、前記ループ配列が標的配列にハイブリダイズすると、前記の２つのステム配列、並びに従って該フルオロフォア及びクエンチャーは分離し、シグナルを生成させ、その読み取りが可能となる。プローブはバックグラウンドシグナルが無いか又は非常に少ないため、分子ビーコンは均一アッセイ（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ ａｓｓａｙ）及び生細胞における標的配列の検出に使用され得ると主張されている。
前記分子ビーコンのステム配列は前記標的配列とは関連性が無い。適切なステム形成及び安定性は前記ステムの長さ及びＧ：Ｃ含量、並びにそれが溶解している緩衝液の条件に依存する。標的配列もＧ：Ｃ含量、長さ、及びどれだけ類似した非標的配列が存在し得るかという点において様々であり得るため、該ループ配列の長さ及びＧ：Ｃ含量はプローブごとに異なる。従って、前記ループ配列に依存した最適化されたステム配列を用いる必要がある。また、前記分子ビーコンはアンプリコンの再アニーリングだけでなく、前記プローブの分子内アニーリングに対しても競合すると思われる。
ＤＮＡ及びＰＮＡを基盤としたステムレスビーコン（Ｓｔｅｍｌｅｓｓ Ｂｅａｃｏｎｓ）を含む、ステムレスビーコン（リニアビーコン（Ｌｉｎｅａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ））に関するいくつかの従来技術が公開されている。ＤＮＡステムレスビーコン（特許文献１
、Ｍｙａｎａｒｄ）はポリメラーゼによる５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性による消化と３’伸長活性とに影響されない状態にされている。前記プローブが結合しなかった場合の、該プローブの一方の末端に位置するフルオロフォアの、該プローブの他方の末端に位置する前記クエンチャーによる消光は、ランダムらせんコイル形成（ｒａｎｄｏｍ ｈｅｌｉｘ ｃｏｉｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によって制御される。Ｍａｙｎａｒｄは前記レポーター分子及びクエンチャー分子は最適なＳ／Ｎ比を達成するため好ましくは１８又は２０塩基によって隔てられるとしている。前記文献及びその従来技術においては、この比は前記プローブの長さに大きく依存すると述べられている。ヌクレアーゼ消化に対する耐性はこれらステムレスビーコンの内在的な部分であり、そのため前記プローブはＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイのようなヌクレアーゼ依存のアッセイに用いることは出来ない。
Ｇｉｌｄｅａほか（特許文献２）はシグナリングペアを含んだリニアビーコンを基盤としたＰＮＡを記載しており、該ペアの２つの部分は該プローブの各末端に位置する。この発明とＤＮＡ基盤の前記リニアビーコンの発明との違いは、主鎖モノマー単位がＧｉｌｄｅａらの例ではＤＮＡではなくＰＮＡの主鎖モノマー単位であるということである。彼らは、該プローブのバックグラウンドが少ないのはＰＮＡの挙動の様式によるものであり、また同様な長さ及び標識形態の核酸とＰＮＡプローブとの間では構造及び機能が明らかに不等価であるとしている。前記文献中に記載されているプローブは次のもののうち２つに無影響であるべきと述べられている：プローブ長、Ｍｇ２＋濃度、緩衝液のイオン強度、及びフルオロフォアとクエンチャーとの間のスペクトルの重複；最初の３者に関しては通常、ＰＮＡ及び少数の他のＤＮＡアナログを基盤とするプローブのみに観察される。該文献にはプローブ中に挿入された疎水性分子を含むオリゴヌクレオチドアナログについては記載されていない。ヌクレアーゼ消化に対する抵抗性も該文献により記載された前記プローブの部分であり（ＰＮＡに内在的）、そのため該プローブはＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイのようなヌクレアーゼ依存のアッセイに用いることは出来ない。
従来技術において、シグナリングペアを含んだヌクレオチド及びヌクレオチドアナログが記載されている：
Ｋｕｔｙａｖｉｎ及び共同研究者らはプローブの３’末端にＭＧＢ分子を結合させ、５’−ヌクレアーゼＰＣＲアッセイ（非特許文献３）においてそれを用いた。また、ＭＧＢが前記プローブの５’末端に取り付けられ、ポリメラーゼのヌクレアーゼ活性を必要としない、Ｅｃｌｉｐｓｅと呼ばれるシステムも同じ研究室が記載した（非特許文献４）。これらの両者のシステムにおいては、一致した標的とミスマッチの標的との間を最適に判別させるため、多型的な塩基（潜在的なミスマッチの箇所）は前記ＭＧＢが取り付けられたサイトから約５ヌクレオチドに位置すべきである。これは、多型的な塩基がプローブの中央に位置している場合に融解温度において最も大きな差異、従って最も高い特異性、を示すことがこれまでに示されている、通常のＤＮＡ基盤のプローブとは対照的である。該プローブが未結合の場合の蛍光の消光はランダムコイリング（ｒａｎｄｏｍ ｃｏｉｌｉｎｇ）に限定されている。望まれない二次構造の形成を回避するため、プローブの設計は多くの場合高度な柔軟性を有する必要が有るため、設計の選択肢が限定的であることは不都合であり得る。
Ｌｅｔｅｒｔｒｅほか ２００３は、ロックド核酸、ＬＮＡを５’−ヌクレアーゼＰＣＲアッセイにおいて用いることが出来、その結果はＭＧＢ ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブで得たものに匹敵することを示した（非特許文献５）。しかし、最適なＬＮＡ含有プローブを設計するのは２つの理由から難しい：まず、ＬＮＡヌクレオチドはヌクレアーゼ抵抗性であり、５’−ヌクレアーゼアッセイの際に該プローブが分解される必要がある；次に、ＬＮＡヌクレオチドは極めて高い自己親和性（ｓｅｌｆ−ａｆｆｉｎｉｔｙ）を有しており、そのため設計を注意深く行わないと二次構造を形成する傾向がある。少数のＬＮＡヌクレオチドのみを含んだＤＮＡ−ＬＮＡハイブリッドは非常に安定な二次構造を形成し得るため、該プローブが相補的な１本鎖ＤＮＡ標的とハイブリダイズ出来ない場合があることがこれまでに示されている（非特許文献６）。
非特許文献７においてはステムレスペプチド核酸（ＰＮＡ）ビーコン（Ｓｔｅｍｌｅｓｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＰＮＡ） ｂｅａｃｏｎ）が記載されている。該ＰＮＡビーコンは標的核酸と未結合の場合、コンパクトなランダムコイル状らせんへとたたみこまれる傾向を示すが、これは望ましくないことが多い。ＰＮＡ基盤の手法がＤＮＡ基盤の手法に対していくつかの面でいくつかの利点をもたらすとは言え、それらはＤＮＡ基盤の手法と比べ高価であり、ＤＮＡ基盤のアッセイよりも合成および最適条件の決定において課題を与えるものである。ＰＮＡはタンパク質とオリゴヌクレオチドとの組み合わせから成るため、ＰＮＡの挙動は常に容易に予測可能な訳ではない。
特許文献３においては、フルオロフォアを結合したプローブ及び２本鎖インターカレーターである遊離した（ｆｒｅｅ ｆｌｏａｔｉｎｇ）クエンチャー分子からなる蛍光システムの存在下で増幅された試料中の蛍光の測定について記載されている。
特許文献４においては、イオン強度、マグネシウム濃度、フルオロフォアとクエンチャーとの間のスペクトルの重複、及びプローブ長に非感受性のＰＮＡ及び関連する分子を含んだ前記リニアビーコンが記載されている。疎水性分子を含んだプローブはこれらの特許において含まれていないか又は議論されていない。
特許文献５においては、前記プローブの同一末端において近接するフルオロフォア及びクエンチャーを有するプローブについて記載されている。相補的核酸へのハイブリダイゼーションの際、該フルオロフォア又は該クエンチャーは形成された２本鎖と（インターカレーション又はマイナーグルーブ（副溝）結合により）相互作用し、該フルオロフォアが消光されることなく蛍光を発することが出来る。
特許文献６においては、フルオロフォア及び任意にクエンチャーを含んだプローブが記載されている。該フルオロフォアはミスマッチが前記標的核酸中に存在しているか否かにより異なった挙動を示し、これによって一方を他方から識別することが出来る。前記プローブは融点分析（ｍｅｌｔｉｎｇ ｐｏｉｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）に用いることも出来る。該プローブは通常、伸長を回避するため、３’末端においてブロックされる必要がある。
特許文献７においては、一方の末端にフルオロフォアを、他方の末端にクエンチャーを有するプローブであって、該プローブが該プローブの３’末端の１または複数個のホスホルチオエートの挿入によって５’から３’方向へのエキソヌクレアーゼ分解から保護されているプローブの使用について記載されている。
特許文献８においては、一方の鎖がフルオロフォアを含み、他方の鎖がクエンチャーを含むプローブ２本鎖の使用について記載されている。鎖の一方は他方よりも長く、該プローブ対の２本の鎖が互いに結合すると、該クエンチャー及びフルオロフォアは互いに近接する。しかし、完全に相補的な標的の存在下では、この長い方のプローブはそれに優先的に結合し、そのため該フルオロフォアはクエンチャーから分離され、従って蛍光を発するようになる。該プローブの消光はこのプローブシステムの前記の２つの部分の二重らせん形成により制御される。
特許文献９においては、任意にフルオロフォア及びクエンチャーによって標識することが出来るプローブであって、該プローブの末端にマイナーグルーブ（副溝）バインダー（ＭＧＢ）を含むプローブが記載されている。該ＭＧＢは相補的ＤＮＡに対する親和性を増加させ、従ってより短く、より特異的なプローブを用いることが出来る。
特許文献１０においては、「分子ビーコン」と呼ばれるヘアピンプローブが記載されている。該プローブはフルオロフォア及びクエンチャーをオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログの各末端に１個含んでいる。該オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログは複数の配列に分かれており、配列１及び３は該プローブが標的核酸に何も結合しなかった場合に前記ヘアピン構造内のステムを構成し、配列２は該標的核酸に対し相補的である。バックグラウンド蛍光は配列１及び３の二重らせん形成に依存している。
特許文献１１においては、標的核酸に対する親和性を向上させ、蛍光タグとしてのヌクレアーゼ安定性を向上させ、及び／又は自己親和性を減少させるためのインターカレート偽ヌクレオチド（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ｐｓｅｕｄｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）を含んだヘアピンプローブについて記載されている。この発明及び記載は本発明の「ステムレスビーコン」の概念を議論していない。この文献には標的核酸の検出のための相補的プローブの使用についても記載されているが、本発明における発見とは異なり、未結合のプローブのステムレス消光については記載されていない。
特許文献１２においては、短波長ハーベスター（ｈａｒｖｅｓｔｅｒ）及び長波長エミッター（ｅｍｉｔｔｅｒ）並びにクエンチャーを含んだ３重標識ヘアピンプローブについて記載されている。標準的な分子ビーコンと比較して追加のフルオロフォアが存在することで蛍光強度が増加し、そのためＳ／Ｎ比が増加する。
特許文献１３においては、ヘアピン形ＰＮＡ分子ビーコンの方法、キット及び組成物について記載されている。この文献はステムレスビーコンの概念に関して記載していない。
特許文献１４においては、３つのオリゴヌクレオチド成分を含み、１個がヘアピン構造を形成し、残りの２つがこの形成されたステムのそれぞれの側に相補的であるトリパータイト分子ビーコン（Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎｓ）（ＴＭＢｓ）について記載されている。
本申請において引用される全ての特許及び非特許文献も本明細書において参照によりその全体が組み込まれたものとする。
米国特許第６，３６１，７９５号 米国特許出願第２００５／０２２７２４７ ＷＯ１９９９／２１８８１ ＷＯ２００４／０３３７２６ 米国特許出願公開第２００２／０６４７７２、ＷＯ１９９９／２１８８１、及びＥＰ１４８４３３７ 米国特許出願公開第２００５／０２３３３６０ ＷＯ ０１／７３１１８ 米国特許出願公開第２００５／０２２７２４７ 米国特許出願公開第２００５／０２２７２５７ 米国特許出願公開第２００５／００６４４６３ 米国特許出願公開第１９９９／５９２５５１７及び米国特許出願公開第２０００／６１０３４７６ ＷＯ０３／０５２１３２ 米国特許出願公開第２０００／６０３７１３０ 米国特許出願公開第２００２／６３５５４２１ 米国特許出願公開第２００５／０１５８７２０ Ｇｒｏｍｐｅ （Ｍ． Ｇｒｏｍｐｅ（１９９３） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ５：１１１−１１７） ２００５、Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．５：２０９−２１９ Ｋｕｔｙａｖｉｎほか （２０００） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：６５５−６６１ Ａｆｏｎｉｎａ，Ｉ．ほか （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２６５７−２６６０ Ｌｅｔｅｒｔｒｅ，Ｃ．ほか （２００３） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ １７：３０７−３１１ Ｆｉｌｉｃｈｅｖほか （２００４） Ｃｈｅｍ−ｂｉｏｃｈｅｍ． ５： １６７３−１６７９ Ｓｅｉｔｚ， Ｏ． （２０００） Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． ３９： ３２４９−３２５２
発明の概要
核酸の標的配列を検出し、定量し、そして同定し得ることは長い間科学者にとって関心の対象であった。この目的に対しては「分子ビーコン」（「ヘアピンプローブ」）及び「ＴａｑＭａｎ」のようないくつかの手法が開発されたが、現在利用可能な全ての手段及び手法はいくつかの制限及び欠点を有している。該分子ビーコンはヘアピン形プローブであり、リアルタイムＰＣＲのアニーリング温度において、アンプリコンの再アニーリングだけでなく該プローブの分子内アニーリングにも競合する必要がある。従ってプローブの最適化、ストリンジェントな条件、及びプローブの設計が必要である。また一方、分子内ステム形成とは異なり、前記ＴａｑＭａｎプローブは未結合プローブの蛍光の消光をランダムコイルらせん構造に依存しており、また前記フルオロフォアを「活性化」するためにポリメラーゼのヌクレアーゼ活性にも依存している。
発明を解決するための手段
驚くべき事に、本発明は、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログに共有結合的に挿入された疎水性分子が未結合オリゴヌクレオチドの折りたたみを促進し、同時に該疎水性分子が標的配列とのハイブリダイゼーションをそれが存在していたときに妨げないということを開示する。本発明で示される該プローブは、疎水性分子が他の疎水性分子との相互作用によりその疎水性表面の水溶液への曝露を遮蔽又は低下させる傾向と、オリゴヌクレオチドアナログの各半分に一つの部分ずつ配置された２つの部分のシグナリングペア間の相互作用の向上とを初めて組み合わせである（図１参照）。
従って、本発明により示される未結合プローブのシグナリングペアの相互作用は単にランダムらせんコイル形成によるものではなく、また一方で未結合プローブの消光をもたらすように設計された分子内ステム構造を必要としない。これまでに開示されている「分子ビーコン」と同様に、本発明のプローブは良好なＳ／Ｎ比を有する。従って、本発明のプローブも本明細書において「ステムレスビーコン」と命名する。本発明のステムレスビーコンは一般的に相補的領域を有しない（即ち「ステム」が無い）ため、一般に対応する分子ビーコンよりも短い。これらは設計及び最適化が容易であり、さらに疎水基の存在により該プローブの精製が容易になり得る。上に概説したように、読み取り温度（ｒｅａｄｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）よりも高く、前記標的核酸への結合と競合する温度よりも低いアニーリング温度を有しなければならない分子内自己アニーリング部分を設計する必要が無い。本発明で記載されるステムレスビーコンは疎水性分子の挿入を有しない対応する直鎖状プローブよりも良好なＳ／Ｎ比を有しており、ヌクレアーゼ依存及びヌクレアーゼ非依存のアッセイにおいて使用することが出来る。
前記分子プローブの主要な課題の一つは、わずか１ヌクレオチドほどしか相違しない極めて類似した標的間における識別を可能にするということである。一般的に言えばプローブが短いほど１個のミスマッチが親和性に対して大きな影響を有し、従って完全に相補的な標的とミスマッチを有するものとを区別することがより容易になる。
本発明は設計が容易で低いバックグラウンド蛍光を有する新たな種類の分子プローブについて記載する。該プローブはヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログ、シグナリングペア（例えばフルオロフォア及びクエンチャー）及び少なくとも１個の追加の疎水性部分を含んでおり、該部分は該ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログが該疎水性分子を含んでいなかった場合よりも良好なＳ／Ｎ比を促進する。本明細書に記載するプローブは、発現、特定対立遺伝子等の標的核酸の存在、一塩基多型（ＳＮＰｓ）、突然変異及びメチル化状態（エピジェネティックな情報）の分析を含む多数の様々な用途に対して有用である。
従って、シグナリングペア及び少なくとも１個の疎水性分子、好ましくは本明細書で以下に記載する疎水性ヌクレオチドを含んだオリゴヌクレオチドアナログを提供することが本発明の第１の目的であり、ここで該オリゴヌクレオチドアナログのＳ／Ｎ比は該疎水性分子を含まない対応するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログのＳ／Ｎ比よりも有意に高いか又は低い（１の値と異なる）。
従って、シグナリングペア及び少なくとも１個の一般構造
Ｘ−Ｙ−Ｑ
［式中、
Ｘは核酸若しくは核酸アナログ、又は核酸若しくは核酸アナログの主鎖に組み込まれ得る主鎖モノマー単位であり、
Ｑは本発明の疎水性分子であって特異的水素結合ともシグナリングペアの部分とも関与せず；そして
Ｙは前記ヌクレオチド若しくはヌクレオチドアナログ又は主鎖モノマー単位と前記疎水性分子とを連結するリンカー部分である］
を示す疎水性ヌクレオチドを含んだオリゴヌクレオチドアナログを提供することは本発明の目的であり、ここで、前記オリゴヌクレオチドアナログのＳ／Ｎ比は、前記オリゴヌクレオチドアナログが標的核酸とハイブリダイズしていない（ｕｎｈｙｂｒｉｄｉｓｅｄ）状態から標的核酸とハイブリダイズしている状態になる場合、また逆の場合においても、前記疎水性分子を含まず前記オリゴヌクレオチドアナログと同一のヌクレオチド配列からなる対応するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログと前記標的核酸との間のハイブリッド（対応するハイブリッド）のＳ／Ｎ比と比較して著しく改善されている。
より具体的には、連続したｎ個のヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログの配列並びに少なくとも１個の疎水性ヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドアナログが共有結合的にシグナリングペアに連結しており、
ここで、前記疎水性ヌクレオチドが一般構造
Ｘ−Ｙ−Ｑ
[式中、
Ｘはヌクレオチド若しくはヌクレオチドアナログ、又は核酸若しくは核酸アナログの主鎖に組み込まれ得る主鎖モノマー単位であり、
Ｑはワトソン・クリック水素結合には関与しない疎水性分子であり；そして
Ｙは前記ヌクレオチド若しくはヌクレオチドアナログ又は主鎖モノマー単位と前記疎水性分子とを連結するリンカー部分である］
を有し；そして
ｎは少なくとも４の整数であり；そして、
少なくとも１個の疎水性ヌクレオチドが一方の末端から最大で９ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログの位置に有り；そして、
前記シグナリングペアが２つの部分で構成されるシステムからなっており、ここで一方の部分が５’末端から６ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログ以内の位置に有り、他方の部分が３’末端から６ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ以内の位置に有り；
前記シグナリングペアの前記部分が前記疎水性ヌクレオチドと同一ではなく、
前記シグナリングペアの１個の部分が突出末端として５’末端に位置している場合、５’末端の最初のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログは疎水性ヌクレオチドではなく、前記シグナリングペアの１個の部分が突出末端として３’末端に位置している場合、３’末端の最初のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログは疎水性ヌクレオチドではない
オリゴヌクレオチドアナログを提供することは、本発明の目的である。
一部の疎水性分子が単独でまたはペアの部分として検出可能なシグナルを生成し得るとは言え、その疎水性分子は前記シグナリングペアの部分とはみなされないことに注意すべきである。従って、前記オリゴヌクレオチドアナログは疎水性分子及びシグナリングペアの２つの部分を有する。
発明者は、向上したヌクレアーゼ安定性を有するオリゴヌクレオチドアナログが、例えばエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いた増幅反応後のエンドポイント測定において有用であり得ることも見いだした。従って、向上したエキソ及び／又はエンドヌクレアーゼ安定性を有するオリゴヌクレオチドアナログ（例えば本発明の任意のオリゴヌクレオチドアナログ）を使用するための方法、並びに広範な各種標的配列の検出及び／又は同定に用いることの出来る標準的な条件を提供することは本発明の第２の目的である。これらの方法は特定のアッセイの条件を最適化するための迅速な方法としても使用され得る。
従って、
１）標的配列を含み得る核酸の混合物を提供し；そして
２）本発明のオリゴヌクレオチドアナログを提供し；そして
３）前記核酸及び前記オリゴヌクレオチドアナログをハイブリダイゼーション可能な条件下でインキュベートし；そして
４）ハイブリダイゼーションを検出する
工程を含む、本発明のオリゴヌクレオチドアナログと核酸混合物中の標的配列との間のハイブリダイゼーションを検出する方法を提供することは本発明の目的である。
本発明のオリゴヌクレオチドアナログと鋳型中の標的配列とのハイブリダイゼーションを増幅中に検出、同定及び／又は定量する方法を提供することも本発明の目的である。
ａ）標的配列及び／又は変異配列を検出、同定及び／又は定量するために用いるのに望ましい核酸の混合物を提供し；そして
ｂ）増幅酵素を含んだ増幅緩衝液、１組のプライマー、及び本発明のオリゴヌクレオチドアナログを提供し、ここで前記プライマー及び前記オリゴヌクレオチドアナログが前記標的配列及び／又は変異配列とハイブリダイズすることが出来、前記増幅酵素が鋳型を標的とした様式でプライマーを伸長することが出来、前記増幅緩衝液が増幅酵素にとってこのような伸長を行うのに必要なもの（プライマー及び鋳型以外）を含んでおり；そして
ｃ）前記プライマーがハイブリダイゼーション可能な条件下で前記プライマー及びオリゴヌクレオチドアナログを核酸の前記混合物とともにインキュベートし；そして
ｄ）ハイブリダイズした配列をヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログとともに前記増幅酵素による前記プライマーの３’末端の鋳型伸長（ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）に使用し；そして
ｅ）前記核酸、伸長産物及びオリゴヌクレオチドアナログをハイブリダイゼーション可能な条件下でインキュベートし；そして
ｆ）ハイブリダイゼーションを検出し；そして
任意に工程ｃ）からｆ）までを反復する。
標的及び／又は変異配列の検出又は同定、並びに均一アッセイにおける最適読み取り温度範囲の迅速な決定のための普遍的な手法を提供することはさらに本発明の目的であり、該手法は上に記載されるハイブリダイゼーションを検出する方法を含み、次の工程が最終工程の後に追加される：
５）前記混合物を変性し、設定温度まで急速に冷却する（親和温度（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）よりも高い温度から開始）；そして、
６）前記シグナリングペアからのシグナルを測定し；そして、
７）工程１）から３）を反復し、温度が前記親和温度よりも低くなるまで工程１）における温度を次第に下げてゆくことによりシグナリングペアを含む前記核酸アナログの親和性を決定する。
また、
ａ）連続したｎ個のヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログの配列並びに少なくとも１個の疎水性ヌクレオチドを含み、該オリゴヌクレオチドアナログが共有結合的に２つの部分で構成されるシステムからなるシグナリングペアに連結しており、
ここで、前記疎水性ヌクレオチドが一般構造
Ｘ−Ｙ−Ｑ
［ここで、
Ｘはヌクレオチド若しくはヌクレオチドアナログ、又は核酸若しくは核酸アナログの主鎖に組み込まれ得る主鎖モノマー単位であり、
Ｑは特定のワトソン・クリック水素結合には関与しない疎水性分子であり；そして、
Ｙは前記ヌクレオチド若しくはヌクレオチドアナログ又は主鎖モノマー単位と前記疎水性分子とを連結するリンカー部分である］
を有しており；そして、
ｎは少なくとも６の整数であり；そして、
前記ヌクレオチドアナログが標的配列にハイブリダイズしていない場合の方が、前記ヌクレオチドアナログが標的配列にハイブリダイズしている場合よりも、前記シグナリングペアの前記の２つの部分が互いに近接している
オリゴヌクレオチドアナログを提供し；そして、
ｂ）前記オリゴヌクレオチドアナログの標的配列を潜在的に含んだ核酸の混合物を提供し；そして、
ｃ）前記核酸及び前記オリゴヌクレオチドアナログをハイブリダイゼーション可能な条件下でインキュベートし；そして、
ｄ）前記シグナリングペアの前記部分同士が近接しているかどうかを決定することによりハイブリダイゼーションを決定し；
ｅ）それによってハイブリダイゼーションを決定する
工程を含む、ハイブリダイゼーションを決定するための方法を提供することも本発明の目的である。
また、
１）標的配列及び／又は変異配列を検出、同定及び／又は定量するために用いるのに望ましい核酸の混合物を提供し；そして、
２）１組のプライマー、増幅酵素を含んだ増幅緩衝液、及びオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログを提供し、ここで前記オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログがヌクレアーゼ抵抗性であり、及び／又は前記増幅酵素がヌクレアーゼ活性を何も含まず；そして、
３）ハイブリダイゼーション可能な条件下で前記プライマー及びオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログを核酸の前記混合物とともにインキュベートし；そして、
４）ハイブリダイゼーションを検出し；そして、
５）所望の伸長温度に達するまで一定の間隔でシグナル強度を測定しながら徐々に温度を上昇させ；そして、
６）前記伸長反応を終了させ、形成されたアンプリコンを変性し、工程ｃ）からｆ）を所望の増幅が生ずるまで反復する
工程を含む、増幅反応における検出、同定又は定量、及び最適読み取り温度範囲の迅速な決定のための普遍的な方法を提供することも本発明の目的である。
また、
１）任意に前記標的配列を含んだ核酸配列の混合物を提供し；そして、
２）１組のプライマー、増幅酵素を含んだ増幅緩衝液、及びオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログを提供し、ここで前記プライマー及び前記オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログは前記標的配列又はそれに相補的な配列とハイブリダイズすることが出来、前記増幅酵素がヌクレアーゼ活性を有する場合、前記オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログはヌクレアーゼ抵抗性であり；そして、
３）ハイブリダイゼーション可能な条件下で前記プライマー及びオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログを核酸の前記混合物をともにインキュベートし；そして、
４）ハイブリダイゼーションを検出し；そして、
５）所望の伸長温度に達するまで一定の間隔でハイブリダイゼーションを検出しながら徐々に温度を上昇させ；そして、
６）前記伸長反応を終了させ、形成されたアンプリコンを変性し、工程３）から６）を所望の増幅が生ずるまで反復する
工程を含む、標的配列の増幅のための方法を提供することも本発明の目的である。
さらに、本発明の少なくとも２つのステムレスビーコンの使用が一塩基多型の特徴付け及び他の極めて類似した核酸同士の識別にどのように用いられ得るのかについて開示される。従って、核酸の混合物に対し少なくとも２つの、それぞれ異なったシグナリングペアで標識された、期待される可能な遺伝子型それぞれに対し相同で相補的なステムレスビーコンを提供することが本発明の第３の目的である。
ステムレスビーコンを含んだキットを提供することが本発明の第４の目的である。
発明の詳細な説明
核酸
「核酸」という語は天然の核酸、ＤＮＡ及びＲＮＡを包含し、メチル化ＤＮＡ、付加物を有するＤＮＡ及びタンパク質に共有結合的に結合したＲＮＡ等の、しかしこれらに限定される物ではないＤＮＡ及びＲＮＡの天然の誘導体を含む。「核酸アナログ」という語は天然の核酸、ＤＮＡ及びＲＮＡの合成誘導体及びアナログを包含する。合成アナログは１又は複数個のヌクレオチドアナログを含む。
「ヌクレオチド」という語は一般的に天然のヌクレオチド、例えば天然のリボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチド、又はリボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチドの天然の誘導体を指す。「ヌクレオチドアナログ」という語は、基本的に天然のヌクレオチドと同様に、核酸主鎖に組み込まれ得る、また特異的に塩基対形成し得る（下記参照）全てのヌクレオチドアナログを含む。「疎水性ヌクレオチド」という語は詳細を下に記す疎水性ヌクレオチドを指す。疎水性ヌクレオチドは一般的に天然のものではない。
「オリゴヌクレオチド」という語はヌクレオチドのオリゴマーを指す。「オリゴヌクレオチドアナログ」という語は少なくとも１個の疎水性ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログ及び／又は偽ヌクレオチド並びに任意に天然のヌクレオチドを含んだオリゴヌクレオチドを指す。
従って、「核酸」又は「核酸アナログ」という語は基本的に複数のヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログ及び／又は疎水性ヌクレオチドからなるあらゆる分子を表す。疎水性ヌクレオチドについては以下に詳細に記載する。本発明の核酸又は核酸アナログは、異なる主鎖モノマー単位を有するさらなる各種ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログを含んでいてもよい（下記参照）。
好ましくは、本発明の核酸又は核酸アナログは、実質的に相補的な１本鎖核酸及び／又は核酸アナログとハイブリダイズして２本鎖核酸又は核酸アナログを形成し得る。より好ましくは、このような２本鎖アナログは二重らせんを形成し得る。好ましくは、該二重らせんは水素結合により形成され、より好ましくは該二重らせんはＡ型、Ｂ型、Ｚ型及びその中間型からなる群より選択される二重らせんである。
従って、本発明の核酸及び核酸アナログは、ＰＮＡ、ＨＮＡ、ＭＮＡ、ＡＮＡ、ＬＮＡ、ＩＮＡ、ＣＮＡ、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２’−ＮＨ）−ＴＮＡ、（３’−ＮＨ）−ＴＮＡ、α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、α−Ｌ−キシロ−ＬＮＡ、β−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、α−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、［３．２．１］−ＬＮＡ、ビシクロ−ＤＮＡ、６−アミノ−ビシクロ−ＤＮＡ、５−エピ−ビシクロ−ＤＮＡ、α−ビシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］−ＤＮＡ、ビシクロ［３．２．１］−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］アミド−ＤＮＡ、β−Ｄ−リボピラノシル−ＮＡ、α−Ｌ−リキソピラノシル−ＮＡ、２’−Ｒ１−ＲＮＡ、２’−ＯＲ１−ＲＮＡ（Ｒ１は置換基）、α−Ｌ−ＲＮＡ、α−Ｄ−ＲＮＡ、β−Ｄ−ＲＮＡ；及びその混合物；並びにそのハイブリッド；さらにホスホロチオエート類、メチルホスホレート類（ｍｅｔｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｌａｔｅｓ）、ホスホルアミジエート類（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉａｔｅｓ）、ホスホロジチエート類（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉａｔｅｓ）、ホスホロセレノエート類、ホスホトリエステル類及びホスホボラノエート類（ｐｈｏｓｐｈｏｂｏｒａｎｏａｔｅｓ）等の、しかしこれらに限定されないそのリン原子修飾物；から選択される核酸及び／又は核酸アナログの種類を含むがそれらに限定されない。さらに、メチルイミノメチル、ホルムアセテート（ｆｏｒｍａｃｅｔａｔｅ）、チオホルムアセテート（ｔｈｉｏｆｏｒｍａｃｅｔａｔｅ）及びアミド類を含む連結基等の、しかしこれらに限定されないリン非含有化合物をヌクレオチド連結のために用いてもよい。特に、核酸及び核酸アナログは１又は複数個の本発明の疎水性ヌクレオチドを含んでいてもよい。
この文脈において、「混合物」とは、異なった種類のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを含んだ核酸又は核酸アナログの鎖を包含した意味で用いられる。また、この文脈において、「ハイブリッド」とは、１又は複数種類の主鎖を有するヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを含んだ１本の鎖と、異なった種類の主鎖を有するヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを含んだ他の鎖とを含む核酸又は核酸アナログを包含した意味で用いられる。「デュープレックス」という語により、鎖が好ましくは同一種類の核酸及び／又は核酸アナログからなる、核酸及び／又は核酸アナログの２本の鎖のハイブリダイゼーション産物が意味される。
ＨＮＡとは、例えばＶａｎ Ａｅｔｓｃｈｏｔほか，１９９５により記載された核酸を意味する。ＭＮＡとは、Ｈｏｓｓａｉｎほか，１９９８により記載された核酸を意味する。ＡＮＡはＡｌｌｅｒｔほか，１９９９により記載された核酸を示す。ＬＮＡはＷＯ ９９／１４２２６（Ｅｘｉｑｏｎ）に記載された任意のＬＮＡ分子であってよく、好ましくはＬＮＡはＷＯ ９９／１４２２６の要約に示された分子から選択される。より好ましくはＬＮＡはＳｉｎｇｈほか，１９９８、Ｋｏｓｈｋｉｎほか，１９９８又はＯｂｉｋａほか，１９９７に記載された核酸である。ＰＮＡは例えばＮｉｅｌｓｅｎほか，１９９１に記載されたペプチド核酸を示す。ＩＮＡは特許ＷＯ ０３／０５１９０１に記載されたインターカレーター偽ヌクレオチドを含んだ核酸を示す。
「ヌクレオチド」という語は核酸又は核酸アナログの構成要素を表し、ヌクレオチドという語は天然のヌクレオチド及びその誘導体、並びに天然のヌクレオチド及びその誘導体と基本的に同一の機能を演じ得るヌクレオチドを包含する。しかし一般的に、そしてより好ましくは、ここで用いられる「ヌクレオチド」という語は天然のヌクレオチド及びその天然の誘導体のみを示す。天然のヌクレオチドには、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）又はシトシン（Ｃ）という４種の核酸塩基のうち１種を有するデオキシリボヌクレオチド、及びアデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）又はシトシン（Ｃ）という４種の核酸塩基のうち１種を有するリボヌクレオチドが含まれる。
ヌクレオチドアナログは核酸主鎖に組み込む事が出来、また特異的に塩基対形成し得るどのようなヌクレオチド様分子であってもよい。
本発明の非天然ヌクレオチド（ヌクレオチドアナログ）には、ＰＮＡ、ＨＮＡ、ＭＮＡ、ＡＮＡ、ＬＮＡ、ＩＮＡ、ＣＮＡ、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２’−ＮＨ）−ＴＮＡ、（３’−ＮＨ）−ＴＮＡ、α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、α−Ｌ−キシロ−ＬＮＡ、β−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、α−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、［３．２．１］−ＬＮＡ、ビシクロ−ＤＮＡ、６−アミノ−ビシクロ−ＤＮＡ、５−エピ−ビシクロ−ＤＮＡ、α−ビシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］−ＤＮＡ、ビシクロ［３．２．１］−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］アミド−ＤＮＡ、β−Ｄ−リボピラノシル−ＮＡ、α−Ｌ−リキソピラノシル−ＮＡ、２’−Ｒ１−ＲＮＡ、２’−ＯＲ１−ＲＮＡ（Ｒ１は置換基）、α−Ｌ−ＲＮＡ、α−Ｄ−ＲＮＡ、β−Ｄ−ＲＮＡから選択されるヌクレオチドが含まれるがこれらに限定されない。
本発明のヌクレオチド及びヌクレオチドアナログの機能は、前記相補的ヌクレオチドの核酸塩基の水素結合により相補的ヌクレオチドと特異的に相互作用し得ること、及び核酸又は核酸アナログに組み込まれ得ることである。天然のヌクレオチド、及びヌクレオチドアナログの一部は酵素的に、例えばＲＮＡ又はＤＮＡポリメラーゼにより、核酸又は核酸アナログに組み込まれ得る。しかし、ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログは化学的にも核酸又は核酸アナログに組み込まれ得る。
さらに、核酸又は核酸アナログは２つのより小さな核酸又は核酸アナログを他方に連結させることにより調製することが出来、例えばこれは酵素的にリガーゼによって行うことが出来、又は化学的に行うことが出来る。
ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログは主鎖モノマー単位及び核酸塩基を有する。該核酸塩基は天然の核酸塩基若しくはその誘導体、又は基本的に同一の機能を演ずることの出来るそのアナログであり得る。核酸塩基の機能は水素結合により１又は複数種の他の核酸塩基と特異的に結合し得ることである。従って、１又は少数種の他の核酸塩基とのみ安定な水素結合を形成することが出来、通常は自身を含めた他のほとんどの核酸塩基とは安定な水素結合を形成し得ないことが核酸塩基の重要な特徴である。１個の核酸塩基の他の核酸塩基との特異的相互作用は一般的に「塩基対形成」と呼ばれる。
塩基対形成は相補的ヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションをもたらす。本発明の相補的ヌクレオチドは塩基対形成し得る核酸塩基を含んだヌクレオチドである。
天然のヌクレオチドの核酸塩基間の塩基対形成はここでワトソン・クリック水素結合とも表される。ワトソン・クリック水素結合はＤＮＡにおいてはアデニン（Ａ）がチミン（Ｔ）と塩基対を形成し、グアニン（Ｇ）がシトシン（Ｃ）と塩基対を形成することを伴う。ＲＮＡにおいてはチミンがウラシル（Ｕ）に置き換わる。
このように、天然の核酸塩基であるアデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）と対を形成する；また、グアニン（Ｇ）はシトシン（Ｃ）と対を形成する。従って、例えばＡを含んだヌクレオチドはＴ又はＵのいずれを含んだヌクレオチドに対しても相補的であり、またＧを含んだヌクレオチドはＣを含んだヌクレオチドに対し相補的である。
本発明のヌクレオチドはさらに付加的な分子的構成要素を含むように誘導体化され得る。該ヌクレオチドは核酸塩基上又は主鎖モノマー単位上で誘導体化され得る。該塩基上の誘導体化の好ましい部位はアデニンの８位、ウラシルの５位、シトシンの５位又は６位、及びグアニンの７位である。複素環修飾は、塩基スタッキングの強化、追加の水素結合及びこれらの組み合わせという３つの構造クラスに分類され得る。平面系（ｐｌａｎａｒ ｓｙｓｔｅｍｓ）π電子雲の拡張により塩基スタッキングを強化する修飾はピリミジンの５位及び７−デアザプリンの７位における共役の親油性修飾（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ， ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）に代表される。ピリミジンの５位における置換の修飾としては、プロピン、ヘキシン、チアゾール、又は単にメチル基等が挙げられる；また、７−デアザプリンの７位における置換基としては、ヨード、プロピニル、及びシアノ基等が挙げられる。シトシンの５位をプロピンから５員複素環及び３環結合系（ｔｒｉｃｙｃｌｉｃ ｆｕｓｅｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）（４位及び５位から発する）（シトシンクランプ（ｃｙｔｏｃｉｎｅ ｃｌａｍｐｓ）へと修飾することも可能である。第２の種類の複素環修飾は、ＧＣ塩基対の３つの水素結合と類似してＡＴ塩基対において追加のアミノ基がもう１個の水素結合を提供する、２−アミノ−アデニンに代表される。効果の組み合わせを提供する複素環修飾は２−アミノ−７−デアザ−７−修飾アデニン、及びヘテロ２本鎖のエトキシアミノ官能基を有する３環系シトシンアナログに代表される。さらに、Ｎ２修飾２−アミノアデニンで修飾されたオリゴヌクレオチドが一般的な修飾の例として挙げられる。リボース又はデオキシリボース部分の誘導体化の好ましい部位は非結合炭素部位Ｃ−２’及びＣ−４’の修飾、結合炭素Ｃ−１’、Ｃ−３’及びＣ−５’の修飾、糖酸素、Ｏ−４’の置換、無水糖修飾（コンフォメーション制限（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ））、シクロ糖（ｃｙｃｌｏｓｕｇａｒ）修飾（コンフォメーション制限）、リボフラノシルの環の大きさの変化、結合部位−糖から糖へ、（Ｃ−３’からＣ−５’へ／Ｃ−２’からＣ−５’へ）、ヘテロ原子環−修飾糖及び上記修飾の組み合わせである。しかし、核酸又は核酸アナログの全体としての塩基対形成特異性が乱されない限りは他の部位を誘導化してもよい。最後に、前記主鎖モノマー単位がリン酸基を有する場合、一部の主鎖モノマー単位のリン酸エステルを誘導体化しても良い。
偽ヌクレオチドは核酸又は核酸アナログに挿入され得るヌクレオチドアナログであるが、核酸塩基は含まない。偽ヌクレオチドはそれ自身の主鎖モノマー単位、例えば本発明の疎水性ヌクレオチドに結合した疎水性分子であってよい。偽ヌクレオチドは通常化学的にのみ挿入され、天然の酵素によって極めてまれに認識される。
ここで用いられるオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログは基本的にヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログ及び／又は偽ヌクレオチドの配列からなる分子である。好ましくは、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログは上で定義された３−２００、５−１００、６−３０個の個々のヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログ及び／又は偽ヌクレオチド及び／又は疎水性ヌクレオチドを含む。
標的核酸
標的核酸又は標的核酸アナログとは、１又は複数種のオリゴヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドアナログ、例えばプライマー又はプローブのハイブリダイゼーションのための１又は複数個のサイト／配列を含んだ核酸又は核酸アナログを表す。標的配列はＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、亜硫酸水素塩処理ＤＮＡを含むがこれらに限定されない任意の核酸又は核酸アナログ中に見いだされ得、例えばコーディング配列若しくはその調節配列等の野生型若しくは突然変異遺伝子配列；又は例えばＰＣＲで増幅されたもの等の増幅された核酸配列、；又は例えばＤＮＡの亜硫酸水素塩処理のようにＤＮＡの化学的組成を変え得る試薬で処理した修飾ＤＮＡを含み得る。標的配列はどのような長さでもよい。記載のサイトは連続した配列であってもそうでなくともよい。例えば前記サイトは任意の数のヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログによって隔てられた複数の連続部分配列からなっていてもよい。しかし、好ましくは該標的配列は連続的である。優先的には、前記オリゴヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドアナログによるその特定の標的核酸又は標的核酸アナログ上の全ての部分配列からなる記載のサイトの全長は典型的には１００ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログ未満である。
本発明の少なくとも１個のシグナリングペア及び少なくとも１個の疎水性分子を含んだヌクレオチドアナログは標的核酸とは見なされない。
変異配列
本発明の「変異配列」という語は、特定の標的配列から少なくとも１、例えば１、例えば２、例えば３、例えば４、例えば５、例えば６、例えば７、例えば８、例えば９、例えば１０、例えば１０ないし２０、例えば２０ないし５０、例えば５０超などの核酸塩基の差で異なった配列を包含する。例えば本発明の変異配列は１又は複数個の突然変異を含んでいてもよい。
「突然変異」という語は、特定の標的配列と比較して１又は複数個のヌクレオチドがもう一方の１又は複数個の他のヌクレオチドに対して変化していることを包含する。さらに、「突然変異」という語は核酸内のヌクレオチドの欠失及び付加、例えば標的配列と比較した際のヌクレオチドの欠失又は付加を包含する。さらに、メチル化様式における変化も包含する。
前記標的配列は多型サイトを含んでいてもよく（下記詳細参照）、従って前記標的配列は１個の多型を含み得るが、「変異配列」は別の多型を含み得る。
一態様においては、前記標的配列は野生型配列、即ち最も頻繁に天然に存在する配列であり、一方で前記変異配列は該野生型配列と比較して１又は複数個の突然変異を有する。従って、本発明の突然変異は一態様において一塩基多型（ＳＮＰ）等の多型であってよい。例えば前記多型は特定のＤＮＡプロファイルの指標であり得る。特定のＤＮＡプロファイルの知見は例えば個体を識別するのに用いられ得る。例えば特定のＤＮＡプロファイルは犯罪者若しくは潜在的な犯罪者を識別すること又は死体若しくは死体の一部を識別することに用いられ得る。
別の態様においては突然変異はヌクレオチドのメチル化又は脱メチル化に関する。従って、本発明の突然変異は一態様においてはＣｐＧデュプレットのメチル化等のヌクレオチドのメチル化状態であってよい。例えばメチル化は特定のＤＮＡプロファイルの指標であり得、そのプロファイルに関する知見は病状の指標であり得る。メチル化状態の検出は亜硫酸水素ナトリウム等の試薬を用いて処理することにより非メチル化ＣｐＧをｄＵｐＧデュプレットに変換した後に行われることが多い。
さらに、特定のＤＮＡプロファイルを用いて個体間の関係、例えば親子関係又はより離れた関係を決定することが出来る。関係は異なる種間又は任意の種の異なる集団間の関係であってもよい。
一態様においては前記突然変異は病態の指標であってよく、又は前記突然変異は病態のリスクの増大の指標であってもよい。
前記病態は例えば腫瘍性疾患；神経変性疾患；循環器疾患；及び糖尿病を含む代謝異常；からなる群より選択されるものであってよい。
さらに、前記突然変異は所定の薬物療法に対する特定の反応の指標であってよい。例えば、前記突然変異は個体に前記薬物療法が効果を示すか、又は個体が特定の薬物療法に対し耐え得ないかということに対する指標であってもよい。
多型サイト
本発明において、「多型サイト」という語は、核酸における目的の特定部位を包含するものである。多型サイトは例えばヌクレオチドの性質が研究者にとって重要である一塩基多型（ＳＮＰ）等の公知の多型の特定部位であり得る。それは他の理由により研究者にとって重要である核酸中の特定部位でもあり得る。従って、前記多型サイトは利用者が複数のあり得る標的間を識別しようとする際に本発明のステムレスビーコンを用いてその情報を得る部位である。多型サイトはヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、核酸又は核酸アナログ中の目的のどのようなサイトであってもよい。
従って本発明によると、多型サイトは、該サイト内の１又は複数部位においていくつかの異なったヌクレオチドのうち一つを含み得、どのヌクレオチドが該サイト内に含まれるか決定することが目的であるサイトである。
前記多型サイトは少なくとも２個、例えば２ないし１０個の範囲、例えば２ないし５個の範囲等の、１又は複数個よりも多いヌクレオチド／ヌクレオチドアナログを含んでいてもよい。
従って、実施例に基づき、任意の標的配列内の特定部位がＡ又はＧであるか決定する目的の場合、この特定サイトを本発明の「多型サイト」と呼ぶ。
当業者は容易に多型サイトを同定し得る。
試料材料の説明
本発明は、特異的標的配列を含む核酸又は核酸アナログを検出する方法並びに特異的標的配列を含む核酸又は核酸アナログと変異配列を含む核酸とを識別する方法を提供する。前記標的配列は、核酸及び／又は核酸アナログを含む任意の有用な混合物中で検出することができる。
混合物は細胞内に、例えば、無傷細胞内に含まれてよい。細胞は、例えば、原核細胞又は植物細胞若しくは哺乳動物細胞などの真核細胞であってよい。そのような態様において、本発明の方法はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのために使用することができる。
混合物は、例えば、検査する核酸又は検査する核酸アナログの試料であってよい。前記試料は、例えば、合成的に調製された試料であってよく、それはiｎ ｖｉｔｒｏでさらに処理されていても又は処理されていなくてもよい。検査する核酸又は核酸アナログの試料は任意の核酸又は核酸アナログ、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、ＭＮＡ、ＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＮＡ、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２’−ＮＨ）−ＴＮＡ、（３’−ＮＨ）−ＴＮＡ、α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、α−Ｌ−キシロ−ＬＮＡ、β−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、α−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、[３．２．１]−ＬＮＡ、ビシクロ−ＤＮＡ、６−アミノ−ビシクロ−ＤＮＡ、５−エピ−ビシクロ−ＤＮＡ、α−ビシクロ−ＤＮＡ、トリ-シクロ−ＤＮＡ、ビシクロ[４．３．０]−ＤＮＡ、ビシクロ [３．２．１]−ＤＮＡ、ビシクロ[４．３．０]アミド−ＤＮＡ、β−Ｄ−リボピラノシル−ＮＡ、α−Ｌ−リキソピラノシル−ＮＡ、２’−Ｒ−ＲＮＡ、２’−ＯＲ−ＲＮＡ、α−Ｌ−ＲＮＡ、α−Ｄ−ＲＮＡ、β−Ｄ−ＲＮＡ及びそれらの混合物及びそれらのハイブリッドを含んでよい。
哺乳動物例えばヒトなどの個体のＤＮＡ又はＲＮＡを検査することが望ましいことがしばしばある。その場合、検査する核酸又は核酸アナログの試料は前記個体由来の試料である。試料は、体液試料例えば血液試料など、生検試料、毛髪、爪等の試料又は任意の他の試料由来であってよい。
試料は、対応する標的核酸及び／又は核酸アナログ及び／又はそれらの変異体の存在の検出に先立ってｉｎ ｖｉｔｒｏで処理することができる。例えば、試料は、核酸を試料から完全に又は部分的に精製することができる１つ又は２つ以上の精製プロセスにかけることができる。さらに、試料は、核酸量が増幅される増幅ステップ、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応又は任意の他の適当な増幅プロセスにかけてあってもよい。そのような方法は当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ほか ２０００．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載されている。
本発明の一つの好ましい態様において、検査する核酸試料は、ゲノムＤＮＡ又はゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅産物などのゲノムＤＮＡの増幅産物からなる群から選択される。
この方法は検出に先立つ分離ステップを含んでよく、そのステップで、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログがハイブリダイズしなかったオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログから分離され、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログのみの特異的検出を容易にすることができる。例えば、核酸の混合物を、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログとのハイブリダイゼーションに先立って固相上に固定化することができる。ハイブリダイゼーション後に、ハイブリダイズしなかったオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログを洗い去り、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログを検出することができる。
しかしながら、分離ステップなしで検出を実施することも、本発明の中に含まれる。したがって、核酸混合物、本発明のオリゴヌクレオチドアナログ及び他の必要な試薬の添加後に、密閉したチューブ中で検出を実施することができる。そのような方法は、本明細書中では均一法（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｍｅｔｈｏｄ）とも称する。
標的ＤＮＡは、例えば、特定の遺伝子、遺伝子断片、マイクロサテライト又は任意の他のＤＮＡ配列であってよい。特に興味深いのは、真核生物、原核生物、古細菌又はウイルス由来であってよい特定のＤＮＡの検出である。重要なこととして、本発明は、特定の微生物に関連することが知られている特定の配列をアッセイすることにより、種々の感染性疾患の診断及び／又は遺伝子型同定に役立ち得る。標的ＤＮＡは、核酸（ＲＮＡ及びＤＮＡ）及び非核酸の複雑な生物学的混合物、例えば、無傷細胞又は粗細胞抽出物で提供することができる。
標的ＤＮＡが二本鎖であるか、そうではなくとも有意な二次及び三次構造を有している場合には、ハイブダイゼーションに先立って加熱する必要があることがある。この場合、オリゴヌクレオチドアナログを含むハイブリダイゼーション媒質中に核酸を導入する前又は後に加熱することができる。場合によっては、当技術分野で既知の任意の方法により、バックグラウンドの干渉を減ずるために、ハイブリダイゼーションアッセイに先立って複雑な生物試料から核酸を抽出することが望ましいこともある。
本発明のハイブリダイゼーション及び抽出方法は、核酸（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）及び非核酸の複雑な生物学的混合物に適用することができる。そのような複雑な生物学的混合物は、プロトプラストを含む広範囲の真核及び原核細胞、又は標的デオキシリボ核酸を収容し得る他の生物学的材料を含む。したがって、本発明の方法は、組織培養動物細胞、動物細胞（例えば、血液、血清、血漿、網状赤血球、リンパ球、尿、骨髄組織、脳脊髄液、又は血液若しくはリンパ液から調製した任意の生成物）又は任意のタイプの生検組織（例えば、細胞溶解緩衝液中にホモゲナイズされた、筋肉生検、肝生検、腎生検、膀胱生検、骨生検、軟骨生検、皮膚生検、膵生検、腸管生検、胸腺生検、乳房生検、子宮生検、精巣生検、眼生検又は脳生検）、植物細胞又は浸透圧ショックに敏感な他の細胞及び細菌、酵母、ウイルス、マイコプラズマ、原生動物、リケッチャ、菌類の細胞及び他の小さな微生物細胞等に適用可能である。本発明のアッセイ及び分離手順は、例えば、関心のある非病原性又は病原性微生物を検出するために有用である。疎水性ヌクレオチド含むオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログと生物試料中に存在する核酸との間の特異的なハイブリダイゼーションを検出することにより、微生物の存在を確認することができる。
本発明の１態様においては、本明細書に記載したオリゴヌクレオチドアナログを使用して、所与の時間に所与の標的核酸の量を検出することが望ましい。このことは、前記オリゴヌクレオチドアナログからのシグナルを定量化することにより、又は例えば、リアルタイムＰＣＲにおける検出可能なシグナルを発生させるために、所与の標的核酸のどれだけの増幅が必要であるかを見極めることにより、実行することができる。しかし、他の定量手段も使用することができる。
相同な核酸
核酸、核酸アナログ、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログは、それらがハイブリダイズすることができるとき、それらは相同相補的（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）であると言われる。相同相補的な核酸、核酸アナログ、又はオリゴヌクレオチドアナログは、低いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズできることが好ましく、相同相補的な核酸、核酸アナログ、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログは、中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズできることがより好ましく、相同相補的な核酸、核酸アナログ、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログは、高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズできることがより好ましい。
核酸ハイブリダイゼーションの当業者は、例えばホルムアミドのような変性剤の濃度、塩濃度（即ちイオン強度）、ハイブリダイゼーション温度、界面活性剤濃度、ｐＨ及びカオトロープの存在若しくは不存在を含むハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを課する又は制御するために通常使用される要因を承知している。プローブの核酸塩基配列のその標的配列へのハイブリダイゼーションのための最適ストリンジェンシーは、これらの要因又はこれらの要因の幾つかを一つ一つ変化させることにより見出されることが多い。
本明細書中で使用される高いストリンジェンシーとは、例えばＳｏｕｔｈｅｒｎ Ｅ．Ｍ．，１９７５，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．９８；５０３−５１７により記載されたサザンブロット及びハイブリダイゼーションに関して通常適用されるストリンジェンシーに比較して同程度、又は少なくとも同程度にストリンジェントなストリンジェンシーを意味するものとする。そのような目的のために、プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションのステップを含むのが、通常の慣行である。通常、そのようなステップは、参照により本明細書に組み込む、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ／Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）中にＳａｍｂｒｏｏｋ ほか，１９８９により記載されているように、６×ＳＳＰＥ、５％デンハート液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精巣ＤＮＡを含む溶液を使用して実施され（４２℃で１８時間インキュベーション）、続いて２×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳで洗浄され（室温及び３７℃で）、０．１×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳで洗浄される（６８℃で３０分間インキュベーション）。
本明細書中で使用する中程度のストリンジェンシー条件とは、1ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４Ｈ２Ｏ、１４０ｍＭ ＮａＣｌをｐＨ ７．０で含む緩衝液、又はハイブリダイゼーションのストリンジェンシーにほぼ同じ影響を有する、これと同様な緩衝液中におけるハイブリダイゼーションを意味するものとする。およそ１．５μＭの各核酸又は核酸アナログ鎖が提供されることが好ましい。あるいは、中程度のストリンジェンシーは、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ ９．０）、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む緩衝液中におけるハイブリダイゼーションを意味してもよい。
本発明による低いストリンジェンシーとは、１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ３ＰＯ４で構成されるｐＨ７．０の緩衝液、又はハイブリダイゼーションのストリンジェンシーにほぼ同じ影響を有する、これと同様な緩衝液中におけるハイブリダイゼーションを意味するものとする。
あるいは、相同相補的核酸、核酸アナログ、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログは、所与の配列にわたって、例えば７０％を超える相補性、例えば７５％を超える相補性、例えば８０％を超える相補性、例えば８５％を超える相補性、例えば９０％を超える相補性、例えば９２％を超える相補性、例えば９４％を超える相補性、例えば９５％を超える相補性、例えば９６％を超える相補性、例えば９７％を超える相補性など、互いに実質的に相補的な核酸、核酸アナログ、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログである。
前記の所与の配列は、少なくとも４ヌクレオチドの長さ、例えば少なくとも７ヌクレオチド、例えば少なくとも１０ヌクレオチド、例えば少なくとも１５ヌクレオチド、例えば少なくとも２０ヌクレオチド、例えば少なくとも２５ヌクレオチド、例えば１０ないし５００ヌクレオチド、例えば４ないし１００ヌクレオチドの長さ、例えば６ないし３０ヌクレオチドの長さなどであることが好ましい。相同相補的オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログは、それらの全長にわたって実質的に相同相補的であることがより好ましい。
ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログの配列は、ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログの第１の配列の全ての核酸塩基が第２の配列の全ての核酸塩基とワトソン−クリック水素結合を形成し得るとき、もう一方のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログの配列と相補的であると言われる。
ハイブリダイゼーションの特異性
核酸及び／又は核酸アナログ及び／又はオリゴヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドアナログのハイブリダイゼーションの特異性とは、前記のハイブリダイゼーション事象が、相同相補的ハイブリダイゼーション相手同士を、それらの配列の相違によって所与のストリンジェンシー条件下で区別する能力を意味する。しばしば、核酸及び／又は核酸アナログ及び／又はオリゴヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドアナログの混合物中でただ一つの特定の配列（標的配列）を標的とし、他の配列とのハイブリダイゼーションは、たとえそれらが前記標的配列に強い類似性を有していても回避することが意図である。時には、ハイブリダイゼーションのために使用される配列領域中の標的及び非標的配列の間でただ１つ又は僅かのヌクレオチドが相違しているだけである。
本明細書中で使用されるハイブリダイゼーションにおける高度の特異性とは、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログが相同な標的配列と、１つ又は僅かの塩基置換により前記標的配列と相違するだけの殆んど同一の任意の配列に対するよりも有意によくハイブリダイズするであろう条件、例えば高度のストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションのことを指す。
クロスハイブリダイゼーション
クロスハイブリダイゼーションという用語は、少なくとも２つの核酸及び／又は核酸アナログの間の期待されないハイブリダイゼーションを包含し、即ち、クロスハイブリダイゼーションは分子間ハイブリダイゼーションを意味することもある。したがって、クロスハイブリダイゼーションという用語は、例えば、核酸プローブ又は核酸アナログプローブ配列のその意図した標的配列以外の他の核酸配列及び／又は核酸アナログ配列へのハイブリダイゼーションを記述するために使用することができる。
クロスハイブリダイゼーションは、プローブと１つ又は２つ以上の相同相補的非標的配列との間で、たとえこれらがプローブとその相補性標的配列との間よりも低い程度の相補性を有していても、しばしば起こる。この望まれない結果は、標的に対する大過剰のプローブ及び／又は急速なアニーリング速度が原因となっている可能性がある。クロスハイブリダイゼーションは、僅かな核酸塩基対の間の、例えばＰＣＲ反応におけるプライマー間の水素結合によっても起こり、その結果としてプライマーダイマー形成及び／又は非特異的ＰＣＲ産物の生成が起こる。
特に、同タイプのヌクレオチドアナログに対して高い親和性を有する１つ又は２つ以上のヌクレオチドアナログを含む核酸は、塩基対形成に基づく２量体又はより高次の複合体を形成する傾向がある。特に、限定するものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、ＭＮＡ、ＡＮＡ、ＬＮＡ、α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、α−Ｌ−キシロ−ＬＮＡ、β−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、α−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、[３．２．１]−ＬＮＡ、２’−Ｒ−ＲＮＡ、２’−ＯＲ−ＲＮＡ及びそれらの混合物などのヌクレオチドアナログを含むプローブは、同タイプの主鎖モノマー単位を含む他のオリゴヌクレオチドアナログにハイブリダイズするための高い親和性を通常有している。したがって、たとえ個々のプローブ分子が低度の相補性を有するだけでも、それらはハイブリダイズする傾向がある。
自己ハイブリダイゼーション
自己ハイブリダイゼーションという用語は、核酸又は核酸アナログ分子が、自分自身に折り返されて例えばヘアピン構造のような二次構造を生ずることにより自身にアニールする過程を包含し、即ち、自己ハイブリダイゼーションは分子内ハイブリダイゼーションと定義することもできる。大抵の応用において、自己ハイブリダイゼーションを回避することは重要である。前記の二次構造の生成は、所望の核酸標的配列とのハイブリダイゼーションを阻害し得る。このことは、大部分のアッセイにおいて、例えば、核酸若しくは核酸アナログがＰＣＲ反応におけるプライマーとして、又はエキソヌクレアーゼアッセイのためのフルオロフォア／クエンチャー標識プローブとして使用されるとき、望ましくない。両方のアッセイにおいて、自己ハイブリダイゼーションは、標的核酸に対するハイブリダイゼーションを阻害する可能性があり、その結果エキソヌクレアーゼアッセイにおけるシグナル発生の程度が低下する。
特に、同タイプのヌクレオチドアナログに対して高い親和性を有する１つ又は２つ以上のヌクレオチドアナログを含む核酸は、自己ハイブリダイズする傾向がある。特に、限定するものではないが、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、ＭＮＡ、ＡＮＡ、ＬＮＡ、α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、α−Ｌ−キシロ−ＬＮＡ、β−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、α−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、[３．２．１]−ＬＮＡ、２’−Ｒ−ＲＮＡ、２’−ＯＲ−ＲＮＡなどのヌクレオチドアナログを含むプローブは、一般的に自己ハイブリダイズするための高い親和性を通常有している。したがって、たとえ個々のプローブ分子が低度の自己相補性を有するだけでも、それらは自己ハイブリダイズする傾向がある。
幾つかの発明において、ヘアピン構造及び他の二次構造の使用は利益がある。これは、例えば、フルオロフォア及びクエンチャーがオリゴヌクレオチドの各末端に位置して且つオリゴヌクレオチドの１端の配列の短い範囲が前記オリゴヌクレオチドの他端の短い配列に相補的である分子ビーコンの場合である。オリゴヌクレオチドの各末端における２つの配列は、標的核酸（ステムを作る２つの部分を分離する配列に対して相補的）が存在しないときに、互いにハイブリダイズして、ステム構造を作り、フルオロフォアとクエンチャーとを互いに近接位置にもたらすであろう。
分子ビーコンと同様に、疎水性分子の存在により促進され又は増強された「自己ハイブリダイゼーション」も、しばしば望ましい結果であり、例えば、プローブが結合していないときに、本明細書中に記述するステムレスビーコン中のシグナリングペアのより有効な相互作用をもたらす。したがって、オリゴヌクレオチドアナログが、前記オリゴヌクレオチドアナログの望ましい３次元構造の形成を促進し得る、１つ又は２つ以上の疎水性ヌクレオチドを含むことは本発明の中に含まれる。本発明において、疎水性分子は、結合していないプローブ中のシグナリングペア間の十分な相互作用を確実にするという、分子ビーコン中のステムの役割と同様な役割を有し得る。したがって、本発明の記載中において、望ましい疎水性自己ハイブリダイゼーション（真の自己ハイブリダイゼーションではなく、むしろ自己相互作用）と水素結合により惹起される望ましくない自己ハイブリダイゼーションとの間が区別される。ヘアピン構造は、通常、ヘアピン中のステム構造を形成する最低３つの相補的塩基対からなり、一方本発明によるステムレスビーコン中の疎水性自己ハイブリダイゼーションは、結合していないプローブのシグナリングペアの相互作用を増大させるために相補的塩基対の塩基対形成に依存していない。
仮に１又は少数の核酸塩基が自己相補的に合致しても、それでも疎水性自己ハイブリダイゼーションと見なされる。
したがって、１態様において、本発明によるオリゴヌクレオチドアナログは、前記オリゴヌクレオチドアナログの中に、３ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログの連続した配列に相補性である３ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログのもう１つの連続した配列を含まない。本発明によるオリゴヌクレオチドアナログは、前記オリゴヌクレオチドアナログの中に、４ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログの連続した配列に相補性である４ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログのもう１つの連続した配列を含まないことが好ましい。例えば、本発明によるオリゴヌクレオチドアナログは、前記オリゴヌクレオチドアナログの中に、６ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログの連続した配列に相補性である６ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログのもう１つの連続した配列を含まない。例えば、本発明によるオリゴヌクレオチドアナログは、前記オリゴヌクレオチドアナログの中に、８ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログの連続した配列に相補性である８ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログのもう１つの連続した配列を含まない。例えば、本発明によるオリゴヌクレオチドアナログは、前記オリゴヌクレオチドアナログの中に、１０ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログの連続した配列に相補性である１０ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログのもう１つの連続した配列を含まない。
したがって、シグナリングペアと少なくとも一つの疎水性分子とを含むオリゴヌクレオチドアナログであって、前記オリゴヌクレオチドアナログのＳ／Ｎ比が、前記疎水性分子を含まない対応オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログのＳ／Ｎ比よりも有意に高いか又は低く（１から大きく異なった値）、且つ前記オリゴヌクレオチドアナログがそれらの標的核酸に相同相補的である（標的配列に相同相補的でないステム構造を含まない）オリゴヌクレオチドアナログを提供することが本発明の好ましい態様である。
これは、本発明によるオリゴヌクレオチドアナログは、設計が容易で、Ｓ／Ｎ比を最適化するのにステムが不要であるためそれらの対応する分子ビーコンよりも短く作ることができることを意味する。
融解温度
核酸及び核酸アナログの融解は、二本鎖核酸分子の２本の鎖の熱分離に起因する。融解温度（Ｔｍ）は、５０％ずつのらせん形（ハイブリダイズしている）とコイル形（ハイブリダイズしていない）とが存在する摂氏の温度を表す。
高い融解温度は、安定な複合体を示し、したがって個々の鎖の間の高い親和性を示す。逆に低い融解温度は、個々の鎖の間の比較的低い親和性を示す。したがって２本の鎖の間の強い水素結合は、通常、高い融解温度を生ずる。それに加えて、融解温度は、周囲の物理的／化学的状態に依存する。例えば、融解温度は、通常塩濃度及びｐＨに依存する。
融解温度は、多くのアッセイにより測定することができ、例えば、ＵＶスペクトルを使用してハイブリダイゼーションの形成及び解体（融解）を決定することにより、又は蛍光により測定することができる。
核酸混合物の存在下で、本発明によるシグナリングペアと少なくとも一つの疎水性分子とを含むオリゴヌクレオチドアナログの融解温度を測定することは、本発明の好ましい態様である。
核酸の混合物からの核酸配列の増幅反応を実施した後に、本発明によるシグナリングペアと少なくとも一つの疎水性分子とを含むオリゴヌクレオチドアナログの融解温度を測定することは、本発明のより好ましい態様である。
ａ）標的配列又は変異配列の存在を検査するために望ましい、核酸又は核酸アナログの混合物を供給するステップ；及び
ｂ）１組のプライマー並びに本明細書に記載した少なくとも一つの疎水性分子とシグナリングペアとを含むオリゴヌクレオチドアナログを提供するステップであって、ここで前記プライマー及び前記オリゴヌクレオチドアナログは前記標的配列及び／又は変異配列とハイブリダイズし得るステップ；及び
ｃ）前記プライマー及びオリゴヌクレオチドアナログと核酸及び／又は核酸アナログの混合物とを、前記プライマーの前記核酸及び／又は核酸アナログに対するハイブリダイゼーションを可能にする条件下でインキュベートするステップ；及び
ｄ）前記のハイブリダイズした標的配列を、ヌクレオチド若しくはヌクレオチドアナログ又はオリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチドアナログとともに前記プライマーの３’末端の鋳型伸長に使用するステップ；及び
ｅ）ステップｃ）からｄ）までを、満足な増幅に達するまで繰り返すステップ；及び
ｆ）混合物を変性して前記プローブのその標的配列及び／又は変異配列に対するハイブリダイゼーションを可能にする温度に速やかに冷却するステップ；及び
ｇ）シグナリングペアからのシグナルを測定しながら、その標的配列からオリゴヌクレオチドアナログの融解する温度が測定されるまで温度を上昇させるステップ；
を含む、本発明によるシグナリングペアと少なくとも一つの疎水性分子とを含むオリゴヌクレオチドアナログの融解温度を測定する方法を提供することは、本発明のより一層好ましい態様である。
さらに、本発明により開示したように、二本鎖核酸の核酸塩基間のインターカレーターのインターカレーション又は疎水性分子のグルーブ結合による疎水性相互作用も、二本鎖核酸を安定化して、その結果より高い融解温度をもたらす。したがって、しばしば、本発明によるオリゴヌクレオチドアナログとＤＮＡとの間のハイブリッドは、一般に対応するＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドよりも高い融解温度を有するであろう。
したがって、シグナリングペア及び少なくとも一つの疎水性分子を含むオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログであって、前記オリゴヌクレオチドアナログの融解温度が、前記疎水性分子を含まない対応するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログの融解温度よりも有意に高い、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログを提供することは、本発明の好ましい態様である。
親和性
核酸の親和性は、２本の一本鎖からの二本鎖核酸分子の熱的形成に関連する。
親和性は、５０％ずつのらせん形（ハイブリダイズしている）とコイル形（ハイブリダイズしていない）とが存在する摂氏の温度として表示される融解温度（Ｔｍ）と類似である。完全な系では、融解温度と親和温度とは等しいか又は同等に近いが、しかし、ときには、その平衡は測定中に到達されず、他の条件又は混合物中に存在する分子がデュープレックスの形成又は変性に影響する可能性がある。
高い親和性は、安定なコンプレックス、したがって個々の鎖の間の高い親和性を示す。逆に低い親和温度は、個々の鎖の間の比較的低い親和性を示す。したがって、２本の鎖の間の強い水素結合は、通常、高い親和性をもたらす。
さらに、本発明により開示したように、二本鎖核酸の核酸塩基間のインターカレーターのインターカレーション若しくは疎水性分子のグルーブ結合による疎水性相互作用も、二本鎖核酸を安定化して、その結果より高い親和性をもたらすことが可能であり、又は疎水性分子による立体効果はより低い親和性をもたらし得る。
それに加えて、親和性は、周囲の物理的／化学的状態に依存する。例えば、親和性は、塩濃度及びｐＨに通常依存する。
親和性は、多くの方法により測定することができて、例えば、ＵＶスペクトルを使用してハイブリダイゼーションの形成及び解体（融解）を測定することにより、又は２本の鎖のアニーリング又は変性による蛍光の変化により測定することができる。
本発明によるシグナリングペアと少なくとも一つの疎水性分子とを含むオリゴヌクレオチドアナログの、核酸を含む混合物に対する親和性を測定することは、本発明の好ましい態様である。
本発明によるシグナリングペアと少なくとも一つの疎水性分子とを含むオリゴヌクレオチドアナログの、核酸を含む混合物に対する親和性を、増幅反応を実施した後に測定することは、本発明のより一層好ましい態様である。
ａ）標的配列又は変異配列の存在を検査するために望ましい、核酸又は核酸アナログの混合物を供給するステップ；及び
ｂ）１組のプライマー並びに本明細書に記載した少なくとも一つの疎水性分子とシグナリングペアとを含むオリゴヌクレオチドアナログを供給するステップであって、前記プライマー及び前記オリゴヌクレオチドアナログは前記の標的配列及び／又は変異配列とハイブリダイズできるセットを供給するステップ；及び
ｃ）前記プライマー及びオリゴヌクレオチドアナログと核酸及び／又は核酸アナログの混合物とを、前記プライマーの前記核酸及び／又は核酸アナログに対するハイブリダイゼーションを可能にする条件下でインキュベートするステップ；及び
ｄ）前記のハイブリダイズした標的配列を、ヌクレオチド若しくはヌクレオチドアナログ又はオリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチドアナログとともに前記プライマーの３’末端の鋳型伸長に使用するステップ；及び
ｅ）ステップｃ）からｄ）までを、満足な増幅に達するまで繰り返すステップ；及び
ｆ）混合物を変性して、親和温度より上で開始するセット温度に速やかに冷却するステップ；及び
ｇ）前記オリゴヌクレオチドアナログがハイブリダイズして直ぐに且つアンプリコンがリアニールする前にシグナリングペアからのシグナルを測定するステップ；及び
ｈ）ステップｆ）における温度を徐々に低下させながら、温度が親和温度より下の温度に低下するまで、ステップｆ）からｇ）までを繰り返すことにより、少なくとも一つの疎水性分子及びシグナリングペアを含む前記核酸アナログの親和性を測定するステップ
を含む、本発明によるシグナリングペアと少なくとも一つの疎水性分子とを含むオリゴヌクレオチドアナログの親和性を測定する方法を提供することは、本発明の最も好ましい態様である。
上記の方法は、アンプリコンの再アニーリング及びシグナリングペアを含む前記核酸アナログの排除と関連する問題を克服する利点を有する。
ヌクレアーゼ耐性
ヌクレアーゼ耐性という用語により、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドアナログ、核酸又は核酸アナログの、ヌクレアーゼによる分解に対する耐性が意味される。ヌクレアーゼは、ヌクレオチドの鎖をより小さい単位に分解することにより核酸の加水分解を触媒する酵素に対する総称であって、エンドヌクレアーゼ（内部の結合で核酸を分解し、それにより種々のサイズの断片を生ずるヌクレアーゼ）及びエキソヌクレアーゼ（核酸の１端で開始して一時に１個のヌクレオチドを（順次）遊離させるヌクレアーゼ）の両者を包含する。
ヌクレアーゼ耐性は、オリゴヌクレオチドを細胞抽出物又は単離されたヌクレアーゼ溶液とインキュベートして、時間を経て無変化のオリゴヌクレオチドの残存する程度を、通常、ゲル電気泳動により又は分光学的に測定することにより、日常的に測定される。ヌクレアーゼ耐性を測定する例は、次のステップを含んでよい：
ａ）オリゴヌクレオチドアナログをゲル精製して、高速液体クロマトグラフで精製された３２Ｐ−ＡＴＰで５’末端標識する。
ｂ）次にオリゴヌクレオチドをヘビ毒ホスホジエステラーゼとインキュベートする。
ｃ）試料を異なる時点で採取して直ちに反応を停止させる。
ｄ）次にオリゴヌクレオチド代謝物を２０％変性ポリアクリルアミドゲル上で分離した後、Ｐｈｏｓｐｈｏｒ Ｉｍａｇｅｒ分析により定量する。
高いヌクレアーゼ耐性は、ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログが安定であるか、又は比較し得るＤＮＡ配列の同様な条件での分解速度に比較して、ヌクレアーゼによりゆっくりと分解されるだけであることを意味し、一方低いヌクレアーゼ耐性は、ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログが、同様な条件での対応するＤＮＡの分解と同程度の速度でヌクレアーゼにより分解されることを意味する。
本発明の幾つかの態様において、本発明によるヌクレオチドアナログ（ステムレスビーコン）は、高いヌクレアーゼ耐性を有し、その結果プローブはエンドポイント読み取りに使用して（例えば、増幅反応中に存在した後）、測定後再使用することができ、又はさらなる検証及び／若しくは品質管理のために使用することができることが好ましい。
本発明によるシグナリングペアと少なくとも一つの疎水性分子とを含むオリゴヌクレオチドアナログであって、ヌクレアーゼ耐性が、前記の少なくとも一つの疎水性基を含まない対応するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログのヌクレアーゼ耐性よりも有意に高いオリゴヌクレオチドアナログを提供することが本発明の好ましい態様である。
オリゴヌクレオチドアナログがポリメラーゼの潜在的ヌクレアーゼ活性に対する高いヌクレアーゼ耐性を有する、本発明によるシグナリングペアと少なくとも一つの疎水性分子とを含むオリゴヌクレオチドアナログを提供することは、本発明のより一層好ましい態様である。例えば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのあるものが有するヌクレアーゼ活性に対するものである。
したがって、本発明の好ましい態様は、核酸の増幅に使用される条件下で比較的安定な、本発明によるシグナリングペアと少なくとも一つの疎水性分子とを含むオリゴヌクレオチドアナログを提供することである。
前記オリゴヌクレオチドアナログは、増幅反応中に低い程度しか分解しない、例えば０％、例えば最大で１％、例えば最大で３％、例えば最大で５％、例えば最大で７％、例えば最大で１０％、例えば最大で１５％、例えば最大で２５％、例えば最大で５０％、例えば０％と２５％の間、例えば０％と１５％の間、例えば０％と１０％の間、例えば０％と５％の間しか分解しないような高いヌクレアーゼ耐性を有することが好ましい。好ましくは、上述の分解は、所与のヌクレアーゼ、好ましくはエキソヌクレアーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼとの、ヌクレアーゼ活性を許容する条件下でのインキュベーション後に得られる。
しばしば、本発明によるオリゴヌクレオチドアナログは、その中に挿入された疎水性ヌクレオチドアナログの直近でヌクレアーゼ活性に耐性である。したがって、ヌクレアーゼが５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を含む場合、本発明によるオリゴヌクレオチドアナログは、５’末端に近い少なくとも一つの疎水性ヌクレオチド、例えば、５’末端から９個以内、好ましくは６個以内、より好ましくは４個以内、例えば２個以内のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログに位置する疎水性ヌクレオチドを含むことが好ましい。同様に、ヌクレアーゼが５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を含む場合、本発明によるオリゴヌクレオチドアナログは、３’末端に近い少なくとも一つの疎水性ヌクレオチド、例えば、３’末端から９個以内、好ましくは６個以内、より好ましくは４個以内、例えば２個以内、１個以内などのヌクレオチド又はヌクレオチドアナログに位置する疎水性ヌクレオチドを含むことが好ましい。ヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼ活性を含むならば、そのときはオリゴヌクレオチドアナログが前記エンドヌクレアーゼの制限部位の直近に少なくとも一つの疎水性ヌクレオチドを含むことが好ましい。
最も容易に利用できるリアルタイムＰＣＲ装置で、温度を下げながら（標準的な親和性測定をして）、シグナル強度を読み取るためにある程度の時間が必要である。経過時間は、プローブがそれらの標的配列に対し有するよりも通常高い親和温度を有するアンプリコンが再アニールして親和性測定に干渉することを可能にするほど長いことがしばしばある。しかしながら、リアルタイムＰＣＲ測定の間、測定条件は、通常、アンプリコンの再アニーリングが大規模に起こることがないようなものである。
それ故、例えば、ヌクレアーゼ耐性プローブを使用して、リアルタイム増幅反応中に、最適読み取り温度範囲を迅速に測定する方法であって、
ａ）標的配列及び／若しくは変異配列を含む核酸又は核酸アナログの混合物を供給するステップ；及び
ｂ）シグナリングペアを含み、前記の標的配列及び／若しくは変異配列とハイブリダイズし得る、ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログを供給するステップ；及び
ｃ）混合物を変性して、設定温度（親和温度より上で開始する）に急速に冷却するステップ；及び
ｄ）シグナリングペアからのシグナルを測定するステップ；及び
ｅ）ステップｃ）からｅ）までを繰り返し、ステップｃ）の温度を親和温度より下に下がるまで、徐々に下げることにより、シグナリングペアを含む前記核酸アナログの親和性を測定するステップ；及び
ｆ）例えば前記核酸の増幅反応中の、標的核酸の見出されたアニーリング温度より低く及び／又は変異配列の見出された温度より高い、今後の測定のための温度を推定するステップ
を含む方法を提供することも、本発明の好ましい態様である。
前記のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログはＤＮＡポリメラーゼのヌクレアーゼ活性に対して、例えば、Ｔａｑポリメラーゼに対して耐性であることが好ましい。標的配列及び／又は変異配列とハイブリダイズし得る前記のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログは、前記の標的配列及び／又は変異配列と相同相補的であることが好ましい。
シグナリングペアを含む前記のヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログが、少なくとも一つの疎水性ヌクレオチドなどの本発明による少なくとも一つの疎水性分子も含むならば、それはより一層好ましい。前記の少なくとも一つの疎水性ヌクレオチドは、本明細書中の上で記載したようなヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドアナログの中に位置することが好ましい。
他の好ましい方法は、測定が親和温度より下で開始されて、温度が、ステップｃ）からｅ）までの反復中徐々に上げられるものである。
シグナリングペアを含む前記のヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログが、増幅反応中に存在する方法も好ましい。前記のヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログを入れた同じ容器が、増幅反応中に存在し、増幅反応とアニーリング温度測定の間に容器を開く必要なしで（密閉チューブ反応）上記の方法に使用されるとき、それはより一層好ましい態様である。
設定温度に達してからシグナルを読むまでに経過する時間は、シグナリングペアを含む比較的小さいヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログがその標的にアニールするためには十分長いが、測定を大いに妨害する可能性がある全長のアンプリコンの再アニーリングを可能にする程長くはないということも好ましい。これは、ステップｃ）で選択された温度に達したとき、ステップｄ）で測定する前に経過した時間が、１秒、例えば２秒、例えば３秒、例えば４秒、例えば５秒、例えば６秒、例えば７秒、例えば８秒、例えば９秒、例えば１０秒、例えば１１秒、例えば１２秒、例えば１３秒、例えば１４秒、例えば１５秒、例えば最大で１秒、例えば最大で２秒、例えば最大で３秒、例えば最大で４秒、例えば最大で５秒、例えば最大で６秒、例えば最大で７秒、例えば最大で８秒、例えば最大で９秒、例えば最大で１０秒、例えば最大で１１秒、例えば最大で１２秒、例えば最大で１３秒、例えば最大で１４秒、例えば最大で１５秒、例えば１秒と１５秒の間、例えば３秒と２０秒の間であることを意味する。
プローブの親和温度は、シグナリングペアを含む前記のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログからのシグナルの変化を、アニーリング温度の変化として観察することにより、当業者により容易に見出される。オリゴヌクレオチドアナログが標的配列とハイブリダイズしていないとき、シグナリングペアの２つの部分は一般に直近にあり、一方オリゴヌクレオチドアナログがその標的配列とハイブリダイズしているとき、シグナリングペアの２つの部分は一般に直近にないので、オリゴヌクレオチドアナログが標的配列とハイブリダイズしているかいないかに依存してシグナリングペアにより発せられるシグナルに相違があるであろう。
例えばリアルタイムＰＣＲ反応中の今後の測定における、シグナリングペアを含む前記のヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログのための測定点として使用される温度は、例えば１℃、例えば２℃、例えば３℃、例えば４℃、例えば５℃、例えば６℃、例えば７℃、例えば８℃、例えば９℃、例えば１０℃でよく、例えば１０℃を超えて、例えば１℃と１０℃の間であり、例えば、前記のヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログの、上記の方法を使用して見出された標的配列へのアニーリング温度よりも少なくとも３℃低くてよい。
今後のアルタイムＰＣＲ反応における、シグナリングペアを含む前記のヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログのための測定点として使用される温度は、例えば１℃、例えば２℃、例えば３℃、例えば４℃、例えば５℃、例えば６℃、例えば７℃、例えば８℃、例えば９℃、例えば１０℃、例えば１０℃を超えて、例えば１℃と１０℃の間でよく、例えば、上記の方法を使用して見出された変異配列へのアニーリング温度よりも少なくとも３℃高くてよい。
今後の遺伝子型特異的アルタイムＰＣＲ反応における、シグナリングペアを含む前記のヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログのための測定点として使用される温度は、例えば、上記の方法を使用することにより十分に相補的な標的に対して見出されたアニーリング温度より低く、且つ変異配列に対して見出されたアニーリング温度より高くてよい。
上記の方法は、プローブの標的配列へのアニーリングとそれより遅く生成されるがより安定なデュープレックスアンプリコンの先んずる形成との間の競合の問題を迂回する利点を有する。しかしながら、上記の方法は、常に好ましいとは限らない。それ故、利用可能な装置の柔軟性、ロバストネス及び温度変化速度に依存して、今後の測定における最適測定温度を決定するために融解温度を使用することが好ましいと思われる。
融解温度及び親和温度は、実験における測定温度を決定するための、標的配列の検出のために使用されるプローブの重要な特徴である。したがって、ヌクレアーゼ耐性プローブを使用して、増幅反応における最適読み取り温度範囲を迅速に決定する方法であって、
ａ）標的配列及び／又は変異配列を含む核酸又は核酸アナログの混合物を供給するステップ；及び
ｂ）１組のプライマー及びシグナリングペアを含むヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドアナログ（プローブ）を提供するステップであって、ここで前記プライマー及び前記オリゴヌクレオチドアナログは前記の標的配列及び／又は変異配列とハイブリダイズできるステップ；及び
ｃ）前記プライマー及びプローブと核酸及び／又は核酸アナログの前記混合物とを、前記プライマーの前記核酸及び／又は核酸アナログに対するハイブリダイゼーションを可能にする条件下でインキュベートするステップ；及び
ｄ）前記のハイブリダイズした標的配列を、ヌクレオチド若しくはヌクレオチドアナログ又はオリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチドアナログとともに前記プライマーの３’末端の鋳型伸長に使用するステップ；及び
ｅ）前記プローブをその標的配列にハイブリダイズさせて、シグナル強度を測定するステップ（例えば、プライマーをハイブリダイズさせたのと同じ温度で）；及び
ｆ）所望の伸長温度に達するまである一定間隔でシグナル強度を測定しながら徐々に温度を上昇させるステップ；及び
ｇ）伸長反応を終了して形成されたアンプリコンを変性し、ステップｃ）からｇ）までを所望の増幅が起こるまで繰り返すステップ；及び
ｈ）プローブの融解温度を測定するステップ
を含む方法を提供することも、本発明の好ましい態様である。
前記オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログは、ＤＮＡポリメラーゼのヌクレアーゼ活性に対して、例えばＴａｑポリメラーゼに対して、耐性であることが好ましい。標的配列及び／又は変異配列とハイブリダイズし得る前記のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログは、前記標的配列及び／又は前記変異配列と相同相補的であることが好ましい。
シグナリングペアを含む前記のヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログが、少なくとも一つの疎水性ヌクレオチドなどの本発明による少なくとも一つの疎水性分子も含むならば、それはより一層好ましい。前記の少なくとも一つの疎水性ヌクレオチドは、本明細書中で上記したようにヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドアナログの中に位置することが好ましい。
プローブをハイブリダイズさせる温度に達してからシグナルを最初に読むまでに経過する時間は、シグナリングペアを含む比較的小さい前記のヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログがその標的にアニールするためには十分長いが、アンプリコンの再アニーリングに測定を有意に妨害させる程長くはないことが好ましい。それに続く温度上昇及び測定は、アンプリコンの再アニーリングを最小化するためにできるだけ迅速に実施すべきである。
ステップｅ）で選択された温度に達したとき、測定する前に経過した時間は、１秒、例えば２秒、例えば３秒、例えば４秒、例えば５秒、例えば６秒、例えば７秒、例えば８秒、例えば９秒、例えば１０秒、例えば１１秒、１２秒、例えば１３秒、例えば１４秒、例えば１５秒、例えば最大で１秒、例えば最大で２秒、例えば最大で３秒、例えば最大で４秒、例えば最大で５秒、例えば最大で６秒、例えば最大で７秒、例えば最大で８秒、例えば最大で９秒、例えば最大で１０秒、例えば最大で１１秒、例えば最大で１２秒、例えば最大で１３秒、例えば最大で１４秒、例えば最大で１５秒、例えば１秒と１５秒の間、例えば３秒と２０秒の間であることが好ましい。
ステップｆ）における好ましい温度上昇は、シグナル強度の各測定に対して、例えば１℃、例えば２℃、例えば３℃、例えば４℃、例えば５℃、例えば６℃、例えば７℃、例えば８℃、例えば９℃、例えば１℃と１０℃の間である。
プローブの融解温度は、温度を上昇させた結果として、前記プローブからのシグナルの変化を観察することにより、当業者により容易に見出される。
今後のリアルタイムＰＣＲ反応における、シグナリングペアを含む前記のヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログのための測定点として使用される温度は、例えば０．１℃、例えば０．２℃、例えば０．５℃、例えば１．０℃、例えば１．５℃、例えば２℃、例えば３℃、例えば４℃、例えば５℃、例えば６℃、例えば７℃、例えば８℃、例えば９℃、例えば０．１℃と１０℃の間でよく、例えば上記の方法を使用して見出された標的配列に対する融解温度より少なくとも３℃低くてもよい。
今後のリアルタイムＰＣＲ反応における、シグナリングペアを含む前記のヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログのための測定点として使用される温度は、例えば１℃、例えば２℃、例えば３℃、例えば４℃、例えば５℃、例えば６℃、例えば７℃、例えば８℃、例えば９℃、例えば１℃と１０℃の間でよく、例えば上記の方法を使用して見出された変異配列に対するアニーリング温度より少なくとも３℃高くてもよい。
今後の遺伝子型特異的アルタイムＰＣＲ反応における、シグナリングペアを含む前記のヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログを使用する測定点として使用される温度は、例えば、上記の方法を使用することにより十分に相補的な標的に対して見出された融解温度より低く、且つ変異配列に対して見出された融解温度より高い。
ポリメラーゼがエキソヌクレアーゼ活性を有している場合、ヌクレアーゼ耐性でないオリゴヌクレオチドを用いて上記の方法を使用することは、可能ではなく又は少なくとも好ましくない。その場合、プローブは分解されて温度範囲を通してシグナル強度の変化はないか又は僅かしかないであろう。
上記の方法は、増幅反応で使用される条件下で各サイクルに対する異なった温度でデータを提供する利点を有する。それ故、当業者がプローブ及び増幅反応の挙動についての情報を引き出し、それによって設定の最適化を容易に且つ迅速に行うことが出来る。
ヌクレアーゼ耐性であるプローブ又はヌクレアーゼ活性の影響を受けなくしたアッセイの他の利点は、プローブの測定温度をアニーリング温度又は増幅反応の伸長温度と関係づける必要がないことである。さらに、増幅中に２つ以上の異なった測定温度を使用することが可能である。２つ以上の測定温度を使用することは、アッセイで２つ以上のプローブが存在するとき、特に有利である。このようにして、複数のプローブをそれらの個々の最適化された温度で読むことが可能になる。
疎水性基
本発明は、一般的構造
Ｘ−Ｙ−Ｑ
（式中、Ｑは疎水性分子）
のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドアナログに関する。
本発明による疎水性分子は疎水性であり、ワトソン−クリック水素結合に関与しない。したがって、本発明による疎水性分子は天然に生ずる核酸塩基ではない。
疎水性とは、物質の水を撥く又は水に完全には溶解し得ない性質のことである。疎水性物質はオクタノールなどの多くの無極性溶媒に易溶性であるが、極性溶媒の水には僅かに可溶であるに過ぎない。化合物の疎水性を測定する１つの方法は、分配とも称される、水への溶解度と比較した無水液体中の溶解度に関係する。有機−水分配（Ｐ）は、水相と不混和性有機相との間で水に溶解した有機混入物の平衡分布を示す。ほとんど１００年間、この２相はオクタノール−水分配係数であったのであって、疎水性のこの尺度は、天然水中の有機物質の挙動を記述するのに広く使用されている。疎水性が大きいほど、その物質の疎水性有機相中へ分配される傾向は大きい。それ故、分配係数は、単純に、接触している２つの不混和性相間の平衡濃度の比であって、即ち、
Ｐ＝［有機中］／［水中］
である。
この簡単な関係は、有意の溶媒相互作用がなく（溶媒は連続体である）、溶質−溶質相互作用がなく（活量係数は濃度から独立）、又は他の如何なるものの相互作用もないことを仮定している。
オクタノール／水２相系の化学物質のオクタノール相中の濃度の水相中の濃度に対する比は、Ｋow値としても知られている。

Ｐ＝Ｋow＝［オクタノール相中の濃度］／［水相中の濃度］

Ｋowの値は単位がなく、通常、溶質自身が分布に影響しないように、低溶質濃度で室温で測定される。
ｎ−オクタノールは、両親媒性物質であり、疎水性及び親水性両方の部分（ｎ−アルカン及びアルコールそれぞれの基）を有する。これは、ｎ−オクタノールが水素結合により親水性の物質と、及びファンデルワールス力により疎水性物質と相互作用し得ることを意味する。Ｋｏｗ値は、１０−３から１０７までの（−３ないし７のｌｏｇＫｏｗ）範囲にあるが、測定された大部分のｌｏｇＫｏｗは５未満であり、それは、この値の上では、化合物の分配は大きすぎて水相中の濃度を測定することが困難だからである（しかし、高い側の値は測定又は計算することができる。）。
Ｋｏｗは、２相が純粋な二元系を構成しているわけではないので、オクタノール及び水中への化学物質の溶解度の比ではない。特に、水はｎ−オクタノールへのかなりの溶解度があり、より親水性の新しい相を作り出す。平衡で、有機相は、２．３ｍｏｌ／Ｌの水を含み、水相は４．５×１０−３ｍｏｌ／Ｌのオクタノールを含む。非極性及び僅かに極性の化合物に対するオクタノール−水分配係数を制御する主たる要因は、ｎ−オクタノール溶解度ではなくむしろ明らかにその化合物の疎水性であり、有機相の厳密な性質は重要性がより小さい。
本発明の疎水性分子が少なくとも１であるＫｏｗを有することは、一般的に好ましい。
分配を調べるのに使用される他の系は、［水］／［シクロヘキサン］、［水］／［クロロホルム］その他を含む。
分配係数は追加の構造特性であり、即ち、所与の分子に対して、それは、その構成部分の追加機能と見なされ得る。これは、−ＣＨ３基を一つの環境から移動させるエネルギー収支が、化合物が変わっても比較的一定であるという事実に基づく。これは、コンピューターに基づく分配予測をすることを可能にしている。
無極性部分は水分子と殆んど全く相互作用できず、そのため無極性部分近傍の水分子は互いの水素結合を最大化するようにそれら自身を再配向する。このことは、水分子の配列を生じさせて系のエントロピーを減少させるが、以下に述べるように、これが役割を演ずる唯一の力であるとは限らない。２つの無極性部分又は表面が互いに接近したとき、これらの束縛された水分子は、絞り出されてバルクの水相中に遊離する。したがって、疎水性相互作用は水相からの排除及びエントロピー最大化の過程と見ることができる。ファンデルワールス相互作用は、無極性表面間の相互作用に寄与するとも提唱されている。無極性分子の双極子モーメントの平均がゼロになることはあるが、任意の瞬間には、電子及び陽子の瞬間的位置が理由で有限の双極子モーメントは存在する。この双極子は、近傍の中性分子中に双極子モーメントを誘起し得る。その結果２つの双極子は互いに引き合うことができる。
分配は次の手順により測定することができる：
問題の化学物質を、容積比がＫｏｗの期待値にしたがって調節されたオクタノールと水の混合物に加える。
１．系中の溶質の濃度は、どの単独相中でも０．０１ｍｏｌ／Ｌ未満であるべきである。
２．非常に純度の高いオクタノール及び水を使用しなければならない。
３．系は、通常分液ロート又は同様な器具中で、平衡に達するまで（０．５時間ないし３日間）穏やかに振り混ぜる。次に系を遠心して２相を分離し、乳濁があればこわす。
４．次に、２相を適当な技法で分析して、溶質濃度を分析する。可能であれば、両相を分析して物質収支をとる。
他の技法も使用され、例えば、ＨＰＬＣにおける溶質の保持時間は疎水性に関連付けることができる（例えば、Ｓａｈｕ ＆ Ｐａｎｄｉｔ（２００３），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍ ＆ Ｒｅｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１３５−１４６）。適切に計画された実験であれば、保持時間の対数はＫｏｗの対数に対して直線関係になる。さらに、コンピューターのアルゴリズムが、化合物の期待値を計算するために使用される（例えば、ＡＬＯＧＰＳ ２．１ ｈｔｔｐ：//１４６．１０７．２１７．１７８／ｌａｂ／ａｌｏｇｐｓ／ｓｔａｒｔ．ｈｔｍｌ（下記も見よ））。
疎水性効果は、非極性分子が水溶液の存在下で自己会合し易いという性質である。最も極端な場合、油は一緒になって溜まり、水と混合し得ないであろうし、また界面活性剤が形成するミセル及び二重層（石鹸の泡のような）は疎水性効果のもう一つの劇的な結果である。この効果は、通常、タンパク質折りたたみ、タンパク質−タンパク質相互作用、核酸構造、及びタンパク質−低分子相互作用に関連しても記述される。タンパク質折りたたみの場合、それは、集合して一緒になったアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン及びメチオニンなどの疎水性アミノ酸からなる、中心の疎水性軸の周りの二重コイル形状の疎水性コアを、なぜ多くのタンパク質が有するかを説明するために使用される。疎水性相互作用は、溶媒に露出した非極性（疎水性）表面の面積を最小化するタンパク質折りたたみの主要な推進力である。この表面は、折りたたみで約３〜４倍減少する。
疎水性効果は、液体の水の特別の性質、最もあり得るのは水の強い水素結合と小さいサイズの組合せの結果であるということは明らかで道理にかなっている。疎水性効果は、エントロピー効果だけではなくて、温度で劇的に変化するエントロピー及びエンタルピー両方の寄与がある。疎水性相互作用の根底にある基礎は、極性の水分子と非極性分子の間には強い有利な相互作用が欠けていることである。これが、非極性分子間の相互作用を効果的に増大させることになる。
疎水性相互作用のエンタルピー寄与は、２０℃付近即ち室温で約０であるが、それに対してエントロピー寄与は１４０℃付近で０になる。室温よりもずっと上の温度では、非極性基周囲の水分子の配列の減少が進む。温度が低下するにつれて、疎水性相互作用の強度は減少する。これは、低温ほど強くなる水素結合の効果と反対の効果である。
疎水性効果は、溶液の温度を０度付近に下げることによりある程度まで無効にすることができて、そのような温度で、水は配列した構造になることを「好み」、疎水性部分により生ずる配列はエネルギー的にもはや不利ではない。これは、室温より低い温度での水中におけるベンゼンの増大した溶解度によりきれいに示される。通常、疎水性は対象となる基の水溶液から非極性溶媒、しばしばオクタノールへの移動の自由エネルギー（Ｇｔｒａｎｓｆｅｒ）によって測定される。一般に、Ｇｔｒａｎｓｆｅｒ値と他の疎水性の尺度との間で良好な相関が見出される。
ΔＧｔｒａｎｓｆｅｒ＝−ＲＴｌｎＰ
０を超えるｌｎＰの値は、化合物が水相中よりも有機相中により濃縮されていることを示す。
本発明において、好ましい疎水性分子は、主鎖モノマー単位又はリンカーを考慮せず、しかし前記リンカー又は主鎖モノマー単位への結合の位置にあるメチル基を考慮に入れて、実験的に測定するか又はコンピュータープログラム、Ｖｉｒｔｕａｌ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙによるＡＬＯＧＰＳ ２．１（オンラインでｈｔｔｐ：//１４６．１０７．２１７．１７８／ｌａｂ／ａｌｏｇｐｓ／ｓｔａｒｔ．ｈｔｍｌで、又はスタンドアローン版としてｈｔｔｐ：//１４６．１０７．２１７．１７８／ｆｏｒｍｓ／ｄｏｗｎｐｒｏｇ＿ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌでダウンロードして入手することができる）（ＡｌｏｇＰｓ ２．１はＴｅｔｋｏ ａｎｄ Ｔａｎｃｈｕｋ（２００２），Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．，４２：１１３６−１１４５及びＴｅｔｋｏ ａｎｄ Ｔａｎｃｈｕｋ（２００１），Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ，４１：１４０７−１４２１による記載）を使用して計算することによるかのいずれかで、０を超えるｌｏｇＰを有する疎水性分子である。本発明のｌｏｇＰ値を如何に計算するかのさらなる情報については本明細書に含まれる実施例も見られたい。
したがって、前記ｌｏｇＰは、リンカ−の代わりにメチル基を含む疎水性分子について測定される。したがって、構造Ｘ−Ｙ−Ｑの任意の所与の疎水性ヌクレオチドに対して、ｌｏｇＰ値は主鎖モノマー単位（Ｘ）及びリンカ−（Ｙ）をメチル基で置換し、それからｌｏｇＰ値を測定することにより測定される。
本発明において、主鎖のモノマーユニット又はリンカーを考慮せず、しかしオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログへの結合の位置にあるメチル基を考慮に入れて計算した、疎水性分子にとって好ましいｌｏｇＰの値は、例えば０より上、例えば０．５より上、例えば０．７５より上、例えば１より上、例えば１．２５より上、例えば１．５より上、例えば１．７５より上、例えば２より上、例えば２．５より上、例えば３より上、例えば４より上、例えば５より上である。
本発明の疎水性分子は、ワトソン−クリック水素結合には関与しないことが好ましい。１態様において、疎水性分子は他の核酸塩基への特定の水素結合に関与しないなど、実質的に関与しない。さらに、疎水性分子はシグナリングペアの部分でないことが好ましい。
疎水性効果が上記のような広い温度範囲で存在するということは、本発明にとって大なる利点である。それは、水溶液中における通常のアッセイの間、任意の所与の温度で、例えば２０℃ないし９５℃などの範囲の温度で、結合していないプローブのバックグラウンドシグナルが改善されることを意味する。
従って、２０℃と９５℃との間の任意の温度において前記疎水性基を含まない対応する核酸と比べ改善されたバックグラウンドシグナルを有する、本発明の少なくとも一つの疎水性ヌクレオチド等の疎水性分子とシグナリングペアとを含んだオリゴヌクレオチドアナログ（例えばステムレスビーコン）を提供することは、本発明の好ましい態様である。
本発明の疎水性分子は、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ又はそれ自身の主鎖モノマー単位に、場合によりリンカ−を通して、共有結合で結合している。一般に、疎水性分子は、主鎖モノマー単位に共有結合で結合したリンカ−に共有結合で結合させることができる。本発明の疎水性分子を含むヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログ中の任意の位置に挿入することができる。本発明のヌクレオチドは、他のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを含むオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログ中に挿入すべきである。前記疎水性分子を含むヌクレオチドアナログは、ハイブリダイゼーションのための核酸塩基をさらに含んでも含まなくてもよい。
本発明の好ましい１態様において、疎水性分子は、天然に生ずる核酸塩基を含むヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに直接には共有結合で結合していない。したがって、この態様においては、リンカ−Ｙは核酸塩基を含まないことが好ましく、また主鎖モノマー単位も核酸塩基を含まない。
本発明の疎水性分子は、それらを含むオリゴヌクレオチドアナログ（例えばステムレスプローブ）中に、改善されたＳ／Ｎ比を、及び任意選択で１つ又は２つ以上の次の特徴を導入すべきである：即ち、改善されたヌクレアーゼ耐性及び／又は増大した親和性などであるが、配列認識、ヌクレアーゼ感受性、緩衝溶液のイオン強度及び／若しくはＭｇ２＋依存性などの他の特徴は、オリゴヌクレオチドアナログを構成する他の（非疎水性）ヌクレオチド（例えばステムレスビーコン）により決定することができる。
本発明の第一の目的は、前記疎水性分子を含まない対応する直線状プローブよりも優れたＳ／Ｎ比を有する、疎水性分子を含む直線状プローブ（ステムレスビーコン）を提供することである。疎水性分子は、前記プローブが標的配列に結合していないとき、プローブの両側部分のより密接な相互作用を助長し、それによりシグナリングペアの２つの部分のより密接な相互作用を助長すべきである。シグナリングペアの両方の部分が、結合していないプローブで強く相互作用する（測定温度で）ことは、本発明で使用される全てのシグナリングペアのシグナル強度が、前記ペアの２つの部分間の距離に依存するので、重要である。プローブが標的核酸に結合しているとき、それは折りたたまれていなくて、プローブの２つの末端は分離しているが、それが標的核酸に結合していないとき、プローブはランダムコイルらせんを形成し、そこでシグナリングペアの２つの部分は互いに密接に近づくことができる。例えばＦＲＥＴの有効性は、分子内での離れ方の６乗に反比例し、良好なＳ／Ｎ比を得るために、結合していないプローブ中のシグナリングペアの２つの部分の密な接近が重要であることを例示する。疎水性分子の存在は、結合していないプローブの両側部分の相互作用を増強する。
本発明の好ましい疎水性基は、シグナリングペアの２つの部分間により強い相互作用をもたらし、それによりプローブのより良いＳ／Ｎ比をもたらし得る疎水性基である。例えば、シグナリングペアがフルオロフォアとクエンチャーとで構成されていれば、Ｓ／Ｎ比は、結合していないプローブのバックグラウンドシグナルを低下させることにより、向上する。特定の学説に拘束されず、その疎水性分子が結合していないプローブ中のシグナリングペアの２つの部分の相互作用を増大させ得る主たる理由は、親水性溶媒に過度に露出する表面を有することから互いを保護しようとしてそれによりシグナリングペアの２つの部分が互いに密に接近する確率を増大させる、本発明のプローブの他端の疎水性分子間の疎水性相互作用であると信じられる。したがって、プローブは、ランダムコイルらせんに依存するだけでなく、折り返しを助長する追加の強い力を有する。
シグナルが前記シグナリングペアの２つの部分間の距離に依存するシグナリングペアを含むプローブが、標的配列を検出、同定又は定量するために使用されるとき、偽陽性及び偽陰性の判定を避けるために、Ｓ／Ｎ比が、できるだけ１から離れていることが重要である。多重反応におけるバックグラウンドシグナルが高過ぎないことも、これはフルオロフォア間の混線を生じ得るので、重要である。
したがって、本発明の少なくとも一つの疎水性分子及びシグナリングペアを含み、プローブが結合していないときに、シグナリングペアの２つの部分間の相互作用が、前記疎水性分子を含まない対応するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログに比較して増大するように、少なくとも一つの前記の疎水性分子が、前記のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログの片側半分に位置して、前記のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログのもう一方の半分に位置する前記シグナリングペアの部分と疎水性相互作用し得る、オリゴヌクレオチドアナログを提供することは好ましい態様である。
本発明の別のより好ましい態様は、シグナリングペアとオリゴヌクレオチドアナログの各半分に少なくとも１つずつある疎水性分子とを含み、前記疎水性分子が互いに疎水性相互作用できて、その結果、プローブが結合していないとき、前記シグナリングペアの２つの部分間の相互作用が、前記疎水性分子を含まない対応するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログと比較して増大するオリゴヌクレオチドアナログを提供することである。
シグナリングペアの２つの部分の増大した相互作用は、前記インターカレーターを含まない対応するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログと比較して、シグナル強度における増大又は減少のいずれかをもたらし得る。シグナリングペアがフルオロフォアとクエンチャーからなれば、２つの部分の間の増大した相互作用は、好ましくは、蛍光の減少という結果になる。
少なくとも一つの疎水性分子、好ましくは疎水性ヌクレオチド、フルオロフォア及びクエンチャーを含み、前記のオリゴヌクレオチドアナログ／プローブが標的配列に結合していないときに、前記の疎水性ヌクレオチドなどの疎水性分子を含まない対応する直線状プローブよりも低いバックグラウンドシグナルを有するオリゴヌクレオチドアナログを提供することは、本発明のより一層好ましい態様である。上記のことは、特に、前記オリゴヌクレオチドアナログが密閉チューブ中（均一）のアッセイで使用される場合に好ましい。
少なくとも一つの疎水性分子及び、シグナリングペアの２つの部分が、密に接近したときに、エキシマー、エキシプレックス、ＦＲＥＴ錯体又は電荷移動錯体を形成し得るシグナリングペアを含み、前記のオリゴヌクレオチドアナログ／プローブが標的配列に結合していないときに、前記疎水性ヌクレオチドを含まない対応する直線状プローブよりも高いバックグラウンドシグナルを有するオリゴヌクレオチドアナログを提供することは、本発明の他の態様である。前記のオリゴヌクレオチドアナログが密閉チューブ（均一）アッセイで使用される場合、特に上記のようであることが好ましい。
本発明の好ましい態様において、ステムレスビーコンなどのオリゴヌクレオチドアナログは、ＤＮＡヌクレオチド、シグナリングペア及び疎水性ヌクレオチドから構成されている。
本発明の、疎水性ヌクレオチドなどの少なくとも一つの疎水性分子とシグナリングペアとを含むオリゴヌクレオチドアナログは、プローブがエキソヌクレアーゼ依存性のアッセイ又はエキソヌクレアーゼ非依存性アッセイで使用されるかどうかに関わらず、前記疎水性分子を含まない対応するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログに優る利点になる特徴を含むことができる。
したがって、前記疎水性分子を含まない対応する直線状プローブよりも良いＳ／Ｎ比を有する、少なくとも一つの疎水性分子とシグナリングペアとを含むオリゴヌクレオチドアナログ（プローブ）を提供し、前記プローブがヌクレアーゼ依存性アッセイで使用されることは本発明の好ましい態様である。前記アッセイがポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性に依存すれば、それはより好ましい。
本発明の幾つかの応用にとって、ステムレスビーコンが、ヌクレアーゼ活性、例えばＤＮＡポリメラーゼの活性により分解されない、又は少なくとも何らかの有意な程度までは分解されないことが必要である。
したがって、本発明の幾つかの態様において、少なくとも一つの疎水性分子及びシグナリングペアを含み、ヌクレアーゼ安定性が、前記疎水性分子を含まない対応するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログのヌクレアーゼ安定性よりも高いオリゴヌクレオチドアナログを提供することは好ましい。
分子プローブの主要な課題の一つは、僅か１ヌクレオチドのように少しだけ変化している非常に類似した標的の間を識別することができることである。一般的にいえば、プローブが短いほど、１つのミスマッチが親和性に大きい影響を有するであろうし、したがって、ミスマッチのものに対して完全に相補的な標的を狙うことが容易になるであろう。高親和性ＤＮＡアナログ、（副溝）バインダー即ちＭＧＢ及びインターカレーターが、対応するＤＮＡベースのプローブよりも短くされ得る蛍光性プローブを生成するために、これまでに使用されている。
したがって、疎水性ヌクレオチドなどの少なくとも一つの疎水性分子及びシグナリングペアを含み、前記オリゴヌクレオチドアナログと標的配列（ＤＮＡ配列など）とのハイブリッドの融解温度が、前記疎水性分子を含まない対応するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログと標的配列（ＤＮＡ配列など）とのハイブリッドの融解温度と同じか又はそれより高い、オリゴヌクレオチドアナログを提供することは、本発明の好ましい態様である。
原理的には、疎水性ヌクレオチドなどの前記疎水性分子を含まない対応する直線状プローブよりも有意に望ましいＳ／Ｎ比（１から離れた値）をプローブに導入することができる疎水性ヌクレオチドなどの任意の疎水性分子は、本発明で使用することができる。それは、１態様において、疎水性分子は、インターカレーター、マイナーグルーブ（副溝）バインダー、及びプローブと前に会合したことのある他の分子でよいことを意味する。しかしながら、前記疎水性分子を含まない対応する直線状プローブよりも有意に望ましいＳ／Ｎ比（１から離れた値）を与えられない疎水性分子は、本発明の好ましい疎水性分子ではない。
脂肪酸、ステロイド、マイナーグルーブ（副溝）バインダー及びインターカレーターは全て、上記のｌｏｇＰ値を有する脂肪酸、ステロイド、マイナーグルーブ（副溝）バインダー及びインターカレーターは特に、本発明に有用な疎水性分子である。しかしながら、本発明の好ましい疎水性分子は、本発明のオリゴヌクレオチドアナログがその標的配列にハイブリダイズしたときに形成されるデュープレックスと、前記疎水性分子が前記のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログ中に存在しない場合に比較して、前記デュープレックスを不安定化せずに、相互作用し得る疎水性基である。本発明の好ましい疎水性分子は、少なくとも一つの、５又は６員環構造などの環系を含む。前記環構造は、芳香族性又は非芳香族性のいずれであってもよい。前記環系は、Ｃ、Ｓ、Ｎ及び／又はＯで構成されていることが好ましく、環系のメンバーの大部分がＣであることが好ましい。環系は各位置で独立に置換されていてよい。本発明のより好ましい疎水性基は、インターカレーター及びマイナーグルーブ（副溝）バインダーである。本発明の最も好ましい疎水性基は、インターカレーターである。
インターカレーター
本発明に記載の用語インターカレーターは、核酸の核酸塩基と共スタックし得る、少なくとも一つの本質的に平らな共役系を含む任意の分子部分を包含する。本発明のインターカレーターは、核酸又は核酸類似物の核酸塩基と共スタックし得る、少なくとも一つの本質的に平らな共役系からなることが好ましい。
インターカレーターは、本発明によりπ電子系を含む他の分子と相互作用し得る少なくとも一つのπ（パイ）電子系を含む。これらの相互作用は、前記インターカレーターの疎水性相互作用に対して正又は負の様式で寄与し得る。Ｈｕｎｔｅｒ ａｎｄ Ｓａｎｄｅｒｓ（１９９０），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：５５２５−５５３４は２つのπ電子系が互いに正に相互作用し得る異なった配向及び条件の範囲を提唱した。
インターカレーターは、多環芳香族（ｐｏｌｙａｒｏｍａｔｅｓ）及び複素多環芳香族（ｈｅｔｅｒｏｐｏｌｙａｒｏｍａｔｅｓ）からなる群から選択された化学基を含むことが好ましく、インターカレーターは、本質的に多環芳香族又は複素多環芳香族からなることがより一層好ましい。インターカレーターは、多環芳香族及び複素多環芳香族からなる群から選択されることが、最も好ましい。
本発明の多環芳香族又は複素多環芳香族は、例えば１、例えば２、例えば３、例えば４、例えば５、例えば６、例えば７、例えば８、例えば９以上の任意の適当な数の環から構成されていてよい。さらに、多環芳香族又は複素多環芳香族は、ヒドロキシル、ブロモ、フルオロ、クロロ、ヨード、メルカプト、チオ、シアノ、アルキルチオ、複素環、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルボアルコイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ニトロ、アミノ、アルコキシル、カルボニル及びアミドからなる群から選択された１つ又は２つ以上で置換されていてよい。
本発明のオリゴヌクレオチドが相補的な標的にハイブリダイズしたとき、シグナリングペアの２つの部分、例えば、フルオロフォアとクエンチャーは空間的距離で分離されていて、フルオロフォアが蛍光を発することが可能である。本発明のオリゴヌクレオチドは、平らな（複素）芳香族インターカレーターなどの疎水性分子を含む少なくとも一つの疎水性ヌクレオチドを含み、それらは相補的デュープレックス中の塩基対の間にインターカレートし得ないときには、相互に又はシグナリングペアのどちらかの部分と疎水性相互作用を有する。このようにして、それらは疎水性分子の疎水性部分とシグナリングペアとの間の相互作用を助長して、緩衝液中の水との接触を最小化することができる。したがって、混合物中に相補的な標的が、ないか又は、本発明のステムレスビーコンなどのオリゴヌクレオチドアナログよりも少なければ、結合していないオリゴヌクレオチドアナログ（プローブ）の疎水性分子例えばインターカレーターは、プローブの２つの末端が互いに密に接近することを助長し、それにより結合していないオリゴヌクレオチドアナログ（ステムレスビーコンなど）のフルオロフォアの消光を強化するであろう。この折り返しの機構は、配列とは独立で、したがって、従来のＤＮＡを基材とする分子ビーコンと異なり、分子の適切な消光を得るために、自己相補的なステム構造を設計することは必要でない。
２つの芳香族系の間の相互作用の強度は、上記の疎水性相互作用並びに共役系の電子分布、密度、配向、距離及びサイズにより決定される。
したがって、本発明の疎水性分子は、好ましくは、フェナントロリン、フェナジン、フェナントリジン、アントラキノン、ピレン、アントラセン、ナフテン、フェナントレン、ピセン、クリセン、ナフタセン、アクリドン類、ベンズアントラセン類、スチルベン類、オキサロピリドカルバゾール類、アジドベンゼン類、ポルフィリン類、ソラーレン類からなる群から選択されたインターカレーター、並びにヒドロキシル、ブロモ、フルオロ、クロロ、ヨード、メルカプト、チオ、シアノ、アルキルチオ、複素環、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルボアルコイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ニトロ、アミノ、アルコキシル及び／若しくはアミドからなる群から選択された１つ又は２つ以上で置換された上記のインターカレーターの任意のものであってよい。
インターカレーターは、好ましくは、フェナントロリン、フェナジン、フェナントリジン、アントラキノン、ピレン、アントラセン、ナフテン、フェナントレン、ピセン、クリセン、ナフタセン、アクリドン類、ベンズアントラセン類、スチルベン類、オキサロピリドカルバゾール類、アジドベンゼン類、ポルフィリン類及びソラーレン類からなる群から選択される。
インターカレーターは、より好ましくは、フェナントロリン、フェナジン、フェナントリジン、アントラキノン、ピレン、アントラセン、ナフテン、フェナントレン、ピセン、クリセン、ナフタセン、アクリドン類、ベンズアントラセン類、スチルベン類、オキサロピリドカルバゾール類、アジドベンゼン類、ポルフィリン類及びソラーレン類からなる群から選択される。
好ましい態様において、インターカレーターは、フェナントロリン、フェナジン、フェナントリジン、アントラキノン、ピレン、アントラセン、フェナントレン、クリセン、ナフタセン、ベンズアントラセン類、スチルベン類、及びポルフィリン類からなる群から選択される。
他の好ましい態様において、疎水性基は、ピレン又はピリド［３’，２’：４，５］チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−４（１Ｈ）−オン又は７，９−ジメチル-ピリド［３’，２’，４，５］チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オンを含む。疎水性基は、ピレン又はピリド［３’，２’：４，５］チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−４（１Ｈ）−オン又は７，９−ジメチル−ピリド［３’，２’，４，５］チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オンからなってもよい。
より好ましくは、インターカレーターは、本明細書中の下に示す構造の１つを含むインターカレーターの群から選択することができる：
Figure 0005284112
Figure 0005284112
Figure 0005284112
Figure 0005284112
Figure 0005284112
Figure 0005284112
 及び、任意選択で、ただしそれほど好ましくはないこれらの誘導体。
より一層好ましくは、インターカレーターは、上でＶ、ＸＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶ、ＸＶＩＩ、ＸＸＩＩＩ、ＸＸＶＩ、ＸＸＶＩＩＩ、ＸＬＶＩＩ、ＬＩ及びＬＩＩと番号付けしたインターカレーター構造並びにそれらの誘導体からなるインターカレーターの群から、好ましくは、上でＶ、ＸＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶ、ＸＶＩＩ、ＸＸＩＩ１、ＸＸＶＩ、ＸＸＶＩＩＩ、ＸＬＶＩＩ、ＬＩ及びＬＩＩと番号付けしたインターカレーター構造からなるインターカレーターの群から選択することができる。
最も好ましくは、インターカレーターは、上でＸＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶＩＩ、ＸＸＩＩ１、ＬＩと番号付けしたインターカレーター構造並びにそれらの誘導体からなる群から、好ましくは、上でＸＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶＩＩ、ＸＸＩＩＩ及びＬＩと番号付けしたインターカレーター構造の群から選択される。
例の上記のリストは決して限定するものと解釈されるべきではなく、インターカレーターを含む疎水性分子の可能な構造の例を提供するためのものである。それに加えて、改変された構造を得るための、各インターカレーターにおける１つ又は２つ以上の化学基の置換も、本発明に含まれる。
本発明の１態様において、インターカレーターは、国際特許出願ＷＯ０３／０５２１３２において、４６頁１０行目ないし５４頁１３行目の「インターカレーター」の項目中に記載されたインターカレーターのいずれであってもよい。
マイナーグルーブ（副溝）バインダー
特定の１態様において、疎水性分子は、マイナールグルーブ（副溝）バインダーであってよいが、本発明の他の態様においては、疎水性分子は、マイナールグルーブ（副溝）バインダーではないことが好ましい。マイナールグルーブ（副溝）バインダーは疎水性で、本明細書中で先に示したｌｏｇＰ値を有することが好ましい。
マイナールグルーブ（副溝）バインダーは、デュープレックスＤＮＡに副溝中で結合するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログ改変剤の効力のあるクラスである。マイナールグルーブ（副溝）バインダーとは、副溝と呼ばれる、二重螺旋中の２つのリン酸−糖主鎖間に形成される深く狭い空間中にぴったり合う、「三日月形」を取り得る、長い平らな分子であり、水分子と入れ替わり、副溝中で密接な原子的接触を形成する。それらは、水素結合及び／又は疎水性相互作用により副溝中で安定化される。
上の先行技術の項で、Ｋｕｔｙａｖｉｎ及び共同研究者らが、如何にしてＭＧＢ分子をプローブの３’末端に結合し、それを、ＭＧＢがプローブの５’末端に結合している、５’−ＰＣＲアッセイ及びヌクレアーゼ非依存性アッセイで使用したかを簡単に説明した。これらの公開文書のいずれも、結合していないプローブにおける疎水性相互作用によるバックグラウンドシグナルの低下を論じていない。したがって、たとえＭＧＢが当技術分野において周知であっても、適切に組み合わされてオリゴヌクレオチドアナログ中に位置する前記ＭＧＢの疎水性が、シグナリングペアの２つの部分の間の相互作用を増大させることにより、Ｓ／Ｎ比を改善するために使用できるということは、本発明に先んじて知られてはいなかった。
したがって、少なくとも一つのマイナールグルーブ（副溝）バインダー及びシグナリングペアを含み、前記マイナールグルーブ（副溝）バインダーが前記オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログの片側半分に位置して、標的配列に結合していないときは、前記のオリゴヌクレオチドアナログのもう一方の半分の部分と疎水性相互作用を有する、オリゴヌクレオチドアナログを提供することは、本発明の好ましい態様である。特に、マイナールグルーブ（副溝）バインダーを含む疎水性ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドアナログの５’末端又は３’末端における１つ目のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログとして位置せず、むしろ内部にあることが好ましい。
シグナリングペア、並びにオリゴヌクレオチドアナログの一方の半分に位置する少なくとも１つのマイナールグルーブ（副溝）バインダーを、及び前記オリゴヌクレオチドアナログの他方の半分に本発明の他の疎水性分子を含み、その結果、前記オリゴヌクレオチドアナログが標的配列に結合していないとき、前記マイナールグルーブ（副溝）バインダー及び前記疎水性分子が、互いに疎水性相互作用を有して、前記シグナリングペア中の２つの部分のより有効な相互作用を生じさせる、オリゴヌクレオチドアナログを提供することは、本発明のより一層好ましい態様である。
主鎖モノマー単位
本発明のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログの主鎖モノマー単位は、核酸又は核酸アナログの主鎖中への組込みに含まれるヌクレオチドの部分である。主鎖モノマー単位（Ｘ）は、疎水性分子に共有結合で結合したリンカ−（Ｙ）に共有結合で結合していることが好ましい。任意の適当な主鎖モノマー単位を、疎水性ヌクレオチドを本発明のオリゴヌクレオチドアナログ中に組み込むために利用することができる。前記主鎖モノマー単位と前記疎水性分子とを結合する任意の種類のリンカ−も利用することができる。それに加えて、主鎖モノマー単位は、前記主鎖モノマー単位を含むオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログの合成中又は合成後に、任意の方法で除去し又は変化させることができる、１つ又は２つ以上の離脱基、保護基及び／又は反応性基を含んでいてよい。
主鎖モノマー単位は、任意の適当な主鎖モノマー単位であってよい。本発明の１態様において、主鎖モノマー単位は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、ＭＮＡ、ＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＮＡ、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２’−ＮＨ）−ＴＮＡ、（３’−ＮＨ）−ＴＮＡ、α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、α−Ｌ−キシロ−ＬＮＡ、β−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、α−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、［３．２．１］−ＬＮＡ、ビシクロ−ＤＮＡ、６−アミノ−ビシクロ−ＤＮＡ、５−エピ−ビシクロ−ＤＮＡ、α−ビシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ビシクロ［４.３．０］−ＤＮＡ、ビシクロ［３．２.１］−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］アミド−ＤＮＡ、β−Ｄ−リボピラノシル−ＮＡ、α−Ｌ−リキソピラノシル−ＮＡ、２’−Ｒ−ＲＮＡ、α−Ｌ−ＲＮＡ又はα−Ｄ−ＲＮＡ、β−Ｄ−ＲＮＡ及びそれらの混合物及びそれらのハイブリッド並びに限定はされないが、ホスホロチオエート類、メチルホスホレート類、ホスホルアミジエート類、ホスホロジチエート類、ホスホロセレノエート類、ホスホトリエステル類、及びホスホボラノエート類などのそれらのリン原子改変の主鎖モノマー単位からなる群から選択することができる。それに加えて、リンを含まない化合物、例えば、限定はされないが、メチルイミノメチル、ホルムアセテート、チオホルムアセテート、及びアミドを含む結合基などを、ヌクレオチドへの結合のために使用することができる。特に、核酸及び核酸アナログは、本発明の１つ又は２つ以上疎水性ヌクレオチドを含むことができる。
本発明に有用なヌクレオチド及びヌクレオチドアナログの種々の異なった主鎖モノマー単位、並びに如何にそれらが主鎖モノマー単位の１つ又は２つの位置に結合されたリンカ−により核酸塩基に接続されるかを下に描く：
Figure 0005284112
Figure 0005284112
Figure 0005284112
Figure 0005284112
Figure 0005284112
Figure 0005284112
上に示した主鎖モノマー単位の幾つかは、本発明の疎水性分子にすでに結合されているが、他のものはヌクレオチドに結合された疎水性分子を有することができる。疎水性分子は、核酸塩基、主鎖、又は存在していれば前記核酸塩基及び主鎖を結合しているリンカ−の原子などの任意の利用し得る原子に接続することができる。疎水性分子は、核酸塩基を置き換えることもでき、又は任意の種類のそれ自身の主鎖モノマー単位に結合することもできる。
好ましい態様において、主鎖モノマー単位は、天然に生ずる核酸塩基などの核酸塩基を含まない。リンカ−が天然に生ずる核酸塩基などの核酸塩基を含まないことも好ましい。
主鎖モノマー単位がリボース基を含むとき、１態様においては、疎水性分子がリンカ−により前記リボ−ス基に共有結合で結合していることが好ましい。したがって、この態様において、疎水性分子は、リンカ−（Ｙ）により主鎖のリン酸基に共有結合で結合していないことが好ましい。
ＬＮＡ（ロックド核酸）の主鎖モノマー単位は、立体的に束縛されたＤＮＡ主鎖モノマー単位であり、それはＤＮＡ主鎖モノマー単位の通常の立体配座の自由度を制限する分子間橋を含む。ＬＮＡは、ＷＯ９９/１４２２６（Ｅｘｉｑｏｎ）に記載されたような任意のＬＮＡ分子であってよく、ＬＮＡはＷＯ９９/１４２２６の要旨に描かれた分子から選択されることが好ましい。本発明の好ましいＬＮＡは、２’−Ｏ位を４’−Ｃ位に接続するメチルリンカ−を含むが、２’オキシ原子が窒素又はイオウ原子のいずれかにより置き換えられたＬＮＡなどの他のＬＮＡも、本発明の内に含まれる。
本発明の疎水性分子を含むヌクレオチドの好ましい主鎖モノマー単位は、前記疎水性分子がその標的核酸と相互作用することを可能にする主鎖モノマー単位である。
本発明の好ましい１態様において、主鎖モノマー単位は、非環状主鎖モノマー単位からなる群から選択される。非環状の意味は、環構造を含まない任意の主鎖モノマー単位、例えば、リボース又はデオキシリボース基を好ましくは含まない主鎖モノマー単位を包含する。
したがって、本発明の疎水性ヌクレオチドの主鎖モノマー単位は、五価のリン原子などの三価及び五価のリン原子からなる群から選択される少なくとも一つの化学基を含む主鎖モノマー単位からなる群から選択することができる好ましい。本発明の主鎖モノマー単位のリン酸原子は、ホスホエステル、ホスホジエステル、ホスホルアミジエート及びホスホルアミダイト基からなる群から選択される少なくとも一つの化学基を含む主鎖モノマー単位からなる群から選択することができることが、より好ましい。
特に、本発明の疎水性ヌクレオチドの主鎖モノマー単位は、リン酸エステル、ホスホエステル、ホスホジエステル、ホスホルアミジエート及びホスホルアミダイト基からなる群から選択される少なくとも一つの化学基を含む非環状主鎖モノマー単位からなる群から選択されることが好ましい。
好ましくは、主鎖モノマー単位は、最大で５個、例えば最大で４個の原子が主鎖モノマー単位のリン原子と最も近いリン原子とを隔て、より好ましくは５個、最大で４個などの原子が（両方の場合ともそれら自身はリン原子を含まない）、主鎖モノマー単位のリン原子と最も近いリン原子とを隔てるように、核酸又は核酸アナログのリン酸エステル主鎖に組み込まれることが可能である。
本発明の特に好ましい態様において、疎水性ヌクレオチドは、ホスホルアミダイトを含む主鎖モノマー単位を含み、より好ましくは、主鎖モノマー単位は三価ホスホルアミダイト又は五価を含む。
適当な三価ホスホルアミダイトは、核酸及び／又は核酸アナログの主鎖中に組み込むことができる三価又は五価のホスホルアミダイトである。通常、アミダイト基自身は核酸の主鎖中に組み込むことができなくて、むしろアミダイト基又はアミダイト基の一部が脱離基及び／又は保護基として役立ち得る。しかしながら、主鎖モノマー単位は、ホスホルアミダイト基を含むことが好ましく、それはそのような基が主鎖モノマー単位を核酸の主鎖中に組み込み易くするからである。
本発明の１態様において、主鎖モノマー単位は、国際特許出願ＷＯ０３/０５２１３２中の２４頁２７行目ないし４３頁１４行目の「主鎖モノマー単位」の項に記載されている主鎖モノマー単位のいずれであってもよい。
リンカ−
本発明の疎水性ヌクレオチドのリンカ−は、疎水性分子と前記疎水性ヌクレオチドの主鎖モノマーとを、好ましくは、前記疎水性分子と主鎖モノマー単位とを共有結合で結合して接続する部分である。リンカ−は、１つ又は２つ以上の原子又は原子間の結合を含むことができる。
本明細書中で上に定義した主鎖及び疎水性分子の定義により、リンカ−は、主鎖と疎水性分子とを結合する最短経路である。疎水性分子が主鎖に直接結合していれば、リンカ−は、１つの結合である。
リンカ−は、通常、原子鎖又は分岐した原子鎖からなる。鎖は飽和並びに不飽和であってよい。リンカ−は、共役系を含むか又は含まない環構造であってもよい。
例えば、リンカ−は、Ｃ、Ｏ、Ｓ、Ｎ、Ｐ、Ｓｅ、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｓｎ及びＰｂからなる群から、好ましくは、Ｃ、Ｏ、Ｓ、ＮおよびＰからなる群から選択されるｍ個の原子の鎖を含むことができ、より一層好ましくは、それらはＣであり、鎖の１つの末端は疎水性分子に接続し、鎖の他の末端は主鎖モノマー単位に接続している。
幾つかの態様において、本発明のリンカ−及び疎水性ヌクレオチドの全長は、好ましくは、８Åと１３Åの間である（本明細書中で下を見られたい）。したがって、ｍは、特定の疎水性ヌクレオチドの疎水性分子のサイズに依存して選択されるべきである。
即ち、インターカレーターが小さいとき、ｍは比較的大きくあるべきで、インターカレーターが大きいとき、ｍは比較的小さくあるべきである。しかし、大部分の目的に対して、ｍは１ないし７、１ないし６など、１ないし５など、１ないし４などの整数であろう。上記のように、リンカ−は、不飽和鎖又は共役した結合を含む他の系であってもよい。例えば、リンカ−は、環状共役構造を含んでいてもよい。リンカ−が飽和鎖であるとき、ｍは１ないし４であることが好ましい。
疎水性分子がピレンであるとき、ｍは好ましくは、１ないし７、１ないし６など、１ないし５など、１ないし４など、より好ましくは１ないし４、より一層好ましくは１ないし３、最も好ましくは２又は３の整数である。
インターカレーターが、
Figure 0005284112
 の構造を有するとき、ｍは好ましくは２ないし６、より好ましくは２である。
１態様において、リンカ−は、アザアルキル、オキサアルキル、チアアルキル又はアルキル鎖である。例えば、リンカ−は、Ｃ、Ｈ、Ｏ、Ｓ、Ｎ、Ｐ、Ｓｅ、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｓｎ及びＰｂからなる群から選択される、好ましくは、Ｃ、Ｈ、Ｏ、Ｓ、ＮおよびＰからなる群から選択される１つ又は２つ以上で置換されたアルキル鎖であってよい。好ましい態様において、リンカ−は、分岐していないアルキル基鎖からなり、その鎖の１つの末端は疎水性分子に接続し、鎖の他の末端は主鎖モノマー単位に接続し、且つ各Ｃは２個のＨで置換されている。より好ましくは、前記の分岐していないアルキル鎖は、１ないし５原子の長さ、１ないし４原子などの長さ、１ないし３原子などの長さ、２ないし３原子などの長さである。
他の態様において、リンカ−は、１ないし６個のＣ原子、次の原子即ちＯ、Ｓ、Ｎの各々０ないし３個からなる。より好ましくは、リンカ−は、１ないし６個のＣ原子、及びＯ、Ｓ、Ｎの各々０ないし１個の原子からなる。
好ましい態様において、リンカ−は、場合により置換されているＣ、Ｏ、Ｓ及びＮの原子の鎖からなる。好ましくは、前記の鎖は、最大で３原子からなるべきで、したがって、場合により置換されているＣ、Ｏ、Ｓ及びＮから個々に選択される０ないし３原子を含む。
好ましい態様において、リンカ−は、Ｃ、Ｏ、Ｓ及びＮの原子の鎖からなり、鎖の１つの末端はインターカレーターに接続し、鎖の他の末端は主鎖モノマー単位に接続している。
好ましくは、そのような鎖は、下に示すリンカ−の１つを含み、最も好ましくは、リンカ−は下に示す分子の１つからなる：
Figure 0005284112
好ましい態様において、鎖は、下に示すリンカ−の１つを含み、より好ましくは、リンカ−は、下に示す分子の１つからなる：
Figure 0005284112
より好ましい態様において、鎖は、下に示すリンカ−の１つを含み、より好ましくは、リンカ−は、下に示す分子の１つからなる：
Figure 0005284112
リンカ−は、先に定義した疎水性ヌクレオチドＸ−Ｙ−Ｑに対する式中のＹを構成し、したがって、Ｘ及びＱはリンカ−の部分ではない。
本発明の１態様において、リンカ−は、ＷＯ０３／０５２１３２中５４頁１５行目ないし５８頁７行目の「リンカ−」の項に記載されたリンカ−のいずれでもよい。
標識
本明細書の文中で、用語「標識」は、例えば、それ自身により又は一連の検出の一部としてのいずれかで検出される基を意味する。レポーター基の機能部の例は、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光性基（電磁放射線、例えば、ある波長の光又はＸ線を吸収することができ、その結果吸収されたエネルギーをより長い波長の放射線として再放出する基；例示となる例は、ダンシル（５−ジメチルアミノ）−１−ナフタレンスルホニル）、ＤＯＸＹＬ（Ｎ−オキシル−４,４−ジメチルオキサゾリジン）、ＰＲＯＸＹＬ（Ｎ−オキシ−２,２,５,５−テトラメチルピロリジン）、ＴＥＭＰＯ（Ｎ−オキシル−２,２,６,６−テトラ−メチルピペリジン）、ジニトロフェニル、アクリジン、クマリン、Ｃｙ３及びＣｙ５（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．の商標）、エリトロシン、クマル酸、ウンベリフェロン、テキサスレッド、ローダミン、テトラメチルローダミン、Ｒｏｘ、７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１−ジアゾール（ＮＢＤ）、ピレン、フルオレセイン、「量子ドット」、ヨーロピウム、ルテニウム、サマリウム、及び他の希土類金属、放射性同位体標識、化学発光標識、（化学反応中の発光により検出され得る標識）、スピン標識（フリーラジカル（例えば置換された有機ニトロキシド）又は電子スピン共鳴分光法の使用により検出される生体分子に結合された他の常磁性プローブ（例えば、Ｃｕ２+、Ｍｇ２＋））、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、及びグルコースオキシダーゼなど）、抗原、抗体、ハプテン類（抗体と複合できるが、それ自身により免疫反応を惹起できない基、ペプチド類及びステロイドホルモン類など）、細胞膜浸透のための担体系：例えば、脂肪酸残基、ステロイドのコレステリル部分、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、葉酸、特定の受容体のためのペプチド、エンドサイトーシスを媒介する基、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ブラディキニン、及び血小板誘導増殖因子（ＰＤＧＦ）などである。特に、興味ある例は、ビオチン、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、ジニトロフェニル、ジゴキシゲニン、ルテニウム、ヨーロピウム、Ｃｙ５、Ｃｙ３等である。
シグナリングペア
本発明のシグナリングペアは、組合されて、相互の物理的距離、配向及び／又は相互作用に依存して、測定可能な変化をすることができる２つの部分と定義される。好ましくは、シグナリングペアは、組み合わされて、検出可能なシグナルを生じ得る２つの部分の系からなり、ペアの部分間の物理的距離に依存して前記の検出可能なシグナルが変化する。
本発明によれば、シグナリングペアの部分は、オリゴヌクレオチドアナログの疎水性ヌクレオチドと同一ではない。したがって、シグナリングペアの部分は、本発明のオリゴヌクレオチドアナログ中に挿入されたときも、疎水性ヌクレオチドと同一の構造の部分ではないことが好ましい。
本発明の好ましい態様において、国際特許出願ＷＯ０３／０５２１３２中の１９９頁の実施例２４に記載されたインターカレーター擬ヌクレオチドＹ又は１８４頁の実施例１４に記載されたインターカレーター擬ヌクレオチドＹと、シグナリングペアの少なくとも一つの部分が同一であるか、より好ましくは、シグナリングペアのどの部分も同一でないことが好ましい。シグナリングペアの部分が、オリゴヌクレオチドアナログに挿入されたとき、国際特許出願ＷＯ０３／０５２１３２中の１９９頁の実施例２４に記載されたインターカレーター擬ヌクレオチドＹ又は１８４頁の実施例１４に記載されたインターカレーター擬ヌクレオチドＹと同一の構造の部分ではないことも好ましい。
発生されたシグナルは、如何なる性質のものでもよく、例えば、シグナルは、系の蛍光又は電気抵抗の変化であってよい。好ましい態様において、シグナリングペアは、ペアの部分間の距離に依存して蛍光を変化させ得る。本発明のシグナリングペアは、前記シグナリングペアが結合しているプローブが標的配列にハイブリダイズしているかいないかに依存して、シグナルを変化させるであろう。したがって、シグナリングペアは、シグナリングペアの部分間の距離が、オリゴヌクレオチドアナログの標的配列へのハイブリダイゼーションで増大するような様式で、オリゴヌクレオチドアナログの中に位置することが好ましい。
本発明のシグナリングペアは、本発明のオリゴヌクレオチドアナログの反対の半分に位置する２つの部分からなることが好ましい。
シグナリングペアの部分の少なくとも１つが、本発明のオリゴヌクレオチドアナログの１つの末端に位置し、一方他の部分が前記オリゴヌクレオチドアナログの他の半分に位置することが、本発明のより好ましい態様である。
本発明におけるシグナリングペアの２つの部分が本発明のオリゴヌクレオチドアナログの反対の末端に又はその近くに位置すれば、それはより一層好ましい。
シグナリングペアの１つの部分は、５’末端から６以内、例えば５以内、例えば４以内、例えば３以内、例えば２以内、例えば１つ目のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログに位置することが好ましい。好ましい態様において、シグナリングペアの部分は５’末端の突出末端として位置する。シグナリングペアの前記部分がオリゴヌクレオチドアナログの５’側の半分の中に位置することは、さらに好ましい。シグナリングペアの前記部分が、オリゴヌクレオチドアナログの５’側３分の１以内に位置することはより好ましい。シグナリングペアの前記部分が、オリゴヌクレオチドアナログの５’側４分の１以内に位置することはより好ましい。したがって、５’末端からの好ましい最大距離はオリゴヌクレオチドアナログの長さに依存し得る。
シグナリングペアのもう一方の部分は、３’末端から６以内、例えば５以内、例えば４以内、例えば３以内、例えば２以内、例えば１つ目のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログに位置することが好ましい。好ましい態様において、シグナリングペアの前記部分は３’末端の突出末端として位置する。シグナリングペアの前記部分がオリゴヌクレオチドアナログの３’側の半分の中に位置することは、さらに好ましい。シグナリングペアの前記部分が、オリゴヌクレオチドアナログの３’側３分の１以内に位置することはより好ましい。シグナリングペアの前記部分が、オリゴヌクレオチドアナログの３’側４分の１以内に位置することはより好ましい。したがって、３’末端からの好ましい最大距離はオリゴヌクレオチドアナログの長さに依存し得る。
好ましくは、シグナリングペアの両方の部分は、上に示したように位置する。
蛍光などの分光学的性質は、ハイブリダイゼーションの検出のために、例えば、定量ＰＣＲ法のリアルタイム検出を実施するときに、好ましい。このように、シグナリングペアは、ペアの部分間の距離に依存して蛍光特性などの分光学的性質の変化を生じさ得ることが好ましい。
蛍光性基は、蛍光を発し得る任意の基であってよく、例えば（限定するものではないが）、蛍光性基は、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ローダミン、リサミンローダミン、ローダミン１２３、クマリン、ＣＹ−２、ＣＹ−３、ＣＹ３．５、ＣＹ−５、ＣＹ５．５、ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＬＩＺ、ＮＥＤ、ＰＥＴ、アレクサ色素、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰ、ＹＯ−ＹＯ、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ナノオレンジ、ナイルレッド、オリグリーン、オレゴングリーン、ピコグリーン、ラジアントレッド、リボグリーン、ＲＯＸ、Ｒ−フィコエリスリン、ＳＹＰＲＯオレンジ、ＳＹＰＲＯレッド、ＳＹＰＲＯルビー、ＴＡＭＲＡ、テキサスレッド、ＸＲＩＴＣ、ヨウ化プロピジウム、アクリジンオレンジ、エチジウムブロマイド、ＳＹＢＲゴールド、ＳＹＢＲグリーンＩ、及びＳＹＢＲグリーンＧｒｅｅｎＩＩからなる群から選択することができる。
本発明の好ましい態様において、シグナリングペアは、さらに少なくとも一つの疎水性分子を含むオリゴヌクレオチドアナログに共有結合で結合された２つの部分を含み、その部分で前記シグナリングペアは、分子内エキシマー及び／又は分子内エキシプレックス及び／又は分子内ＦＲＥＴ錯体及び／又は分子内電荷移動錯体を形成することができる。
特に、それらが密に接近しているときに、それらは、分子内エキシマー及び／又は分子内エキシプレックス及び／又は分子内ＦＲＥＴ錯体及び／又は分子内電荷移動錯体を形成することができる。シグナリングペアの部分は、それらが、最大で１００Å離れ、好ましくは最大で７５Å、より好ましくは最大で５０Å、より一層好ましくは最大で２０Å離れ、例えば最大で１０Å離れているとき、密に接近している。
如何なる特定の学説にも捉われず、オリゴヌクレオチドアナログの立体配座は動的で、したがって、上記の距離は平均と見なすことができると予想される。同様な考慮は、本明細書中で言及される他の距離にも関する。
２つの分子が、それらが互いに相互作用し得るような関係で、相互間の位置を占めている場合のみ、分子の部分が、エキシマー、エキシプレックス、ＦＲＥＴ錯体又は電荷移動錯体を形成することが可能である。したがって、シグナリングペアは、２つの部分を分離する分子部分があれば、エキシマー、エキシプレックス、ＦＲＥＴ錯体又は電荷移動錯体を形成することができない。
さらに、オリゴヌクレオチドアナログが少なくとも一つのクエンチャー分子を含み得ることも、本発明の内に含まれる。本発明のクエンチャー分子は、その近隣にある蛍光性基の蛍光を消光することができる任意の分子である。クエンチャーは、蛍光性基からエネルギーを吸収して、エネルギーを例えば熱として散逸させることができる。したがって、蛍光性基からのシグナルは、低下するか又はなくなるであろう。したがって、蛍光性基と適当なクエンチャー分子が互いに密に接近して配置されれば、蛍光性基の蛍光は消光されるであろう。
クエンチャーは、それらが、最大で１００Å、好ましくは最大で７５Å、より好ましくは最大で５０Å、より一層好ましくは最大で２０Å、例えば最大で１０Å離れているとき、蛍光性基に密に接近しているといわれる。
本発明中で、ＦＲＥＴという用語は、フルオロフォアとクエンチャーとからなるペアも含む。したがって、本発明においてＦＲＥＴという用語は、エネルギーがフルオロフォアからクエンチャーへ移動して、熱及び／又は振動エネルギーのような不可視エネルギーとして放出されるフルオロフォア−クエンチャーペアと、エネルギーが１つの部分から他の部分へ移動して、１つの部分から他の部分へ移動したエネルギーよりも低いエネルギーの光（より長波長）として放出される古典的ＦＲＥＴペアとの２つのクラスのシグナリングペアを包含する。
クエンチャー分子の例には、ＤＡＢＣＹＬ、ＤＡＢＳＹＬ、ＴＡＭＲＡ、メチルレッド、ブラックホールクエンチャー−１、ブラックホールクエンチャー−２、エルクエンチャー及びＱＳＹ−７が挙げられるが、これらに限定されない。しかしながら、クエンチャー分子は、通常、蛍光性基に応じて選択されなければならない。
本発明のオリゴヌクレオチドアナログは、１態様において、シグナリングペアに加えて、１つ又は２つ以上の直接的又は間接的に検出可能な標識を含むことができる。シグナリングペアの１つの部分は、２つ以上の部分で構成されてもよいが、シグナリングペアの１つの部分は１つの部分のみを含むことが好ましい。蛍光クエンチャーシグナリングペアは、例えば、３つの部分で構成することができ、そこで２つの部分は、前記部分が組み合わされてシグナリングペアの１つの部分を構成し、第３の部分が他の部分を構成するように、相互に依存している。フルオロフォア部分は、例えば、米国特許出願２０００／６０３７１３０号に記載された短波長捕集部と長波長捕集部とで構成することができ、他の例は、ＷＯ２００５／０１９８１２に記載された、クエンチャー部分が表面探索基と固体表面の複合体である、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）により検出可能な標識ペアであるが、他の組合せも使用することができる。
シグナリングペアの部分は、通常、オリゴヌクレオチドアナログに共有結合で結合されている。シグナリングペアの部分は、主鎖モノマー単位、ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログの、例えば主鎖モノマー単位又は核酸塩基を含む任意の部分に、個別に共有結合で結合することができる。好ましくは、シグナリングペアの部分は、ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ、例えば、ヌクレオチドに個別に共有結合で結合される。したがって、シグナリングペアの部分は、主鎖モノマー単位のリボース部分に、主鎖モノマー単位のリン酸エステルに又は核酸塩基に、個別に結合することができる。シグナリングペアの部分は、オリゴヌクレオチドアナログの化学的若しくは酵素的合成に先立って、合成中に、又は合成後に前記ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログ中に組み込むことができる。それらは、本明細書中で先に言及した任意のリンカ−などの適当なリンカ−を使用して結合することができる。シグナリングペアの部分は、本発明のオリゴヌクレオチドアナログ中に好ましくは共有結合で挿入される。適当な方法は、当業者に利用可能であろう。
蛍光：エキシマー、エキシプレックス、ＦＲＥＴ及び電荷移動
エキシマーは、電子の励起状態では会合し、基底状態では解離性である、化合物の２量体である。単離された化合物が励起されたとき、それはその励起を解くことができるか又は同種の（励起されていない）他の化合物と会合することができて、それによりエキシマーが形成される。エキシマーは、モノマーの蛍光発光と異なった波長で蛍光を発する。エキシマーがその励起を解くとき、会合は最早有利ではなく、２つの種は解離するであろう。エキシプレックスは、エキシマーと似た２量体であるが、この場合は２つの化合物が異なっている。
分子内エキシマーは、１つの分子中に含まれる２つの部分、例えば、同一分子内の２つの多環芳香族基により形成される。同様な分子内エキシプレックスは、同一分子内に含まれる２つの部分により、例えば２つの異なる多環芳香族基により形成される。
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、２つの色素分子の電子励起状態間の距離依存性相互作用であり、光子の放出なしに、励起が供与体分子から受容体分子に移動する。ＦＲＥＴは、分子間距離にその６乗に反比例して依存し、生体高分子の大きさと比較し得る距離の範囲で有用になる。ＦＲＥＴが起こるためには、供与体と受容体とは必ず密に接近していることが好ましい。（典型的には、１０ないし１００Åの間、例えば１０ないし７５Åの間、例えば１０ないし５０Åの間、例えば１０ないし２０Åの間）。さらに、受容体の吸収スペクトルは、供与体の蛍光発光スペクトルと重なっていなければならない。供与体と受容体との遷移双極配向は必ずほぼ平行であることが、さらに好ましい。
本発明の方法の幾つかにおいて、発光された第１の色素の蛍光は第２の色素により吸収され、第２の色素は赤外領域にのみ発光するＦＲＥＴペアが使用される。これはフルオロフォアクエンチャー対と呼ばれる。
非ＦＲＥＴフルオロフォアクエンチャー対も記載されていて（米国特許出願２０００/６１５００９７号）、それは、クエンチャーによる消光の程度を説明するのに十分大きいスペクトルの重なりをクエンチャーが有しない、クエンチャーによるフルオロフォアの消光を含む。そのような非ＦＲＥＴ消光機構及びペアも、本発明中に組み込まれる。
電荷移動錯体は、電子供与体及び受容体と呼ばれる２つの分子内又は分子間の部分間の電荷移動を伴う弱い配位がある化学的錯体である。そのような２つの部分は遷移の間、観測可能な電荷移動吸収帯を示し得る。一例は、フェノール及びキノンの分子が正規の化学結合によっては一緒に保たれていないが、化合物の芳香族環系間の電荷移動により会合しているフェノキノンである。
ＦＲＥＴ
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、核酸をアッセイするための最も一般的な手段の一つになっている。それは、ＦＲＥＴが、大量高速処理自動化に向いていて、十分感度がよく、配列及び一塩基多型（ＳＮＰ）分析のための最適な方法になるからである。それに加えて、それは、ＤＮＡ及びＲＮＡの構造、動力学及び分子間相互作用を探査するために高度に有用である。
ＦＲＥＴは、励起が１つの部分（供与体分子）から他の部分（受容体分子）へ光子の放出なしに移動する、２つの色素の電子励起状態間の距離依存性相互作用である。ＦＲＥＴの効率は、分子間の隔たりの６乗に反比例して依存し、供与体分子と受容体分子との間の距離が非常に重要になる。したがって、ＦＲＥＴは、分子の近接に変化を生じさせる種々の生物学的現象を研究するための重要な技法である。
エネルギー移動の効率は、さらに、供与体及び受容体分子の配向、供与体の蛍光の量子収率、受容体の消光係数及び供与体の発光と受容体の吸収との間のスペクトルの重なりに依存する。
本発明の好ましいフルオロフォア−クエンチャーシグナリングペアは、次のものを含むが、これらに限定されない：
蛍光性基 クエンチャー
ＦＡＭ ＴＡＭＲＡ
ＴＥＴ ＴＡＭＲＡ
ローダミン ＴＡＭＲＡ
クマリン ＤＡＢＣＹＬ
ＥＤＡＮＳ ＤＡＢＣＹＬ
フルオレセイン ＤＡＢＣＹＬ
ルシファーイエロー ＤＡＢＣＹＬ
エオシン ＤＡＢＣＹＬ
ＴＡＭＲＡ ＤＡＢＣＹＬ
Ｃｙ３ ブラックベリークエンチャー６５０
ＴＡＭＲＡ ブラックベリークエンチャー６５０
テキサスレッド ブラックベリークエンチャー６５０
Ｃｙ５ ブラックベリークエンチャー６５０
Ｃｙ５．５ ブラックベリークエンチャー６５０
ＲＯＸ ブラックベリークエンチャー６５０
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ３５０ ＱＳＹ３５
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ ＱＳＹ３５
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６ ＱＳＹ３５
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ３５０ Ｄａｂｃｙｌ
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ Ｄａｂｃｙｌ
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６ Ｄａｂｃｙｌ
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６ ＱＳＹ７及びＱＳＹ９
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ ＱＳＹ７及びＱＳＹ９
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５５５ ＱＳＹ７及びＱＳＹ９
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８ ＱＳＹ７及びＱＳＹ９
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８ ＱＳＹ２１
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４ ＱＳＹ２１
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７ ＱＳＹ２１
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ３５０ ＢＨＱ−０
パシフィックブルー ＢＨＱ−０
マリーナブルー ＢＨＱ−０
アクリジン ＢＨＱ−０
Ｅｄａｎｓ ＢＨＱ−１
クマリン ＢＨＱ−１
Ｃｙ２ ＢＨＱ−１
ダンシル ＢＨＱ−１
Ａｌｅｘａ４８８ ＢＨＱ−１
ＦＡＭ ＢＨＱ−１
オレゴングリーン ＢＨＱ−１
ローダミングリーン−Ｘ ＢＨＱ−１
ＴＥＴ ＢＨＱ−１
Ａｌｅｘａ５３２ ＢＨＱ−１
ＶＩＣ ＢＨＱ−１
ＨＥＸ ＢＨＱ−１
ＣＡＬｆｌｏｕｒオレンジ５６０ ＢＨＱ−１
Ａｌｅｘａ５４６ ＢＨＱ−２
ＴＡＭＲＡ ＢＨＱ−２
ローダミンレッド−Ｘ ＢＨＱ−２
ＣＡＬｆｌｏｕｒレッド５９０ ＢＨＱ−２
Ｃｙ３．５ ＢＨＱ−２
ＲＯＸ ＢＨＱ−２
Ａｌｅｘａ５６８ ＢＨＱ−２
ＣＡＬｆｌｏｕｒレッド６１０ ＢＨＱ−２
Ａｌｅｘａ５９４ ＢＨＱ−２
ＣＡＬｆｌｏｕｒレッド６３５ ＢＨＱ−２
Ｐｕｌｓａｒ６５０ ＢＨＱ−２
Ａｌｅｘａ６４７ ＢＨＱ−２
Ｑｕａｓａｒ６７０ ＢＨＱ−２
Ｃｙ５ ＢＨＱ−３
Ｃｙ５．５ ＢＨＱ−３
本発明の古典的ＦＲＥＴシグナリングペアの好ましいペアは、次のものを含むが、これらに限定されない。
供与体 受容体
フルオレセイン テトラメチルローダミン
ＩＡＥＤＡＮＳ フルオレセイン
ＥＤＡＮＳ ＤＡＢＣＹＬ
フルオレセイン フルオレセイン
ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ
フルオレセイン ＱＳＹ７色素
フルオレセイン ＱＳＹ９色素
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ３５０ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５５５
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５５５ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５５５ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７
「ブラックホールクエンチャー」、「ＢＨＱ」、「パルサー」「クエーサー」、「ＣＡＬｆｌｏｕｒオレンジ」、「ＣＡＬｆｌｏｕｒレッド」は、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．の商標であり、オレゴングリーンはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．の商標であり、「ブラックベリー」はＢｅｒｒｙ ＆ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．の商標であり、「Ｃｙ２」、「Ｃｙ３．５」、「Ｃｙ５」及び「Ｃｙ５．５」は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ．の商標であり、「テキサスレッド」はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓの登録商標であり、「ＲＯＸ」はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．の商標である。
特に、本発明のオリゴヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドアナログは、ＦＲＥＴペアを含むことができる。供与体基は、５’末端に、３’末端に又は両末端に突出末端として付けることができる。少なくとも一つの受容体分子が突出末端として結合されることも好ましい。受容体分子は、５’末端に、３’末端に又は両末端に突出末端として付けることができる。好ましくは、１つの供与体基又は１つの受容体基が、オリゴヌクレオチドアナログの５’末端に突出末端として付けられることが好ましい。さらに、１つの供与体基が５’末端に突出末端として付けられれば、好ましくは、受容体基は内部に、又は３’末端に入れられる。逆に、１つの受容体基がオリゴヌクレオチドアナログの５’末端に突出末端として付けられれば、供与体分子は内部に、又は３’末端に入れられる。
したがって、供与体基及び受容体分子は、２つの部分を分離する配列がハイブリダイズしていないときに、受容体分子が、供与体基の励起又は励起の一部を受容し得るが、２つの部分を分離する配列が標的核酸にハイブリダイズしているときは、供与体基の励起を受容できないように、相互に関連して（互いに相互作用して）位置する。
疎水性分子を含まない対応するプローブに比較して、プローブの改善されたＳ／Ｎ比を得やすくするであろう、シグナリングペア及び少なくとも一つの疎水性分子を含むプローブを提供することは、本発明の好ましい態様である。
したがって、シグナリングペアと疎水性ヌクレオチドなどの少なくとも一つの疎水性分子とを含み、ハイブリダイゼーション条件下で十分相補的な標的にかけられない限り、自己ハイブリダイズするであろう（少なくとも一部は疎水性相互作用により）オリゴヌクレオチドアナログ（ステムレスビーコン）を提供することは、本発明の好ましい態様である。
フルオロフォア、対応するクエンチャー及び疎水性ヌクレオチドなどの少なくとも一つの疎水性分子を含み、プローブが結合していないときに、前記疎水性分子を含まない対応するプローブのバックグラウンドシグナルよりも望ましい、前記クエンチャー分子による前記蛍光性基の消光（より低いバックグラウンド）を得やすくするであろうオリゴヌクレオチドアナログ（ステムレスビーコン）を提供することは、本発明のより一層好ましい態様である。
フルオロフォア、対応するクエンチャー及び疎水性ヌクレオチドなどの少なくとも２つの疎水性分子を含み、プローブが結合していないときに、前記疎水性基を含まない対応するプローブのバックグラウンドシグナルよりも望ましい、前記クエンチャー分子による前記蛍光性基の消光（より低いバックグラウンド）を得やすくするであろうオリゴヌクレオチドアナログを提供することは、本発明のさらに最も好ましい態様である。
上記の特性は、例えば、前記疎水性ヌクレオチドのための適当な位置を選択することにより得ることができる（より詳細は本明細書中以下で参照されたい）。
したがって、疎水性ヌクレオチドなどの少なくとも２つの疎水性分子及びシグナリングペアを含み、前記シグナリングペアのスペクトル特性が、標的核酸へのハイブリダイゼーションで又は標的核酸増幅の結果として変化するオリゴヌクレオチドアナログを提供することは、本発明の好ましい態様である。好ましい態様において、スペクトルシグナルは、標的核酸がないか又は量が少ないときに低く、より多くの量の標的核酸が存在するときに高い。例えばＰＣＲによる標的配列の増幅反応中に使用されるとき、スペクトルシグナルは前記標的核酸配列の増加に対応して増大することが好ましい。
したがって、第３の配列により隔てられた第１の配列と第２の配列を含み、第１及び第３の配列は各々本発明の疎水性ヌクレオチドなどの少なくとも一つの疎水性分子を含み、スペクトルシグナルは、前記第１の配列が第２の配列に自己ハイブリダイズしているときに低く、それらがハイブリダイズしていないきに高いオリゴヌクレオチドアナログを提供することは好ましい。
第１の配列が例えばＦＲＥＴ、エキシマー若しくはエキシプレックスに対する供与体を含み、第２の配列が例えばＦＲＥＴ、エキシマー若しくはエキシプレックスに対する受容体を含んでもよく、又はその逆でもよいことも本発明に含まれる。好ましくは、前記供与体及び前記受容体は、第１の配列が第２の配列に自己ハイブリダイズしたときにＦＲＥＴが起こり得るように位置し、その結果第１の配列が第２の配列にハイブリダイズしたときだけ、ＦＲＥＴ蛍光が検出され得る。
さらに、二本鎖核酸及び／又は核酸アナログ例えばＤＮＡを構成するヌクレオチド又はヌクレオチドアナログの伸長生成物のハイブリダイゼーション又は形成も、オリゴヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドアナログと、及び場合により伸長を開始させるために使用されたオリゴヌクレオチドと、直接には会合していない標識を使用して検出することができる。
１態様において、そのような標識は、ヨウ化プロピジウム、アクリジンオレンジ、エチジウムブロマイド、ＬＣグリーン、ＳＹＢＲゴールド、ＳＹＢＲグリーンＩ、及びＳＹＢＲグリーンＩＩからなる群から選択されるが、これらに限定されない。蛍光性基の蛍光特性は、緩衝条件及び物理的要因により変調され得る。例えば、温度、イオン強度及びｐＨは、特定のフルオロフォアから得られる蛍光シグナルの強度に影響し得るパラメーターである。ピレンのエキシマーの蛍光に影響することも知られている物質の種々の化学基の例は、米国特許第５，４６６，５７８号に開示された親油性界面活性剤分子である。その著者らは、例えば、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムのような、炭素鎖が結合した第４級アンモニウム塩を含む界面活性剤のカチオン基の部分が、ピレンエキシマーで末端標識されたオリゴヌクレオチドからのシグナルを大きく増大させるために使用され得ることを教示している。
ピレンの特に２量体（又はそれを超える多量体）錯体の蛍光強度に対する界面活性剤の正の効果は、界面活性剤分子が２量体から水分子を押しのけて蛍光を消光するように作用することに基づく可能性があるので、他の親油性分子が蛍光強度に同様の効果を有する可能性がある。インターカレーター２量体から水を押しのけ得る親油性基及び他の分子は、標準的アッセイ緩衝液中にしばしば使用される。蛍光強度に影響することが示されているそのような分子の例は、トリトンＸ−１００、ドデシル硫酸ナトリウム、グリセロール及びＤＭＳＯである。
シグナル対ノイズ
本発明のＳ／Ｎ比は、本発明の全ての又は本質的に全てのオリゴヌクレオチドアナログが、相同相補的標的核酸にハイブリダイズしたときのシグナル強度（陽性シグナル）を、同量の前記オリゴヌクレオチドアナログがハイブリダイズしていないときのシグナル強度（十分相補的な標的核酸に、バックグラウンドシグナル）で除したものとして定義される。
Figure 0005284112
シグナル対ノイズ＝陽性シグナル／バックグラウンドシグナル
したがって、バックグラウンドシグナルは、例えば、標的核酸が存在しないとき、本発明の少なくとも一つの疎水性分子及びシグナリングペアを含むヌクレオチドアナログが自己ハイブリダイズしているとき、又は本発明の２つのヌクレオチドアナログが相互にハイブリダイズしているがそれらの標的核酸にはハイブリダイズしていないときである。
幾つかのシグナリングペアは、それらが強く相互作用するときに（結合していないプローブで）低いシグナルを、それらがそれほど強く相互作用しないときに（ハイブリダイズしたプローブで）高いシグナルを有するが、一方他のシグナリングペアは、シグナリングペアの２つの部分が強く相互作用するときに高いシグナルを、強く相互作用しないときに低いシグナルを有する。したがって、プローブで使用されるシグナリングペアに依存して、陽性シグナルは、バックグラウンドシグナルより有意に高いか又は低いかのいずれかであリ得ることは明らかである。１というＳ／Ｎ比は、プローブがハイブリダイズしているかいないかに関わらずシグナルが同じであることを示すので、Ｓ／Ｎ比はできるだけ１から離れていることが好ましい。「Ｓ／Ｎ比は、少なくとも一つの疎水性基を含まない対応するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログのＳ／Ｎ比より有意に高いか又は有意に低いかのいずれかである」ということは、少なくとも一つの疎水性基を含まない対応するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログのＳ／Ｎ比が１より高ければ、本発明のシグナリングペアと少なくとも一つの疎水性分子とを含むオリゴヌクレオチドアナログは、より一層高いＳ／Ｎ比を有し、また、少なくとも一つの疎水性基を含まない対応するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログのＳ／Ｎ比が１より低ければ、本発明のシグナリングペアと少なくとも一つの疎水性分子とを含むオリゴヌクレオチドアナログは、より一層低いＳ／Ｎ比を有することを意味する。より高い又はより低いＳ／Ｎ比は、「Ｓ／Ｎ比の値が１からさらに離れている」又は「値が１とはより大きく異なる」又は「改善された」とも記述される。
シグナリングペアの２つの部分は、オリゴヌクレオチドアナログ（例えばステムレスビーコン）が標的配列に結合していないときに互いに消光するならば（例えば、シグナリングペアがフルオロフォアとクエンチャーとから構成されていれば）、Ｓ／Ｎ比は、本発明の少なくとも一つの疎水性分子を含まない対応するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログに比較して、本発明の前記ステムレスビーコンにおいて高くなるはずである。
シグナリングペアの２つの部分のシグナルが、ステムレスビーコンが標的配列に結合していないときに上昇するならば（例えば、シグナリングペアが２つのフルオロフォアの古典的ＦＲＥＴペアからなれば）、Ｓ／Ｎ比は、本発明の前記ステムレスビーコンにおいて、少なくとも一つの疎水性分子を含まない対応するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログに比較して、低くなるべきである。
したがって、本発明のシグナリングペア及び少なくとも一つの疎水性分子を含み、Ｓ／Ｎ比が、前記の少なくとも一つの疎水性基を含まない対応するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログのＳ／Ｎ比よりも値１から有意に離れているオリゴヌクレオチドアナログを提供することは、本発明の好ましい態様である。
本発明のシグナリングペア及び少なくとも２つの疎水性分子を含み、Ｓ／Ｎ比が、前記の少なくとも２つの疎水性基を含まない対応するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログのＳ／Ｎ比よりも値１から有意に離れているオリゴヌクレオチドアナログを提供することは、より一層好ましい本発明の好ましい態様である。
１態様において、Ｓ／Ｎ比は、本発明のオリゴヌクレオチドアナログと標的核酸との低温及び高温におけるインキュベーション後のシグナルを測定して、低温で得られたシグナルを高温で得られたシグナルで除することにより測定される。低温は、オリゴヌクレオチドアナログとその標的配列との間のハイブリッドの融解温度より低い温度、例えば、１５℃ないし８０℃の範囲内、例えば１５℃ないし５０℃の範囲内、例えば５０℃ないし８０℃の範囲内、例えば２５℃ないし７０℃の範囲内、好ましくは１５℃ないし４０℃の範囲内、例えば２５℃ないし３５℃の範囲内の温度であるべきである。高温は、オリゴヌクレオチドアナログとその標的配列との間のハイブリッドの融解温度より高い温度、例えば５０℃ないし９５℃の範囲内、例えば６０℃ないし９５℃の範囲内、例えば６５℃ないし９０℃の範囲内の温度であるべきである。
Ｓ／Ｎ比がこのようにして測定され、シグナルがバックグラウンドシグナルより高いとき、Ｓ／Ｎ比は、好ましくは少なくとも４．５、例えば少なくとも５．０、例えば少なくとも５．５、例えば少なくとも５．８である。
好ましい態様において、Ｓ／Ｎ比は、本明細書中、下の実施例２に、又は実施例１０に記載したようにして測定される。
シグナルがバックグラウンドシグナルより低い態様において、Ｓ／Ｎ比は、例えば０．７５未満、例えば０．５未満、例えば０．２５未満である。
固相支持体
本発明のステムレスビーコンを固相支持体に結合すること、又は別の方法として、固相支持体に結合された核酸若しくは核酸アナログを検出するために前記ステムレスビーコンを使用することは、好ましい態様である。その際、混合物からの核酸又は核酸アナログとハイブリダイズした前記ステムレスビーコンの分離は、混合物から前記固相支持体を分離することにより、又は結合していない物質を洗浄除去することにより実施することができる。
所望の成果に依存して、異なる多くの種類の固相支持体が、本発明の方法に適している。
１態様において、固相支持体は活性化された表面である。活性化された表面は、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログの固相支持体への結合を容易にする。
固相支持体は、例えば、磁性ビーズ、アルミニウムビーズ、アガロースビーズ、セファロースビーズ、ガラス、プラスチック表面、重金属及びチップ表面からなる群から選択することができる。
磁性ビーズは、磁石を使用して懸濁液からビーズを分離することを可能にする磁性材料を含むビーズを含む。アルミニウムビーズは、ビーズを認識することを可能にするバーコード化ビーズを含む。しかし、コード化された及びコード化されていない他のビーズも、本発明で使用することができる。
アガロースビーズ及びセファロースビーズは、懸濁液から、例えば、遠心分離又は濾過により分離することができる。
プラスチック表面は、例えば、マイクロタイタープレート又は例えば診断に対して適当であり得る他のプラスチックデバイスを含む。
チップ表面は、任意の適当な材料、例えば、ガラス、樹脂、金属、ポリマーコートで被覆されたガラス、金属コートで被覆されたガラス、及び金属コートで被覆された樹脂で構成することができる。ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）センサープレートも利用可能であり、それは日本特許公開平１１−３３２５９５に記載されている。ＣＣＤも、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．１１，２１２４−２１２５に記載されているように利用可能である。
チップ表面は、ガラスプレート上のセルロース及び小ポリアクリルアミドゲルを含み、それにオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログを、ポリアクリルアミドとオリゴヌクレオチドとの間の共有結合又は非共有結合を形成させることにより、固定化することができる（Ｙｅｒｓｈｏｖ，Ｇ．，ほか（１９９６） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：４９１３）。
チップ表面は、Ｓｏｓｎｏｗｓｋｉ，Ｒ．Ｇ．，ほか（１９９７） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：１１１９−１１２３により記載されたシリカチップでもよい。そのようなチップは、シリカチップ上に微小電極のアレイを置くステップ、微小電極上にストレプトアビジン含有アガロース層を形成させるステップ、及びアガロース層を正に荷電させることにより、ビオチン修飾ＤＮＡフラグメントをアガロース層に結合させるステップを含むプロセスにより調製される。
さらに、チップ表面は、Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．，ほか（１９９６） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１０６１４−１０６１９に記載されたようにして調製することが出来、そのプロセスは、ＳＳＣ（即ち標準的塩化ナトリウム−クエン酸緩衝溶液）中でアミノ基修飾ＰＣＲ産物の懸濁液を調製するステップ、その懸濁液をスライドガラス上にスポットするステップ、スポットされたガラススライドをインキュベートするステップ、インキュベートされたスライドガラスを水素化ホウ素ナトリウムで処理するステップ、及びそのように処理されたスライドガラスを加熱するステップを含む。
さらに、固体材料を含むカラムを使用することができる。
疎水性分子又は疎水性ヌクレオチドを含むヌクレオチド
本発明の疎水性分子は、ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログの任意の部分に、及び／又はそれ自身の主鎖モノマー単位に共有結合で結合することができる。疎水性分子は、プローブの化学的又は酵素的合成に先立って、合成中に、又は合成後に、前記ヌクレオチド及び／若しくはヌクレオチドアナログ並びに／又は主鎖モノマー単位中に組み込むことができる。疎水性分子は、任意の適当なリンカ−を使用することにより、ヌクレオチド及び／若しくはヌクレオチドアナログ並びに／又は主鎖モノマー単位中に直接結合することができる。
しかし、上記のように、疎水性分子は主鎖モノマー単位に、場合によりリンカ−により、結合されることが好ましく、そこでは主鎖モノマー単位もリンカ−も核酸塩基を含まない。
次の一般構造の少なくとも一つの疎水性ヌクレオチドアナログを含むオリゴヌクレオチドアナログを提供することは、本発明の１局面である。
Ｘ−Ｙ−Ｑ
（式中、
Ｘは、核酸又は核酸アナログの主鎖中に組み込まれ得るヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ又は主鎖モノマー単位であり、
Ｑは本発明の疎水性分子であり；及び
Ｙは、前記ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ又は主鎖モノマー単位と前記疎水性分子とを結合させるリンカ−部分である。）
「核酸又は核酸アナログの主鎖中に組み込まれる」という用語は、疎水性ヌクレオチドが核酸及び／又は核酸アナログの配列中に挿入され得ることを意味する。
少なくとも一つの疎水性分子を含む前記オリゴヌクレオチドアナログを化学的に合成することができれば、それは本発明のより好ましい局面である。少なくとも一つの疎水性ヌクレオチドアナログを含む前記オリゴヌクレオチドアナログを、当業者に公知の化学反応を使用する自動ＤＮＡ合成機で合成することができれば、それはより一層好ましい。
本発明の多くの態様において、
Ｘ−Ｙ−Ｑ
（式中、
Ｘは、核酸又は核酸アナログの主鎖中に組み込まれ得るヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ又は主鎖モノマー単位であり、
Ｑは本発明の疎水性分子であり；及び
Ｙは、前記ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ又は主鎖モノマー単位と前記疎水性分子とを結合させるリンカ−部分である）
の一般構造の、少なくとも２つの疎水性ヌクレオチドアナログを含むオリゴヌクレオチドアナログを提供することは好ましい。
本発明のオリゴヌクレオチドアナログ（ステムレスビーコンなど）中に挿入された疎水性ヌクレオチドは、標的核酸への結合を有意に減少させることがないことは、本発明の好ましい態様である。多くのそのような改変が当業者に公知である。本発明の疎水性ヌクレオチドアナログが、次のものの１つの疎水性ヌクレオチド構造から構成されていることは、より一層好ましい：本明細書で先に示した、ヌクレオチドのリボース環の２’位における改変は、標的核酸（Ｙａｍａｎａ ほか（１９９１） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ｌｅｔｔ．６３４７−６３５０）及び／又はそれら自身の主鎖モノマー単位に結合されたインターカレーター（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ほか（２００４） Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ＆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ２３：２０７−２２５）に対する親和性を増大させることが既に示されている。
主鎖モノマー単位Ｘがオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログ中でホスホジエステル又はホスホジエステルアナログ結合を形成し得ることは好ましい態様である。
本発明の１態様において、疎水性ヌクレオチドは、例えば、国際特許公開ＷＯ０３／０５２１３２中の６４頁ないし１１５頁に記載されている構造１ないし３４７のインターカレーター擬ヌクレオチドのいずれであってもよい。
疎水性ヌクレオチドの性質に依存して、異なる製造方法が当業者には利用可能である。疎水性ヌクレオチドは、例えば、国際特許公開ＷＯ０３／０５２１３２中の１１５頁１４行目ないし１２１頁３０行目の「インターカレーター擬ヌクレオチドの調製」の項に記載されたインターカレーター擬ヌクレオチドの調製と同様な方法で調製することができる。当業者は疎水性分子がインターカレーターでない場合にプロトコルに適当な修正をすることができるであろう。
疎水性基を含むオリゴヌクレオチドアナログ
少なくとも一つの疎水性分子とシグナリングペアとを含むオリゴヌクレオチドアナログであって、前記オリゴヌクレオチドアナログが標的核酸にハイブリダイズしていない状態から標的核酸にハイブリダイズしている状態へ移るとき又はその逆のときの、前記オリゴヌクレオチドアナログのシグナルにおける変化が、前記オリゴヌクレオチドアナログと同じ配列からなり、前記疎水性分子を含まない対応するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログと前記標的核酸との間のハイブリッド（対応するハイブリッド）のシグナルにおける変化よりも有意に高い、オリゴヌクレオチドアナログを提供することは本発明の目的である。
好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドアナログは、ｎが少なくとも４の整数である、ｎ個のヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログを含む。ｎが少なくとも５、より好ましくは少なくとも６、より一層好ましくは少なくとも７であることが好ましい。例えば、ｎは４ないし１００の範囲内、例えば５ないし９０の範囲内、例えば７ないし１００の範囲内、例えば７ないし８０の範囲内、例えば７ないし６０の範囲内、例えば７ないし４０の範囲内、例えば７ないし３０の範囲内、例えば７ないし２０の範囲内、例えば１５ないし５０の範囲内の整数であってよい。１態様において、オリゴヌクレオチドアナログは、１個と１００個の間の核酸塩基又は核酸塩基アナログ、例えば５個と４０個の間の核酸塩基又は核酸塩基アナログ、例えば５個と３０個の間の核酸塩基又は核酸塩基アナログ、例えば５個と２５個の間の核酸塩基又は核酸塩基アナログ、例えば５個と２０個の間の核酸塩基又は核酸塩基アナログを含むことができる。本発明のオリゴヌクレオチドアナログが、例えば６個と２５個の間の核酸塩基又は核酸塩基アナログ並びに少なくとも一つの疎水性分子及びシグナリングペアを含むことはより好ましい。
本発明のオリゴヌクレオチドアナログが、例えば６個と２５個の間の核酸塩基又は核酸塩基アナログ並びに２個と６個の間の疎水性分子及び１つのシグナリングペアを含むことはより一層好ましい態様である。
疎水性分子は、所与のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログ中の任意の所望の位置に入れることができる。例えば、疎水性分子は、オリゴヌクレオチドアナログの末端に付けることができ、又は疎水性分子は、オリゴヌクレオチドアナログ中の内部の位置に入れることができる。
疎水性ヌクレオチドは、１つの末端から最大で９、例えば最大で８、例えば最大で７、例えば最大で６ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログの位置にあることが好ましい。
シグナリングペアの各々の部分は、疎水性ヌクレオチドよりもそれぞれ５’末端及び３’末端に近く位置することが好ましい。このように、疎水性分子は、シグナリングペアのいずれの部分よりも内部の位置を占めることが好ましい。
シグナリングペアの任意の部分は、任意の疎水性ヌクレオチドに対して、少なくとも１個、例えば２個、例えば３個、例えば４個、例えば５個、例えば５個を超える、例えば１ないし１０個の範囲内、好ましくは１ないし８個の範囲内、例えば１ないし６個の範囲内、例えば２ないし６個の範囲内のヌクレオチド／ヌクレオチドアナログが、シグナリングペアの任意の部分と任意の疎水性ヌクレオチドとを分離しているように位置することが好ましい。
好ましい態様において、オリゴヌクレオチドアナログは、１個と５個の間、例えば５個と１０個の間、例えば１０個と１５個の間、例えば１５個と２０個の間の疎水性ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドアナログが、少なくとも２個、例えば２個と５個の間の疎水性ヌクレオチドを含むことは非常に好ましい。
オリゴヌクレオチドアナログ中の疎水性分子は、互いに対して任意の位置に入れることができる。例えば、それらは、互いに隣り合って入れられてもよく、又はそれらは、１個、例えば２個、例えば３個、例えば４個、例えば５個、例えば５個を超えるヌクレオチドが、これらの疎水性分子を分離しているように、位置することができる。しかし、全ての疎水性ヌクレオチドは、疎水性ヌクレオチドではない少なくとも一つのヌクレオチド又はヌクレオチドアナログにより分離されていることが好ましい。
オリゴヌクレオチドアナログが、少なくとも２つの疎水性ヌクレオチドを含む態様において、それらは、前記オリゴヌクレオチドアナログの反対側の半分に位置することが好ましい。したがって、１つの疎水性ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドアナログの５’側の半分に位置し、他の疎水性ヌクレオチドはオリゴヌクレオチドアナログの３’側の半分に位置することが好ましい。
少なくとも２つの、好ましくはすべての疎水性ヌクレオチドは、１つの末端から最大で９個、例えば最大で８個、例えば最大で７個、例えば最大で６個のヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログの位置にあることが好ましい。
より好ましくは、少なくとも２つの疎水性ヌクレオチドは、それらそれぞれに最も近い末端から、最大で９個、例えば最大で８個、例えば最大で７個、例えば最大で６個のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログの位置で反対側の半分にある。したがって、末端からの好ましい最大距離は、オリゴヌクレオチドアナログの長さに依存し得る。
シグナリングペアのいずれの部分も、少なくとも一つの、より好ましくは少なくとも２つの、例えば全ての疎水性ヌクレオチドよりも、５’末端及び３’末端の近くに位置することはさらに好ましい。したがって、少なくとも１個、好ましくは２個、例えば全ての疎水性ヌクレオチドが、シグナリングペアのいずれの部分よりも内部の位置を占めることは好ましい。
本発明の非常に好ましい態様において、オリゴヌクレオチドアナログは、少なくとも２つの疎水性ヌクレオチドを含み、前記２つの疎水性ヌクレオチドは前記オリゴヌクレオチドアナログ中で対称的に位置する。したがって、前記の少なくとも２つの疎水性ヌクレオチドは、シグナリングペアのそれぞれの部分からおよそ同じ距離に、より好ましくは同じ距離に位置することが好ましい。
他の態様において、前記の少なくとも２つの疎水性ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドアナログの中央からおよそ同じ距離に、より好ましくは同じ距離に位置することが好ましい。
本明細書の文中で「およそ同じ距離」は、同数のヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログ＋／−１ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログだけ離れていることを意味する。
オリゴヌクレオチドアナログが、３個を超える疎水性ヌクレオチドを含む態様において、疎水性ヌクレオチドの各対は、シグナリングペアのそれぞれの部分からおよそ同じ距離、より好ましくは同じ距離、又はオリゴヌクレオチドアナログの中央からおよそ同じ距離、より好ましくは同じ距離のいずれかに位置することが好ましい。
オリゴヌクレオチドアナログが２つ以上の疎水性分子を含むとき、少なくとも１つの前記疎水性分子の位置が、前記オリゴヌクレオチドアナログが標的核酸にハイブリダイズしていない状態から標的核酸にハイブリダイズしている状態へ移るとき又は逆のときに、前記オリゴヌクレオチドアナログのシグナルの変化が、前記疎水性分子を含まない対応するハイブリッドのシグナルの変化よりも有意に高いことを確実にするような位置であることは、本発明の好ましい局面である。
前記オリゴヌクレオチドアナログの各半分に位置する少なくとも一つの前記疎水性ヌクレオチドアナログがあれば、それはより好ましい。一つの好ましい態様において、３’及び５’末端にそれぞれ１つの部分が位置する２つの部分で構成されるシグナリングペアを有するオリゴヌクレオチドアナログ中の第１の疎水性分子が３’近くに位置し、第２の疎水性分子は５’末端近くに位置し、即ち、それらの疎水性分子は、オリゴヌクレオチドアナログのそれらそれぞれの末端の任意の位置に入れることができ、場合により任意の位置に入れられた第３、第４、第５又はそれより多くの疎水性分子が含まれてよい。前記疎水性ヌクレオチドアナログは、シグナリングペアの１つの部分に隣接して、例えば、前記疎水性ヌクレオチドとシグナリングペアの最も近い部分とを分離する、１ヌクレオチド、例えば２ヌクレオチド、例えば３ヌクレオチド、例えば４ヌクレオチド、例えば５ヌクレオチド、例えば６ヌクレオチド、例えば７ヌクレオチド、例えば８ヌクレオチド、例えば９ヌクレオチド、例えば１０ヌクレオチド、例えば０個と１０個の間のヌクレオチドがあって、独立に位置することができる。
疎水性分子を含むオリゴヌクレオチドアナログのシグナルの変化が、前記オリゴヌクレオチドアナログが標的核酸にハイブリダイズしていない状態から標的核酸にハイブリダイズしている状態へ移るとき又はその逆のとき、前記疎水性分子を含まない対応するハイブリッドのシグナルの変化よりも有意に高くなるように、全ての疎水性分子が位置することはより好ましい。
したがって、疎水性分子を、同じオリゴヌクレオチドアナログに含まれる他の疎水性分子及びシグナリングペアの部分との関係で配置することは本発明の１局面である。したがって、本発明の、各部分が前記オリゴヌクレオチドアナログの各末端に位置する２つの部分を有するシグナリングペアと、一つの疎水性分子が前記オリゴヌクレオチドアナログの各半分に、シグナリングペアの最も近い部分に対して、前記シグナリングペアの他の部分への他の疎水性分子の距離と等しいか又はほぼ等しい距離で位置している２つの疎水性分子とを含むオリゴヌクレオチドアナログを提供することは、本発明の好ましい態様である。
各部分が前記オリゴヌクレオチドアナログの各末端に位置する２つの部分を有するシグナリングペアと、プローブが結合していないとき全ての疎水性分子が少なくとも一つの他の疎水性分子と疎水性相互作用を有して、この相互作用が前記のシグナリングペアの２つの部分を密に近接させるように、全ての疎水性分子が相互に関係して位置する、本発明の少なくとも２つの疎水性分子とを含むオリゴヌクレオチドアナログを提供することは、本発明のより一層好ましい態様である。
上記の性質は、例えば、上述の疎水性ヌクレオチドの配置により達成することができる。
本発明の幾つかの態様においては、疎水性ヌクレオチドアナログを、同じオリゴヌクレオチドアナログ配列の全ての他の疎水性ヌクレオチドアナログから分離している少なくとも一つのヌクレオチド又はヌクレオチドアナログが存在することが好ましい。これは、オリゴヌクレオチドの小領域中に高すぎる濃度の疎水性分子が存在すれば、標的配列に対する親和性を低下させる傾向があるという事実に基づく。
幾つかの疎水性分子、特に共役π電子を有するものであるが、他のものもまた、ＦＲＥＴ類似の機構又はＦＲＥＴ類似でない衝突機構のいずれかにより、フルオロフォアからの蛍光を消光することができるので、前記疎水性ヌクレオチドを全ての他の疎水性ヌクレオチドから及びシグナリングペアのどの部分からも分離している、少なくとも１個、例えば２個、例えば３個のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログがあることはより一層好ましい。このようにして、疎水性分子による消光及び親和性の減少は最小化される。
オリゴヌクレオチドアナログは、任意の種類のヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログ、例えば本明細書中で先に記載したヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログなどを含んでよい。したがって、オリゴヌクレオチドアナログは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ホモ−ＤＮＡ、ｂ−Ｄ−アルトロピラノシル−ＮＡ、ｂ−Ｄ−グルコピラノシル−ＮＡ、ｂ−Ｄ−アロピラノシル−ＮＡ、ＨＮＡ、ＭＮＡ、ＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＮＡ、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２’−ＮＨ）−ＴＮＡ、（３’−ＮＨ）−ＴＮＡ、α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、α−Ｌ−キシロ−ＬＮＡ、β−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、α−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、［３．２．１］−ＬＮＡ、ビシクロ−ＤＮＡ、６−アミノ−ビシクロ−ＤＮＡ、５−エピ−ビシクロ−ＤＮＡ、α−ビシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］−ＤＮＡ、ビシクロ［３．２．１］−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］アミド−ＤＮＡ、β−Ｄ−リボピラノシル−ＮＡ、α−Ｌ−リキソピラノシル−ＮＡ、２’−Ｒ−ＲＮＡ、２’−ＯＲ−ＲＮＡ、α−Ｌ−ＲＮＡ、α−Ｄ−ＲＮＡ、β−Ｄ−ＲＮＡのサブユニット及びそれらの混合物からなる群から選択される１つ又は２つ以上を含んでよい。
疎水性分子は水に容易に溶解せず、しかも本発明のハイブリダイゼーション及び／又は測定は水溶液中で起こることになるので、ステムレスビーコンに含まれ得る疎水性分子の数には上限がある。
したがって、アッセイで使用される緩衝水溶液中に容易に溶解する、本発明の少なくとも一つの疎水性基を含むオリゴヌクレオチドアナログを提供することは、本発明の好ましい態様である。
核酸塩基の数に比較して最大５０％の本発明の疎水性ヌクレオチドがあるオリゴヌクレオチドアナログを提供することは、本発明のより好ましい態様である。それは、オリゴヌクレオチドアナログ中に存在する２個の核酸塩基ごとに前記オリゴヌクレオチドアナログ中に存在する本発明の疎水性ヌクレオチドが最大１個存在し得ることを意味する。
前記オリゴヌクレオチドアナログの核酸塩基の数に比較して、最大で例えば５％と５０％の間、例えば５％と４５％の間、例えば１０％よ４５％の間、例えば１２％と４５％の間の本発明の疎水性基がある、オリゴヌクレオチドアナログを提供することは、本発明のより一層好ましい態様である。
水中の溶解度は、疎水性分子の疎水性に依存するであろう。疎水性分子がピレンであれば、オリゴヌクレオチドアナログは３ヌクレオチド／ヌクレオチドアナログ当たり最大で１個の疎水性ヌクレオチドを含むことが好ましい。疎水性分子がピレンよりも疎水性であれば（即ち、より高いｌｏｇＰを有すれば）、オリゴヌクレオチドアナログは４ヌクレオチド／ヌクレオチドアナログ当たり最大で１個の疎水性ヌクレオチドを含むことが好ましい。疎水性分子がピレンよりも疎水性でなければ（即ち、より低いｌｏｇＰを有すれば）、オリゴヌクレオチドアナログは２ヌクレオチド／ヌクレオチドアナログ当たり最大で１個の疎水性ヌクレオチドを含むことが好ましい。
しかしながら、本発明者らは疎水性分子を導入しており、本発明のステムレスビーコンが水溶液に可溶性であることは重要なので、主鎖モノマー単位が、ステムレスビーコンのオリゴヌクレオチドアナログ中に挿入後荷電していれば、それが好ましい。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドアナログの主鎖モノマー単位が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＨＮＡ、ＭＮＡ、ＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＮＡ、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２’−ＮＨ）−ＴＮＡ、（３’−ＮＨ）−ＴＮＡ、α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、α−Ｌ−キシロ−ＬＮＡ、β−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、α−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、［３．２．１］−ＬＮＡ、ビシクロ−ＤＮＡ、６−アミノ−ビシクロ−ＤＮＡ、５−エピ−ビシクロ−ＤＮＡ、α−ビシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］−ＤＮＡ、ビシクロ［３．２．１］−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］アミド−ＤＮＡ、β−Ｄ−リボピラノシル−ＮＡ、α−Ｌ−リキソピラノシル−ＮＡ、２’−Ｒ−ＲＮＡ、α−Ｌ−ＲＮＡ又はα−Ｄ−ＲＮＡ、β−Ｄ−ＲＮＡ及びそれらの混合物及びそれらのハイブリッド並びにそれらのリン原子改変物、特に荷電した主鎖を残す改変物から選択されることはより一層好ましい態様である。
本発明のステムレスビーコンは、均一系アッセイとも言われる密閉チューブアッセイにおける標的核酸の検出、同定及び定量に、特によく適している。これはまた、非対称性且つ競争的ＰＣＲアッセイ、並びにＰＣＲオープナー（ＰＣＲ ｏｐｅｎｅｒｓ）、ブロッカー、及び多くの他の改変ＰＣＲアッセイを含むアッセイも含む。さらに、本明細書で提示したステムレスビーコンの幾つかは、ヌクレアーゼ耐性なので、それらは、生きていてもいなくても、細胞、組織又は生物中の標的配列の検出、同定及び定量にも特によく適している。さらに他の態様において、本発明は、関心のある標的配列を検出、同定及び定量するために適した、支持体に結合した２つ以上のステムレスビーコンを含むアレイも目的とする。ステムレスビーコンは、それらが、第２の検出系を使用しないで、関心のある多数の試料を、迅速に調べる手段を提供するので、便利である。
合成核酸の標的核酸に対する高い親和性は、検出アッセイを大いに容易にし、さらに標的核酸に対する親和性の高い合成核酸は、遺伝子ターゲティング及び核酸の精製などの多くの他の目的に有用であり得る。疎水性基を含むオリゴヌクレオチドアナログは、幾つかの場合に、相同相補的核酸に対する親和性を向上させることが示されている。
少なくとも一つの疎水性分子を含むオリゴヌクレオチドアナログと本質的に相補的なＤＮＡとからなるハイブリッド（ＤＮＡハイブリッド）の融解温度が、前記の本質的に相補的なＤＮＡとそれに相補的なＤＮＡとのハイブリッドからなるデュープレックスの融解温度より有意に高くなり得ることは、本発明のオリゴヌクレオチドアナログのあるものの利点である。
したがって、本発明のオリゴヌクレオチドアナログは、天然に生ずる核酸よりも高い親和性でＤＮＡとのハイブリッドを形成することができる。融解温度は、好ましくは、１ないし３０℃、例えば５ないし２０℃、例えば１０ないし１５℃、例えば２℃ないし５℃、例えば５℃ないし１０℃、例えば１５℃ないし２０℃、例えば２０℃ないし２５℃、例えば２５℃ないし３０℃、例えば３０℃を超えて高く上昇する。
本発明の他の態様において、本発明の１つ又は２つ以上の疎水性分子を含むオリゴヌクレオチドアナログは、相同相補的核酸若しくは核酸アナログ又はオリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチドアナログに対するフーグスティーン型又は逆フーグスティーン型いずれかの塩基対形成により結合された前記オリゴヌクレオチドアナログからなる三重鎖構造（トリプレックス構造）を形成することができる。
本発明の他の好ましい態様において、前記オリゴヌクレオチドアナログは、前記トリプレックス構造中の前記フーグスティーン型塩基対の融解温度を上昇させることができる。
本発明のさらに他のより一層好ましい態様において、前記オリゴヌクレオチドアナログは、前記トリプレックス構造中のフーグスティーン型塩基対の融解温度を、プリンに富む・ピリミジンに富む核酸又は核酸アナログデュープレックス標的配列のような特定の配列制約の存在に依存しない様式で、上昇させることができる。したがって、前記トリプレックス構造中の前記フーグスティーン型塩基対は、前記オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログが疎水性分子を有しなければ、前記デュープレックス標的に対する前記フーグスティーン型塩基対の融解温度よりも有意に高い融解温度を有する。
したがって、本発明のオリゴヌクレオチドアナログは、天然に生ずる核酸よりも高い親和性で相同相補的な核酸若しくは核酸アナログ又はオリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチドアナログとトリプレックス構造を形成することができる。融解温度は、２ないし５０℃、例えば２ないし４０℃、例えば２ないし３０℃、例えば５ないし２０℃、例えば１０℃ないし１５℃、例えば２℃ないし５℃、例えば５℃ないし１０℃、例えば１０℃ないし１５℃、例えば１５℃ないし２０℃、例えば２０℃ないし２５℃、例えば２５℃ないし３０℃、例えば３０℃ないし３５℃、例えば３５℃超、好ましくは上昇する。
トリプレックス形成は、フーグスティーン型塩基対を形成した第３の鎖が標的デュープレックスに侵入して、同一の鎖の一部又は全体を置き換え、相補的な鎖とワトソン−クリック塩基対を形成する、鎖侵入というプロセスに進行することもあり、又は進行しないこともある。これは、幾つかの目的のために活用することができる。
オリゴヌクレオチドアナログが多形サイトの検出に使用されるためのものであれば、多形サイトは、オリゴヌクレオチドアナログの中央に位置し、好ましくは、オリゴヌクレオチドアナログの、最も中央に位置する１０個以内、例えば８個以内、例えば６個以内、例えば４個以内のヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログに位置することが好ましい。
多重化
標的配列を検出、同定又は定量するときに、陽性シグナルを受けることは、しばしば有利である。研究者は、しばしば、単に「試料中に遺伝子型Ａは存在するか？」と尋ねるのではなく、「試料中にどの遺伝子型が存在するのか？」という質問をする方がよい。したがって、適当な対照が実験に含まれることは大切である。定量化反応のための対照は、例えば、１つ又は２つ以上のハウスキーピング遺伝子を定量化するためであってもよい。同様に、突然変異に特異的なプローブのための対照は、野生型に対して特異的なプローブであってよい。アッセイにおいて、対照が同じ反応容器に添加されてよければ、対照及びアッセイの条件（の少なくとも大部分）が同じであることが保証され、したがって、このことは、並行実験を行うよりもしばしば有利である。２つ以上の実験がアッセイに含まれるとき、それは多重化アッセイであるといわれる。
プローブの特異性も、ミスマッチの性質に非常に依存する。ＳａｎｔａＬｕｃｉａは、「Ｇ・Ｃ」＞「Ａ・Ｔ」＞「Ｇ・Ｇ」＞「Ｇ・Ｔ」≧「Ｇ・Ａ」＞「Ｔ・Ｔ」≧「Ａ・Ａ」＞「Ｔ・Ｃ」≧「Ａ・Ｃ」≧「Ｃ・Ｃ」の順に安定性が減少する明確な傾向があることを示し、「Ｇ」は、それが最強の塩基対及び最強のミスマッチを形成するので、最も乱交雑（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）の塩基対であるとした（ＳａｎｔａＬｕｃｉａ ＆ Ｈｉｃｋｓ（２００４） Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．３３：４１５−４４０）。それに反して、「Ｃ」は、それが最強の対と最弱の３つのミスマッチとを形成するので、最もよく識別する核酸塩基であり、「Ａ」がそれに続く。したがって、単独のヌクレオチドの特異性の順は、次のようである：「Ｃ」＞「Ａ」＞「Ｔ」＞「Ｇ」。上記のように、ＤＮＡのメチル化状態は、亜硫酸水素塩で変換された一つの鎖のＤＮＡにおける「Ｃ」／「Ｔ」ミスマッチに、及び逆に、前記の変換されたＤＮＡのＰＣＲ増幅後の相補的な鎖における「Ｇ」／「Ａ」ミスマッチに翻訳されて、多くの突然変異も「Ｃ」の「Ｔ」へのトランジションである。したがって、１つのプローブが（例えば、メチル化されたＤＮＡに特異的な）、多型サイトに高度に選択性の「Ｃ」塩基を含み、他のプローブが（メチル化されていないＤＮＡに特異的な）多型サイトに「Ａ」を含むならば、それは最高に識別性である。これは最も効率的であるが、一方それは、２つのプローブが互いに高度に相同的であるであろうということを意味する。本発明の適当にデザインされたオリゴヌクレオチドアナログは、それらの完全に相補的なＤＮＡ標的に、他の遺伝的変異のための完全に相補性でないプローブに対するよりも強く結合する。１つのプローブ中に、他のプローブの疎水性分子に密に近接して位置するように位置した疎水性分子を含むオリゴヌクレオチドアナログの対は、前記相同相補的（しかし完全に相補的でない）プローブがハイブリダイズするものであった場合、この用途に極めてよく適している（図５を参照されたい）。
したがって、それぞれ本発明の少なくとも一つの疎水性ヌクレオチドなどの疎水性分子及びシグナリングペアを含み、異なる標的配列に対して個々に相補的である、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドアナログを同一アッセイ容器に供給することは本発明の１態様である。前記標的配列は標的配列又はその変異配列であってよい。
本発明の少なくとも一つの疎水性ヌクレオチドなどの疎水性分子及びシグナリングペアを含み、標的核酸又は標的核酸アナログと少なくとも一つの既知のその変異体の配列とを識別できる少なくとも２つのオリゴヌクレオチドアナログを提供することは本発明のより一層好ましい態様である。標的配列と既知の変異配列との間の変化は、突然変異、メチル化状態、欠失、挿入又は同様な小変化であってよい。
複数のステムレスビーコンの標識対からのシグナルが、同一容器中で使用された場合に、互いから識別され得ることは、本発明の１局面であるが、一方他の態様においては、融解温度又は物理的スポッティングのような他の物理的相違が、オリゴヌクレオチドアナログ（ステムレスビーコンなど）間を識別するために使用され得る。
プライマーの通常の１セットを使用して、１つのチューブ中で２つ以上のオリゴヌクレオチドアナログ（ステムレスビーコンなど）を多重化することは、本発明の他の局面である。より高度の複雑な多重化は、多くのより新しいリアルタイムＰＣＲ装置で可能であり、５又は６種までのフルオロフォアを同時に測定することができる。本発明のオリゴヌクレオチドアナログ（ステムレスビーコンなど）での多重化は、第一に、通常の分子ビーコンに比較して、「ステム」領域がないので、本発明のオリゴヌクレオチドアナログ（ステムレスビーコンなど）のより短い長さが、非特異的ハイブリダイゼーションのリスクを減少させるという理由で、さらに、配列中の内部に付け加えられた疎水性分子が、その配列が擬似的なプライマーの伸長を可能にする非特異的な鋳型として働くリスクを減少させるであろうという理由で、大部分の他の技法より容易であろう。
したがって、全て、本発明の少なくとも一つの疎水性ヌクレオチドなどの疎水性分子及びシグナリングペアを含み、単一多型サイトを含む配列間を識別できる、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドアナログを提供することも、本発明の好ましい態様である。増幅反応は好ましくは「密閉チューブ」中で起こる。
双方とも本発明の少なくとも一つの疎水性分子及びシグナリングペアを含み、標的配列と前記標的配列の単一点突然変異との間を識別でき、且つ増幅反応中に存在して、前記の増幅された配列のそれらそれぞれの鎖に相同相補的である２つのオリゴヌクレオチドアナログを提供することは、本発明のより一層好ましい態様である。増幅反応は、好ましくは、「密閉チューブ」中で起こる。前記変異が、メチル化の相違、「Ｃ」から「Ｔ」、「Ｔ」から「Ｃ」、「Ａ」から「Ｇ」又は「Ｇ」から「Ａ」へのトランジションである場合、一つのステムレスビーコンが高度に選択的な塩基「Ｃ」を多型サイトに含み、且つ他のプローブが「Ａ」を多型サイトに含めば、それが最も好ましい。
その他の方法及びアッセイ条件
ハイブリダイゼーションによる存在の検出、同定及び定量
本発明による、標的配列及び／又は変異配列の存在、同定並びに定量は、ハイブリダイゼーションに特異的なシグナルの強度、存在又は不存在により測定することができる。
ハイブリダイゼーションの程度の測定は、当技術分野に周知の任意の方法により実施することができる。検出可能なハイブリダイゼーションがなければ、ハイブリダイゼーションの程度は０であるといわれる。本発明のオリゴヌクレオチドアナログは、疎水性部分及びシグナリングペアを含み、ハイブリダイゼーションを直接検出するために使用することができる。
存在の検出、同定及び／又は定量のためのプローブとして使用することができるオリゴヌクレオチドアナログは、それらの標的核酸及び／又は核酸アナログと特異的相互作用をすることができなくてはならない。標的配列と変異配列との間を識別するときに、融解又は親和温度における相違は、一般的に使用することができるパラメーターである。この戦略を使用するとき、本発明の少なくとも一つの疎水性分子とシグナリングペアとを含むオリゴヌクレオチドアナログは、効率的な識別のための手段を提供する。前記オリゴヌクレオチドアナログ中の少なくとも一つのヌクレオチドがハイブリダイズしていないとき、そのハイブリッドの融解温度は、全てのヌクレオチドがハイブリダイズしているときの比較し得るハイブリッドの融解温度よりも低いであろう。
本発明の対応する標的核酸及び／又は核酸アナログ又はオリゴヌクレオチドアナログは、ハイブリダイズしているオリゴヌクレオチドアナログの存在を検出するために使用される幾つかの方法のいずれによっても標識することができる。本発明のオリゴヌクレオチドアナログの、２つ以上のシグナリングペアを含むものを使用するか又は含まないものを使用するかの選択は、必要とされる感度、特異性並びに他の要因に依存し得る。標識の選択は、感度、プローブとの結合の容易さ、安定性の要求、及び利用可能な装置に依存する。
検出プローブがＤＮＡ又はＲＮＡを含む状況を構想することができる。そのようなプローブは、標識の選択に依存して種々の方法で標識することができる。放射性プローブは、通常、所望の放射性同位体を含む市販のヌクレオチドを使用して作製することができる。放射性ヌクレオチドは、二本鎖プローブのニックトランスレーションにより；ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントを有する特異的インサートを有する一本鎖Ｍ１３プラスミドを放射性ｄＮＴＰの存在下でコピーすることにより；逆転写酵素を使用して放射性ｄＮＴＰの存在下でＲＮＡテンプレートからｃＤＮＡを転写することにより；ＳＰ６又はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して、放射性ＮＴＰの存在下でＳＰ６プロモーター又はＴ７プロモーターを含むベクターからＲＮＡを転写することにより；放射性ｄＮＴＰを含む通常のＰＣＲにより；ターミナルトランスフェラーゼを使用して放射性ヌクレオチドをプローブの３’末端につなぐことにより；又は［３２Ｐ］−ＡＴＰ及びポリヌクレオチドキナーゼを使用してプローブの５’末端をリン酸化することによりなど幾つかの手段によりプローブ中に組み込むことができる。
非放射性プローブは、しばしば間接的手段で標識される。一般に、１つ又は２つ以上のリガンド分子がプローブに共有結合で結合される。次にリガンドが、本来検出可能であるか又は検出可能な酵素、蛍光性化合物若しくは化学発光性化合物などのシグナル系に共有結合で結合されているかのいずれかである抗リガンド分子に結合する。リガンド及び抗リガンドは広く様々であってよい。リガンドに天然の抗リガンド、例えば、ビオチン、チロキシン及びコルチゾールなどが存在する場合、それは、標識された、天然に生ずる抗リガンドとともに使用することができる。あるいは、任意のハプテン又は抗原性化合物を抗体と組み合わせて使用することができる。
上記のように本発明のオリゴヌクレオチドアナログは、シグナル発生化合物に、例えば酵素又はフルオロフォアとの結合により、直接結合することもできる。標識として興味ある酵素は、主として加水分解酵素、特にホスファターゼ、エステラーゼ及びグリコシダーゼ、又は酸化還元酵素、特にペルオキシダーゼであろう。蛍光性化合物には、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンその他が含まれるが、これらに限定されない。化学発光性化合物には、ルシフェリン、ＡＭＰＰＤ（［３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３’−ホスホリルオキシ）−フェニル−１，２−ジオキセタン］）及び２，３−ジヒドロフタラジンジオン類例えばルミノールが含まれる。
ハイブリダイゼーション媒質又は抽出溶液中に存在する標識プローブの量は、広く変化してよい。一般に、標的核酸の化学量論量を上回る実質的過剰のプローブが、標的ＤＮＡへのプローブの結合速度を増大させるために使用されるであろう。本発明のオリゴヌクレオチドアナログの、特定の核酸に対する高親和性アニーリング特性及び／又は疎水性相互作用を探究することにより、実質的過剰のプローブを使用することは必要でなくすることができる。反応容器を市販の超音波処理器中に浸漬することによる超音波での処理は、ハイブリダイゼーション速度をしばしば加速することができる。
本発明の幾つかの態様において、非標識種又は過剰の標識剤は、検出が実施される前に除去される。除去は、後洗浄が容易に行える固相支持体（本明細書で先に記載した）に、プローブ又は標的のいずれかを固定化することにより行われることが多い。使用される特定のハイブリダイゼーション溶液に対して適当な温度及び時間でのハイブリダイゼーションの後、捕捉用プローブ（本発明のオリゴヌクレオチドアナログ）と対応する標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーション複合体が結合している支持体を、ハイブリダイゼーション溶液中に供給されたものと通常同様な試薬（例えば、塩化ナトリウム、緩衝剤、有機溶媒及び界面活性剤）を含む洗浄溶液中に導入する。これらの試薬は、ハイブリダイゼーション媒質と同様な濃度であってよいが、それらは、よりストリンジェントな洗浄条件が望まれるときには、より低い濃度であることが多い。支持体が洗浄溶液中に保たれる時間は、数秒から数時間以上と様々であってよい。ハイブリダイゼーション又は洗浄媒質いずれもストリンジェントであってよい。適当なストリンジェントな洗浄の後、正しいハイブリダイゼーション複合体を、標識の性質に合わせていよいよ検出することができる。
ステムレスビーコンは標識と直接結合される。例えば、標識が蛍光性である場合、ハイブリダイゼーション複合体基質と会合したステムレスビーコンは、特定波長の光での最初の照射により検出される。試料はこの光を吸収し、次に異なる波長の光を発し、それが検出器により受け取られる（Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅｒ，Ｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．（１９８２），ｐｐ．５３７−５４２）。標識が放射性である場合、試料は、Ｘ線フィルム又はホスホイメージャースクリーンその他に露光される。標識が酵素である場合、試料は、酵素にとって適当な基質でのインキュベーションにより検出される。生ずるシグナルは、着色した沈澱、着色した若しくは蛍光性の可溶性物質、又は生物発光若しくは化学発光による光子であってよい。
標識が酵素であるとき、酵素は、陽性の読みを示す着色した沈澱の生成を触媒することができることが好ましく、本発明の好ましい酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、コウシ腸アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼからなる群から選択することができる。例えば、アルカリホスファターゼは、インドキシルホスフェートを脱リン酸化して、次にそれが還元反応に関与して、テトラゾリウム塩を転化して強く着色した不溶性のホルマザンにする。
ハイブリダイゼーション複合体の検出は、対応する標識とオリゴヌクレオチドアナログとのハイブリッドへのシグナル発生複合体の結合を必要とすることがある。通常、そのような結合は、リガンド結合プローブとシグナルに結合した抗リガンドとの間などのリガンドと抗リガンドとの相互作用によって起こる。シグナル発生複合体の結合は、超音波エネルギーに曝すことによっても、加速され易い。
標識は、ハイブリダイゼーション複合体の間接的検出も可能にすることができる。例えば、標識がハプテン又は抗原である場合、抗体を使用して、試料を検出することができる。これらの系においては、抗体に結合している蛍光性若しくは酵素分子又は放射性標識がシグナルを発生する（Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐ．“Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，”Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｕｒｄｏｎ，Ｒ．Ｈ．，ｖａｎ Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ，Ｐ．Ｈ．，Ｅｄｓ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８５），ｐｐ．９−２０）。
エキシマー、エキシプレックス、ＦＲＥＴ錯体及び電荷移動錯体を含む数種類の蛍光を検出のために使用することができる。
幾つかの興味あるアッセイは、固相支持体に固定化された、疎水性分子を含むオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログのプローブの関与する、ハイブリダイゼーション及び蛍光に基づく検出アッセイである。これらの場合には、固定化されたプローブが、対応する標的核酸又は対応する標的核酸アナログにハイブリダイズして、それによりシグナルが発せられる。その後、過剰又は結合していない核酸又は核酸アナログの鎖が、ストリンジェントな洗浄により除去され、残留した標識が検出される。この方法は、点突然変異の遺伝子型解析及び発現プロファイルのために非常に適している。
標的核酸、標的核酸アナログ、及び変異配列間の融解温度による検出及び鑑別
本発明は、少なくとも一つの疎水性分子とシグナリングペアとを含むオリゴヌクレオチドアナログに関する。
本発明の１態様において、前記のオリゴヌクレオチドアナログは、混合物中に存在する如何なる他の核酸配列よりもその標的核酸に対して有意に高い親和性を有する。
本発明の好ましい態様において、検出手順は温度に依存し、前記オリゴヌクレオチドアナログに対して、標的核酸又は標的核酸アナログが有するよりも、低い親和性を有する核酸又は核酸アナログを除去するために、洗浄手順が使用されるアッセイを含む。
本発明の他の好ましい態様において、高い融解温度は混合物中における標的核酸の存在を示す。
より一層好ましい態様において、ハイブリダイゼーションの検出は、ストリンジェントな洗浄手順後に実施され、陽性シグナルは、混合物中における標的核酸の存在を示す。
ハイブリダイゼーションの程度の測定は、当技術分野において周知の任意の方法により実施することができる。本発明の少なくとも一つの疎水性分子を含むオリゴヌクレオチドアナログは、ハイブリダイゼーションを直接検出するために使用することができる。
本発明の１態様において、疎水性分子及び本発明のシグナリングペアを含む、幾つかの同一でないオリゴヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログは、混合物中の異なる標的核酸又は核酸アナログを対象として同時に使用することができて、その結果、前記オリゴヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドアナログの数に対応する数の核酸又は核酸アナログの検出を容易にする。
分光学的性質を使用する標的核酸、標的核酸アナログ、及び変異配列間の検出、定量及び／又は鑑別
本発明は、少なくとも一つの疎水性分子及びシグナリングペアを含み、前記シグナリングペアはモノマー蛍光及び／又は分子内エキシマー、及び／又は分子内エキシプレックス及び／又は分子内ＦＲＥＴ錯体及び／又は分子内電荷移動錯体を含む、オリゴヌクレオチドアナログに関する。
好ましい態様において、オリゴヌクレオチドアナログは、一つの部分が前記オリゴヌクレオチドアナログの１つの末端に又はそれに近接して位置し、他の部分は前記オリゴヌクレオチドアナログの他の末端に又はそれに近接して位置するシグナリングペアを含む。さらに、前記オリゴヌクレオチドアナログは、少なくとも２つの疎水性分子を、前記オリゴヌクレオチドアナログの各半分に１つずつ含み、前記疎水性分子は、標的核酸に結合していないときに、前記オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログと同じヌクレオチド配列からなり前記疎水性基を欠くオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログ中のシグナリングペアの相互作用よりも有意に望ましい前記のシグナリングペアの相互作用を助長することができる。したがって、少なくとも２つの疎水性分子を含むオリゴヌクレオチドアナログは、疎水性分子を含まない対応するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログよりも高いシグナル又は低いバックグラウンドシグナルを有するであろう。
対応する標的核酸及び／又は標的核酸アナログ及びそれらの変異体の存在を検出する方法
少なくとも一つの核酸塩基により如何なる他の配列とも異なっている可能性のある特定の標的配列を含む核酸又は核酸アナログを検出する方法であって、次のステップを含む方法を提供することは、本発明の一つの目的である：
ａ）突然変異があるか試験するために望ましい、核酸及び／又は核酸アナログの混合物を供給するステップ；及び
ｂ）前記の特定配列とハイブリダイズできる、少なくとも一つの疎水性分子とシグナリングペアとを含むオリゴヌクレオチドアナログを供給するステップ；及び
ｃ）前記オリゴヌクレオチドアナログと核酸又は核酸アナログを含む混合物とをハイブリダイゼーションを可能にする条件下でインキュベートするステップ；及び
ｄ）前記オリゴヌクレオチドアナログに対して標的配列よりも弱い親和性を有する配列を洗浄し去るステップ；及び
ｅ）標的配列の存在又は不存在を決定するステップ。
さらに、本発明は、特定の標的配列を含む核酸又は核酸アナログと変異配列を含む核酸との間を鑑別する方法を提供する。
好ましくは、ハイブリダイゼーション、測定又は分離のいずれも、高ストリンジェント条件で実施される。例えば、溶液中の分離は、例えば、電気泳動又はクロマトグラフィにより実施することができる。
高ストリンジェント条件化でハイブリダイゼーションを実施したときに、本発明の少なくとも一つの疎水性分子及びシグナリングペアを含むオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログと対応する標的核酸及び／又は核酸アナログとの間のハイブリダイゼーションのみがあることがより好ましい。
さらに他の好ましい態様において、本発明の少なくとも一つの疎水性分子を含むオリゴヌクレオチドアナログは、標的核酸及び／又は標的核酸アナログに相補的である。
さらに他の好ましい態様において、本発明の少なくとも一つの疎水性分子を含むオリゴヌクレオチドアナログは、標的核酸及び／又は標的核酸アナログの変異体に相補的である。
さらに好ましい態様において、本発明の少なくとも一つの疎水性分子を含む少なくとも２つのオリゴヌクレオチドアナログは、標的配列及びその少なくとも一つの既知の変異配列に個別に相補的である。
より好ましい態様において、本発明の少なくとも一つの疎水性分子を含むより多くのオリゴヌクレオチドアナログが、標的核酸及び／又は標的核酸アナログと僅か１つの位置で変化している全ての他の既知の核酸との間を鑑別するために使用される。標的核酸と見かけの近い核酸との間の変化は、例えば、突然変異、メチル化状態、欠失、挿入又は同様な小変化であってよい。最も好ましい態様において、本発明の少なくとも一つの疎水性分子を含むより多くのオリゴヌクレオチドアナログは、標的核酸及び／又は標的核酸アナログと既知のタイプのそれらの単一点突然変異との間を鑑別するために使用される。
好ましい態様において、標的核酸及び／又は標的核酸アナログとその変異体との間の鑑別は、分子間のエキシマー、エキシプレックス、ＦＲＥＴ錯体及び／又は電荷移動錯体の使用により実施される。
対応する標的核酸及び／又は標的核酸アナログ及びそれらの変異体の存在を、融解温度を使用して検出する方法
少なくとも１核酸塩基だけ任意の他の配列と異なっている可能性がある特定の標的配列を含む核酸又は核酸アナログを検出する方法であって、
ａ）変異があるか試験するために望ましい、核酸及び／又は核酸アナログの混合物を供給するステップ；及び
ｂ）少なくとも一つの疎水性分子及びシグナリングペアを含む、前記特定の標的とハイブリダイズし得るステムレスビーコンを供給するステップ；及び
ｃ）前記ステムレスビーコンと核酸又は核酸アナログを含んだ混合物とを、融解及び／又は親和温度の決定を可能にする条件下でインキュベートするステップ；及び
ｄ）標的配列の有無を決定するステップ
を含む方法を提供することは、本発明の一つの目的である。
他の好ましい態様において、本発明の少なくとも一つの疎水性分子及びシグナリングペアを各々含む、１つは標的核酸に特異的、１つは変異体核酸に対して特異的な、２つのステムレスビーコンが使用さる。
より好ましい態様において、前記の２つのステムレスビーコンは、互いに区別され得るシグナルを生ずる。
より一層好ましい態様において、本発明の少なくとも一つの疎水性分子及びシグナリングペアを含む標的核酸特異的オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログの高い融解及び／又は親和温度は、標的核酸が存在することを意味し、本発明の少なくとも一つの疎水性分子及びシグナリングペアを含む変異体核酸特異的オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログの高い融解及び／又は親和温度は、変異体核酸が存在することを意味する。
酵素的ステップを含む検出方法
本発明の、標的配列及び／又は変異配列の存在、同定又は定量は、酵素的ステップを含む方法により実施することができる。
したがって、１態様において、本発明は、標的配列及び／又は変異配列を検出、同定及び／又は定量する方法に関する。
本発明のより好ましい態様は、標的配列及び／又は変異配列を検出、同定及び／又は定量する方法であって、
ｇ）標的配列又は変異配列を検出、同定及び／又は定量するために使用するのに望ましい、核酸及び／又は核酸アナログの混合物を供給するステップ；及び
ｈ）前記標的配列及び／又は変異配列とハイブリダイズし得る本発明の１組のプライマー及びオリゴヌクレオチドアナログを供給するステップ；及び
ｉ）前記プライマー及びオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログと核酸及び／又は核酸アナログの前記混合物とを、前記プライマーの前記核酸及び／又は核酸アナログへのハイブリダイゼーションを可能にする条件下でインキュベートするステップ；及び
ｊ）前記のハイブリダイズした標的配列を、ヌクレオチド若しくはヌクレオチドアナログ又はオリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチドアナログとともに前記プライマーの３’末端の鋳型伸長に使用するステップ；及び
ｋ）少なくとも一つの疎水性分子を含む前記オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログをハイブリダイズさせて前記シグナリングペアのシグナル強度を測定するステップ；及び
ｌ）任意選択でステップｃ）ないしｅ）を繰り返すステップ
を含む方法に関する。
ハイブリダイゼーションは、高ストリンジェント条件下に実施することが好ましい。
ハイブリダイゼーションを高ストリンジェント条件下で実施したときに、本発明の少なくとも一つの疎水性分子を含むオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログと対応する標的核酸及び／又は標的核酸アナログとの間のハイブリダイゼーションのみがあることがより好ましい。
他の局面は、シグナリングペアのシグナル強度は、当業者により、前記標的及び／又は変異配列の存在、同定及び／又は定量に関連付けられ得ることである。
１態様において、本発明の方法は、標的配列及び／又は、標的配列と少なくとも１核酸塩基だけ異なる、好ましくは、標的配列と１ないし５核酸塩基の範囲だけ異なる変異配列を検出する。
より一層好ましい態様において、本発明の少なくとも一つの疎水性分子及びシグナリングペアを各々含む、１つは標的核酸に特異的、１つは変異体核酸に対して特異的な、２つのオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログが使用される。
本発明の他の態様において、本発明のオリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチドアナログ又は核酸及び／又は核酸アナログは、固相支持体に固定化することができる。次に、分離は、通常、高ストリンジェント条件下で１回又は２回以上の洗浄ステップにより実施される。
増幅のために使用される幾つかの酵素は、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログを、それが標的核酸の増幅中にハイブリダイズしていれば、分解することができる。そのような分解は、標的核酸の存在の検出のために使用することができる。
したがって、増幅のために使用される酵素によるヌクレアーゼ活性を受け易い本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログを提供することは好ましい態様である。
しかしながら、酵素的分解は、エンドポイント融解及び／又は親和性測定をするための可能性を、それ故そのような測定による結果を検証する能力を失わせるか又は低下させることもする。
したがって、本発明の少なくとも一つの疎水性分子及びシグナリングペアを含むオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログであって、前記の少なくとも一つの疎水性分子が、使用された酵素による前記オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログの酵素的分解を大きく阻害するように位置するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログを提供することは、本発明のより好ましい態様である。
本発明の少なくとも一つの疎水性分子及びシグナリングペアを含むオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログであって、前記の少なくとも一つの疎水性分子が、使用された酵素による前記オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログの酵素的分解を大きく阻害するように、且つＳ／Ｎ比が、前記疎水性基を含まない対応するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログに比較して増大するように位置するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログを提供することは、本発明のより好ましい態様である。
前記オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログが前記酵素工程によっても適度に不変であり、且つさらなる検証に使用され、又は測定のために再使用され得るならば、それは、本発明のより一層好ましい態様である。
標的核酸の量及び多型サイトにおける変異の有無の決定
本発明の１態様において、標的及び変異配列の量は、少なくとも一つの疎水性分子とシグナリングペアとを含むオリゴヌクレオチドアナログを含むアッセイの分光学的特性により、ハイブリダイゼーション後に測定される。
検出は、前記オリゴヌクレオチドアナログに結合された標識対を検出するか、又は他の標識を検出することにより間接的に、のいずれかで行うことができる。
本発明による変異の有無は、多くの異なるアッセイを使用して決定することができる。好ましくは、アッセイは融解温度を測定するか又は分光学的特性を測定するか又は両者の併用のいずれも包含する。
したがって、本発明の１態様において、変異の有無は、少なくとも一つの疎水性分子を含むオリゴヌクレオチドアナログの分光学的特性を、ハイブリダイゼーション後に測定することにより、決定される。
分光学的特性は蛍光特性であってよく、例えば、分光学的特性は、モノマー蛍光、エキシマー蛍光、エキシプレックス蛍光、ＦＲＥＴ及び電荷移動錯体のＵＶ吸収帯からなる群から選択することができる。
２つ以上の分光学的特性を測定することも可能であり、例えば、分光学的特性は、モノマー蛍光、エキシマー蛍光、エキシプレックス蛍光、ＦＲＥＴ及び電荷移動錯体蛍光からなる群から選択される２種以上であってよく、特に、分光学的特性は、モノマー蛍光及びエキシマー若しくはエキシプレックス若しくはＦＲＥＴ若しくは電荷移動錯体蛍光であってよい。
本明細書において上で論じたように、少なくとも一つの疎水性分子を含むオリゴヌクレオチドアナログ中のシグナリングペアの少なくとも２つの部分が、互いの関係で、それらが分子内エキシマー、分子内エキシプレックス、ＦＲＥＴ又は電荷移動錯体を形成し得るように位置するとき、次にこれら２つの部分を分離している核酸塩基対が塩基対をなすと、それは、前記部分が相互作用できず、その結果分子内エキシマー、分子内エキシプレックス、ＦＲＥＴ又は電荷移動錯体を形成し得ない結果を好ましくは生ずるであろう。疎水性分子は、標的配列とハイブリダイズしていないオリゴヌクレオチドアナログ中のシグナリングペアの部分の有意により有効な相互作用を保証して、分子内エキシマー、分子内エキシプレックス、ＦＲＥＴ又は電荷移動錯体を、疎水性分子が存在しないときよりも強くし、その結果、シグナリングペアの前記の２つの部分を分離している核酸塩基が塩基対をなすとき、分子内エキシマー、分子内エキシプレックス、ＦＲＥＴ又は電荷移動錯体における変化は、疎水性分子が存在しない場合よりも有意に大きくなるはずである。
したがって、少なくとも一つの疎水性分子を含むオリゴヌクレオチドアナログ中のシグナリングペア中の部分が互いの関係で、それらが分子内エキシマー、分子内エキシプレックス、ＦＲＥＴ又は電荷移動錯体を形成できるように位置するとき、エキシマーの蛍光、エキシプレックスの蛍光、ＦＲＥＴ又は電荷移動錯体のＵＶ発光帯が低いか又は本質的にないことは標的核酸の不在を示すとしてよく、高いエキシマーの蛍光、エキシプレックスの蛍光、ＦＲＥＴ又は電荷移動錯体のＵＶ発光帯は標的核酸の存在を示すとしてよく、逆もまた成り立つ。
実施例
次の実施例は本発明の選択された態様を例証するものであり、本発明を限定するものと見なされるべきではない。
実施例中、次の略語が用いられる：
ＯＤＮ：オリゴデオキシヌクレオチド
この実施例においては、どのように分子が描かれ、上記のプログラムＡＬＯＧＰＳ ２．１ ｈｔｔｐ：／／１４６．１０７．２１７．１７８／ｌａｂ／ａｌｏｇｐｓ／ｓｔａｒｔ．ｈｔｍｌ を用いてそのＳＭＩＬＥＳ記法及びＡＬＯＧＰｓ値が計算されるかを示す。
前記分子はＡＣＤ／Ｌａｂｓ ８．００リリースを用いて可視化される：製品バージョン８．１７、ビルド０４、２００５年５月。
疎水性分子ＡＬＯＧＰｓ値はメチル基の結合により計算される。ここで、該分子は該分子が疎水性ヌクレオチド等のヌクレオチドアナログ中に含まれている場合、通常、リンカー又は主鎖モノマー単位に結合される。ここで示される結合部分はどのようにも限定的な意味を有するものではない。メチル基を結合する理由は、リンカー又は主鎖モノマー単位がＮ−Ｈ結合のように完全に置換されていない場合、高度に双極性な基に結合することが多いということからである。そして、これは例えば該Ｎ−Ｈ結合がヌクレオチド又は前記疎水性分子を含んだ偽ヌクレオチド中に存在していない場合、疎水性に関する誤った結果をもたらす。
前記主鎖モノマー単位への通常の結合部位にメチル基を加えた天然ヌクレオチドのＡＬＯＧＰｓ値：
Figure 0005284112
上記構造は左から右に、メチル化核酸塩基：アデニン、シトシン、グアニン、チミン及びウラシルである。上記から明らかなように全核酸塩基は０を下回るＡＬＯＧＰｓ値を有しており、従って本発明の疎水性分子ではない。
リンカー又は主鎖モノマー単位への通常の結合部位にメチル基を加えた疎水性芳香族インターカレーターのＡＬＯＧＰｓ値。該メチル基の位置はここで示す例においては重要ではない。これらのいずれも本発明の疎水性分子であってよい：
Figure 0005284112
上記から明らかなように、共役系が大きいほどＡＬＯＧＰｓ値が高くなる。
リンカー又は主鎖モノマー単位への通常の結合部位にメチル基を加えた疎水性複素環式芳香族インターカレーターのＡＬＯＧＰｓ値。これらのいずれも本発明の疎水性分子であってよい。
Figure 0005284112
疎水性アルカン類及びアルケン類のＡＬＯＧＰｓ値。
Figure 0005284112
ここで明らかなように、アルカン類及びアルケン類の長さの増加に伴いＡＬＯＧＰｓ値が増加する。
一部のブラックホールクエンチャー、ＢＨＱの疎水性部分のＡＬＯＧＰｓ値及びＳＭＩＬＥＳ記法：
Figure 0005284112
Figure 0005284112
上に例示されたクエンチャーは疎水性であり、示された全例が２を超えるＡＬＯＧＰｓ値を有することが分かる。これが、本発明の疎水性分子が前記フルオロフォアと同じ側半分に位置することでステムレスビーコンの各末端に有るフルオロフォア及び疎水性クエンチャーの相互作用を増加させ得る理由である。該クエンチャーと該疎水性分子との間の疎水性相互作用は該フルオロフォア及びクエンチャーを互いに近接させ得る−このためバックグラウンド蛍光が減少する。
いくつかのフルオロフォアのシグナル生成部位のＡＬＯＧＰｓ値及びＳＭＩＬＥＳ記法：
Figure 0005284112
上に例示したフルオロフォアのいくつかは本発明によると０を上回るＡＬＯＧＰｓ値を有し、疎水性であることが分かる。本発明の疎水性分子はクエンチャーと同じ側半分に位置することでステムレスビーコンの各末端に有る疎水性フルオロフォアとクエンチャーとの相互作用を増加させ得る。該フルオロフォアと疎水性分子との間の疎水性相互作用はバックグラウンド蛍光を低下させる。
低バックグラウンド蛍光
測定は融解温度実験として、９６穴プレート内でＳｔｒａｔａｇｅｎｅリアルタイムＰＣＲ機器Ｍｘ３０００上にて行った。この測定は通常のリアルタイムＰＣＲ反応で用いられる緩衝液を反映した緩衝液内において行った。該緩衝液は４ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ，ｐＨ＝８．０、１μＬのステムレスビーコン（５ｐｍｏｌ／μＬ）及び２μＬの前記ＤＮＡ標的配列（５ｐｍｏｌ／μＬ）並びに２２μＬの上記緩衝液を含んだ。まず、該混合液を９５℃で１分間加熱し、二次構造を変性させた後、３５℃で２本鎖をアニールさせ、温度を９５℃まで、その変化ごとにシグナルを測定しながら上昇させた。結果を図２に示し、ステムレスビーコンの配列等の他の詳細をこの図の説明文に示した。
図２から明らかなように、両プローブが同一の最大蛍光を有する（３５℃）場合において、前記ステムレスビーコンは前記ステムレスＤＮＡプローブと比較して著しく低いバックグラウンド蛍光（非結合プローブの蛍光）を有する。また、疎水性分子を有する前記ステムレスビーコンのバックグラウンド蛍光（又はノイズ）は全温度範囲にわたって低く、一方でＤＮＡ基盤の前記プローブのバックグラウンド蛍光は低い温度でより高いことが明らかである。これはより低い温度において該プローブの動きが減少し、フルオロフォア及びクエンチャーの「衝突」頻度がより低くなったためと考えられる。
この実施例における２つのプローブは亜硫酸水素塩処理したＤＮＡ試料のメチル化及び非メチル化標的を区別するように設計されている。ＲＴ−ＰＣＲ実施中のこのプローブの好ましい読み取り温度は、完全に一致する標的（６７℃）及びミスマッチの標的（５６℃）に対するプローブの融解温度の中間であり、この場合６２℃となる。従って重要なのは、該プローブが読み取り温度において良好なＳＮ非を有することである。Ｓ／Ｎ比は次のように計算される：
Figure 0005284112
図１に示す例において、６２℃におけるＳ／Ｎ比は：
Figure 0005284112
いくつかのステムレスビーコンの高い親和性及び特異性
上記実施例２に記載されたように測定を行った。結果及び配列情報を図３及びこの図の説明文に示す。結果は温度に対するシグナルの一次導関数として示す。
図３は、インターカレート疎水性分子の挿入を有するステムレスビーコンがそのＤＮＡ同等物よりも高い特異性を達成するように設計され得ることを示す。示した例においてステムレスビーコン、ＳＢは６３．７℃及び４９．９℃という１３．８℃異なった温度でそれと一致した、及びミスマッチの標的にそれぞれハイブリダイズするが、前記ＤＮＡは６４．９℃及び５７．１℃という７．８℃しか異ならない温度でそれと一致した、及びミスマッチの標的にそれぞれハイブリダイズする。特異性は従ってこのステムレスビーコンのほうが標的配列に対して同一の親和性を有するステムレスＤＮＡプローブよりも７７％高い（一致した標的に対する親和性対ミスマッチの標的に対する親和性の差として測定）。
ＰＣＲアッセイ中のプライマー及びプローブの試験及び最適化
この実施例に記載したプロトコルは２つの遺伝子型Ａ及びＢを複数の読み取り（１サイクル中で４回超の読み取り）を行うことが可能なリアルタイムＰＣＲ機器を用いて区別するためのものである。この種の機器の例としてはＳｔｒａｔａｇｅｎｅのリアルタイムＰＣＲ機器Ｍｘ３０００Ｐが上げられ、これを本研究に用いた。
下記の方法を用いることにより、選択したアニーリング温度において前記プライマーが前記鋳型に対して機能するかを、両プローブに対する読み取り温度も個別に最適化しつつ試験することが可能である。測定自体を密接に関連した遺伝子型間の識別に用いることが出来る。
１．光学ＰＣＲチューブ（ｏｐｔｉｃａｌ ＰＣＲ−ｔｕｂｅ）に１０μＬの２ｘＰＣＲマスターミックス、１μＬのフォワード側プライマー（１０ｐｍｏｌ／μＬ）、１μＬのリバース側プライマー（１０ｐｍｏｌ／μＬ）、１μＬの遺伝子型Ａ特異的ステムレスビーコン（５ｐｍｏｌ／μＬ）、１μＬの遺伝子型Ｂ特異的ステムレスビーコン（５ｐｍｏｌ／μＬ）、５μＬのＨ２Ｏ及び１μＬのＤＮＡ（１００ｐＧ−２０ｎＧ／μｌ）を加える。
２．可能なら上記のように目的の標的それぞれに対し２つのチューブを準備し、１個が遺伝子型Ａ、及び１個が遺伝子型Ｂのものとする。もしこれらのコントロールが入手出来なければ、単に未知の試料を加えたチューブを準備する。
３．（ほとんどのモデルがそうであるように蛍光を蓋を通して測定するリアルタイムＰＣＲ機器を用いる場合は）光学蓋（ｏｐｔｉｃａｌ ｌｉｄ）で、又はチューブの側面若しくは底面を通して読み取りを行う機械を用いる場合は単に標準的な蓋で前記チューブを密閉する。
４．前記チューブを前記リアルタイムＰＣＲ機器に設置し、次のプログラムを実施する（図６に説明）：
ａ．ホットスタートポリメラーゼを用いる場合、製品説明書に従ってこれを活性化するか、又は単に９５℃で１分間加熱し、二次構造を除去する；そして、
ｂ．次に、下記の工程を４５サイクル行う：
ｉ．９５℃にて３０秒間変性する；そして、
ｉｉ．前記プライマー及びプローブを（例えば５０℃にて）１：００分間アニールし、エンドポイント又は連続蛍光測定；そして、
ｉｉｉ．温度を２℃ずつ上昇させ、エンドポイント蛍光測定を行う。可能な限り短い時間間隔を用いる（試料の数と位置とに依存）；そして、
ｉｖ．工程ｉｉを約７０℃に達するまで反復する；そして、
ｖ．７２℃において３０秒間伸長する；そして、
５．データを分析する−この標的の将来的なリアルタイムＰＣＲ実験における使用のためのこのプローブの最適な蛍光読み取り温度は、前記ステムレスビーコンが完全に相補的な標的のみにハイブリダイズし、可能な限り高いシグナルを示す温度である。両プローブに対して個別の読み取り温度が見いだされる。
異なる温度段階における蛍光の相違の例及びこのプロトコルがどのように将来的なその特定の標的のＲＴ−ＰＣＲの実施を最適化するのに用いられるかを図８に示す。この例では１本の密閉されたチューブ内で２種のステムレスビーコンを用いて多重化することについても説明している。
プライマー及びプローブの試験及び最適化、エンドポイント測定
この節ではエンドポイント親和性測定を本発明のステムレスビーコンを最適化するために、また２つの遺伝子型ＡとＢとの間を識別するために、どのように用いることが出来るかを記載する。この方法は特に、例えばＣｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ’ｓ Ｒｏｔｏｒｇｅｎｅ（登録商標）３０００、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、及び毎秒３℃以上の温度変化（冷却）速度を有する他の高温度変化速度リアルタイムＰＣＲ機器、等の高い温度変化速度を有するリアルタイムＰＣＲ機器に適しているが、標準的なリアルタイムＰＣＲ機器においても実施することが出来る。この実施例のこの方法に基づく測定はＣｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ’ｓ Ｒｏｔｏｒｇｅｎｅ（登録商標）３０００上で行った。
１．光学ＰＣＲチューブに１０μＬの２ｘＰＣＲマスターミックス、１μＬのフォワード側プライマー（１０ｐｍｏｌ／μＬ）、１μＬのリバース側プライマー（１０ｐｍｏｌ／μＬ）、１μＬの遺伝子型Ａ特異的ステムレスビーコン（５ｐｍｏｌ／μＬ）、１μＬの遺伝子型Ｂ特異的ステムレスビーコン（５ｐｍｏｌ／μＬ）、５μＬのＨ２Ｏ及び１μＬのＤＮＡ（１００ｐＧ−２０ｎＧ／μｌ）を加える；そして、
２．可能なら上記のように目的の標的それぞれに対し２個のチューブを準備し、１個に遺伝子型Ａを含んだＤＮＡ、及び１個に遺伝子型Ｂを含んだＤＮＡを入れる。もしこれらのコントロールが入手出来なければ、単に未知の試料を加えたチューブを準備する；そして、
３．（ほとんどのモデルがそうするように蛍光を蓋を通して測定するリアルタイムＰＣＲ機器を用いる場合は）光学蓋で、又はＲｏｔｏｒｇｅｎｅ（登録商標）（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ株式会社，オーストラリア）がそうであるようにチューブの側面を通して読み取りを行う機械を用いる場合は単に標準的な蓋を用いて前記チューブを密閉する；そして、
４．前記チューブを前記リアルタイムＰＣＲ機器に設置し、次のプログラムを実施する（図７に説明）：
ａ．ホットスタートポリメラーゼを用いる場合、製品説明書に従ってこれを活性化するか、又は単に９５℃で１分間加熱し、二次構造を除去する；そして、
ｂ．次に、下記の工程を用いて増幅を４５サイクル行う（注釈８を参照）：
ｉ．９５℃にて１０秒間変性する；そして、
ｉｉ．前記プライマー及びプローブを（例えば５０℃にて）１５秒間アニールし、エンドポイント蛍光を読み取る；そして、
ｉｉｉ．任意にさらなる１又は２種類の温度において蛍光を読み取る；そして、
ｉｖ．７２℃において２０秒間伸長する；そして、
ｂ．エンドポイント親和性試験を次の方法で行う：
ｉ．９５℃にて１５秒間変性する；そして、
ｉｉ．７２℃から開始し、前回のアニーリングよりも１℃低い温度で１５秒間アニーリングする。エンドポイント蛍光を読み取る；そして
ｉｉｉ．上記２つの工程を２７回反復する（７２℃から４５℃）；そして、
５．データを分析する−この標的の将来的なリアルタイムＰＣＲ実験における使用のための最適な蛍光読み取り温度は、完全に相補的な標的にハイブリダイズした前記ステムレスビーコンの蛍光が「テイクオフ（ｔａｋｅ ｏｆｆ）」し始める温度とミスマッチの標的にハイブリダイズした前記ステムレスビーコンの蛍光が「テイクオフ」し始める温度との中間である。見いだされた温度は同様な設定を用いた将来的な測定における読み取りポイントとして用いることが出来る。ここに記載されたもののような親和性測定は類似した標的間を識別するための極めて鋭敏な方法である。
前記エンドポイント、親和性測定が将来的な同一の標的のためのＲＴ−ＰＣＲの実施を最適化するのにどのように用いられ得るか、また該親和性測定が２つの極めて類似した標的を区別するのにどのように非常に有力であるかの例を図９にす。
ＨＯＸＢ５における単一のＣｐＧのメチル化状態の検出
試験はＨＯＸＢ５遺伝子内の単一のＣｐＧサイトのメチル化、非メチル化、及び「ヘテロ接合体」を識別することが可能かどうか調べるために設定された。この実施例における測定はＣｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ’ｓ Ｒｏｔｏｒｇｅｎｅ（登録商標）３０００上で行った。
標的、プライマー及びプローブ
［配列番号１０］
フォワード側プライマー：５’−１ＴＴＴＧＴＴＴＡＧＡＧＧＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＴＴＴＴＴ
［配列番号１１］
リバース側プライマー：５’−１ＴＣＡＡＡＡＡＡＴＡＡＴＴＣＡＴＡＣＴＣＴＡＴＡＡＴＴＡＣ
［配列番号１２］
非メチル化特異的プローブ：ＨＥＸ−ＴＴ１ＡＡＡＡＡＣ１ＣＡＡＴＴＣ１ＡＡＴ１Ａ−ＢＨＱ１
［配列番号１３］
メチル化特異的プローブ：ＦＡＭ−ＴＴ１ＧＡＡＴＣＧ１ＧＴＴＴ１Ｔ−ＢＨＱ１
前記標的配列はＨｅＬａ又はＢＬ１３のいずれかからあらかじめ増幅した亜硫酸水素塩処理ＤＮＡ（外側プライマー：５’−１ＧＧＧＡＧＴＴＡＧＴＡＧＧＧＡＧＧＴＡＧＴ［配列番号１４］及び５’−１ＴＡＡＡＡＡＡＴＣＡＣＲＴＡＣＴＴＴＴＡＴＴＡＡＣＣ［配列番号１５］）中に含まれた。シーケンスデータにより、これまでにＨｅＬａは目的の多型サイトにおいてメチル化されていることが示されており、一方ＢＬ１３はメチル化されていないことが示されている。標的ＤＮＡを含んだ３６試料が、純粋なＨｅＬａ；純粋なＢＬ１３；又はＨｅＬａ及びＢＬ１３の亜硫酸水素塩処理ＤＮＡの１：１混合物；のそれぞれ１２ずつから調製された。該標的を各３つずつ、４つの異なった希釈（１０、１００、１，０００、又は１００，０００倍）で用いた。１という表示は挿入された偽ヌクレオチド、即ち疎水性のインターカレート分子のピレンを含んだ疎水性ヌクレオチド（（Ｓ）−１−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチルオキシ）−３−ピレンメチルオキシ−２−プロパノールのホスホルアミダイト）を意味する。ＦＡＭ及びＨｅｘはフルオロフォア、及びＢＨＱ１はクエンチャーである。
ＱＰＣＲの設定
フォワード側プライマー １μＬ（１０．０ｐｍｏｌ／μＬ）
リバース側プライマー １μＬ（１０．０ｐｍｏｌ／μＬ）
プローブ（ＦＡＭ） １μＬ（１２．５ｐｍｏｌ／μＬ）
プローブ（Ｈｅｘ） １μＬ（１２．５ｐｍｏｌ／μＬ）
Ｈ２Ｏ ５μＬ
２ｘマスターミックス、Ｐｒｏｍｅｇａ １０μＬ
ＤＮＡ鋳型 １μＬ（希釈情報については上記参照）
リアルタイムＰＣＲプロファイル
用いたリアルタイムＰＣＲプロファイルを図１４Ａに示す。
結果
前記リアルタイムＰＣＲ中の蛍光測定のいずれを用いても、１個を除いた全ての試料を正確に決定することが出来た。全試料が前記親和性分析により正確に決定された。１試料については増幅しなかった。
ヒトアンドレノーゲン受容体のヌクレオチド２０７４におけるＳＮＰの検出
用いたプローブの組み合わせが野生型とＡからＧへのトランジション変異とを区別し得るか確かめるため、試験を設定した。この実施例における測定はＣｏｒｂｅｔｔ ＲｅｓｅａｒｃｈのリアルタイムＰＣＲ機器Ｒｏｔｏｒｇｅｎｅ（登録商標）３０００上において行った。
標的、プライマー及びプローブ
［配列番号１６］
フォワード側プライマー：５’−ＴＣＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧＣＴＣＡＡＧ
［配列番号１７］
リバース側プライマー：５’−ＡＴＣＴＣＴＧＣＣＡＴＣＡＴＴＴＣＣＧ
［配列番号１８］
Ｗｔ特異的プローブ：ＦＡＭ−Ｔ１ＣＡＡＡ１ＡＧＴＧＡ１ＡＣＴＧ１ＡＴ−ＢＨＱ１
［配列番号１９］
Ｍｕｔ．特異的プローブ：ＨＥＸ−２ＴＣＡＡＡ２ＡＧＣＧＡ２ＡＣＴＧ２ＡＴ−ＢＨＱ１
この実験においてはｍｕｔ．特異的プローブをｗｔ．特異的プローブとともに均一アッセイに加えた。１という表示は挿入された偽ヌクレオチドまたは疎水性のインターカレート分子のピレン（上記からの番号ＸＩＩ）を含んだ疎水性ヌクレオチド（（Ｓ）−１−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチルオキシ）−３−ピレンメチルオキシ−２−プロパノールのホスホルアミダイト）を意味する。２という表示は挿入された偽ヌクレオチド又は疎水性ヌクレオチド（３−（１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−２−Ｏ−（２−シアノエチルジイソプロピルアミドホスファイト）−１，２−ブタンジオール）−４−Ｎ−（７，９−ジメチル−３Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−オン）のホスホルアミダイト）（上記の番号ＸＸＶＩのインターカレート疎水基を含む）を意味する。ＦＡＭ及びＨｅｘはフルオロフォア、及びＢＨＱ１はクエンチャーである。
前記鋳型：それぞれＬＮＣａｐ（突然変異体）及び／又はＴＨＰ（ｗｔ）から抽出されたｃＤＮＡを含んだ２試料（全体で６試料）。
ＱＰＣＲの設定
フォワード側プライマー １μＬ（１０．０ｐｍｏｌ／μＬ）
リバース側プライマー １μＬ（１０．０ｐｍｏｌ／μＬ）
プローブ（ＦＡＭ） １μＬ（１２．５ｐｍｏｌ／μＬ）
プローブ（Ｈｅｘ） １μＬ（１２．５ｐｍｏｌ／μＬ）
Ｈ２Ｏ ５μＬ
２ｘマスターミックス、Ｐｒｏｍｅｇａ １０μＬ
ＤＮＡ鋳型 １μＬ
リアルタイムＰＣＲプロファイル
用いたリアルタイムＰＣＲプロファイルを図１４Ｂに示す。
結果
５５℃において、ｗｔ特異的プローブは前記野生型標的及び前記突然変異体の両者に結合したが、前記ｍｕｔ．特異的プローブは特異的にその標的にハイブリダイズした。
６１℃においては、野生型ではｗｔプローブからの特異的なシグナルのみが得られるように基準値を調整することが出来、またｍｕｔ．特異的プローブはうまく機能した。
６５℃においては、前記ｗｔ．特異的プローブはその特異的標的にのみ結合し、一方前記突然変異型特異的プローブはもはや結合しなかった。
ＦＡＭチャンネルにおけるエンドポイント親和性測定においては、前記ｗｔ特異的プローブが前記ＴＨＰｃＤＮＡのみにハイブリダイズし、前記ＬＮＣａｐにはハイブリダイズしない約５度の範囲（ｗｉｎｄｏｗ）（６１℃から６６℃）があることが示された。
ＨＥＸチャンネルにおけるエンドポイント親和性測定においては、前記ｍｕｔ．特異的プローブを用いて、前記の完全に相補的な標的への結合を単一ヌクレオチドミスマッチの標的への結合と区別することが、５５℃超の温度における少なくとも１０℃の範囲で極めて容易であることが示された。
結論
組み合わせで用いたプローブではヒトアンドレノーゲン受容体のヌクレオチド２０７４に見いだされるＡからＧへのトランジション変異を検出することが出来た。前記ＦＡＭ標識プローブは６１℃から６６℃の範囲において特異的であり、一方前記ＨＥＸ標識プローブは５５℃及び６３℃の間の温度において特異的であった。
ここに記載されたエンドポイント親和性解析が核酸の極めて小さな変化の特異的検出に用られ得るということがこの場合も示された。この方法は、増幅を最適な条件下において行い、続いて親和性測定を行うことが出来る均一な（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）ものである。
リアルタイムＰＣＲ及び疎水性ヌクレオチドのポジショニング
序論
この実施例は疎水性ヌクレオチドのポジショニングと関連した蛍光シグナル強度について説明する。
材料
Figure 0005284112
標的配列のプローブ、プライマー
［配列番号２０］
Ｂｇａｌｐｒｏｂ＿０１：５’−Ｆａｍ １ＡＣ ＣＧＡ ＣＣＣ ＡＧＣ ＧＣＣ Ｃ１ ＢＨＱ１−３’
［配列番号２１］
Ｂｇａｌｐｒｏｂ＿０２：５’−Ｆａｍ Ａ１Ｃ ＣＧＡ ＣＣＣ ＡＧＣ ＧＣＣ １Ｃ ＢＨＱ１−３’
［配列番号２２］
Ｂｇａｌｐｒｏｂ＿０３：５’−Ｆａｍ ＡＣ１ ＣＧＡ ＣＣＣ ＡＧＣ ＧＣ１ ＣＣ ＢＨＱ１−３’
１＝構造Ｘ−Ｙ−Ｑの疎水性ヌクレオチドであり、ここでＸは前記オリゴにホスホルジエステル結合により結合した主鎖モノマー単位であって構造−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−を有し、Ｙは−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−リンカーであり、Ｑは１’−ピレンである。
プライマー
［配列番号２３］
Ｂｇａｌ＿ＳＮＰ０１＿Ｆ：５’−ＣＧＧ ＴＴＡ ＣＧＡ ＴＧＣ ＧＣＣ ＣＡＴ ＣＴＡ ＣＡＣ−３’
［配列番号２４］
Ｂｇａｌ＿ＳＮＰ０１＿Ｒ：５’−ＣＡＧ ＣＡＣ ＣＡＴ ＣＡＣ ＣＧＣ ＧＡＧ ＧＣ−３’
結果／結論
図１０から明らかなように、前記シグナリングペアの近傍へのＩＰＮｓのポジショニングによって蛍光シグナルが著しく減少する。しかし、前記シグナリングペアと第１の疎水性ヌクレオチドとの間に１個のヌクレオチドを有するだけでシグナルが著しく向上し、２つのヌクレオチドを間に有するとさらに高いシグナルが産生される。従って、疎水性ヌクレオチドを前記（フルオロフォア部位）シグナリングペアの最近傍の隣に（ａｓ ｎｅｘｔ ｎｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｕｒｓ）有しないようにすることは本発明の好ましい態様である。
エンドポイント添加及び標的の検出
序論
この実施例では標的核酸へのプローブの添加を前記標的核酸の存在の検出にどのように用い得るかを説明する。
材料及び方法
まず、特定のプライマー及びマスターミックスを用い：
Figure 0005284112
この混合物を下記の増幅プロファイルにかけ：
Figure 0005284112
標的核酸を増幅した。
その後、２．００μｌの次のプローブをそれぞれの増幅反応に加えた（下表の１１番はプローブ添加無し）。
［配列番号２５］
Ｂｇａｌｐｒｏｂ＿０２ ５’−Ｆａｍ Ａ１Ｃ ＣＧＡ ＣＣＣ ＡＧＣ ＧＣＣ １Ｃ ＢＨＱ１−３’
［配列番号２６］
Ｂｇａｌｐｒｏｂ＿０３：５’−Ｆａｍ ＡＣ１ ＣＧＡ ＣＣＣ ＡＧＣ ＧＣ１ ＣＣ ＢＨＱ１−３’
［配列番号２７］
Ｂｇａｌｐｒｏｂ＿０５：５’−Ｆａｍ ＡＣＣ Ｇ１Ａ ＣＣＣ ＡＧＣ １ＧＣ ＣＣ ＢＨＱ１−３’
［配列番号２８］
Ｂｇａｌｐｒｏｂ＿ｒｅｆ：５’−Ｆａｍ ＡＣＣ ＧＡＣ ＣＣＡ ＧＣＧ ＣＣＣ ＢＨＱ１−３’
１＝構造Ｘ−Ｙ−Ｑの疎水性ヌクレオチドであり、ここでＸは前記オリゴにホスホルジエステル結合により結合した主鎖モノマー単位であって構造−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−を有し、Ｙは−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−リンカーであり、Ｑは１’−ピレンである。
そして最後に、図１１の下部に示したプロファイルを用いて親和性測定を行った。
結果及び結論
図１１から、示した親和性測定プロファイルを用いた標的核酸のエンドポイント検出に対して、示した全てのプローブが使用出来ることが明らかである。疎水性ヌクレオチドを含んだ前記ステムレスビーコンは、前記のＤＮＡ基盤のプローブと比べ、標的核酸に対する高い親和性及び高い蛍光シグナル強度を有することも明らかである。
追加
次のプローブを同様な反応において比較することにより：
［配列番号２９］
Ｂｇａｌｐｒｏｂ＿０１：５’−Ｆａｍ １ＡＣ ＣＧＡ ＣＣＣ ＡＧＣ ＧＣＣ Ｃ１ ＢＨＱ１−３’
［配列番号３０］
Ｂｇａｌｐｒｏｂ＿０５：５’−Ｆａｍ ＡＣＣ Ｇ１Ａ ＣＣＣ ＡＧＣ １ＧＣ ＣＣ ＢＨＱ１−３’
［配列番号３１］
Ｂｇａｌｐｒｏｂ＿ｒｅｆ：５’−Ｆａｍ ＡＣＣ ＧＡＣ ＣＣＡ ＧＣＧ ＣＣＣ ＢＨＱ１−３’
１＝構造Ｘ−Ｙ−Ｑの疎水性ヌクレオチドであり、ここでＸは前記オリゴにホスホルジエステル結合により結合した主鎖モノマー単位であって構造−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−を有し、Ｙは−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−リンカーであり、Ｑは１’−ピレンである。
図１２から明らかなように、前記シグナリングペアの近傍への疎水性ヌクレオチドのポジショニングはこの種類の測定においても蛍光シグナルを著しく減少させる。
ステムレスプローブの１本鎖オリゴ標的への親和性
序論
この実施例は、構造：Ｘ−Ｙ−ＱにおいてＸが前記オリゴにホスホルジエステル結合により結合した主鎖モノマー単位であって構造−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−を有し、Ｙが−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−リンカーであり、Ｑが１’−ピレンである構造：Ｘ−Ｙ−Ｑの疎水性修飾を有するステムレスビーコンが、完全に相補的な標的配列に対して、前記疎水性修飾を含まないプローブよりも高い親和性をどのように有するか説明したものである。
材料及び方法
次のプローブを試験した：
［配列番号３２］
Ｂｇａｌｐｒｏｂ＿１：５’−Ｆａｍ １ＡＣ ＣＧＡ ＣＣＣ ＡＧＣ ＧＣＣ Ｃ１ ＢＨＱ１−３’
［配列番号３３］
Ｂｇａｌｐｒｏｂ＿２：５’−Ｆａｍ Ａ１Ｃ ＣＧＡ ＣＣＣ ＡＧＣ ＧＣＣ １Ｃ ＢＨＱ１−３’
［配列番号３４］
Ｂｇａｌｐｒｏｂ＿５：５’−Ｆａｍ ＡＣＣ Ｇ１Ａ ＣＣＣ ＡＧＣ １ＧＣ ＣＣ ＢＨＱ１−３’
［配列番号３５］
Ｂｇａｌｐｒｏｂ＿６：５’−Ｆａｍ ＡＣＣ ＧＡ１ ＣＣＣ ＡＧ１ ＣＧＣ ＣＣ ＢＨＱ１−３’
［配列番号３６］
Ｂｇａｌｐｒｏｂ＿７：５’−Ｆａｍ ＡＣＣ ＧＡＣ １ＣＣ Ａ１Ｇ ＣＧＣ ＣＣ ＢＨＱ１−３’
［配列番号３７］
Ｂｇａｌｐｒｏｂ＿ｒｅｆ：５’−Ｆａｍ ＡＣＣ ＧＡＣ ＣＣＡ ＧＣＧ ＣＣＣ ＢＨＱ１−３’
オリゴ標的配列：
Ｂｇａｌ＿ＷＴ＿ｔａｒ：５’−ＡＡＣ ＧＧＧ ＣＧＣ ＴＧＧ ＧＴＣ ＧＧＴ ＴＡＣ−３’
プロファイル
Figure 0005284112
混合液
Figure 0005284112
結果及び結論
図１３から、全ステムレスビーコンは前記の相補的なオリゴヌクレオチド標的に対し、対応するＤＮＡとの比較において同等の又はより高い親和性を有していることが明らかである。さらに、この実施例に示した全てのステムレスビーコン（プローブ＿１を除く）は疎水性修飾を有しない前記ＤＮＡプローブと比較して同等の又はより高いＳ／Ｎ比を有していることが計算され得る（２５度におけるシグナルを９０度におけるシグナルで割ったもの）。
Ｓ／Ｎ比
Figure 0005284112
Ａ）相補的標的が存在しない場合、前記ステムレスビーコンの前記疎水性分子は互いに相互作用しようとし、フルオロフォア（点を打ったボール）及びクエンチャー（黒い四角形）を互いに近接させる。そのため、該フルオロフォアは消光される。Ｂ）相補的標的が例えば増幅反応中に添加され又は形成された場合、該ステムレスビーコンは広がってそれに結合する。Ｃ）該ステムレスビーコンがその相補的標的に結合している際、前記フルオロフォア及びクエンチャーはもはや互いに近接しておらず、従ってフルオロフォアは蛍光を発する。 ステムレスＤＮＡ（ＴａｑＭａｎ（登録商標）様）配列（黒い記号、ＦＡＭ−ＡＡＡＡＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＣＴＣＣ−ＢＨＱ１）［配列番号１］と、下記からの疎水基ＸＸＶＩを含んだ疎水性分子（２と表される；３−（３，４−ジヒドロキシブチル）−７，９−ジメチルピリド［３’，２’：４，５］チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オンのホスホルジエステルの挿入）を有する４つの偽ヌクレオチドの挿入を含む対応するステムレスビーコン（白い記号、ＦＡＭ−Ａ２ＡＡＡ２ＡＴＣＣＣＧ２ＣＧＡ２ＡＣＴ−ＢＨＱ１）［配列番号２］とを、それらの一致した（ダイヤモンド、ＧＣＧＧＧＡＧＴＴＣＧＣＧＧＧＡＴＴＴＴＴＴＡＧ）［配列番号３９］及びミスマッチの（四角形、ＧＴＧＧＧＡＧＴＴＴＧＴＧＧＧＡＴＴＴＴＴＴＡＧ）［配列番号４０］ＤＮＡ標的に対してそれぞれハイブリダイズさせた際の解離曲線。ステムレスビーコン、ＳＢのバックグラウンド蛍光は前記ＤＮＡプローブからのものよりもずっと低いことが明らかである。前記標的オリゴヌクレオチドには、前記ＤＮＡのみ、又は前記ＳＢ及びＤＮＡプローブの両方が前記領域にハイブリダイズする場合に１本又は２本線のアンダーラインがそれぞれ付されている。ハイブリダイゼーション領域におけるミスマッチは灰色で強調されている。「２」という表示は下記の番号ＸＸＶＩのインターカレート疎水基（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｇｒｏｕｐ）を含んだ挿入偽ヌクレオチド（３−（１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−２−Ｏ−（２−シアノエチルジイソプロピルアミドホスファイト）−１，２−ブタンジオール）−４−Ｎ−（７，９−ジメチル−３Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−オンのホスホルアミダイト）を意味する。 一致した標的（ダイヤモンド、ＣＣＧＣＡＡＡＡＡＡＡＣＧＣＣＣＴＡＡＡＡＴＣＣＣ）［配列番号５］及びミスマッチの標的（四角形、ＣＣＧＣＡＡＡＡＡＡＡＣＡＣＣＣＴＡＡＡＡＴＣＣＣ）［配列番号６］とアニールした、ステムレスビーコン（ＳＢ、白い記号、ＦＡＭ−Ｔ２ＡＧＧ２ＧＣＧＴ２ＴＴＴＴ２Ｔ−ＢＨＱ１）［配列番号３］の解離曲線に対する負の導関数（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）を、ステムレスＤＮＡ、ＴａｑＭａｎ（登録商標）様プローブ（黒い記号、ＦＡＭ−ＡＴＴＴＴＡＧＧＧＣＧＴＴＴＴＴＴＴＧ−ＢＨＱ１）［配列番号４］と比較したもの。前記ＤＮＡ内には６つ分多くの相補的核酸塩基が存在しているが、前記ＳＢは相補的な標的に対し同様に強く結合し、この結合はより特異的である。前記ＳＢは一致した及びミスマッチの標的に対しそれぞれ６３．７℃及び４９．９℃でハイブリダイズし、１３．８℃の差異を生じているが、前記ＤＮＡは一致した及びミスマッチの標的に対しそれぞれ６４．９℃及び５７．１℃でハイブリダイズし、７．８℃の差異しか生じていない。前記標的オリゴヌクレオチドには、前記ＤＮＡのみ、又は前記ＳＢ及びＤＮＡプローブの両方が前記領域にハイブリダイズする場合に１本又は２本線のアンダーラインがそれぞれ付されている。ハイブリダイゼーション領域におけるミスマッチは灰色で強調されている。ＳＢのシグナルがより強いのはそれらのバックグラウンド蛍光がより低いためである。「２」という表示は下記の番号ＸＸＶＩのインターカレート疎水基を含んだ挿入偽ヌクレオチド（３−（１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−２−Ｏ−（２−シアノエチルジイソプロピルアミドホスファイト）−１，２−ブタンジオール）−４−Ｎ−（７，９−ジメチル−３Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−オン）のホスホルアミダイト）を意味する。 Ａ）相補的ＤＮＡ標的が存在しないか、又は少ししか無い場合の部分的に相補的なステムレスビーコン、ＳＢ。この２つのプローブは互いに結合し及び／又はそれら自身で折りたたまれ、それにより蛍光が消光される。メチル化検出部位（多型サイト）及び該プローブ間のミスマッチの部位を淡い灰色のバーで強調する。Ｂ）相補的ＤＮＡ標的が増幅工程中に添加又は形成された場合、前記ＳＢはそれに対して他のＳＢに対する結合よりも優先的に結合する。Ｃ）その結果として前記標的に相補的な前記ＳＢは蛍光を発することが出来、従って検出出来るが、他のＳＢはそれ自身で折りたたまれ、自身の蛍光を消光する。 この図は、全ての非メチル化デオキシシトシン（ｄＣ）をデオキシウラシル（ｄＵ）に変換し、メチル化されたｄＣはｄＣとして変化させない、ゲノムＤＮＡの亜硫酸水素塩処理について説明したものである。Ａ）亜硫酸水素ナトリウムのｄＣとの化学反応、Ｂ）ゲノムＤＮＡ、Ｃ）亜硫酸水素塩処理した非メチル化ＤＮＡ、及びＤ）単一のメチル化ＣｐＧデュプレットを有する亜硫酸水素塩処理ＤＮＡ。中央の太いバーは該ＣｐＧデュプレットを強調しており、他の全てのバーはゲノムＤＮＡ内のｄＣの位置及びｄＵへの変化を強調している。 各工程において蛍光を測定しながら徐々に温度を上昇させた際の増幅プロファイル。まず、前記ＤＮＡポリメラーゼを製品アドバイスに従い活性化させる。次に、４５サイクルの増幅を行う。該サイクルはアニーリング及び最初の測定（例えば５０℃）を含み、その後温度を例えば２度のステップで次第に上昇させ、各段階で蛍光を測定する。通常の伸長温度、例えば７２℃に達するまでこれを反復する。各測定段階の時間は可能な限り短くする必要がある。中に「終了」と書かれた虫眼鏡及びその縁の「１」は、その段階の終わりに蛍光が１回測定されたことを表す。 エンドポイント親和性読み取り（ｅｎｄｐｏｉｎｔ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｒｅａｄｉｎｇｓ）を用いた増幅プロファイル。まず、前記ＤＮＡポリメラーゼを製品説明書に従い活性化する。次に前記ＤＮＡ領域を、最適アニーリング温度（例えば５０℃）及び任意に追加の読み取りポイント（ｒｅａｄｉｎｇ ｐｏｉｎｔ）（例えば５５℃及び６０℃）を用いて増幅する。これを十分な増幅が生ずるまで反復する。その後、エンドポイント親和性測定を行うが、ここでは２本の鎖をオルタナティブに（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ）（９５℃までにおいて）変性し、次いで冷却（例えば最初の工程において７２℃まで）を、冷却を行うたびに徐々に（例えば１工程当たり１℃）温度を下げながら行う。この与えられた工程において前記混合物が選択された温度にまで冷却されるごとにシグナルを測定し、前記プローブがその標的にアニールできるよう短時間そのまま維持する。これを、両プローブが少なくともそれらの相補的な標的に結合する水準の所望の温度（例えば４５℃）に達するまで反復する。中に「終了」と書かれた虫眼鏡及びその縁の「１」は、その段階の終わりに蛍光が１回測定されたことを表す。 この図は、図６に示したプロトコルを用いてどのように完全に相補的な標的（メチル化ＤＮＡ）及びミスマッチの標的（非メチル化ＤＮＡ）からの蛍光を識別出来るかを示す。４５℃及び５９℃までにおいてはメチル化プローブ（ＦＡＭ−Ａ２ＡＡＡ２ＡＴＣＣＣＧ２ＣＧＡ２ＡＣＴ−ＢＨＱ１）［配列番号７］は前記のミスマッチの標的にも少量結合するが、６１℃及び７１℃までにおいては該プローブの結合は完全に相補的な標的に対して特異的である。将来的な測定においては６１℃の読み取りポイントをこのプローブに対して用いることが出来る可能性がある。多型的なサイトを灰色で強調した。「２」という表示は下記の番号ＸＸＶＩのインターカレート疎水基を含んだ挿入偽ヌクレオチド（３−（１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−２−Ｏ−（２−シアノエチルジイソプロピルアミドホスファイト）−１，２−ブタンジオール）−４−Ｎ−（７，９−ジメチル−３Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−オン）のホスホルアミダイト）を意味する。 図７に示したプロトコル、及びＦＡＭ標識（ＦＡＭ−ＴＴ１ＧＡＡＴＣＧ１ＧＴＴＴ１Ｔ−ＢＨＱ１［配列番号８］又はＨＥＸ標識（ＨＥＸ−ＴＴ１ＡＡＡＡＡＣ１ＣＡＡＴＴＣ１ＡＡＴ１Ａ−ＢＨＱ１）［配列番号９］されたプローブのいずれかを用いて、どのように完全に相補的な標的（この例ではメチル化ＤＮＡ）及びミスマッチの非標的（この例では非メチル化ＤＮＡ）からの蛍光シグナルを区別できるかを示した例。両プローブは４５℃及び５０℃の間で特異的にアニールする。将来的な測定においては両プローブにおいて４６℃の読み取りポイントを用いることが望ましいと思われる。記載されたプロトコルを用いれば２つの関連した標的を、この例ではメチル化ＤＮＡを非メチル化ＤＮＡから、区別することが容易であることが様々なプロファイルから明らかである。各プローブの多型的なサイトを灰色で強調した。「１」という表示は疎水性のインターカレート分子であるピレンを含んだ挿入偽ヌクレオチド（（Ｓ）−１−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチルオキシ）−３−ピレンメチルオキシ−２−プロパノールのホスホルアミダイト）を意味する。 図１０においては、上部のパネルに実施例８に記載された実験中に用いられたＰＣＲサイクルプロファイルを示す。中央のパネル及び下部のパネルに蛍光の生データを示し、下部のパネルに実施例８に記載の通り得られた定量データを示す。 図１１においては、上部パネルに実施例９に記載の通り得られた結果を示す。下部パネルに測定プロファイルを示す。 図１２に実施例９に記載の通り得られた結果を示す。 図１３に実施例１０に記載の通り得られた結果を示す。曲線は次のプローブを用いた結果を表す：−プローブ＿０１−プローブ＿０２−プローブ＿０５−プローブ＿０６−プローブ＿０７−プローブ＿ｒｅｆ 図１４Ａ及びＢは本発明の方法に対して有用であり得るリアルタイムＰＣＲプロファイルを示す。

Claims (17)

  1. ｎ個のヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログの連続した配列と、少なくとも２個の疎水性ヌクレオチドとを含むオリゴヌクレオチドアナログであって、当該オリゴヌクレオチドアナログが共有結合的にシグナリングペアに連結しており、前記疎水性ヌクレオチドの一般構造が：
    Ｘ−Ｙ−Ｑ
    であり、Ｘがヌクレオチド若しくはヌクレオチドアナログ、又は核酸若しくは核酸アナログの主鎖に組み込まれ得る主鎖モノマー単位であり、Ｑがワトソン・クリック水素結合には関与しない疎水性分子である、疎水性のインターカレート分子のピレン：
    Figure 0005284112

    を含む、疎水性ヌクレオチド（（Ｓ）−１−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチルオキシ）−３−ピレンメチルオキシ−２−プロパノールのホスホルアミダイト、又はインターカレート疎水基：
    Figure 0005284112

    を含む、３−（１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−２−Ｏ−（２−シアノエチルジイソプロピルアミドホスファイト）−１，２−ブタンジオール）−４−Ｎ−（７，９−ジメチル−３Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−オンであり、Ｙが前記ヌクレオチド若しくはヌクレオチドアナログ又は主鎖モノマー単位と前記疎水性分子とを連結するリンカー部分であり；
    ｎが４以上の整数であり；
    ２以上の前記疎水性ヌクレオチドが３’末端又は５’末端の各々から最大で９ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログの位置に均等に配置され；
    前記２以上の疎水性ヌクレオチドが前記シグナリングペアの各部分からおよそ同一の距離に位置しており；
    前記シグナリングペアが２の部分のシステムからなり、一方の部分が突出末端として５’末端に位置し、他方の部分が突出末端として３’末端に位置し；
    前記シグナリングペアの２の部分が前記疎水性ヌクレオチドと同一ではなく；
    前記疎水性ヌクレオチドが任意の前記シグナリングペアの部分の隣に配置されず；
    ５’末端の最初のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログが疎水性ヌクレオチドではなく、３’末端の最初のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログが疎水性ヌクレオチドではない；
    ことを特徴とするオリゴヌクレオチドアナログ。
  2. 前記シグナリングペアがこのペアの部分間の物理的距離に応じて検出可能なシグナルを変化させ得ることを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
  3. 前記シグナリングペアの一方の部分がフルオロフォアであり、前記シグナリングペアのもう一方の部分がクエンチャーであり、前記フルオロフォア及び前記クエンチャーが分子内ＦＲＥＴ複合体を形成し得ることを特徴とする、請求項２に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
  4. 少なくとも２個の前記疎水性ヌクレオチドが前記オリゴヌクレオチドアナログの３’末端方向及び５’末端方向に均等に配置されることを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
  5. 前記疎水性ヌクレオチドの前記疎水性分子が互いに疎水性相互作用が可能であり、それによって前記シグナリングペアの２つの部分を近接させ得ることを特徴とする、請求項４に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
  6. 前記シグナリングペアの一方の部分よりも５’末端に近く位置している疎水性ヌクレオチドが無く、前記シグナリングペアのもう一方の部分よりも３’末端に近く位置している疎水性ヌクレオチドが無いことを特徴とする、請求項５に記載のオリゴヌクレオチドヌクレオチドアナログ。
  7. 前記オリゴヌクレオチドが固相に固定されていることを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
  8. ハイブリダイゼーションを決定する方法であって：
    ａ）請求項１に記載のオリゴヌクレオチドアナログを提供するステップと；
    ｂ）前記オリゴヌクレオチドアナログの標的配列を潜在的に含んだ核酸の混合物を提供するステップと；
    ｃ）前記核酸及び前記オリゴヌクレオチドアナログをハイブリダイゼーション可能な条件下でインキュベートするステップと；
    ｄ）前記シグナリングペアの前記部分が近接しているかどうかを決定することによりハイブリダイゼーションを検出するステップと；
    ｅ）それによってハイブリダイゼーションを決定するステップと；
    を具えることを特徴とする方法。
  9. 請求項１に記載のオリゴヌクレオチドアナログと標的配列とのハイブリダイゼーションを増幅中に検出及び／又は定量する方法であって、前記方法が
    ａ）標的配列を潜在的に含む核酸の混合物を提供するステップと；
    ｂ）増幅酵素を含んだ増幅緩衝液、１組のプライマー、及び請求項１に記載のオリゴヌクレオチドアナログを提供し、前記プライマー及び前記オリゴヌクレオチドアナログが前記標的配列又はそれに相補的な配列とハイブリダイズすることができ、前記増幅酵素が鋳型を標的とした様式でプライマーを伸長することができ、前記増幅緩衝液が前記増幅酵素に対してこのような伸長をプライマー及び鋳型の存在下で行うための条件を提供するステップと；
    ｃ）前記プライマーのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で前記プライマー及びオリゴヌクレオチドアナログを核酸の前記混合物とともにインキュベートするステップと；
    ｄ）前記標的配列を鋳型に用い、前記増幅酵素を使用して前記のハイブリダイズしたプライマーの３’末端を伸長するステップと；
    ｅ）前記核酸、伸長産物及び前記オリゴヌクレオチドアナログをハイブリダイゼーションを可能にする条件下でインキュベートするステップと；
    ｆ）ハイブリダイゼーションを検出し、また任意にハイブリダイゼーションを定量するステップと；
    ｇ）任意にステップｃ）からｆ）までを反復するステップと；
    を具えることを特徴とする方法。
  10. 該ハイブリダイゼーションの検出が融解温度及び／又は親和温度を測定するステップを含むことを特徴とする、請求項８又は９に記載の方法。
  11. ヌクレアーゼ活性が前記シグナリングペアの最も５’の部分を除去することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
  12. 前記オリゴヌクレオチドアナログが前記標的配列に相補的であり、前記の少なくとも１個の多型サイトが前記オリゴヌクレオチドアナログの中央部分内に位置している請求項９に記載の方法。
  13. 請求項１に記載の少なくとも２種のオリゴヌクレオチドアナログが提供され、前記オリゴヌクレオチドアナログの１種が前記標的配列の１個の遺伝子型に相補的であり、前記オリゴヌクレオチドアナログの他のものが前記標的配列の他の遺伝子型に相補的であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
  14. 一方のオリゴヌクレオチドアナログが「Ｃ」−核酸塩基を前記多型サイトに含み、他方のオリゴヌクレオチドアナログが「Ａ」−核酸塩基を前記多型サイトに含むことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
  15. オリゴヌクレオチドアナログの標的配列への親和温度を測定する方法であって、前記方法が請求項８又は９に記載の方法を実施するステップを具え、最後のステップの後に：
    ａ）前記混合物を変性し、前記親和温度を超える第一の所定の温度まで急速に冷却するステップと；
    ｂ）前記シグナリングペアからの検出可能なシグナルを測定することによりハイブリダイゼーションを検出し、前記シグナリングペアは前記ペアの前記部分間の物理的距離に応じて前記の検出可能なシグナルを変化可能にするステップと；
    ｃ）前記混合物を変性し、第二の所定の温度まで急速に冷却し、前記の第二の所定の温度は前記の第一の所定の温度よりも低くするステップと；
    ｄ）前記の検出可能なシグナルを測定することによりハイブリダイゼーションを検出するステップと；
    ｅ）３）及び４）のステップを反復し、前記の所定の温度は徐々に前記親和温度未満にまで下げるステップと；
    ｆ）前記核酸アナログの前記標的配列に対する前記親和温度を測定するステップと；
    を実施することを特徴とする方法。
  16. 請求項１に記載のオリゴヌクレオチドアナログを用いて標的配列を増幅する方法であって、前記方法が：
    ａ）前記標的配列を任意に含んだ核酸の混合物を提供するステップと；
    ｂ）１組のプライマー、増幅酵素を含んだ増幅緩衝液、及び前記オリゴヌクレオチドアナログを提供し、前記プライマー及び前記オリゴヌクレオチドアナログは前記標的配列又はそれに相補的な配列とハイブリダイズすることができ、前記増幅酵素がヌクレアーゼ活性を有する場合は前記オリゴヌクレオチドアナログがヌクレアーゼ抵抗性となるステップと；
    ｃ）前記プライマー及びオリゴヌクレオチドアナログを核酸の前記混合物とハイブリダイゼーション可能な条件下でインキュベートするステップと；
    ｄ）ハイブリダイゼーションを検出するステップと；
    ｅ）前記の所望の伸長温度に達するまで特定の間隔でハイブリダイゼーションを検出しながら徐々に温度を上昇させるステップと；
    ｆ）伸長反応を終了させ、生成したアンプリコンを変性し、所望の増幅が生ずるまでステップｃ）からｆ）を反復するステップと；
    を具えることを特徴とする方法。
  17. 複数の前記オリゴヌクレオチドアナログが同一の密閉されたチューブ内で用いられることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
JP2008558640A 2006-03-16 2007-03-16 核酸、メチル化状態及び核酸の突然変異体を検出するための、シグナリングペア及び疎水性ヌクレオチドを含んだオリゴヌクレオチド、ステムレスビーコン Active JP5284112B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200600379 2006-03-16
DKPA200600379 2006-03-16
PCT/DK2007/000134 WO2007104318A2 (en) 2006-03-16 2007-03-16 Oligonucleotides comprising signalling pairs and hydrophobic nucleotides, stemless beacons, for detection of nucleic acids, methylation status and mutants of nucleic acids

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2009529337A JP2009529337A (ja) 2009-08-20
JP2009529337A5 JP2009529337A5 (ja) 2010-07-08
JP5284112B2 true JP5284112B2 (ja) 2013-09-11

Family

ID=38509827

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2008558640A Active JP5284112B2 (ja) 2006-03-16 2007-03-16 核酸、メチル化状態及び核酸の突然変異体を検出するための、シグナリングペア及び疎水性ヌクレオチドを含んだオリゴヌクレオチド、ステムレスビーコン

Country Status (9)

Country Link
US (1) US8133984B2 (ja)
EP (1) EP2004847B1 (ja)
JP (1) JP5284112B2 (ja)
CN (1) CN101448957A (ja)
AU (1) AU2007224843A1 (ja)
CA (1) CA2645136C (ja)
DK (1) DK2004847T3 (ja)
NZ (1) NZ571966A (ja)
WO (1) WO2007104318A2 (ja)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9879222B2 (en) 2007-12-14 2018-01-30 Mofa Group Llc Gender-specific separation of sperm cells and embryos
EP2235177B1 (en) * 2008-06-13 2012-07-18 RiboxX GmbH Method for enzymatic synthesis of chemically modified rna
DE102010012421B4 (de) 2009-03-23 2023-04-20 Vermicon Ag Verfahren zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen
WO2011032034A2 (en) 2009-09-10 2011-03-17 University Of Idaho Nucleobase-functionalized conformationally restricted nucleotides and oligonucleotides for targeting nucleic acids
JP5717169B2 (ja) * 2010-09-14 2015-05-13 国立大学法人名古屋大学 オリゴヌクレオチド及びその利用
BR112014001075A2 (pt) 2011-07-19 2016-11-29 Univ Idaho sonda, seu uso, método in vitro para associar uma sonda com um alvo e kit
EP2820157B1 (en) 2012-03-02 2019-05-01 Winthrop-University Hospital Method for using probe based pcr detection to measure the levels of circulating demethylated beta cell derived dna as a measure of beta cell loss in diabetes
CN102911111B (zh) * 2012-11-08 2014-06-11 齐鲁工业大学 一种咔唑苯甲醛缩对苯二胺双席夫碱及其制备方法
US10988810B2 (en) 2015-09-14 2021-04-27 Pentabase Aps Methods and materials for detection of mutations
CN108827935B (zh) * 2018-06-08 2021-09-07 南京师范大学 一种基于金纳米孔阵列的dna甲基化表面增强拉曼散射光谱检测方法及其应用
WO2020229510A1 (en) * 2019-05-13 2020-11-19 Pentabase Aps Melting temperature methods, kits and reporter oligo for detecting variant nucleic acids
CN110261964B (zh) * 2019-07-01 2021-06-04 国检中心深圳珠宝检验实验室有限公司 一种用于光纤光谱仪的光纤头
WO2022002958A1 (en) * 2020-06-29 2022-01-06 Pentabase Aps Detection of methylation status

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5466578A (en) * 1992-04-09 1995-11-14 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Surfactant-enhanced light emission- or absorbance-based binding assays for polynucleic acids
US5925517A (en) * 1993-11-12 1999-07-20 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits
US6312894B1 (en) * 1995-04-03 2001-11-06 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Hybridization and mismatch discrimination using oligonucleotides conjugated to minor groove binders
ATE196322T1 (de) * 1995-05-05 2000-09-15 Perkin Elmer Corp Methoden and reagentien fuer die kombination einer pcr-amplifizierung mit einem hybridisierungs-assay
CA2252048C (en) * 1996-04-12 2008-03-11 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detection probes, kits and assays
JPH11332595A (ja) 1997-07-09 1999-12-07 Masao Karube プローブｐｎａによるｄｎａの検出方法
DE69829760T3 (de) 1997-09-12 2016-04-14 Exiqon A/S Bi- und tri-zyklische - nukleosid, nukleotid und oligonukleotid-analoga
AU1366299A (en) * 1997-10-27 1999-05-17 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions pertaining to pna molecular beacons
US6485901B1 (en) 1997-10-27 2002-11-26 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions pertaining to linear beacons
US6037130A (en) * 1998-07-28 2000-03-14 The Public Health Institute Of The City Of New York, Inc. Wavelength-shifting probes and primers and their use in assays and kits
US20070059752A1 (en) * 1999-06-09 2007-03-15 Biosearch Technologies, Inc. Fluorescence energy transfer probes with stabilized conformations
PT1278889E (pt) 2000-03-29 2006-12-29 Lgc Ltd Farol de hibridização e método para a detecção e discriminação rápida de sequência
US6902900B2 (en) * 2001-10-19 2005-06-07 Prolico, Llc Nucleic acid probes and methods to detect and/or quantify nucleic acid analytes
AU2002358464B2 (en) 2001-12-18 2006-04-27 Human Genetic Signatures Pty Ltd Pseudonucleotide comprising an intercalator
US20040086879A1 (en) * 2001-12-20 2004-05-06 Yingufu Li Tripartite molecular beacons
CA2472554A1 (en) * 2002-02-27 2003-09-04 Biosource International Inc. Methods of using fet labeled oligonucleotides that include a 3' 5' exonuclease resistant quencher domain and compositions for practicing the same
GB0223563D0 (en) 2002-10-10 2002-11-20 Secr Defence Detection system
GB0319949D0 (en) 2003-08-26 2003-09-24 Univ Strathclyde Nucleic acid sequence identification
CA2548205C (en) * 2003-12-03 2017-06-27 Abbott Laboratories Double stranded linear nucleic acid probe and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
NZ571966A (en) 2011-09-30
EP2004847B1 (en) 2017-05-03
WO2007104318A3 (en) 2008-03-20
CA2645136C (en) 2017-09-19
US20100068704A1 (en) 2010-03-18
EP2004847A2 (en) 2008-12-24
CA2645136A1 (en) 2007-09-20
JP2009529337A (ja) 2009-08-20
CN101448957A (zh) 2009-06-03
US8133984B2 (en) 2012-03-13
WO2007104318A2 (en) 2007-09-20
DK2004847T3 (en) 2017-08-21
AU2007224843A1 (en) 2007-09-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5284112B2 (ja) 核酸、メチル化状態及び核酸の突然変異体を検出するための、シグナリングペア及び疎水性ヌクレオチドを含んだオリゴヌクレオチド、ステムレスビーコン
Ranasinghe et al. Fluorescence based strategies for genetic analysis
Asseline Development and applications of fluorescent oligonucleotides
EP2459743B1 (en) A set of oligonucleotide probes as well as methods and uses related thereto
JP6553598B2 (ja) 混合物から変異された核酸の富化方法
JP2002528053A (ja) 核酸分析物における蛍光偏光
JP5932808B2 (ja) 標的核酸の検出方法
WO2003052134A2 (en) Oligonucleotides comprising intercalator pseudonucleotide(s) for detection of nucleic acids and mutants hereof
JP2013501508A (ja) 核酸の違いを検出するためのプローブの形式
CN106702000A (zh) 利用等位基因特异性抑制序列变体的核酸扩增
US6887662B1 (en) Oligonucleotides and assemblies thereof useful in the detection of the presence or absence of target nucleic acid sequences in a sample
EP2722388B1 (en) Nucleic acid probe for assaying nucleic acids
Vet et al. Molecular beacons: colorful analysis of nucleic acids
US20130288246A1 (en) Compositions, methods, and kits for analyzing dna methylation
JP4460228B2 (ja) 核酸の新規測定方法
US20170253878A1 (en) Rapid oligo probes
JP2022533088A (ja) 変異体核酸を検出するための融解温度法、キットおよびレポータオリゴ
Oladepo et al. Non-enzymatic detection of miR-21 in cancer cells using a homogeneous mix-and-read smart probe assay
JP6442534B2 (ja) ヌクレオチド多型の検出方法
US20070184453A1 (en) Fret process
WO2015012363A1 (ja) 標的核酸の検出方法
US20070269803A1 (en) Fluorogenic Nucleic Acid Probes Including Lna for Methods to Detect and/or Quantify Nucleic Acid Analytes
JP2024515187A (ja) 核酸の多重化分析及び多重化法のために最適化したオリゴヌクレオチドｔｘプローブ
ES2629979T3 (es) Métodos y composición para generar sondas de ADN de secuencia única, marcaje de sondas de ADN y el uso de estas sondas
US20090117575A1 (en) Detection Probe Acting by Molecular Recognition

Legal Events

Date Code Title Description
RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20100227

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20100316

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20100316

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20100419

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20121002

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20130104

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20130111

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20130118

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20130125

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20130301

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20130313

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20130402

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20130507

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20130529

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 5284112

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250