WO2015012363A1 - 標的核酸の検出方法 - Google Patents

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WO2015012363A1
WO2015012363A1 PCT/JP2014/069596 JP2014069596W WO2015012363A1 WO 2015012363 A1 WO2015012363 A1 WO 2015012363A1 JP 2014069596 W JP2014069596 W JP 2014069596W WO 2015012363 A1 WO2015012363 A1 WO 2015012363A1
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WO
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nucleic acid
amplification
hybridization
labeling substance
product
Prior art date
Application number
PCT/JP2014/069596
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English (en)
French (fr)
Inventor
孝介 丹羽
廣田　寿一
三雄 川瀬
Original Assignee
日本碍子株式会社
国立大学法人東北大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/682—Signal amplification

Definitions

  • the present specification relates to a method for detecting a target nucleic acid.
  • the present application is based on Japanese Patent Application No. 2013-153288 filed on July 24, 2013 and Japanese Patent Application No. 2014-074469 filed on April 1, 2014. All the contents described in this Japanese application are incorporated in this specification.
  • a product obtained by adding a single-stranded tag to the end of a DNA double-stranded fragment based on the target nucleic acid is obtained as a PCR amplification product, and chromatographed using the complementary strand of this amplified product tag as a probe.
  • the use of graphy is disclosed (Patent Documents 1 and 2).
  • a region that becomes a single-stranded tag modified so as to inhibit or suppress the DNA polymerase reaction is provided on the 5 'end side of a commonly used primer.
  • a primer that hybridizes with the extension product of this primer is not extended so as to form a complementary strand to the single-stranded tag.
  • an amplification product having a single-stranded tag is obtained as a result.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 a primer that can remove the primer and primer dimer after nucleic acid amplification is also disclosed (Non-Patent Documents 1 and 2).
  • the reagent is added to the amplified product, and after standing, centrifuged at 13000 g for 10 minutes, the pellet is washed with ethanol, centrifuged at 14000 g, and the pellet is collected to obtain a primer or primer dimer of about 100 bp or less. It is described that the low molecular weight DNA can be removed.
  • Wako BioWindow 10, No. 91, p. 5 Wako Pure Chemical Industries, Ltd., issued in October 2008
  • the PCR amplification product may include an unreacted primer in addition to the amplification product associated with the target nucleic acid, and may include a primer dimer amplification product depending on the primer base sequence. It was difficult to assume that these by-products would react with the probe during normal hybridization.
  • nucleic acid amplification product can be directly hybridized with the probe without denatured to make the single-stranded DNA.
  • hybridization can be carried out at a relatively low temperature.
  • the present specification provides a method for detecting a target nucleic acid, which can perform hybridization between a nucleic acid amplification product to which a single-stranded tag has been added and a probe with good accuracy.
  • the masking agent comprises a masking agent that is a nucleic acid that is the same as or hybridizable to at least a part of the nucleic acid structure of (b).
  • the nucleic acid amplification product includes a nucleic acid amplification product comprising the double-stranded portion and a tag strand that is a single-stranded portion that protrudes from only one end of the double-stranded portion, (1) The detection method according to any one of (8).
  • a method for purifying a nucleic acid amplification product In the presence of a nucleic acid amplification product comprising a double-stranded part and a tag strand that is a single-stranded part located protruding from at least one end of the double-stranded part, The following (a) and (b); (A) An amplification primer capable of holding a labeling substance or a labeling substance binding substance (b) At least selected from amplification products derived from dimers of amplification primers including an amplification primer capable of holding a labeling substance or labeling substance binding substance A purification method comprising a step of providing a masking agent capable of hybridizing with at least a part of a kind of nucleic acid structure.
  • a purification agent for a nucleic acid amplification product is a nucleic acid amplification product comprising a double-stranded portion and a tag strand that is a single-stranded portion located protruding from at least one end of the double-stranded portion,
  • the following (a) and (b);
  • a purification agent comprising a masking agent capable of hybridizing with at least a part of a kind of nucleic acid structure.
  • amplification primer capable of holding a labeling substance or a labeling substance binding substance
  • a masking agent capable of hybridizing with at least a part of a kind of nucleic acid structure; Including kit.
  • FIG. 3 is a plan view showing an arrangement state of probes on the membrane array used in Example 1. It is a figure which shows the result (when a prior
  • FIG. 3 is a plan view showing an arrangement state of probes on the membrane array used in Example 1. It is a figure which shows the result (when a prior
  • FIG. 6 is a plan view showing the arrangement state of probes in the chromatography used in Example 2.
  • FIG. It is a figure which shows the result (when a prior
  • FIG. It is a figure which shows the result in the chromatography type
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of hybridization in Example 3.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of chromatographic hybridization in Example 4.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of chromatographic hybridization in Example 5.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of chromatographic hybridization in Example 7.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of chromatographic hybridization in Example 8.
  • the present specification relates to a target nucleic acid detection method, a nucleic acid amplification product purification method, a nucleic acid amplification product purification agent, a detection kit, and the like.
  • a hybridization product between a probe and a nucleic acid structure such as an unreacted primer or primer-dimer amplification product that can accompany a nucleic acid amplification product having a single-stranded tag as a hybridization site with the probe.
  • FIG. 1 shows an outline of the formation state of the by-product hybridized product.
  • FIG. 2 shows an outline of a state in which the formation of by-product hybridized products is suppressed.
  • a masking agent capable of hybridizing capable of hybridizing, the ability to hybridize with the probe of the nucleic acid structure can be suppressed or inhibited. it can.
  • the formation of by-product hybridized products can be suppressed easily and quickly, and the occurrence of false positives can be suppressed.
  • the primer dimer removal reagent described in Non-Patent Documents 3 and 4 complicated operations and time are required.
  • Hybridization of the nucleic acid structure and the masking agent can be performed as a pre-hybridization step or pretreatment prior to the original hybridization step.
  • nucleic acid means a nucleotide polymer, and the number thereof is not particularly limited. Nucleic acids include oligonucleotides in which several tens of nucleotides are linked, and longer polynucleotides are also included.
  • the nucleic acid includes DNA single-stranded or double-stranded, RNA single-stranded or double-stranded, DNA / RNA hybrid, DNA / RNA chimera, and the like.
  • nucleic acid may include a natural base, a nucleotide, and a nucleoside, and may include a non-natural base, a nucleotide, and a nucleoside in part.
  • Nucleic acids include all DNA and RNA including cDNA, genomic DNA, synthetic DNA, mRNA, total RNA, hnRNA and synthetic RNA, as well as artificial nucleic acids such as peptide nucleic acid, morpholino nucleic acid, methylphosphonate nucleic acid and S-oligonucleic acid. Contains synthetic nucleic acids. Moreover, it may be single-stranded or double-stranded.
  • the “target nucleic acid” is not particularly limited, and is any nucleic acid whose presence and / or amount should be detected.
  • the target nucleic acid may be natural or artificially synthesized.
  • natural target nucleic acids include genetic indicators in organisms such as humans and non-human animals, such as constitution, genetic diseases, onset of specific diseases such as cancer, disease diagnosis, treatment prognosis, selection of drugs and treatments, etc. Or a base sequence. Typically, polymorphisms such as SNP and congenital or acquired mutations can be mentioned.
  • nucleic acids derived from microorganisms such as pathogenic bacteria and viruses are also included in the target nucleic acid.
  • synthetic target nucleic acids include nucleic acids that are artificially synthesized for some kind of identification.
  • the amplification product obtained by performing nucleic acid amplification reaction with respect to a certain kind of natural or artificial nucleic acid is mentioned.
  • a sample described later or a nucleic acid fraction thereof can be used as it is, but preferably, an amplification product obtained by amplifying a plurality of target nucleic acids by PCR amplification reaction, more preferably multiplex PCR amplification reaction is used. It is preferable to use it.
  • sample refers to a sample that may contain a target nucleic acid.
  • samples that can contain the target nucleic acid include various biological samples (blood, urine, sputum, saliva, tissue, cells (cultivated animal cells and cultured plant cells derived from various animals). , Etc.), or a DNA extraction sample obtained by extracting DNA from such a biological sample.
  • the DNA sample etc. which extracted RNA from the said biological sample and converted into DNA are also contained. Fractions containing nucleic acids from these various samples can be obtained by those skilled in the art with reference to conventional techniques as appropriate.
  • the “target sequence” refers to a sequence composed of one or more bases characteristic of the target nucleic acid to be detected.
  • it may be a partial sequence with low homology between target nucleic acids, or may be a sequence that is complementary or has low homology to other nucleic acids that may be contained in a sample.
  • the target sequence may be a sequence characteristic of the target nucleic acid.
  • Such target sequences may be artificially altered sequences.
  • nucleic acid chromatography refers to a porous solid phase carrier capable of diffusing and moving a liquid (development medium) by a capillary phenomenon, and the nucleic acid is moved inside the solid phase carrier by the liquid to be solidified.
  • This refers to chromatography in which a hybridized product is formed by specific base pairing with a probe prepared in advance on a phase carrier and the nucleic acid is captured on a solid phase carrier.
  • the method for detecting a target nucleic acid disclosed in the present specification comprises a nucleic acid amplification product comprising at least one single-stranded tag strand (single-stranded tag), and a probe capable of hybridizing to the tag.
  • a hybridization step can be provided in which the contact is performed under conditions that allow hybridization.
  • the present detection method comprises: The following (a) and (b); (A) Primer for amplification of nucleic acid amplification product (b) Amplification product derived from dimer of amplification primer, It suppresses formation of a by-product hybridized product between at least one nucleic acid structure selected from the above and the probe.
  • the step of obtaining the nucleic acid amplification product may be performed as one step of the present detection method prior to the hybridization step.
  • the nucleic acid amplification product having at least one single-stranded tag protrudes from the double-stranded portion and at least one end of the double-stranded portion, as shown in the bottom of FIGS. 3A and 3B. And a tag chain which is a single-stranded part located in the middle.
  • the nucleic acid amplification product may have one single-stranded tag at one end of the double strand as shown in FIG. 3A, or both double-stranded as shown in FIG. 3B. Each end may be provided with a single-stranded tag.
  • the single-stranded tag is preferably located at the 5 ′ end of each constituent strand of the double strand.
  • the double-stranded portion in the nucleic acid amplification product generally has a structure in which nucleotides having natural bases (adenine, guanine, thymine, and cytosine) that can serve as a substrate for a DNA strand extension reaction by DNA polymerase are linked by a phosphodiester bond.
  • nucleotides having natural bases adenine, guanine, thymine, and cytosine
  • the present invention is not limited to this.
  • One single-stranded tag of a nucleic acid amplification product can hybridize with a probe previously associated with a target nucleic acid. That is, it has a base sequence capable of hybridizing with a specific probe.
  • one single-stranded tag (hereinafter also referred to as a hybridizing tag) has a tag sequence that is completely complementary to a specific probe.
  • the tag can be used as, for example, a labeling substance binding region.
  • the hybridizing tag can be synthesized by a nucleic acid amplification reaction, and generally has a structure in which nucleotides having natural bases (adenine, guanine, thymine, and cytosine) are linked by a phosphodiester bond, but are not limited thereto. . It may be a non-natural synthetic oligonucleotide chain that does not depend on a nucleic acid amplification reaction. For this nucleotide chain, in addition to the so-called natural ribose-phosphate backbone, a known artificial backbone such as a backbone of PNA (peptide nucleic acid) or a backbone of BNA (crosslinked nucleic acid) can be adopted.
  • PNA peptide nucleic acid
  • BNA crosslinked nucleic acid
  • the base since the base only needs to be capable of hybridizing specifically with the probe, it may be provided with non-natural, for example, L-DNA, assuming that the probe is matched, or L-DNA. It may consist only of. Moreover, you may have a non-natural base and you may be comprised only from the non-natural base.
  • the hybrid tag has a tag sequence that can hybridize with the probe.
  • the base length of the tag sequence matches the base length of the probe detection sequence, preferably 20 bases or more and 50 bases or less, more preferably 20 bases or more and 25 bases or less.
  • the nucleic acid amplification product is associated with the target nucleic acid to be detected. That is, it is amplified by a primer set constructed so that the target nucleic acid in the sample that may contain the target nucleic acid can be specifically amplified.
  • the nucleic acid amplification product is generally provided with a linking site described later in order to give a single-stranded tag.
  • nucleic acid amplification product acquisition process Such a nucleic acid amplification product can be obtained, for example, by a nucleic acid amplification reaction with DNA polymerase using the primer set shown below.
  • Examples of the nucleic acid amplification method in this step include various known methods for obtaining a double-stranded DNA fragment by amplifying DNA or the like using a DNA polymerase reaction such as PCR as a template. An outline of these steps is shown in FIGS. 3A and 3B.
  • the first primer identifies the first arbitrary base sequence that is a hybridization tag for the probe previously associated with the target nucleic acid and the first base sequence that identifies the first base sequence in the target nucleic acid. And a linking site capable of suppressing or stopping the DNA polymerase reaction between the first arbitrary sequence and the first recognition sequence.
  • the second primer includes a second identification sequence that identifies the second base sequence in the target nucleic acid.
  • the linking site suppresses or stops the DNA polymerase reaction. That is, the linking site cannot be a template for a DNA extension reaction by DNA polymerase because it does not contain a natural base or the like. Therefore, as shown in FIG. 3A, when the DNA single strand amplified by the first primer becomes a template strand and further amplified by the second primer, the DNA extension reaction from the second primer is In addition, it is suppressed or stopped on the 3 ′ side from the site that matches the linking site. Therefore, as a result, the amplified product piece (DNA double-stranded fragment) obtained by the amplification step is provided with a first arbitrary base sequence protruding from one end as a single strand, and the two by base pairing. It is inferred to have a heavy chain part.
  • the second primer further has a second arbitrary base sequence, and has the linking site between the second arbitrary base sequence and the second identification sequence.
  • the process of the case is shown.
  • FIG. 3B like the first primer shown in FIG. 3A, when the DNA single strand amplified by the second primer becomes a template strand and further amplified by the first primer, The DNA extension reaction from one primer is suppressed or stopped on the 3 ′ side from the site that pairs with the ligation site. For this reason, the amplification product (DNA double-stranded fragment) obtained by the process has, as a result, a single strand with a hybridizing tag protruding at one end and an arbitrary base sequence protruding at the other end.
  • the second arbitrary base sequence derived from the second primer can be a site (label tag) to which a labeling substance, a label binding substance, or the like is added.
  • This nucleic acid amplification product can be obtained by the following first primer and second primer set. Nucleic acid amplification is performed using these primers. As described above, various known methods can be applied to the nucleic acid amplification method, but typically, various PCRs such as PCR and multiplex PCR are used. A person skilled in the art can appropriately set the solution composition, temperature control, time, etc. in carrying out the nucleic acid amplification step.
  • the first primer includes a hybridizing tag, a first identification sequence, and a linking site capable of suppressing or stopping a DNA chain elongation reaction by DNA polymerase.
  • a linking site capable of suppressing or stopping a DNA chain elongation reaction by DNA polymerase.
  • a nucleic acid amplification product including a first strand having a hybridizing tag can be synthesized by a nucleic acid amplification reaction.
  • the first primer generally comprises a hybridizing tag, a linking site and a first identification sequence from the 5 ′ side.
  • hybridizing tag The hybridizing tag is as described above.
  • the tag sequence is a sequence that allows the amplified fragment to hybridize with the detection probe and detects the target nucleic acid, so that each target nucleic acid can be hybridized to the detection sequence of the detection probe. Is done.
  • the base sequence is complementary to the detection sequence. Therefore, one target nucleic acid is associated with one probe.
  • the first identification sequence is a sequence for amplifying the target nucleic acid by nucleic acid amplification, and can specifically hybridize with the first base sequence constituting a part of the target sequence in the target nucleic acid.
  • the first identification sequence is set complementarily to the extent that it can hybridize with the first base sequence with high selectivity. Preferably, it is set to be completely complementary (specific).
  • the first base sequence and the second base sequence in the target nucleic acid may have any configuration with respect to the target nucleic acid.
  • only one of the base sequences may contain a mutation site of one or more bases, or both may contain a mutation site.
  • the first primer has such a tag sequence and a first identification sequence, has a natural base constituting such a base sequence or an artificial base homologous thereto, and a base pair with a natural nucleic acid. It has a skeleton that can be combined. Typically an oligonucleotide or a derivative thereof.
  • the ligation site is a site capable of suppressing or stopping the DNA polymerase reaction when included in the template strand.
  • the DNA polymerase reaction it is said that if there is no nucleic acid (or base) as a template, the DNA strand will not be extended any further.
  • the linking site of the present invention has a structure that cannot serve as a template during DNA elongation by DNA polymerase. That is, the linking site does not include a natural base or a derivative of a natural base (such as a natural base) that pairs with the natural base. By not including such a natural base or the like, it can be prevented from becoming a template, and DNA chain elongation by DNA polymerase can be suppressed or avoided.
  • the linking site may be only a skeleton chain that does not have a natural base or the like. That is, it may be a sugar-phosphate skeleton or a skeleton applied to other known artificial oligonucleotides.
  • the DNA polymerase includes various known DNA polymerases. Typically, DNA polymerase used for nucleic acid amplification methods, such as various PCR, is mentioned.
  • the linking site may be a chain linking group containing a single chain structure having 2 to 40 elements adjacent to the nucleotide via a phosphodiester bond. This is because if the number of elements is 1 or less, the DNA polymerase reaction is likely to be incompletely inhibited or stopped, and if the number of elements exceeds 40, the solubility of nucleotides may be reduced. Considering the effect of suppressing or stopping the DNA polymerase reaction, the chain linking group element is preferably 2 or more and 36 or less, more preferably 3 or more and 16 or less.
  • connection site includes a single bond to facilitate rotation at the connection site, and the single bond includes a carbon-carbon single bond, a carbon-oxygen single bond, a carbon-nitrogen single bond, and an SS single bond. Etc. It is preferable that the linking site is mainly composed of such a single bond. In addition, the linking site may partially contain an aromatic ring or cycloalkane as long as it contains a single bond.
  • the linking site preferably includes an alkylene chain or a polyoxyalkylene chain which has 2 to 40 elements and may be substituted.
  • Such a chain-like connection structure is structurally simple and can be easily introduced as a connection site.
  • connection part represented by the following formula
  • equation (1) is mentioned, for example.
  • equation (1) (In the formula, 5 ′ represents an oxygen atom of a phosphodiester bond on the 5 ′ side, 3 ′ represents a phosphate atom of a phosphodiester bond on the 3 ′ side, and m represents an integer of 2 to 40. To express.)
  • m is preferably 2 or more and 36 or less, and more preferably 3 or more and 16 or less.
  • substituent of H in formula (1) include an alkyl group, an alkoxy group, and a hydroxyl group.
  • the alkyl group and alkoxy group preferably have 1 to 8 carbon atoms, more preferably 1 to 4 carbon atoms.
  • the substituents may be the same or different.
  • connection part represented by the following formula
  • equation (2) is mentioned.
  • equation (2) (In the formula, 5 ′ represents an oxygen atom of a phosphodiester bond on the 5 ′ side, 3 ′ represents a phosphate atom of a phosphodiester bond on the 3 ′ side, and n represents an integer of 2 or more and 4 or less.
  • l is an integer of 2 or more, and (n + 1) ⁇ l represents an integer of 40 or less.)
  • (n + 1) ⁇ l is preferably 2 or more and 36 or less, and more preferably 3 or more and 16 or less.
  • the same aspect as the substituent in Formula (1) is applied to the substituent of H in Formula (2).
  • linking site examples include the following chain sites.
  • linking site examples include the following chain sites.
  • the linking site includes a nucleic acid sequence having a three-dimensional structure that inhibits the progression of polymerase such as a strong hairpin structure or a pseudoknot structure, a target nucleic acid natural nucleic acid such as an L-type nucleic acid or an artificial nucleic acid, RNA, and a fatty chain
  • Non-nucleic acid structures such as Examples of the artificial nucleic acid include peptide nucleic acid, cross-linked nucleic acid, azobenzene and the like.
  • the second primer is a primer for obtaining a second strand that pairs with the first strand of the nucleic acid amplification product. As shown in FIG. 4, the second primer can be constructed without including a linking site.
  • a nucleic acid amplification product having only a hybridizing tag (a nucleic acid amplification product having only a single-stranded tag on one side) can be obtained.
  • a nucleic acid amplification product having only a hybridizing tab is preferable because the target nucleic acid can be detected with high sensitivity and accuracy, particularly in a hybridization process in a chromatographic form.
  • the second primer includes a second identification sequence that identifies the second base sequence in the target nucleic acid.
  • the second identification sequence is a sequence for amplifying the target nucleic acid together with the first primer by nucleic acid amplification, and specifically with the second base sequence constituting the other part of the target sequence in the target nucleic acid. Can hybridize.
  • the second identification sequence is set complementarily to the extent that it can hybridize with the second base sequence with high selectivity. Preferably, it is set to be completely complementary (specific).
  • the second primer can be provided with a labeling substance in advance.
  • the labeling substance 40 is for detecting the partial double-stranded nucleic acid 10 bound to the probe on the solid phase carrier.
  • a labeling substance which will be described later, conventionally known substances can be appropriately selected and used.
  • the labeling substance is preferably provided at the 5 'end of the second primer.
  • the second primer may include a labeling substance binding substance as shown in FIG.
  • the labeling substance-binding substance is preferably provided at the 5 'end of the second primer.
  • the second primer may not include a labeling substance and a labeling substance binding substance. That is, in the amplification step, a nucleic acid amplification reaction is performed using a nucleoside triphosphate composition containing a nucleoside derivative triphosphate having a labeling substance or a labeling substance binding substance, thereby binding the labeling substance or the labeling substance to the DNA extension site. This is because a nucleic acid amplification product labeled with a substance can be obtained.
  • the second primer preferably has a labeling substance or a labeling substance binding substance and a second identification sequence in that order from the 5 'side.
  • a second strand having a labeling substance or a labeling substance binding substance at the 5 'end can be obtained (see FIGS. 4 to 6).
  • a nucleic acid amplification product having two single-stranded tags can be obtained. That is, a nucleic acid amplification product including a hybridizing tag and another single-stranded tag (for example, a tag) can be obtained (see FIG. 3B).
  • the second primer comprising a linking site can comprise a label tag, a linking site and a second identification sequence.
  • the label tag is formed so as to be capable of specifically hybridizing with a label probe holding a label substance or a label substance binding substance.
  • Such a labeled probe can be hybridized with a label tag of a hybridized product that has hybridized with the probe on the solid phase carrier in the hybridization step or detection step described later, and the hybridized product can be labeled.
  • the labeling substance or the labeling substance binding substance may be finally provided at any location of the nucleic acid amplification product.
  • the second primer it may be incorporated in any of the amplification step, the hybridization step and the detection step.
  • the labeling substance or the labeling substance binding substance may be added without relying on the second primer.
  • the nucleic acid amplification product may be incorporated by performing a nucleic acid amplification reaction using a nucleoside triphosphate composition containing the nucleoside derivative triphosphate provided.
  • the “labeling substance” is a substance that makes it possible to distinguish a substance or molecule to be detected from others.
  • the labeling substance is not particularly limited, but typically, a labeling substance using fluorescence, radioactivity, enzyme (for example, peroxidase, alkaline phosphatase, etc.), phosphorescence, chemiluminescence, coloring and the like can be mentioned.
  • the labeling substance is preferably a luminescent substance or a coloring substance that presents luminescence or coloring that can be detected visually (with the naked eye). That is, it is preferably a substance that itself can directly generate a signal that is visible to the naked eye without the need for other components.
  • the detection process can be performed quickly and easily.
  • Such materials typically include various colorants such as various pigments and dyes.
  • noble metals such as gold and silver
  • various metals or alloys such as copper, or organic compounds containing the metal (may be complex compounds) may be used.
  • inorganic compounds such as mica, which are similar to the colorant, can be used.
  • This kind of labeling substance typically includes various dyes, various pigments, luminol, isoluminol, acridinium compounds, olefins, enol ethers, enamines, aryl vinyl ethers, dioxene, aryl imidazoles, lucigenin, luciferin and eclion.
  • a chemiluminescent substance is mentioned.
  • particles such as latex particles labeled with such a labeling substance are also included.
  • colloids or sols including gold colloids or sols or silver colloids or sols can be mentioned.
  • a metal particle, an inorganic particle, etc. are mentioned.
  • the labeling substance may include particles in a part thereof.
  • the average particle diameter of particles such as latex particles constituting a part of the labeling substance is not particularly limited, and is, for example, from 0.1 nm to 20 ⁇ m, and can be appropriately selected depending on the pore diameter of the solid phase carrier.
  • Preferred particles are particles that can be suspended in an aqueous solution and are made of a water-insoluble polymer material.
  • a water-insoluble polymer material for example, polyethylene, polystyrene, styrene-styrene sulfonate copolymer, acrylic acid polymer, methacrylic acid polymer, acrylonitrile polymer, acrylonitrile-butadiene-styrene, polyvinyl acetate-acrylate, polyvinylpyrrolidone, or vinyl chloride-acrylate may be mentioned. Mention may also be made of latex particles having active groups on their surface, for example carboxyl, amino or aldehyde groups.
  • the labeling substance binding substance can utilize protein-protein interaction, low molecular weight compound-protein interaction, and the like.
  • proteins in antigen-antibody reaction biotin in avidin (streptavidin) -biotin system, digoxigenin in anti-digoxigenin (DIG) -digoxigenin (DIG) system, or haptens represented by FITC in anti-FITC-FITC system, etc.
  • the labeling substance finally used for detection is the other molecule or substance that interacts with the labeling substance binding substance (for example, an antigen, ie, streptavidin, anti-FITC, etc.) and the labeling substance binding substance. It is modified so as to be provided as a site for binding.
  • the amplification product includes a labeling substance binding substance, a label having a labeling substance binding substance of the amplification product and a site that binds to the labeling substance binding substance in the hybridization step, prior to or after this step. A complex with the substance is formed, and the amplification product is detected by the labeling substance.
  • Such labeling substances and labeling substance-binding substances are commercially available, and the production of labeling substances and labeling substance-binding substances and methods for labeling labeling substances etc. are also known. And can be obtained. Furthermore, binding between such a labeling substance or particles labeled with a labeling substance or a labeling substance binding substance and an oligonucleotide such as DNA can be appropriately performed via a functional group such as an amino group, and as such is itself in the field. It is well known.
  • Such primers can be synthesized according to a normal oligonucleotide synthesis method.
  • the linking site can be synthesized using a phosphoramidite reagent having an alkylene chain.
  • a reagent itself is known and can be obtained from, for example, GlenResearch.
  • the following reagents can be mentioned.
  • DMT represents a typical dimethoxytrityl group as a hydroxyl protecting group, but may be other known hydroxyl protecting groups.
  • PA represents a phosphoramidite group.
  • a nucleic acid amplification product having a hybridizing tag can detect a target nucleic acid with extremely high sensitivity and speed without being heat denatured when hybridized with a probe.
  • the nucleic acid amplification product acquisition step described above can be performed simultaneously on two or more target nucleic acids.
  • the process of simultaneously obtaining a plurality of amplification products associated with a plurality of target nucleic acids is generally referred to as multiplex PCR.
  • This detection method is particularly significant when nucleic acid amplification products are obtained from a plurality of target nucleic acids, respectively.
  • a plurality of primer sets are used according to each target nucleic acid.
  • it is often difficult to suppress the formation of primer dimers, and there is a high possibility of exhibiting false positives.
  • hybridization process In this detection method, the nucleic acid amplification product is subjected to a hybridization tag preliminarily associated with a target nucleic acid and a probe preliminarily associated with the target nucleic acid under conditions that allow these hybridization products (target hybridization products) to be formed.
  • a hybridization step for contacting In this detection method, the nucleic acid amplification product is subjected to a hybridization tag preliminarily associated with a target nucleic acid and a probe preliminarily associated with the target nucleic acid under conditions that allow these hybridization products (target hybridization products) to be formed.
  • a hybridization step for contacting In this detection method, the nucleic acid amplification product is subjected to a hybridization tag preliminarily associated with a target nucleic acid and a probe preliminarily associated with the target nucleic acid under conditions that allow these hybridization products (target hybridization products) to be formed.
  • the conditions under which the target hybridized product can be formed can be appropriately set by those skilled in the art. That is, those skilled in the art can appropriately set the hybridization time, such as the hybridization temperature, the salt concentration of the hybridization solution, and the type of solvent.
  • the hybridization time such as the hybridization temperature, the salt concentration of the hybridization solution, and the type of solvent.
  • this detection method particularly in the case of chromatographic hybridization, for example, about 10 ° C. to 50 ° C., preferably about 20 ° C. to 35 ° C., about several minutes to several tens of minutes, typically within 30 minutes.
  • the hybridization step can be performed within 20 minutes.
  • the hybridization step if the nucleic acid amplification product is not preliminarily provided with a labeling substance based on the second primer or the like, a labeled probe having such a labeling substance or a label binding substance is appropriately supplied, The target hybridized product can be detected in the detection step in (1).
  • the step of denaturing the nucleic acid amplification product so that it can hybridize with the probe can be omitted.
  • the hybridization step is usually performed on a probe bound to a solid phase carrier.
  • the probe and solid phase carrier will be described later.
  • the form of hybridization is not limited to the form of hybridization (immersion type hybridization) performed by supplying a hybridization solution to the entire solid phase carrier on which the probe is immobilized.
  • it is a form of chromatography (development type hybridization) in which a hybridization solution that is also a mobile phase is supplied to a part of a solid phase body, and the hybridization solution is developed in a predetermined direction with respect to the solid phase body. May be.
  • chromatography development type hybridization
  • the development medium used for the hybridization step is preferably an aqueous medium.
  • the aqueous medium can be prepared by appropriately blending known components used for such chromatography.
  • the nucleic acid structure forming the by-product hybridization product may be an unreacted primer, a primer dimer-derived amplification product, or both of them. These tend to vary depending on primer sequences and hybridization conditions.
  • a step of removing unreacted primers and primer dimer-derived amplification products from a nucleic acid amplification reaction solution containing nucleic acid amplification products prior to the hybridization step As a method of suppressing the formation of by-product hybridized products that generate false positives, a step of removing unreacted primers and primer dimer-derived amplification products from a nucleic acid amplification reaction solution containing nucleic acid amplification products prior to the hybridization step. It is mentioned to carry out.
  • a DNA adsorbent such as polyethylene glycol (average molecular weight of about 3000 to 10000, preferably about 6000 to 10000, more preferably about 8000)
  • a relatively long nucleic acid amplification product (nucleic acid amplification intended herein)
  • the product is generally adsorbed on the order of 100 bp to 1000 bp).
  • unreacted primers or primer dimer-derived amplification products of 100 bp or less, generally 60 bp or less, can be separated as supernatant and nucleic acid amplification products as pellets.
  • the DNA adsorbent such as polyethylene glycol can be removed by washing the pellet with ethanol.
  • Non-patent Document 1 For such purification, typically, commercially available primers and primer dimer-derived amplification product removal reagents described in Non-patent Document 1 can be used.
  • nucleic acid amplification product For removal of unreacted probes, etc., add a solution with a density that allows nucleic acid amplification products to be pelleted into the nucleic acid amplification reaction solution and separate unreacted probes into supernatant, mix well, etc. Centrifugation by gravity and time. By washing the nucleic acid amplification product obtained as a pellet with ethanol or the like and obtaining it again as a pellet, a nucleic acid amplification product from which the nucleic acid structure has been removed can be obtained.
  • Preceding hybridization As another method, prior to the hybridization step, at least a part of at least one nucleic acid structure capable of generating a false positive hybridization product and a masking agent capable of hybridizing with the part are hybridized. For example, performing a pre-hybridization step to form a soy clean-up hybridization product. According to the preceding hybridization step, an undesired nucleic acid structure can be removed (captured) as a clean-up hybridization product easily and quickly.
  • the second primer that can hold the labeling substance or the label-binding substance used for amplification.
  • a masking agent that is a nucleic acid capable of hybridizing to at least a part of the second identification sequence.
  • the pre-hybridization step for forming a clean-up hybridization product that removes unreacted amplification primers it is performed under conditions for forming a clean-up hybridization product. Since the unreacted primer generally exists in a single strand in the nucleic acid amplification reaction solution, a cleanup hybrid product is easily formed by supplying a masking agent.
  • FIG. 2B In order to form a cleanup hybrid product that removes (captures) the amplification product derived from the primer dimer between the first primer and the second primer capable of holding the labeling substance or the label-binding substance, it is shown in FIG. 2B.
  • the same as at least a part of these constituent strands ie, the first primer extension and the second primer extension in the primer dimer amplification product) so as to suppress reannealing of the primer dimer-derived amplification product, or
  • a masking agent that is a nucleic acid that hybridizes can be used.
  • a masking agent which is a nucleic acid that is the same as or hybridizable to at least a part of the first identification sequence of the first primer, can be mentioned.
  • a masking agent that is a nucleic acid that is the same as or hybridizable to at least a part of the second identification sequence of the second primer can be used.
  • the masking agent is preferably not hybridizable to the hybridizing tag or label tag.
  • the pre-hybridization step for forming a cleanup hybrid product that captures the primer dimer amplification product may be performed under conditions for forming such a cleanup hybrid product. Since the primer-dimer amplification product is generally present in double strands in the nucleic acid amplification reaction solution, it cannot form a cleanup hybrid product with the masking agent unless it is once denatured and melted into a single-stranded state.
  • Such denaturation treatment may be heat denaturation treatment (heat melting treatment), or may be a denaturation treatment with a chemical substance.
  • the chemical modification treatment is simpler, safer and can be carried out quickly in that no heating is involved.
  • the heat denaturation treatment is usually performed by heating to about 90 ° C. to 95 ° C. and maintaining for a predetermined time, for example, about 1 to 5 minutes.
  • a predetermined time for example, about 1 to 5 minutes.
  • after heat processing in order to form a cleanup hybrid product by re-annealing, it cools rapidly or cools.
  • the Tm of the nucleic acid amplification product is higher than the Tm of the nucleic acid structure, the nucleic acid amplification product is not denatured and can be denatured under a temperature condition that allows only the nucleic acid structure to be denatured.
  • alkaline conditions can be employed. Modification by alkaline conditions can be carried out by those skilled in the art by setting an appropriate concentration using an alkali selected from known organic alkalis and inorganic alkalis.
  • an acid is added to neutralize the denaturation treatment with an alkali in order to form a clean-up hybridized product. Urea and dimethylformamide can be decomposed with urease.
  • the masking agent may be supplied to the nucleic acid amplification reaction solution prior to the denaturing treatment, may be supplied during the denaturing treatment (during heating, etc.), or supplied in the subsequent reannealing process. May be.
  • the masking agent is composed of nucleic acid as defined in this specification.
  • the masking agent is generally supplied as a DNA single strand or as an appropriately hybridized DNA double strand.
  • the masking agent can be used in an amount of 2.5 pmol or more and 2.5 nmol or less with respect to a reaction result of 250 fmol as an initial amount of the amplification primer set, for example. Within this range, the formation of by-product hybridized products can be suppressed by the masking agent.
  • the nucleic acid amplification product or the nucleic acid amplification reaction solution that has been subjected to the removal step of such unreacted primers is subjected to a hybridization step with the probe.
  • this hybridization step the formation of a by-product hybridization product with an unreacted second probe that includes (or will have) a preceding probe and a labeling substance or a labeling substance-binding substance is suppressed. Detection is suppressed or avoided.
  • the formation of by-product hybridization products between the primer dimer-derived amplification product and the probe that includes (or will have) the labeling substance or the labeling substance-binding substance is suppressed. Detection is suppressed or avoided. As a result, the target nucleic acid can be detected simply and quickly with high accuracy.
  • the formation of the clean-up hybrid product can greatly simplify the operation compared to the removal step of the primer and the like, and thus the contribution to simplification and speeding up of the detection of the target nucleic acid is greater.
  • the probe used in the hybridization step is used in a state immobilized on a solid support.
  • Each probe has a detection sequence which is a unique base sequence for probing.
  • a detection sequence can be set as a sequence characteristic of the target nucleic acid, or can be set independently of the target sequence.
  • Hybridization conditions such as temperature and time suitable for hybridization so that the non-specific binding between multiple probes can be suppressed or avoided by setting the probe detection sequence independently of the target sequence. Can be set in consideration.
  • the same detection probe can always be used regardless of the type of target nucleic acid.
  • the length of the detection sequence is not particularly limited, but is preferably 20 bases or more and 50 bases or less. This is because within this range, hybridization efficiency can be ensured while ensuring the specificity of each detection sequence.
  • a base length detection sequence includes a 46 base length sequence obtained by combining two base sequences each having a base length of 23 bases each selected from SEQ ID NOs: 1 to 100 and a complementary sequence thereof, and the combined base sequence. Can be obtained by appropriately adding or deleting a base. More preferably, it is 20 bases or more and 25 bases or less.
  • such a base length detection sequence can be obtained by appropriately adding or deleting bases to the 23 base length sequences of SEQ ID NOS: 1 to 100 and their complementary sequences or these base sequences. it can.
  • the tag sequence in the first primer is a base sequence that is paired with the detection sequence
  • the base length of the tag sequence is preferably 20 bases or more and 50 bases or less, like the detection sequence. Preferably, it is 20 bases or more and 25 bases or less.
  • the base sequences described in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 100 or a base sequence complementary to this base sequence can be used. These base sequences all have the same base length (23 base length), and have a melting temperature (Tm) of 40 ° C. or higher and 80 ° C. or lower, preferably 50 ° C. or higher and 70 ° C. or lower. In hybridization at about 15 ° C., a homogeneous hybridization result can be obtained. However, for hybridization in the form of chromatography, use at room temperature (20 ° C ⁇ 15 ° C) is assumed, and among these, a combination of probes that hardly cause nonspecific reaction between probes at about 15 ° C is used. Yes.
  • the detection sequence for the detection probe used at the same time is selected from the group of the base sequences (groups) represented by SEQ ID NOs: 1 to 100 or the complementary base sequence (group) to these. Is preferred.
  • the detection sequence in such a probe is also called an orthonormalization sequence, and is described in detail in H. YoshidaYand A.Suyama, “Solution to 3-SAT by breadth first search”, DIMACS Vl.54, 9-20 (2000). Is described. Orthonormalized sequences can be designed using the methods described in these references.
  • the probe is immobilized on a carrier.
  • a carrier a solid phase carrier can be used.
  • the carrier may be plastic or glass, and the material is not particularly limited.
  • porous bodies such as a cellulose, a nitrocellulose, and nylon, may be sufficient. This type of porous carrier is particularly suitable for hybridizing the detection probe immobilized on the solid phase carrier and the amplified fragment by affinity chromatography.
  • the shape of the carrier may be a flat plate shape, but may be a bead shape, and the shape is not particularly limited.
  • the solid phase is preferably an array (particularly a microarray) in which the carrier is in the form of a solid plate and a plurality of detection probes are fixed in a fixed arrangement.
  • the array can fix a large number of probes, and is convenient for comprehensively detecting various target nucleic acids at the same time.
  • the end of the carrier has a size (width direction) and shape that can be immersed in a hybridization solution supplied to a microtube such as a trademark.
  • a hybridization solution supplied to a microtube such as a trademark.
  • it is a long body provided with a part that can be accommodated from the vicinity of the bottom of this type of tube to the upper end.
  • the solid phase carrier used for chromatography hybridization examples include so-called porous materials mainly composed of polymers such as polyethersulfone, nitrocellulose, nylon, and polyvinylidene fluoride. Cellulose materials such as filter paper can also be preferably used.
  • the probe-immobilized body for chromatography does not necessarily need to be composed of a single solid phase carrier. As long as the development medium can be moved by capillary action as a whole, it may be connected by a plurality of solid phase carriers. Moreover, the whole form of the probe immobilized body for chromatography is not particularly limited. Any form such as a sheet form or a thin bar form capable of developing and diffusing the chromatographic liquid by the capillary phenomenon may be used. Preferably, it is an elongate body, and one edge part along the longitudinal direction contacts the developing medium of chromatography.
  • the detection step is a step of detecting the target hybridization product based on the labeling substance. More specifically, it is a step of confirming the position of the hybridized product with a signal specific to the labeling substance. In order to detect the signal by the labeling substance, it is appropriately selected according to the type of the labeling substance. When a specific binding reaction or a color reaction with an enzyme is required, such an operation is appropriately performed.
  • the labeling substance is a labeling substance that presents color development or luminescence that can be detected with the naked eye, such as latex particles, gold colloidal particles, and silver colloidal particles, the presence of the target nucleic acid and its amount (color density) immediately with the naked eye. Etc.) can be detected. For this reason, further rapid detection is possible.
  • the method for purifying a nucleic acid amplification product disclosed in the present specification comprises a nucleic acid amplification product comprising a double-stranded portion and a tag strand that is a single-stranded portion located protruding from at least one end of the double-stranded portion.
  • a step of providing a masking agent capable of hybridizing with at least a part of one kind of nucleic acid structure is provided.
  • This purification method expresses the previous hybridization step of the detection method described above as a method for purifying a nucleic acid amplification product. This purification method can also be carried out as a pretreatment method prior to detection of the target nucleic acid by hybridization.
  • the purification agent for a nucleic acid amplification product disclosed in the present specification is characterized in that the nucleic acid amplification product is a double-stranded part and a single-stranded part located protruding from at least one end of the double-stranded part.
  • a nucleic acid amplification product comprising a hybridization tag capable of hybridizing with a probe; The following (a) and (b); (A) An amplification primer capable of holding a labeling substance or a labeling substance binding substance (b) At least selected from amplification products derived from dimers of amplification primers including an amplification primer capable of holding a labeling substance or labeling substance binding substance A masking agent capable of hybridizing with at least a part of one kind of nucleic acid structure may be included.
  • This purification agent represents the masking agent used in the preceding hybridization step of the detection method already described as a purification agent for nucleic acid amplification products.
  • This purification agent can also be implemented as a pretreatment reagent prior to detection of the target nucleic acid by hybridization.
  • the detection kit disclosed in the present specification comprises a double-stranded portion and a hybridizing tag that is located at one end of the double-stranded and protrudes from at least one end of the double-stranded portion and can hybridize with a probe.
  • At least a pair of amplification primers for obtaining a nucleic acid amplification product The following (a) and (b); (A) An amplification primer capable of holding a labeling substance or a labeling substance binding substance (b) At least selected from amplification products derived from dimers of amplification primers including an amplification primer capable of holding a labeling substance or labeling substance binding substance And a masking agent capable of hybridizing with at least a part of one kind of nucleic acid structure.
  • This detection kit is expressed as a combination of a primer set used in the above-described detection method and a masking agent used in the preceding hybridization step, and a target nucleic acid detection kit.
  • the detection kit may further be combined with a probe immobilized body for chromatography used for nucleic acid chromatography.
  • the target nucleic acid was detected by the following method.
  • a capture DNA probe solution comprising a base sequence shown in the following table on a Hi-Flow Plus membrane sheet (60 mm x 600 mm) manufactured by Merck Millipore is described in JP-A-2003-75305. Spotting was performed using GENISHOT (registered trademark) spotter using NGK Corporation using a discharge unit (inkjet method).
  • UV irradiation apparatus (XL-1500UV Crosslinker) manufactured by Spectroline, irradiation with ultraviolet light of about 200 to 500 mJ / cm 2 was performed for immobilization.
  • the amplification reagent is transferred to the thermal cycle plate, and the thermal cycle reaction (after 95 minutes at 95 ° C .; 30 seconds at 95 ° C., 1 second at 80 ° C., 40 minutes for 6 minutes at 64 ° C., then lowered to 10 ° C.) ) To obtain an amplified sample.
  • a PCR sample was used as a control sample by performing a PCR reaction with the same composition (PCR (water (Funakoshi)) as the above reagent except that it did not contain genomic DNA.
  • the purified sample was purified by QIAGEN's MinElute® PCR® Purification® Kit, and then confirmed to have been amplified by the intended length by agarose electrophoresis.
  • Hybridization pretreatment sample composition PCR complete sample 10.0 ⁇ l
  • Complementary sequence single-stranded synthetic DNA mixed aqueous solution (10 ⁇ M, each) 10.0 ⁇ l Total 20.0 ⁇ l
  • Hybridized sample composition Hybri Solution * (0.5% Tween20-1% BSA-PBS) 200.0 ⁇ l Biotin-labeled oligo DNA with a sequence complementary to the D1-100 probe sequence (25 ⁇ M) 4.0 ⁇ l Sample 4.0 ⁇ l Total 208.0 ⁇ l
  • Membrane-type DNA microarray is cut into a size that can fit into a 0.2 ml tube, set in the tube, and 200 ⁇ l of each prepared hybridized sample is added without heating for denaturation, etc., and heated at a heat block temperature of 37 ° C. for 30 minutes. Hybridization reaction was performed for 1 minute.
  • the membrane type DNA microarray was transferred to a 0.2 ml tube containing a washing solution (0.1% Tween 20-1 mM EDTA-TBS) and washed in a 37 ° C. heat block (37 ° C. ⁇ 1 min, 37 ° C. ⁇ 10 min, 37 ° C. ⁇ 1 min).
  • the washed membrane type DNA microarray was transferred to a 0.2 ml tube containing a mixed solution of biotin-HRP and streptavidin, and reacted at room temperature for 20 minutes.
  • the membrane type DNA microarray was transferred to a 0.2 ml tube containing a washing solution (0.1% Tween 20-1 mM EDTA-TBS) and washed (room temperature ⁇ 1 min, room temperature ⁇ 10 min, room temperature ⁇ 1 min).
  • the washed membrane type DNA microarray was subjected to a color reaction for about 5 minutes at room temperature using TMB Peroxidase Substrate Kit, 3, 3 ', 5, 5'-tetramethylbenzidine, manufactured by Vector Laboratories.
  • the amplification sample and control sample subjected to the previous hybridization step were visually confirmed for color development after the array was dried.
  • the results are shown in FIG.
  • the upper part of FIG. 9 shows the result of the amplified sample. As shown in the upper part of FIG. 9, it was confirmed that all the amplified fragments 1 to 4 were colored at each probe position (D1-001,002,003,005) on the membrane.
  • the result of the control sample is shown in the lower part of FIG. As shown in the lower part of FIG. 9, color development was not confirmed at each probe position (D1-001, 002, 003, 005) on the membrane that reacts when fragments 1 to 4 were amplified. It was found that the formation of the hybridized product was suppressed.
  • FIG. 10 shows the results of the amplified sample and the control sample that were not subjected to the preceding hybridization step.
  • each probe position (D1-001, 002, 003) on the membrane reacts when fragments 1 to 4 are amplified. , 005), color development was confirmed.
  • color development was confirmed at each probe position (D1-001, 002, 003, 005) on the membrane. It was. That is, it was found that a false positive reaction occurred.
  • a UV irradiation apparatus (XL-1500 UV Crosslinker) manufactured by Spectroline was used, and the irradiation was performed with irradiation with ultraviolet light of about 300 mJ / cm 2 at a wavelength including a component of 280 nm.
  • Hybridization pretreatment sample composition PCR complete sample 10.0 ⁇ l
  • Complementary sequence single-stranded synthetic DNA mixed aqueous solution (10 ⁇ M, each) 10.0 ⁇ l Total 20.0 ⁇ l
  • the latex stock solution used in the present invention is prepared by coating a polystyrene latex bead containing a blue colorant with avidin (streptavidin) with a chromatographic developing solution so that it has an arbitrary concentration. Used.
  • Hybridization and color reaction 42 ⁇ l of each of the above samples was added to a 0.2 ml tube, and chromatography was inserted to start the reaction. The sample solution was all sucked up in about 20 minutes, and the reaction was completed. After completion of the reaction, the chromatography was air-dried, and the reaction site was visually confirmed and an image was taken.
  • the amplification sample and control sample subjected to the previous hybridization step were visually confirmed for color development after the array was dried.
  • the results are shown in FIG.
  • the upper part of FIG. 12 shows the result of the amplified sample subjected to the preceding hybridization step. As shown in the upper part of FIG. 12, it was confirmed that all of the amplified fragments 1 to 4 were colored at each probe position (D1-001,002,003,005) on the chromatography.
  • the results for the control sample are shown in the lower part of FIG. As shown in the lower part of FIG. 12, in the case of the control sample, color development was not confirmed at each probe position (D1-001,002,003,005) on the membrane that reacts when fragments 1 to 4 were amplified. It was found that the formation of by-product hybridized products showing positive was suppressed.
  • FIG. 13 shows the results of the amplified sample and the control sample that were not subjected to the preceding hybridization step.
  • color development occurs at each probe position (D1-001, 002, 003, 005) on the membrane that reacts when fragments 1 to 4 are amplified even when the preceding hybridization step is not performed. confirmed.
  • color development was confirmed at each probe position (D1-001,002,003,005) on the membrane, unlike the case where the preceding hybridization step was performed. It was. That is, it was found that a false positive reaction occurred.
  • pretreatment using alkali / SDS and a masking agent was evaluated prior to immersion type hybridization.
  • the amplified sample of the sample gene obtained in Example 1 was pretreated according to the following procedure and then detected using a membrane type DNA microarray according to Example 1.
  • a sequence complementary to the primer sequence used in the amplification step (of which is a sequence specific to the human genomic DNA sequence), as in Example 1, for the amplified sample obtained in the sample gene amplification step in Example 1 Add an appropriate amount of an aqueous solution mixed with single-strand synthetic DNA (masking agent), add 0.1N sodium hydroxide / 1% SDS aqueous solution, mix, and then add 3M sodium acetate aqueous solution (pH 4.8) and mix. After carrying out the steps, amplification products were detected using the membrane type DNA microarray described in Example 1. As a control, a PCR reaction was performed with the same composition as the above reagent (PCR water (Funakoshi)) except that genomic DNA was not included, and the same operation was performed.
  • PCR water PCR water (Funakoshi)
  • Hybridization pretreatment sample composition PCR complete sample 10.0 ⁇ l
  • Complementary sequence single-stranded synthetic DNA mixed solution (10 ⁇ M, each) 10.0 ⁇ l 0.1N sodium hydroxide / 1% SDS aqueous solution 5.0 ⁇ l 3M sodium acetate aqueous solution (pH4.8) 5.0 ⁇ l Total 30.0 ⁇ l
  • the amplified sample and the control sample were amplified. It was found that the false positive reaction can be suppressed by returning to neutral after alkali / SDS denaturation. That is, the primer-dimer that may be present in the amplified sample and the control sample is once denatured, and the resulting single-stranded primer and single-stranded synthetic DNA (masking agent) are hybridized to suppress false positive reactions. I found out. Moreover, from these results, it was found that the dimer formation was suppressed by forming a hybridized product of the primer and the masking agent after eliminating the primer dimer by the pretreatment.
  • pretreatment using an alkali / SDS and a masking agent was evaluated prior to development-type hybridization.
  • Example 2 After pretreatment of the amplified sample obtained in the sample gene amplification step in Example 1 according to the following procedure, detection using chromatography was performed according to Example 2.
  • Hybridization pretreatment sample composition PCR complete sample 10.0 ⁇ l
  • Complementary sequence single-stranded synthetic DNA mixed solution (10 ⁇ M, each) 10.0 ⁇ l 0.1N sodium hydroxide / 1% SDS aqueous solution 5.0 ⁇ l 3M sodium acetate aqueous solution (pH4.8) 5.0 ⁇ l Total 30.0 ⁇ l
  • the amplified sample was once denatured with alkali / SDS in the presence of single-stranded synthetic DNA complementary to the identification sequence in the primer used in the PCR reaction, and neutralized with respect to the amplified sample and the control sample. It turned out that a false positive reaction can be suppressed by returning to (1). Moreover, from these results, it was found that the dimer formation was suppressed by forming a hybridized product of the primer and the masking agent after eliminating the primer dimer by the pretreatment using alkali / SDS.
  • the pretreatment using urea and a masking agent was evaluated prior to the development-type hybridization.
  • Hybridization pretreatment sample composition PCR complete sample 10.0 ⁇ l
  • Complementary sequence single-stranded synthetic DNA mixed solution (10 ⁇ M, each) 10.0 ⁇ l 1M urea aqueous solution 5.0 ⁇ l 1% urease aqueous solution 5.0 ⁇ l Total 30.0 ⁇ l
  • the amplified sample is once denatured with urea in the presence of a single-stranded synthetic DNA complementary to the identification sequence in the primer used in the PCR reaction, and then urea is removed.
  • urea a single-stranded synthetic DNA complementary to the identification sequence in the primer used in the PCR reaction
  • Example 5 when the detection was carried out by changing the 1M urea aqueous solution to the 1M formamide aqueous solution, the same effect as in Example 5 was confirmed. From these results, it was found that the dimer formation was suppressed by forming a hybridized product of the primer and the masking agent after eliminating the primer dimer by the pretreatment using DMF.
  • Hybridization to a chromatographic probe was performed using 5 ′ biotin-labeled oligo DNA having the base sequence described below as a sample. This base sequence is not completely complementary to the probe D1_2.
  • a pretreatment solution containing a single-stranded synthetic DNA (5′- GCAGTGGCTTGGTTCATATAGGC-3) (SEQ ID NO: 118) as a masking agent was prepared and mixed well as described below for pretreatment.
  • the pretreatment liquid was chromatographed according to Example 2.
  • a chromatographic solution was prepared with the same composition as the following pretreatment sample composition except that the amount of the sample was increased by 4 ⁇ l instead of 5 ⁇ l of the masking agent solution, and chromatography was performed according to Example 2.
  • Hybridization pretreatment sample composition Sample (0.8 ⁇ M) 5.0 ⁇ l Complementary sequence single-stranded synthetic DNA mixed aqueous solution (10 ⁇ M, each) 5.0 ⁇ l Developing solution * 30.0 ⁇ l Latex solution * 2.0 ⁇ l Total 42.0 ⁇ l
  • Sample composition II Developing solution 30.0 ⁇ l Latex solution 2.0 ⁇ l Sample 1 (0.8 ⁇ M) 5.0 ⁇ l Sample 2 (0.8 ⁇ M) 5.0 ⁇ l Total 42.0 ⁇ l
  • Sample composition III Developing solution 30.0 ⁇ l Latex solution 2.0 ⁇ l Sample 1 (1.6 ⁇ M) 2.5 ⁇ l Sample 2 (1.6 ⁇ M) 2.5 ⁇ l Sample 3 (10 ⁇ M) 5.0 ⁇ l Total 42.0 ⁇ l
  • sample composition III strong color development equivalent to sample composition I was confirmed in the probe (D1-002). This means that the unreacted primer was masked with a complementary sequence masking agent, so that the non-specific reaction was eliminated and the reaction result of the sample to be reacted was obtained properly. Show.

Abstract

二本鎖部分と、当該二本鎖部分の少なくとも一方の端部に突出して位置される一本鎖部分であるタグ鎖と、を備え、標的核酸に関連付けられる核酸増幅産物と、前記タグ鎖の１つとハイブリダイズ可能なプローブとを、第１のハイブリダイズ産物が形成可能な条件で接触させるハイブリダイゼーション工程、を備え、　前記ハイブリダイゼーション工程において、　以下の（ａ）及び（ｂ）； （ａ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマー （ｂ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマーを含む増幅用プライマーのダイマー由来の増幅産物 から選択される少なくとも一種の核酸構造体と前記プローブとのと副生ハイブリダイズ産物の形成を抑制するようにする。

Description

標的核酸の検出方法
　本明細書は、標的核酸の検出方法に関する。
（関連出願の相互参照）
　本出願は、２０１３年７月２４日に出願された日本国特許出願である特願２０１３－１５３２８８及び２０１４年４月１日に出願された日本国特許出願である特願２０１４－０７５４６９に基づく優先権を主張するものであり、この日本出願に記載された全ての内容を本明細書に援用するものである。
　標的核酸の検出方法として、標的核酸に基づき、ＤＮＡ二本鎖断片の末端に一本鎖のタグを付加したものをＰＣＲの増幅産物として取得し、この増幅産物のタグの相補鎖をプローブとしてクロマトグラフィーを用いることが開示されている（特許文献１、２）。これらの方法では、通常用いられるプライマーの５’末端側に、ＤＮＡポリメラーゼ反応を阻害又は抑制するように修飾した一本鎖タグとなる領域を有している。こうしたプライマーを用いることで、このプライマーの伸長産物とハイブリダイズするプライマーは、一本鎖タグに相補鎖を形成するように伸長されることはない。こうした伸長反応の繰り返しにより、結果として、一本鎖タグを備える増幅産物が得られる。
　一方、核酸増幅後におけるプライマー、プライマーダイマーを除去できる試薬も開示されている（非特許文１、２）。この方法では、増幅産物にその試薬を添加し、静置後、１３０００ｇで１０分間遠心後、ペレットをエタノール洗浄し、１４０００ｇで遠心してペレットを採取することで、プライマーやプライマーダイマー等の１００ｂｐ以下程度の低分子ＤＮＡを除去できることが記載されている。
国際公開第２０１２／０７０６１８号 国際公開第２０１３／０３９２２８号
Ｗａｋｏ ＢｉｏＷｉｎｄｏｗ １０，Ｎｏ．９１、ｐ．５（和光純薬工業株式会社、２００８年１０月発行）
　ＰＣＲの増幅産物には、標的核酸に関連付けられる増幅産物のほか、未反応プライマーが含まれうるし、また、プライマーの塩基配列によっては、プライマーダイマーの増幅産物が含まれうる。こうした副生成物は、通常のハイブリダイゼーションではプローブと反応することが想定しにくかった。
　核酸増幅産物に付与した一本鎖タグをプローブへのハイブリダイズ部位とする系では、変性して核酸増幅産物を一本鎖にすることなく、そのままプローブとハイブリダイズさせることができるという利点がある。また、比較的低温でハイブリダイゼーションを実施できるという利点もある。
　しかしながら、本発明者らによれば、熱変性を省略し比較的低温でハイブリダイゼーションを実施する場合には、予想を超えて、こうした未反応プライマーやプライマーダイマーの増幅産物が、プローブとハイブリダイズ産物を形成してしまうことがわかった。この結果、標識物質や標識物質に結合しうる標識物質結合物質を備えるプライマーやプライマータイマー由来の増幅産物がプローブとハイブリダイズ産物を形成すると、偽陽性となってしまうことがわかった。
　本明細書は、こうした課題に鑑み、一本鎖タグを付与した核酸増幅産物とプローブとのハイブリダイゼーションを、良好な確度で実施することができる、標的核酸の検出方法を提供する。
　本発明者らは、種々検討した結果、増幅反応の副生成物とプローブとのハイブリダイズ産物の形成を抑制することにより、偽陽性を抑制できるという知見を得た。この知見に基づき、本明細書は、以下の手段を提供する。
（１）標的核酸の検出方法であって、
　二本鎖部分と、当該二本鎖の少なくとも一方の端部に突出して位置される一本鎖部分であるタグ鎖と、を備え、標的核酸に関連付けられる核酸増幅産物と、前記タグ鎖の１つとハイブリダイズ可能なプローブとを、目的ハイブリダイズ産物が形成可能な条件で接触させるハイブリダイゼーション工程、
を備え、
　前記ハイブリダイゼーション工程において、
　以下の（ａ）及び（ｂ）；
（ａ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマー
（ｂ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマーを含む増幅用プライマーのダイマー由来の増幅産物
から選択される少なくとも一種の核酸構造体と前記プローブとのと偽陽性を呈する副生ハイブリダイズ産物の形成を抑制する、検出方法。
（２）前記ハイブリダイゼーション工程に先立って、
　前記少なくとも一種の核酸構造体の少なくとも一部と、当該一部とハイブリダイズ可能なマスキング剤と、がハイブリダイズしたクリーンアップハイブリダイズ産物を形成する先行ハイブリダイゼーション工程
を備える、（１）に記載の検出方法。
（３）前記先行ハイブリダイゼーション工程は、前記クリーンアップハイブリダイズ産物を、前記（ｂ）の核酸構造体を融解後、前記（ｂ）の核酸構造体の構成鎖と前記マスキング剤とから形成する、（２）に記載の検出方法。
（４）前記先行ハイブリダイゼーション工程は、前記（ｂ）の核酸構造体を熱融解する、（３）に記載の検出方法。
（５）　前記先行ハイブリダイゼーション工程は、前記（ｂ）の核酸構造体を酸又はアルカリで融解する、（３）に記載の検出方法。
（６）　前記先行ハイブリダイゼーション工程は、前記（ｂ）の核酸構造体を核酸変性剤で融解する、（３）に記載の検出方法。
（７）前記マスキング剤は、前記（ａ）の核酸構造体の少なくとも一部とハイブリダイズ可能な核酸であるマスキング剤を含む、（２）～（６）いずれかに記載の方法。
（８）前記マスキング剤は、前記（ｂ）の核酸構造体の少なくとも一部と同一又はハイブリダイズ可能な核酸であるマスキング剤を含む、（２）～（７）のいずれかに記載の方法。
（９）前記核酸増幅産物は、前記二本鎖部分と、前記二本鎖の一方の端部にのみ突出して位置される一本鎖部分であるタグ鎖と、を備える核酸増幅産物を含む、（１）～（８）のいずれかに記載の検出方法。
（１０）前記ハイブリダイゼーション工程は、クロマトグラフィー形態で実施する、（１）～（９）のいずれかに記載の検出方法。
（１１）　前記ハイブリダイゼーション工程は、浸漬型ハイブリダイゼーションの形態で実施する、（１）～（９）のいずれかに記載の検出方法。
（１２）核酸増幅産物の精製方法であって、
　二本鎖部分と、当該二本鎖の少なくとも一方の端部に突出して位置される一本鎖部分であるタグ鎖を備える核酸増幅産物の存在下で、
以下の（ａ）及び（ｂ）；
（ａ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマー
（ｂ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマーを含む増幅用プライマーのダイマー由来の増幅産物
から選択される少なくとも一種の核酸構造体の少なくとも一部とハイブリダイズ可能なマスキング剤をハイブリダイズ可能に付与する工程
を備える、精製方法。
（１３）核酸増幅産物の精製剤であって、
　前記核酸増幅産物は、二本鎖部分と、当該二本鎖の少なくとも一方の端部に突出して位置される一本鎖部分であるタグ鎖を備える核酸増幅産物であり、
　以下の（ａ）及び（ｂ）；
（ａ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマー
（ｂ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマーを含む増幅用プライマーのダイマー由来の増幅産物
から選択される少なくとも一種の核酸構造体の少なくとも一部とハイブリダイズ可能なマスキング剤を含む、精製剤。
（１４）二本鎖部分と、当該二本鎖の少なくとも一方の端部に突出して位置される一本鎖部分であるタグ鎖を備える核酸増幅産物を得るための少なくとも一対の増幅用プライマーと、
　以下の（ａ）及び（ｂ）；
（ａ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマー
（ｂ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマーを含む増幅用プライマーのダイマー由来の増幅産物
から選択される少なくとも一種の核酸構造体の少なくとも一部とハイブリダイズ可能なマスキング剤と、
を含むキット。
（１５）さらに、核酸クロマトグラフィーに用いるクロマトグラフィー用プローブ固定化体を含む、（１４）に記載のキット。
副生ハイブリダイズ産物の形成状態を示す図である。 本発明の検出方法におけるクリーンアップハイブリダイズ産物形成状態の一例を示す図である。 本発明の検出方法におけるクリーンアップハイブリダイズ産物形成状態の他の一例を示す図である。 一本鎖タグを有する核酸増幅産物の増幅の一例を示す図である。 一本鎖タグを有する核酸増幅産物の増幅の他の一例を示す図である。 一本鎖タグを有する核酸増幅産物の一例を示す図である。 一方の端にハイブリダイズタグを備え他方の端に標識物質を備える核酸増幅産物の増幅工程を示す図である。 一方の端にハイブリダイズタグを備え他方の端に標識物質結合物質を備える核酸増幅産物の増幅工程を示す図である。 二本鎖部分に標識物質又は標識物質結合物質を備える核酸増幅産物の増幅工程を示す図である。 実施例１で用いたメンブレンアレイ上のプローブの配置状態を示す平面図である。 実施例１におけるハイブリダイゼーションにおける結果（先行ハイブリダイゼーション工程を実施した場合）を示す図である。 実施例１におけるハイブリダイゼーションにおける結果（先行ハイブリダイゼーション工程を実施しない場合）を示す図である。 実施例２で用いたクロマトグラフィーにおけるプローブの配置状態を示す平面図である。 実施例２におけるクロマトグラフィー型ハイブリダイゼーションにおける結果（先行ハイブリダイゼーション工程を実施した場合）を示す図である。 実施例２におけるクロマトグラフィー型ハイブリダイゼーションにおける結果（先行ハイブリダイゼーション工程を実施しない場合）を示す図である。 実施例３におけるハイブリダイゼーションにおける結果を示す図である。 実施例４におけるクロマトグラフィー型ハイブリダイゼーションにおける結果を示す図である。 実施例５におけるクロマトグラフィー型ハイブリダイゼーションにおける結果を示す図である。 実施例７におけるクロマトグラフィー型ハイブリダイゼーションにおける結果を示す図である。 実施例８におけるクロマトグラフィー型ハイブリダイゼーションにおける結果を示す図である。
　本明細書は、標的核酸の検出方法、核酸増幅産物の精製方法、核酸増幅産物の精製剤及び検出キット等に関する。
　本明細書の開示によれば、一本鎖タグをプローブとのハイブリダイズ部位として備える核酸増幅産物に付随しうる未反応プライマー、プライマーダイマー増幅産物などの核酸構造体とプローブとのハイブリダイズ産物を排除することで、意図しないハイブリダイズ産物の形成を抑制して、意図した核酸増幅産物とプローブとのハイブリダイズ産物のみをハイブリダイゼーション工程において得ることができる。この結果、検出感度の低下や偽陽性を回避して確度の高い検出が可能となる。
　図１に、副生ハイブリダイズ産物の形成状態の概略を示す。
　さらに、図２に、副生ハイブリダイズ産物の形成が抑制された状態の概略を示す。図２に示すように、こうした核酸構造体の少なくとも一部とハイブリダイズ可能なマスキング剤とをハイブリダイズするようにすることで、核酸構造体のプローブとのハイブリダイズ能を抑制又は阻害することができる。この結果、簡易かつ迅速に副生ハイブリダイズ産物の形成を抑制でき、偽陽性の発生を抑制できる。非特許文献３，４記載のプライマーダイマー除去試薬を用いる場合、煩雑な操作と時間が必要となるが、各種核酸構造体とマスキング剤とをハイブリダイズさせることで、簡易でかつ短時間で副生ハイブリダイズ産物の形成を抑制できる。核酸構造体とマスキング剤とのハイブリダイズは、本来のハイブリダイゼーション工程に先立つ先行ハイブリダイゼーション工程や前処理等として実施できる。
　以下、本開示の代表的かつ非限定的な具体例について、適宜図面を参照して詳細に説明する。この詳細な説明は、本発明の好ましい例を実施するための詳細を当業者に示すことを単純に意図しており、本開示の範囲を限定することを意図したものではない。また、以下に開示される追加的な特徴ならびに発明は、さらに改善された標的核酸の検出方法を提供するために、他の特徴や発明とは別に、又は共に用いることができる。
　また、以下の詳細な説明で開示される特徴や工程の組み合わせは、最も広い意味において本開示を実施する際に必須のものではなく、特に本開示の代表的な具体例を説明するためにのみ記載されるものである。さらに、上記及び下記の代表的な具体例の様々な特徴、ならびに、独立及び従属クレームに記載されるものの様々な特徴は、本開示の追加的かつ有用な実施形態を提供するにあたって、ここに記載される具体例のとおりに、あるいは列挙された順番のとおりに組合せなければならないものではない。
　本明細書及び／又はクレームに記載された全ての特徴は、実施例及び／又はクレームに記載された特徴の構成とは別に、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、個別に、かつ互いに独立して開示されることを意図するものである。さらに、全ての数値範囲及びグループ又は集団に関する記載は、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、それらの中間の構成を開示する意図を持ってなされている。
　以下、本明細書の開示に関するいくつかの実施形態を、適宜図面を参照して説明する。なお、本明細書において「核酸」とは、ヌクレオチドの重合体を意味しており、その数は特に限定しない。核酸は、数十程度のヌクレオチドが連結したオリゴヌクレオチドが包含され、さらに長いポリヌクレオチドも包含される。核酸は、ＤＮＡ１本鎖若しくは二本鎖のほか、ＲＮＡ一本鎖若しくは二本鎖、さらには、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラなども包含される。また、核酸は、天然の塩基、ヌクレオチド及びヌクレオシドからなるもののほか、非天然の塩基、ヌクレオチド、ヌクレオシドを一部に含むものであってもよい。また、核酸は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡおよび合成ＲＮＡを含む全てのＤＮＡおよびＲＮＡのほかペプチド核酸、モルホリノ核酸、メチルフォスフォネート核酸およびＳ－オリゴ核酸などの人工合成核酸を含む。また、１本鎖であっても２本鎖であってもよい。
　また、本明細書において「標的核酸」とは、特に限定されないでその存在及び／又は量を検出するべき任意の核酸である。標的核酸は、天然のあるいは人工的に合成されたものであってもよい。天然の標的核酸としては、例えば、体質、遺伝病、癌などの特定疾患についての発症、疾患診断、治療予後、薬剤や治療の選択などのヒト、非ヒト動物などの生物における遺伝子上の指標となる塩基あるいは塩基配列を含んでいる。典型的には、ＳＮＰなどの多型や先天的又は後天的変異が挙げられる。また、病原菌やウイルスなどの微生物由来の核酸なども標的核酸に含まれる。また、合成の標的核酸としては、人為的になんらかの識別のために合成された核酸が挙げられる。また、ある種の天然あるいは人工の核酸に対して核酸増幅反応を行って得られる増幅産物が挙げられる。
　標的核酸は、後述する試料又はその核酸画分をそのまま用いることもできるが、好ましくは、ＰＣＲによる増幅反応、より好ましくはマルチプレックスＰＣＲによる増幅反応により、複数の標的核酸が増幅された増幅産物を用いることが好ましい。
　本明細書において「試料」とは、標的核酸を含む可能性のある試料をいう。試料採取源は特に限定されないが、標的核酸が含まれうる試料としては、各種の生体由来の試料（血液、尿、痰、唾液、組織、細胞（各種の動物由来の培養動物細胞、培養植物細胞、培養微生物細胞を含む）等）あるいは、こうした生体試料からＤＮＡを抽出したＤＮＡ抽出試料等が挙げられる。さらには、上記生体試料からＲＮＡを抽出し、ＤＮＡに変換したＤＮＡ試料等も含まれる。こうした各種の試料からの核酸を含む画分は当業者であれば適宜従来技術を参照して取得することができる。
　本明細書において「標的配列」とは、検出対象の標的核酸に特徴的な１又は２以上の塩基からなる配列をいう。例えば、標的核酸同士のホモロジーの低い部分配列であってもよいし、試料に含まれる可能性のある他の核酸に相補性もしくは相同性の低い配列であってもよい。標的配列は、標的核酸に特徴的な配列であってもよい。こうした標的配列は、人工的に配列を変更したものであってもよい。
　本明細書において、核酸クロマトグラフィーとは、キャピラリー現象により液体（展開媒体）を拡散・移動可能な多孔質状の固相担体を用いて、前記液体により核酸を固相担体内を移動させて固相担体に予め準備したプローブとの特異的な塩基対合によってハイブリダイズ産物を形成させて前記核酸を固相担体に補足するクロマトグラフィーをいう。
　以下では、本明細書の開示の代表的かつ非限定的な具体例について、図面を参照して詳細に説明する。この詳細な説明は、本明細書の開示の好ましい例を実施するための詳細を当業者に示すことを単純に意図しており、本明細書の開示の範囲を限定することを意図したものではない。また、以下に開示される追加的な特徴ならびに開示は、さらに改善された標的核酸の検出方法等を提供するために、他の特徴や発明とは別に、又は共に用いることができる。
　また、以下の詳細な説明で開示される特徴や工程の組み合わせは、最も広い意味において本明細書の開示を実施する際に必須のものではなく、特に本明細書の開示の代表的な具体例を説明するためにのみ記載されるものである。さらに、上記及び下記の代表的な具体例の様々な特徴、ならびに、独立及び従属クレームに記載されるものの様々な特徴は、本明細書の開示の追加的かつ有用な実施形態を提供するにあたって、ここに記載される具体例のとおりに、あるいは列挙された順番のとおりに組合せなければならないものではない。
　本明細書及び／又はクレームに記載された全ての特徴は、実施例及び／又はクレームに記載された特徴の構成とは別に、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、個別に、かつ互いに独立して開示されることを意図するものである。さらに、全ての数値範囲及びグループ又は集団に関する記載は、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、それらの中間の構成を開示する意図を持ってなされている。
（標的核酸の検出方法）
　本明細書に開示される標的核酸の検出方法は、少なくとも１つの一本鎖であるタグ鎖（一本鎖タグ）を備える核酸増幅産物と、前記タグとハイブリダイズ可能なプローブとを、これらがハイブリダイズ可能な条件で接触させるハイブリダイゼーション工程を備えることができる。本検出方法は、このハイブリダイゼーション工程において、
　以下の（ａ）及び（ｂ）；
（ａ）核酸増幅産物の増幅用プライマー
（ｂ）増幅用プライマーのダイマー由来の増幅産物、
から選択される少なくとも一種の核酸構造体と前記プローブとのと副生ハイブリダイズ産物の形成を抑制する、ことを特徴とする。
　以下、本検出方法で用いる核酸増幅産物及びその取得工程について説明する。核酸増幅産物の取得工程は、ハイブリダイゼーション工程に先立って、本検出方法の一工程として実施してもよい。
（核酸増幅産物）
　本検出方法における、少なくとも１つの一本鎖タグを備える核酸増幅産物は、図３Ａ及び図３Ｂの最下段に示すように、二本鎖部分と、当該二本鎖の少なくとも一方の端部に突出して位置される一本鎖部分であるタグ鎖と、を備えている。核酸増幅産物は、図３Ａに示すように、二本鎖の一方の端部に１つの一本鎖タグを備えるものであってもよいし、図３Ｂに示すように、二本鎖の双方の端部にそれぞれ一本鎖タグを備えるものであってもよい。一本鎖タグは、二本鎖の各構成鎖の５’末端に位置されることが好ましい。
　核酸増幅産物における二本鎖部分は、概して、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖の伸長反応の基質となりうる天然塩基（アデニン、グアニン、チミン及びシトシン）を備えるヌクレオチドがリン酸ジエステル結合で連結された構造を有するが、これに限定するものではない。
　核酸増幅産物の、１つの一本鎖タグが、標的核酸に予め関連付けられたプローブとハイブリダイズ可能である。すなわち、特定プローブとハイブリダイズ可能な塩基配列を有している。典型的には、１つの一本鎖タグ（以下、ハイブリダイズタグともいう。）は、特定プローブと完全に相補的なタグ配列を有している。核酸増幅産物が、もう１つの一本鎖タグを備えるとき、当該タグは、例えば、標識物質結合領域等として用いることができる。
　ハイブリダイズタグは、核酸増幅反応によって合成可能に、概して、天然塩基（アデニン、グアニン、チミン及びシトシン）を備えるヌクレオチドがリン酸ジエステル結合で連結された構造を有するが、これに限定するものではない。核酸増幅反応によらない非天然の合成によるオリゴヌクレオチド鎖であってもよい。このヌクレオチド鎖は、バックボーンに関しても、いわゆる天然のリボース－リン酸バックボーン以外にも、ＰＮＡ(ペプチド核酸）のバックボーン、ＢＮＡ（架橋化核酸）などのバックボーン等公知の人工的バックボーンを採用できる。また、塩基についても、プローブとの特異的とハイブリダイズ可能であればよいので、プローブを対応させることを前提に、非天然の、例えば、Ｌ－ＤＮＡを備えていてもよいし、Ｌ－ＤＮＡのみからなっていてもよい。また、非天然塩基を有していてもよく、非天然塩基のみから構成されていてもよい。
　ハイブリダイズタグは、プローブとハイブリダイズ可能なタグ配列を有している。タグ配列の塩基長は、プローブの検出用配列の塩基長に一致し、好ましくは、２０塩基以上５０塩基以下であり、より好ましくは、２０塩基以上２５塩基以下である。
　核酸増幅産物は、検出しようとする標的核酸に関連付けられている。すなわち、標的核酸を含む可能性のある試料中の標的核酸を特異的に増幅できるように構築されたプライマーセットにより増幅される。また、核酸増幅産物は、一本鎖タグを付与するために、概して、後述する連結部位を備えたものとなっている。
（核酸増幅産物の取得工程）
　こうした核酸増幅産物は、例えば、以下に示すプライマーセットを用いるＤＮＡポリメラーゼによる核酸増反応で得ることができる。本工程における核酸増幅法は、ＰＣＲを始めとするＤＮＡポリメラーゼ反応を用いてＤＮＡ等を鋳型として増幅して二重鎖ＤＮＡ断片を取得する各種の公知の方法が挙げられる。こうした工程の概要を図３Ａ及び図３Ｂに示す。
　図３Ａに示す工程では、第１のプライマーは、標的核酸に予め関連付けられたプローブに対するハイブリダイズタグである第１の任意の塩基配列と標的核酸中の第１の塩基配列を識別する第１の識別配列とを含み、第１の任意配列と第１の認識配列との間に、ＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な連結部位を有している。また、第２のプライマーは、標的核酸中の第２の塩基配列を識別する第２の識別配列を含んでいる。
　連結部位は、ＤＮＡポリメラーゼの反応を抑制又は停止させる。すなわち、当該連結部位は、天然塩基等を含まないなどの理由により、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応の鋳型とはなりえない。このため、図３Ａに示すように、第１のプライマーによって増幅されたＤＮＡ一本鎖が鋳型鎖となって、さらに第２のプライマーによって増幅されるとき、第２のプライマーからのＤＮＡ伸長反応は、当該連結部位に対合する部位より３’側において抑制又は停止される。このため、増幅工程により得られる増幅産物片（ＤＮＡ二重鎖断片）は、結果として、一方の端部に第１の任意の塩基配列を突出する一本鎖として備えるとともに塩基の対合による二重鎖部分を備えたものとなると推論される。
　また、図３Ｂに示す工程では、第２のプライマーが、第２の任意の塩基配列をさらに有し、当該第２の任意の塩基配列と第２の識別配列との間に前記連結部位を有する場合の工程を示す。図３Ｂに示すように、図３Ａで示した第１のプライマーと同様、第２のプライマーによって増幅されたＤＮＡ一本鎖が鋳型鎖となって、さらに第１のプライマーによって増幅されるとき、第１のプライマーからのＤＮＡ伸長反応は、当該連結部位に対合する部位より３’側において抑制又は停止される。このため、工程により得られる増幅産物（ＤＮＡ二重鎖断片）は、結果として、一方の端部にハイブリダイズタグを突出した一本鎖として備え、他方の端部に任意の塩基配列を突出した一本鎖として備えるとともに、塩基の対合による二重鎖部分を備えたものとなると推論される。なお、図３Ｂに示す形態では、第２のプライマーに由来する第２の任意の塩基配列は、標識物質や標識結合物質などを付与する部位（標識タグ）とすることもできる。
　以下に、一本鎖タグを備える核酸増幅産物の取得工程についてより詳細に説明する。この核酸増幅産物は、以下の第１のプライマー及び第２のプライマーのセットにより取得できる。核酸増幅は、これらのプライマーを用いて実施する。核酸増幅法は既に説明したように各種公知の方法を適用できるが、典型的にはＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ等の各種ＰＣＲである。核酸増幅工程を実施するにあたっての、溶液組成、温度制御、時間等については、当業者であれば適宜設定することができる。
(第１のプライマー）
　第１のプライマーは、ハイブリダイズタグと、第１の識別配列と、ＤＮＡポリメラーゼよるＤＮＡの鎖伸長反応を抑制又は停止可能な連結部位と、を備えている。既に記載したように、連結部位を備えることで、核酸増幅反応により、ハイブリダイズタグを備える第１の鎖を含む核酸増幅産物を合成できる。また、こうした連結部位を備えることで、ハイブリダイズタグの自由運動性を向上させることができ、プローブとの効率的なハイブリダイゼーションが可能となる。第１のプライマーは、概して、５‘側からハイブリダイズタグ、連結部位及び第１の識別配列を備えている。
（ハイブリダイズタグ）
　ハイブリダイズタグは既に説明したとおりである。タグ配列は、増幅断片が検出用プローブとハイブリダイゼーションを可能とするための配列であり、標的核酸を検出するものであるため、標的核酸毎に検出用プローブの検出用配列にハイブリダイズ可能に設定される。典型的には、検出用配列に相補的な塩基配列となっている。したがって、一つの標的核酸は、一つのプローブに対応付けられることになる。
（第１の識別配列）
　第１の識別配列は、核酸増幅により、標的核酸を増幅するための配列であり、標的核酸中の標的配列の一部を構成する第１の塩基配列と特異的にハイブリダイズできる。第１の識別配列は、第１の塩基配列と高い選択性でハイブリダイズ可能な程度に相補的に設定される。好ましくは完全に相補的（特異的）に設定される。
　標的核酸中の第１の塩基配列と第２の塩基配列とは、標的核酸に対してどのような構成となっていてもよい。例えば、ＤＮＡ上の変異を検出する場合、いずれか一方の塩基配列にのみ１又は２以上の塩基の変異部位が含まれるようにしてもよいし、双方に変異部位が含まれるようにしてもよい。なお、第１のプライマーは、こうしたタグ配列及び第１の識別配列を有しており、こうした塩基配列を構成する天然塩基あるいはこれに相同な人工塩基を有するとともに、天然核酸との間で塩基対合を可能とする骨格を有している。典型的にはオリゴヌクレオチド又はその誘導体である。
（連結部位）
　連結部位は、鋳型鎖に含まれたとき、ＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な部位である。ＤＮＡポリメラーゼ反応は、鋳型となる核酸（ないし塩基）がないとそれ以上ＤＮＡ鎖を伸長しないとされている。このため、本発明の連結部位は、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長時の鋳型となりえない構造を有している。すなわち、連結部位は、天然塩基又は天然塩基と対合する天然塩基の誘導体（天然塩基等）を含まない。こうした天然塩基等を含まないことで、前記鋳型となることを回避して、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖の伸長を抑制又は回避できる。したがって、連結部位は、天然塩基等を有しないない単なる骨格鎖だけであってもよい。すなわち、糖－リン酸骨格や、他の公知の人工オリゴヌクレオチドに適用される骨格であってもよい。なお、ＤＮＡポリメラーゼは、各種公知のＤＮＡポリメラーゼが包含される。典型的には、各種ＰＣＲなどの核酸増幅法に用いられるＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
　また、連結部位は、リン酸ジエステル結合を介してヌクレオチドに隣接される、元素数が２以上４０以下である一重鎖構造を含む鎖状の連結基であってもよい。元素数が１以下では、ＤＮＡポリメラーゼ反応を抑制又は停止が不完全になりやすく、元素数が４０を超えると、ヌクレオチドの溶解性が低下するおそれがあるからである。ＤＮＡポリメラーゼ反応の抑制又は停止の効果を考慮すると、鎖状の連結基の元素は、２以上３６以下であることが好ましく、より好ましくは３以上１６以下である。
　連結部位が、一重結合を含むのは、連結部位における回転を容易にするためであり、一重結合は、炭素－炭素一重結合、炭素－酸素一重結合、炭素－窒素一重結合、Ｓ－Ｓ一重結合などが挙げられる。連結部位は、こうした一重結合を主体とすることが好ましい。また、連結部位は、一重結合を含む限り一部に芳香環あるいはシクロアルカンを含んでいてもよい。
　連結部位としては、元素数が２以上４０以下であって置換されていてもよいアルキレン鎖又はポリオキシアルキレン鎖を含むことが好ましい。こうした鎖状の連結構造は、構造的に簡易であるほか、連結部位としての導入も容易である。
　こうした連結部位としては、例えば、以下の式（１）で表される連結部位が挙げられる。
５’－Ｏ－ＣmＨ2m－Ｏ－３’　　　　　式（１）
（式中、５’は、５’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、３’は、３’側のリン酸ジエステル結合のリン酸原子を表し、ｍは２以上４０以下の整数を表す。）
　式（１）においてｍは、好ましくは２以上３６以下であり、より好ましくは３以上１６以下である。式（１）中のＨの置換基は、典型的には、アルキル基、アルコキシ基、水酸基等が挙げられる。アルキル基及びアルコキシ基の炭素数は１～８であることが好ましく、より好ましくは１～４である。また、２以上の置換基を有する場合には、置換基は同一であっても異なっていてもよい。さらに、置換基を有していないことも好ましい。
　また、他の連結部位としては、以下の式（２）で表される連結部位が挙げられる。
５’－（ＯＣnＨ2n）l－Ｏ－３’　　　　式（２）
（式中、５’は、５’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、３’は、３’側のリン酸ジエステル結合のリン酸原子を表し、ｎは２以上４以下の整数を表し、ｌは、２以上の整数であって、（ｎ＋１）×ｌは４０以下となる整数を表す。）
　式（２）において（ｎ＋１）×ｌは、好ましくは２以上３６以下であり、より好ましくは３以上１６以下である。式（２）中のＨの置換基は、式（１）中の置換基と同様の態様が適用される。
　連結部位としては、例えば、以下の鎖状部位が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
  
　さらに、連結部位としては、例えば、以下の鎖状部位が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
  
　連結部位は、このほか、強固なヘアピン構造やシュードノット構造のようにポリメラーゼの進行を阻害する立体構造を有する核酸配列、Ｌ型核酸や人工核酸等の標的核酸天然型核酸や、ＲＮＡ及び脂肪鎖のような非核酸構造が挙げられる。人工核酸としては、ペプチド核酸、架橋化核酸、アゾベンゼン等が挙げられる。
（第２のプライマー）
　第２のプライマーは、核酸増幅産物の第１の鎖と対合する第２の鎖を得るためのプライマーである。図４に示すように、第２のプライマーは、連結部位を含まずに構成することができる。こうした第２のプライマーを用いることで、ハイブリダイズタグのみを備える核酸増幅産物（一方にのみ一本鎖タグを備える核酸増幅産物）を得ることができる。ハイブリダイズタブのみを備える核酸増幅産物は、特に、クロマトグラフィー形態のハイブリダイゼーション工程において、高い感度と正確性で標的核酸を検出できるため好ましい。
（第２の識別配列）
　既に説明したように、第２のプライマーは、標的核酸中の第２の塩基配列を識別する第２の識別配列を含んでいる。第２の識別配列は、核酸増幅により、第１のプライマーとともに標的核酸を増幅するための配列であり、標的核酸中の標的配列の他の一部を構成する第２の塩基配列と特異的にハイブリダイズできる。第２の識別配列は、第２の塩基配列と高い選択性でハイブリダイズ可能な程度に相補的に設定される。好ましくは完全に相補的（特異的）に設定される。
　図５に示すように、第２のプライマーは、予め標識物質を備えることができる。標識物質４０は、固相担体上でプローブに結合した部分二本鎖核酸１０を検出するためのものである。標識物質としては後述するが、従来公知のものを適宜選択して用いることができる。標識物質は、第２のプライマーの５’末端に備えられていることが好ましい。
　また、第２のプライマーは、図６に示すように、標識物質結合物質を備えていてもよい。標識物質結合物質は、第２のプライマーの５’末端に備えられていることが好ましい。さらに、第２のプライマーは、図７に示すように、標識物質及び標識物質結合物質を備えていなくてもよい。すなわち、増幅工程において、標識物質又は標識物質結合物質を備えるヌクレオシド誘導体三リン酸を含むヌクレオシド三リン酸組成物を用いて核酸増幅反応を実施することで、ＤＮＡ伸長部位に標識物質又は標識物質結合物質が導入され標識された核酸増幅産物を得ることができるからである。
　第２のプライマーにおいては、その５’側から、標識物質又は標識物質結合物質、第２の識別配列の順でこれらを有していることが好ましい。これにより、５’末端に標識物質又は標識物質結合物質を備える第２の鎖を得ることができる（図４～図６参照）。
　第２のプライマーが、連結部位を備えるとき、２つの一本鎖タグを備える核酸増幅産物を得ることができる。すなわち、ハイブリダイズタグと、もう１つの一本鎖タグ（例えば標識タグ）を備える核酸増幅産物を得ることができる（図３Ｂ参照）。
　連結部位を備える第２のプライマーは、標識タグ、連結部位及び第２の識別配列を備えることができる。標識タグは、標識物質又は標識物質結合物質を保持する標識プローブと特異的にハイブリダイズ可能に形成されている。こうした標識プローブは後述するハイブリダイゼーション工程や検出工程において固相担体上のプローブとハイブリダイズしたハイブリダイズ産物の標識タグとハイブリダイズさせて、そのハイブリダイズ産物を標識することができる。
（標識物質）
　標識物質又は標識物質結合物質は、最終的に核酸増幅産物のいずれかの箇所に備えられていればよい。第２のプライマーに依拠して増幅工程、ハイブリダイゼーション工程及び検出工程のいずれかで組み込まれてもよいし、第２のプライマーに依拠せずに、増幅工程において、標識物質又は標識物質結合物質を備えるヌクレオシド誘導体三リン酸を含むヌクレオシド三リン酸組成物を用いて核酸増幅反応を実施することで核酸増幅産物に組み込まれていてもよい。
　本明細書において「標識物質」とは、検出しようとする物質あるいは分子を他と識別することを可能とする物質である。標識物質は、特に限定しないが、典型的には、蛍光、放射能、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等）、燐光、化学発光、着色などを利用した標識物質が挙げられる。
　標識物質は、目視（肉眼で）で検出可能な発光又は発色を提示する発光物質又は発色物質であることが好ましい。すなわち、直接それ自体が、他の成分を必要としないで肉眼で視認可能なシグナルを生成することができる物質であることが好ましい。検出工程で迅速かつ簡易に行うことができる。こうした物質としては、典型的には、各種の顔料や染料などの各種の着色剤が挙げられる。また、これに準ずる、金、銀などの貴金属ほか、銅などの各種金属又は合金、あるいは当該金属を含む有機化合物（錯体化合物であってもよい）が挙げられる。また、着色剤に準ずる、マイカ等の無機化合物が挙げられる。
　この種の標識物質としては、典型的には、各種染料、各種顔料、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウム化合物、オレフィン、エノールエーテル、エナミン、アリールビニルエーテル、ジオキセン、アリールイミダゾール、ルシゲニン、ルシフェリン及びエクリオンを包含する化学発光物質が挙げられる。また、こうした標識物質でラベルされているラテックス粒子などの粒子も挙げられる。さらに、金コロイド若しくはゾル又は銀コロイド若しくはゾルを包含するコロイド若しくはゾル等が挙げられる。さらにまた、金属粒子、無機粒子等が挙げられる。
　標識物質は上記のように、その一部に粒子を備えていてもよい。標識物質の一部を構成するラテックス粒子などの粒子の平均粒子径は、特に限定しないが、例えば、０．１ｎｍ以上２０μｍ以下であり、固相担体の孔径等によって適宜選択することができる。
　好ましい粒子は、水溶液に懸濁でき、そして水不溶性ポリマー材料からなる粒子である。例えばポリエチレン、ポリスチレン、スチレン－スチレンスルホン酸塩共重合体、アクリル酸ポリマー、メタクリル酸ポリマー、アクリロニトリルポリマー、アクリロニトリル－ブタジエン－スチレン、ポリビニルアセテート－アクリレート、ポリビニルピロリドン又は塩化ビニル－アクリレートが挙げられる。それらの表面上に活性基、例えばカルボキシル、アミノ又はアルデヒド基を有するラテックス粒子も挙げられる。
　標識物質結合物質は、タンパク質－タンパク質相互作用、低分子化合物－タンパク質相互作用等を利用できる。例えば、抗原抗体反応における抗体や、アビジン（ストレプトアビジン）－ビオチンシステムにおけるビオチン、抗ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）－ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）システムにおけるジゴキシゲニン、又は抗ＦＩＴＣ－ＦＩＴＣシステムにおけるＦＩＴＣ等に代表されるハプテン類などが挙げられる。この場合、最終的に検出のために用いられる標識物質は、標識物質結合物質と相互作用する他方の分子又は物質（例えば、抗原、すなわち、ストレプトアビジン、抗ＦＩＴＣなど）を、標識物質結合物質との結合のための部位として備えるように修飾される。増幅産物が標識物質結合物質を備える場合には、ハイブリダイゼーション工程において、あるいはこの工程に先立って、あるいはこの工程後に、増幅産物の標識物質結合物質と、標識物質結合物質と結合する部位を備える標識物質との複合体を形成させて、標識物質により増幅産物を検出する。
　こうした標識物質や標識物質結合物質は商業的に入手できるほか、標識物質及び標識物質結合物質の製造及び標識物質等を粒子にラベルする方法も公知であり、当業者であれば適宜公知技術を利用して取得することができる。さらに、こうした標識物質又は標識物質でラベル化された粒子や標識物質結合物質と、ＤＮＡ等のオリゴヌクレオチドとの結合もアミノ基等の官能基を介して適宜可能であり、それ自体は当該分野において周知である。
　こうしたプライマーは、通常のオリゴヌクレオチド合成法にしたがって合成することができる。例えば、連結部位については、アルキレン鎖を有するホフォスホアミダイト試薬を用いて合成することができる。こうした試薬自体は、公知であり、例えば、GlenResearch社等から入手することができる。例えば、以下の試薬が挙げられる。なお、以下の式においてＤＭＴは、水酸基保護基として典型的なジメトキシトリチル基を表すが、他の公知の水酸基保護基であってもよい。また、以下の式においてＰＡは、ホスホアミダイト基を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
  
　ハイブリダイズタグを有する核酸増幅産物は、プローブとハイブリダイゼーションさせるとき、熱変性させなくても、極めて高感度にかつ迅速に標的核酸を検出できる。
　以上説明した核酸増幅産物の取得工程は、２以上の標的核酸について同時に実施することができる。複数の標的核酸に関連付けられた複数の増幅産物を一挙に得る工程は、一般的にはマルチプレックスＰＣＲと称される。
　本検出方法は、複数の標的核酸からそれぞれ核酸増幅産物を得る場合において特に有意義である。こうした場合においては、通常、それぞれの標的核酸に応じて複数のプライマーセットを用いる。こうした場合には、プライマーダイマーの形成を抑制することが困難な場合が多く、偽陽性を呈する可能性が高いからである。
（ハイブリダイゼーション工程）
　本検出方法は、核酸増幅産物を、標的核酸に予め関連付けられたハイブリダイズタグとこの標的核酸と予め関連付けられたプローブとを、これらのハイブリダイズ産物（目的ハイブリダイズ産物）が形成可能な条件で接触させるハイブリダイゼーション工程、を備える。
　目的ハイブリダイズ産物が形成可能な条件は当業者であれば適宜設定できる。すなわち、ハイブリダイゼーション温度、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度及び溶媒の種類等、ハイブリダイゼーション時間は当業者であれば適宜設定できる。本検出方法において、特には、クロマトグラフィー形態のハイブリダイゼーションでは、例えば、１０℃～５０℃程度、好ましくは２０℃～３５℃程度で、数分から数十分程度、典型的には、３０分以内、好ましくは２０分以内でハイブリダイゼーション工程を実施できる。
　ハイブリダイゼーション工程においては、核酸増幅産物において第２のプライマー等に基づいて予め標識物質を備えていない場合には、適宜、こうした標識物質や標識結合物質を備える標識プローブを供給するようにして、後段での検出工程で目的ハイブリダイズ産物を検出できるようにすることができる。
　本検出方法においては、核酸増幅産物は、ハイブリダイズタグを一本鎖として備えているため、核酸増幅産物をプローブとハイブリダイズ可能に変性して一本鎖化する工程を省略することができる。
　ハイブリダイゼーション工程は、通常、固相担体に結合されたプローブに対して実施される。プローブ及び固相担体については後述する。ハイブリダイゼーションの形態としては、プローブが固定化された固相担体全体にハイブリダイゼーション溶液を供給して実施するハイブリダイゼーションの形態（浸漬型ハイブリダイゼーション）に限定されない。例えば、固相体の一部に移動相でもあるハイブリダイゼーション溶液を供給して、固相体に対して所定の方向性でハイブリダイゼーション溶液を展開するクロマトグラフィーの形態（展開型ハイブリダイゼーション）であってもよい。本検出方法においては、クロマトグラフィー形態を採用することが好ましい。簡易で迅速性に優れるクロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション工程において、検出確度の向上の意義はより高いからである。
　なお、クロマトグラフィー形態でハイブリダイゼーション工程を実施するとき、ハイブリダイゼーション工程に用いる展開媒体は、水性媒体であることが好ましい。水性媒体は、こうしたクロマトグラフィーに用いられる公知の成分等を適宜配合して調製することができる。
（副生ハイブリダイズ産物の形成抑制）
　本検出方法では、ハイブリダイゼーション工程において、
　以下の（ａ）及び（ｂ）；
（ａ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマー
（ｂ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマーを含む増幅用プライマーのダイマー由来の増幅産物
から選択される少なくとも一種の核酸構造体と前記プローブとの偽陽性を呈する副生ハイブリダイズ産物の形成を抑制する。
　こうすることで、偽陽性を生じる副生ハイブリダイズ産物の形成を抑制できる。すなわち、標識物質又は標識結合物質を備えうる未反応プライマーとプローブとの副生ハイブリダイズ産物や、標識物質又は標識結合物質を備えうるプライマーダイマー増幅産物との副生ハイブリダイズ産物の形成を抑制することができる。
　副生ハイブリダイズ産物を形成する核酸構造体は、未反応プライマーである場合もあるし、プライマーダイマー由来増幅産物である場合もあるし、これらの双方である場合もある。プライマーの配列や、ハイブリダイゼーション条件によって、これら変化する傾向がある。
（未反応プライマー等の除去）
　偽陽性を生じる副生ハイブリダイズ産物の形成を抑制する１つの方法として、ハイブリダイゼーション工程に先立って、未反応プライマーやプライマーダイマー由来増幅産物を、核酸増幅産物を含む核酸増幅反応液から除去する工程を実施することが挙げられる。例えば、ポリエチレングリコール（平均分子量３０００～１００００程度、好ましくは、６０００～１００００程度、より好ましくは８０００程度）などのＤＮＡ吸着剤を用いて、比較的長い核酸増幅産物（本明細書で意図する核酸増幅産物は概して１００ｂｐ～１０００ｂｐ程度である）を吸着するようにする。これを遠心分離により１００ｂｐ以下、概して６０ｂｐ以下の未反応プライマーやプライマーダイマー由来の増幅産物を上清に、核酸増幅産物をペレットとして分離することができる。遠沈後は、ペレットをエタノール洗浄することでポリエチレングリコール等のＤＮＡ吸着剤を除去することができる。
　このような精製には、典型的には、市販されている非特許文献１に記載のプライマー、プライマーダイマー由来増幅産物の除去試薬を用いることができる。
　未反応プローブ等の除去には、核酸増幅反応液に、核酸増幅産物をペレットとし、未反応プローブ等を上清に分離できるような密度の溶液を添加して、よく混合等したのち、所定の重力及び時間で遠心分離することが挙げられる。ペレットとして取得した核酸増幅産物をエタノール等で洗浄し、再度ペレットとして取得することで、核酸構造体を除去した核酸増幅産物を得ることができる。
（先行ハイブリダイゼーション）
　また、他の１つの方法として、ハイブリダイゼーション工程に先立って、偽陽性ハイブリダイズ産物を生じうる少なくとも一種の核酸構造体の少なくとも一部と、当該一部とハイブリダイズ可能なマスキング剤と、がハイブリダイズしたクリーンアップ用ハイブリダイズ産物を形成する先行ハイブリダイゼーション工程を実施することが挙げられる。この先行ハイブリダイゼーション工程によれば、簡易にかつ迅速に不都合な核酸構造体をクリーンアップハイブリダイズ産物として除去（捕捉）しておくことができる。
　例えば、未反応の増幅用プライマーを除去（捕捉）するクリーンアップハイブリダイズ産物を形成するには、図２Ａに示すように、増幅に用いた標識物質又は標識結合物質を保持しうる第２のプライマーの第２の識別配列の少なくとも一部にハイブリダイズ可能な核酸であるマスキング剤が挙げられる。こうしたマスキング剤の１種又は２種以上を用いて核酸増幅反応液との先行ハイブリダイゼーション工程を実施することで、第２のプローブに基づく擬陽性を呈する副生ハイブリダイズ産物の形成を抑制できる。なお、本明細書において、ハイブリダイズ可能であるとは、ハイブリダイズする相手鎖と完全に相補的であることを包含している。
　未反応増幅用プライマーを除去するクリーンアップハイブリダイズ産物を形成する先行ハイブリダイゼーション工程を実施するには、クリーンアップハイブリダイズ産物を形成する条件で行う。未反応プライマーは、核酸増幅反応液において概して一本鎖で存在するため、マスキング剤を供給することで、容易にクリーンアップハイブリダイズ産物を形成する。
　また、第１のプライマーと標識物質又は標識結合物質を保持しうる第２のプライマーとのプライマーダイマー由来の増幅産物を除去（捕捉）するクリーンアップハイブリダイズ産物を形成するには、図２Ｂに示すように、プライマーダイマー由来増幅産物の再アニールを抑制するように、これらの構成鎖（すなわち、プライマーダイマー増幅産物における第１のプライマー伸長物と第２のプライマー伸長物）の少なくとも一部と同一又はハイブリダイズする核酸であるマスキング剤が挙げられる。
　典型的には、第１のプライマーの第１の識別用配列の少なくとも一部と同一か又はハイブリダイズ可能な核酸であるマスキング剤が挙げられる。また、第２のプライマーの第２の識別用配列の少なくとも一部と同一か又はハイブリダイズ可能な核酸であるマスキング剤が挙げられる。マスキング剤は、好ましくはハイブリダイズタグや標識タグにハイブリダイズ可能でないようにする。
　プライマーダイマー増幅産物を捕捉するクリーンアップハイブリダイズ産物を形成する先行ハイブリダイゼーション工程を実施するには、こうしたクリーンアップハイブリダイズ産物を形成する条件で行えばよい。プライマーダイマー増幅産物は、核酸増幅反応液において概して二本鎖で存在するため、一旦、変性して融解させて一本鎖状態としないとマスキング剤とクリーンアップハイブリダイズ産物を形成できない。
　こうした変性処理（融解処理）は、熱変性処理（熱融解処理）であってもよいし、化学物質による変性処理であってもよい。化学変性処理は、加熱を伴わない点において、簡易でありより安全であり、かつ迅速に実施できる。
　熱による変性処理は、通常、９０℃～９５℃程度に加熱し、所定時間、例えば、１～５分程度維持することが挙げられる。なお、加熱処理後には、再アニールによりクリーンアップハイブリダイズ産物を形成するために、急冷ないし放冷する。また、核酸増幅産物のＴｍが核酸構造体のＴｍよりも高い場合には、核酸増幅産物は変性せず、核酸構造体のみが変性できる温度条件により変性処理することも可能である。
　化学変性の場合、通常、０．２Ｎ ＮａＯＨ、１％ＳＤＳの添加、尿素添加、ホルムアミドなどのＤＮＡを変性可能な溶媒などの核酸変性剤の添加、アルカリ条件を採用することができる。アルカリ条件による変性は、公知の有機アルカリ及び無機アルカリから選択されるアルカリを用いて、適当な濃度に設定することにより、当業者であれば実施可能である。化学変性処理後には、クリーンアップハイブリダイズ産物の形成のため、例えばアルカリによる変性処理であれば、酸を添加して中和するようにする。また、尿素やジメチルホルムアミドについてはウレアーゼで分解することが可能である。
　マスキング剤は、変性処理を行う場合、変性処理に先立って核酸増幅反応液に供給してもよいし、変性処理中（加熱中等）に供給してもよいし、その後の再アニール過程において供給してもよい。
　なお、マスキング剤は、本明細書で意味するところの核酸で構成されている。マスキング剤は、概して、ＤＮＡ一本鎖として、あるいは、適宜ハイブリダイズしたＤＮＡ二本鎖として供給される。
　マスキング剤は、例えば、増幅用プライマーセットの初期量として２５０ｆｍｏｌによる反応結果物に対して、２．５ｐｍｏｌ以上２．５ｎｍｏｌ以下用いることができる。この範囲であると、マスキング剤によって副生ハイブリダイズ産物の形成を抑制できる。
　こうした未反応プライマー等の除去工程を行った核酸増幅産物又はその核酸増幅反応液を、プローブとのハイブリダイゼーション工程に供する。本ハイブリダイゼーション工程によれば、先行プローブと標識物質又は標識物質結合物質を備える（あるいは備えることとなる）未反応の第２のプローブと副生ハイブリダイズ産物の形成が抑制されるため、偽陽性の検出が抑制又は回避される。また、本ハイブリダイゼーション工程によれば、標識物質又は標識物質結合物質を備える（あるいは備えることとなる）プライマーダイマー由来増幅産物とプローブとの副生ハイブリダイズ産物の形成が抑制されるため、偽陽性の検出が抑制又は回避される。結果として、簡易かつ迅速で、しかも高い確度で標的核酸を検出できる。
　特に、クリーンアップハイブリダイズ産物を形成することは、プライマー等の除去工程を行うことよりも操作を格段に簡素化できるため、標的核酸の検出の簡易化、迅速化への貢献程度はより大きい。
　ハイブリダイゼーション工程で用いるプローブは、固相担体に固定化された状態で使用される。プローブは、それぞれプロービングのための固有の塩基配列である検出用配列を有している。このような検出用配列は、標的核酸に特徴的な配列で設定することもできるし、標的配列と、無関係に設定することができる。標的配列と無関係に設定することで、プローブの検出用配列を、複数のプローブ間での非特異的結合を抑制又は回避できるように、かつ、ハイブリダイゼーションに好適な温度及び時間等のハイブリダイゼーション条件を考慮して設定することができる。また、標的核酸の種類にかかわらず、いつも同じ検出用プローブを用いることができるようになる。
　検出用配列の長さは、特に限定しないが、２０塩基以上５０塩基以下であることが好ましい。この範囲であると、各検出用配列の特異性を確保しつつハイブリダイゼーション効率も確保できるからである。例えば、こうした塩基長の検出用配列は、後述する配列番号１～１００及びその相補配列から選択される各２３塩基長の塩基配列を２つ組み合わせた４６塩基長の配列や、当該組み合わせた塩基配列に対して適宜塩基を付加、欠失などすることにより得ることができる。より好ましくは、２０塩基以上２５塩基以下である。例えば、こうした塩基長の検出用配列は、配列番号１～１００の各２３塩基長の塩基配列及びその相補配列又はこれらの塩基配列に対して適宜塩基を付加、欠失などすることにより得ることができる。なお、第１のプライマーにおけるタグ配列は、検出用配列と対合する塩基配列であるため、タグ配列の塩基長は、検出用配列と同様、２０塩基以上５０塩基以下であることが好ましく、より好ましくは、２０塩基以上２５塩基以下である。
　こうしたプローブの検出用配列としては、例えば、配列番号１～配列番号１００に記載の塩基配列又はこの塩基配列に相補的な塩基配列を用いることができる。これらの塩基配列は全て同一塩基長（２３塩基長）であり、融解温度（Ｔｍ）が４０℃以上８０℃以下、好ましくは５０℃以上７０℃以下であって、同一条件、例えば、融解温度マイナス１５℃程度でのハイブリダイズにおいて均質なハイブリダイズ結果が得ることができるようになっている。ただしクロマトグラフィー形態のハイブリダイゼーションにおいては、常温（２０℃±１５℃）での使用を想定し、これらのなかでも１５℃程度においてプローブ間の非特異反応が発生しにくいプローブの組合せを使用している。なお、上述したように、これらの塩基配列群から選択される２種を組み合わせることもできる。さらに、こうした配列に対して、特異性を失わない範囲で塩基を付加、欠失、置換等することができる。同時に用いる検出用プローブのための検出用配列は、配列番号１～１００で表される塩基配列（群）か、あるいはこれらに相補的な塩基配列（群）のいずれかの群から選択されることが好ましい。
　このようなプローブにおける検出用配列は、正規直交化配列ともいい、H.Yoshida and A.Suyama,“Solution to 3-SAT by breadth first search”,DIMACS Vl.54, 9-20(2000)に詳細が記載されている。これらの文献に記載の方法を使用して正規直交化配列を設計することができる。
　プローブは、担体に固定化されている。こうした担体としては、固相担体を用いることができる。例えば、担体はプラスチックであってもよいし、ガラスであってもよく、材質は特に限定されない。また、セルロース、ニトロセルロース、ナイロン等の多孔質体であってもよい。この種の多孔質担体は、特に、アフィニティークロマトグラフィーにより、固相担体に固定化した検出用プローブと増幅断片とをハイブリダイゼーションさせるのに好適である。
　なお、担体の形状は平板状であってもよいが、ビーズ状であってもよく、形状は特に限定されない。固相体は、好ましくは、担体が固相平板状であり、複数の検出用プローブが一定の配列で固定されたアレイ（特にマイクロアレイ）である。アレイは、多数個のプローブを固定でき、同時に網羅的に各種の標的核酸を検出するのに都合がよい。
　また、ハイブリダイゼーションを、アフィニティークロマトグラフィーの原理を用いて多孔質体である固相担体に固定化したプローブとの間で実施する形態では、少なくとも、検査や研究用に汎用されているエッペンドルフチューブ（商標）のようなマイクロチューブに供給されるハイブリダイゼーション溶液に対して担体の端部が浸漬可能なサイズ（幅方向）及び形状を備えていることが好ましい。好ましくは、この種のチューブの底部近傍から上端までに収容可能な部位を備える長尺体である。
　クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーションに用いる固相担体としては、例えば、ポリエーテルスルホン、ニトロセルロース、ナイロン、ポリフッ化ビニリデンなどのポリマーを主体としたいわゆる多孔質性の材料が挙げられる。また、ろ紙などのセルロース系材料も好ましく用いることができる。クロマトグラフィー用のプローブ固定化体は、単一の固相担体で構成されている必要は必ずしもない。全体としてキャピラリー現象により展開媒体を移動可能であれば、複数の固相担体で連結されていてもよい。また、クロマトグラフィー用プローブ固定化体の全体形態は特に問わない。シート状や細い棒状など、キャピラリー現象によるクロマトグラフィー用液の展開拡散が可能な形態であればよい。好ましくは、長尺状体であって、その長手方向に沿う一つの端部がクロマトグラフィーの展開媒体に接触するようになっている。
（検出工程）
　検出工程は、目的ハイブリダイズ産物を、標識物質に基づいて検出する工程である。より具体的には、ハイブリダイズ産物を標識物質固有のシグナルにてその位置を確認する工程である。標識物質によるシグナルを検出するには、標識物質の種類に応じて適宜選択される。特異的結合反応や酵素による発色反応が必要な場合には、適宜そうした操作が行われる。
　標識物質が、例えば、ラテックス粒子、金コロイド粒子、銀コロイド粒子など、肉眼で検出可能な発色又は発光を提示する標識物質であるときには、肉眼で直ちに標的核酸の存在やその量（色の濃さ等で）を検出できる。このため、一層の迅速検出が可能となっている。
（核酸増幅産物の精製方法）
　本明細書に開示される核酸増幅産物の精製方法は、二本鎖部分と、当該二本鎖の少なくとも一方の端部に突出して位置される一本鎖部分であるタグ鎖を備える核酸増幅産物の存在下で、以下の（ａ）及び（ｂ）；
（ａ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマー
（ｂ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマーを含む増幅用プライマーのダイマー由来の増幅産物
から選択される少なくとも一種の核酸構造体の少なくとも一部とハイブリダイズ可能なマスキング剤をハイブリダイズ可能に付与する工程
を備えることができる。
　本精製方法は、既に説明した本検出方法の先行ハイブリダイゼーション工程を核酸増幅産物の精製方法として表現したものである。本精製方法は、ハイブリダイゼーションによる標的核酸の検出に先立つ前処理方法としても実施できる。
（核酸増幅産物の精製剤）
　本明細書に開示される核酸増幅産物の精製剤は、前記核酸増幅産物は、二本鎖部分と、当該二本鎖の少なくとも一方の端部に突出して位置される一本鎖部分であってプローブとハイブリダイズ可能なハイブリダイズタグを備える核酸増幅産物であり、
　以下の（ａ）及び（ｂ）；
（ａ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマー
（ｂ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマーを含む増幅用プライマーのダイマー由来の増幅産物
から選択される少なくとも一種の核酸構造体の少なくとも一部とハイブリダイズ可能なマスキング剤を含むことができる。
　本精製剤は、既に説明した本検出方法の先行ハイブリダイゼーション工程に用いるマスキング剤を核酸増幅産物の精製剤として表現したものである。本精製剤は、ハイブリダイゼーションによる標的核酸の検出に先立つ前処理用の試薬としても実施できる。
（検出キット）
　本明細書に開示される検出キットは、二本鎖部分と、当該二本鎖の少なくとも一方の端部に突出して位置される一本鎖部分であってプローブとハイブリダイズ可能なハイブリダイズタグを備える核酸増幅産物を得るための少なくとも一対の増幅用プライマーと、
　以下の（ａ）及び（ｂ）；
（ａ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマー
（ｂ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマーを含む増幅用プライマーのダイマー由来の増幅産物
から選択される少なくとも一種の核酸構造体の少なくとも一部とハイブリダイズ可能なマスキング剤と、を備えることができる。
　本検出キットは、既に説明した本検出方法に用いるプライマーセットと、先行ハイブリダイゼーション工程に用いるマスキング剤との組合せと、標的核酸の検出キットとして表現したものである。本検出キットには、さらに、核酸クロマトグラフィーに用いるクロマトグラフィー用プローブ固定化体とを組み合わせていてもよい。
　以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、以下の実施例は本発明を限定するものではない。なお、以下の実施例において、％は、いずれも質量％を意味する。
（メンブレンタイプアレイによるハイブリダイゼーションによる標的核酸の検出）
　本実施例では、以下の方法で標的核酸を検出した。
（１）メンブレンタイプＤＮＡマイクロアレイの作製
　メルクミリポア製Ｈｉ－Ｆｌｏｗ　Ｐｌｕｓ　メンブレンシート（６０mm x ６００mm）に以下の表に示す塩基配列からなるキャプチャーＤＮＡプローブ溶液を、特開２００３－７５３０５号公報に記載されている吐出ユニット（インクジェット法）を用いた日本ガイシ株式会社ＧＥＮＥＳＨＯＴ（登録商標）スポッターを用いて、スポットした。使用した合成オリゴDNA配列は、文献（Analytical Biochemistry 364(2007)78-85）のSupplementary Table1記載のＤ１_１からＤ１_１００の１００種のうち以下の表に示す４４種の配列（表１）をプローブとして使用し、図８に示す配置でアレイ化した。なお、プローブとしては、オリゴヌクレオチドの３‘末端をアミノ基で修飾した配列を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
  
　プローブのスポットの後、Ｓｐｅｃｔｒｏｌｉｎｅ社のＵＶ照射装置（ＸＬ－１５００ＵＶ　Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ）を用いて、２００～５００ｍＪ／ｃｍ２程度の紫外線光の照射を行って固定化した。
（２）サンプル遺伝子の増幅
　増幅に使用したゲノムＤＮＡとしてはヒト由来のものを使用し、表２に記す配列のプライマーを使用して増幅を行った。なお、連結部位（Ｘ）には、以下に示すGlen Research社 Spacer Phosphoramidite C3を用い、通常のオリゴヌクレオチド合成方法に準じて合成した。なお、以下の断片１～４は、プローブＤ１－００１、００２，００３、００５によって検出されるようにプライマーが設計されている（ハイブリダイズタグはイタリックで記載している。）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
  
　なお、サンプル増幅用試薬として、ＱＩＡＧＥＮ社のmultiplex PCR master mix を使用した。サーマルサイクラーとして、Applied Biosystems社のGeneAmp PCR System9700を使用した。
（試薬調製）
ｄＨ２Ｏ    　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ４．０μｌ
2×multiplex PCR master mix　　　　　　　　　　　　　　５．０μｌ
プライマー混合物（各500nM）　　　　　　　　　　　 　　 ０．５μｌ
サンプル：ヒトゲノムDNA（50ng/μｌ）またはPCR water（フナコシ）
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　０．５μｌ
合計　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 １０．０μｌ
　次に、増幅用試薬をサーマルサイクルプレートに移し、サーマルサイクル反応（９５℃で１５分後；９５℃で３０秒、８０℃で１秒、６４℃で６分を４０サイクル、その後１０℃に下げる）を行って増幅試料とした。なお、対照として、ゲノムＤＮＡを含まない以外は上記試薬と同様の組成（PCR water（フナコシ））でＰＣＲ反応を行って対照試料とした。
　増幅したサンプルはＱＩＡＧＥＮ社のMinElute PCR Purification Kitにて精製を行った後、アガロース電気泳動により意図した長さで増幅していることを確認した。
（３）先行ハイブリダイゼーション
　サンプル遺伝子の増幅工程にて得られた増幅試料及び対照試料につき、増幅工程にて使用したプライマー配列（うちヒトゲノムＤＮＡ配列に対して特異的な配列）に相補な配列の１本鎖合成ＤＮＡ（表３）を混合した水溶液を適当量加え（以下組成記載）、９０℃～１００℃にセットされたヒートブロックにて数秒から１分程度熱処理を実施した。熱処理後常温程度に放冷して、先行ハイブリダイゼーション工程を実施した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
  
（ハイブリダイズ前処理サンプル組成）
ＰＣＲ完了サンプル　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０μｌ
相補配列1本鎖合成DNA混合水溶液（１０μＭ，ｅａｃｈ）１０．０μｌ
合計　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０．０μｌ
（４）メンブレンタイプＤＮＡマイクロアレイを用いた検出
（２）にて増幅し、（３）先行ハイブリダイゼーション工程を実施した増幅試料及び対照試料、並びに増幅しただけで先行ハイブリダイゼーション工程を実施していない増幅試料及び対照試料を用いてのメンブレンタイプＤＮＡマイクロアレイへの反応を行った。反応手順及びその検出手順は以下の通りとした。
（ハイブリダイズサンプル組成）
Hybri Solution*（0.5%Tween20-1%BSA-PBS）　　　　２００．０μｌ
D1-100プローブ配列に相補な配列のビオチン標識オリゴＤＮＡ（２５μＭ）
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　４．０μｌ
サンプル　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　４．０μｌ
合計　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０８．０μｌ
（ハイブリダイズおよび発色反応）
　メンブレンタイプＤＮＡマイクロアレイを０．２ｍｌチューブに入る大きさに切断し、チューブ内にセットし、調製したハイブリダイズサンプル各２００μｌを変性等のために加熱することなく添加し、ヒートブロック温度３７℃で３０分間ハイブリダイゼーション反応を行った。
　ハイブリダイゼーション反応終了後、メンブレンタイプＤＮＡマイクロアレイを洗浄液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０－１ｍＭ ＥＤＴＡ－ＴＢＳ）入り０．２ｍｌチューブに移し、３７℃のヒートブロック内で洗浄作業（３７℃×１ｍｉｎ、３７℃×１０ｍｉｎ、３７℃×１ｍｉｎ）を行った。
　洗浄済みのメンブレンタイプＤＮＡマイクロアレイをビオチン－ＨＲＰとストレプトアビジンとの混合液が入った０．２ｍｌチューブに移して室温下で２０分間の反応を行った。
　反応終了後、メンブレンタイプＤＮＡマイクロアレイを洗浄液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０－１ｍＭ ＥＤＴＡ－ＴＢＳ）入り０．２ｍｌチューブに移し、洗浄作業（室温×１ｍｉｎ、室温×１０ｍｉｎ、室温×１ｍｉｎ）を行った。
　洗浄済みメンブレンタイプＤＮＡマイクロアレイをＶｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ，３，３’，５，５’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅを用いて室温下で５分程度の発色反応を行った。
（検出判定）
　先行ハイブリダイゼーション工程を実施した増幅試料及び対照試料についてアレイの乾燥後の発色の有無を目視で確認した。結果を図９に示す。図９上段には、増幅試料の結果を示す。図９上段に示すように、増幅断片１～４のすべてにおいて、メンブレン上の各プローブ位置（Ｄ１－００１，００２，００３，００５）にて発色することを確認できた。一方、図９下段に対照試料の結果を示す。図９下段に示すように、断片１～４が増幅した際に反応するメンブレン上の各プローブ位置（Ｄ１－００１，００２，００３，００５）にて発色は確認されず、偽陽性を示す副生ハイブリダイズ産物の形成が抑制されていることがわかった。
　これに対して、先行ハイブリダイゼーション工程を実施しない増幅試料及び対照試料の結果を図１０に示す。図１０上段に示すように、ＰＣＲ時のサンプルにヒトゲノムＤＮＡを用いた場合では実施例１同様、断片１～４が増幅した際に反応するメンブレン上の各プローブ位置（Ｄ１－００１，００２，００３，００５）にて発色が確認された。一方で、図１０下段に示すように、対照試料では、先行ハイブリダイゼーション工程を実施した場合とは異なり、メンブレン上の各プローブ位置（Ｄ１－００１，００２，００３，００５）には発色が確認された。すなわち、偽陽性反応が生じていることがわかった。
(クロマトグラフィー形態のハイブリダイゼーションによる標的核酸の検出）
（１）クロマトグラフィーの作製
　メルクミリポア製Hi-Flow Plus メンブレンシート（６０ｍｍｘ６００ｍｍ）に以下の表に示す塩基配列からなるキャプチャーＤＮＡプローブ溶液を、特開２００３－７５３０５号公報に記載されている吐出ユニット（インクジェット法）を用いた日本ガイシ株式会社ＧＥＮＥＳＨＯＴ（登録商標）スポッターを用いて、スポットした。使用した合成オリゴDNA配列は、文献（Analytical Biochemistry 364(2007)78-85）のSupplementary Table1記載のＤ１_１からＤ１_１００の１００種のうち任意の８種の配列の３’末端側にアミノ基）を付加した配列（表４）をプローブとして使用し、図１１の通りの配置とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　スポットの後の処置としてＳｐｅｃｔｒｏｌｉｎｅ社のＵＶ照射装置(ＸＬ－１５００ＵＶ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ)を用いて、２８０ｎｍの成分を含む波長にて３００ｍＪ／ｃｍ２程度の紫外線光の照射を行って固定化を実施した。
（２）サンプル遺伝子の増幅
　サンプル遺伝子の増幅は、実施例１と同様に行った。
（３）先行ハイブリダイゼーション
　サンプル遺伝子の増幅工程にて得られた増幅試料及び対照試料につき、増幅工程にて使用したプライマー配列（うちヒトゲノムＤＮＡ配列に対して特異的な配列）に相補な配列の１本鎖合成ＤＮＡ（表３）を混合した水溶液を適当量加え（以下組成記載）、９０℃～１００℃にセットされたヒートブロックにて数秒から１分程度熱処理を実施した。熱処理後常温程度に放冷して、先行ハイブリダイゼーション工程を実施した。
（ハイブリダイズ前処理サンプル組成）
ＰＣＲ完了サンプル　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０μｌ
相補配列1本鎖合成DNA混合水溶液（１０μＭ，ｅａｃｈ）１０．０μｌ
合計　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０．０μｌ
（４）クロマトグラフィーを用いた検出
　先行ハイブリダイゼーション工程を実施した増幅試料及び対照試料、ならびに増幅しただけで先行ハイブリダイゼーション工程を実施していない増幅試料及び対照試料を用いてクロマトグラフィーへの反応及びその検出手順は以下の通りとした。
サンプル組成
展開液*　　　　　　　　　　　３０．０μｌ
ラテックス液＊　　　　　　　　 ２．０μｌ
サンプル　　　　　　　　　　 １０．０μｌ
合計　　　　　　　　　　　 　４２．０μｌ
*本発明に使用したラテックス保存液には青色系の着色剤を含有するポリスチレン系のラテックスビーズにアビジン(ストレプトアビジン)を被覆させたものを任意の濃度となるようにクロマト展開液で調製を行って使用した。
*クロマト展開液には、Phosphate buffered salineを使用した。
（ハイブリダイズおよび発色反応）
　上記試料各４２μｌを０．２ｍｌチューブに加えて、クロマトグラフィーを差込んで反応を開始した。サンプル液は約２０分間ですべて吸い上がり反応は完了した。反応終了後、クロマトグラフィーを風乾させた後、目視による反応箇所の確認及び画像を撮影した。
（検出判定）
　先行ハイブリダイゼーション工程を実施した増幅試料及び対照試料についてアレイの乾燥後の発色の有無を目視で確認した。結果を図１２に示す。図１２上段には、先行ハイブリダイゼーション工程を実施した増幅試料の結果を示す。図１２上段に示すように、増幅断片１～４のすべてにおいて、クロマトグラフィー上の各プローブ位置（Ｄ１－００１，００２，００３，００５）にて発色することを確認できた。一方で、対照試料についての結果を図１２下段に示す。図１２下段に示すように、対照試料の場合、断片１～４が増幅した際に反応するメンブレン上の各プローブ位置（Ｄ１－００１，００２，００３，００５）にて発色が確認されず、偽陽性を示す副生ハイブリダイズ産物の形成が抑制されていることがわかった。
　これに対して、先行ハイブリダイゼーション工程を実施しない増幅試料及び対照試料の結果を図１３に示す。図１３上段に示すように、先行ハイブリダイゼーション工程を実施しない場合でも、断片１～４が増幅した際に反応するメンブレン上の各プローブ位置（Ｄ１－００１，００２，００３，００５）にて発色が確認された。一方で、図１３下段に示すように、対照試料では、先行ハイブリダイゼーション工程を実施した場合とは異なり、メンブレン上の各プローブ位置（Ｄ１－００１，００２，００３，００５）には発色が確認された。すなわち、偽陽性反応が生じていることがわかった。
　本実施例では、浸漬型ハイブリダイゼーションに先だってアルカリ／ＳＤＳとマスキング剤とを用いた前処理について評価した。
　実施例１において得られたサンプル遺伝子の増幅試料につき、以下の手順に従い前処理を行った後、実施例１に準じてメンブレンタイプＤＮＡマイクロアレイを用いた検出を実施した。
　実施例1におけるサンプル遺伝子の増幅工程にて得られた増幅試料に対し、実施例１と同様、増幅工程にて使用したプライマー配列（うちヒトゲノムDNA配列に対して特異的な配列）に相補な配列の1本鎖合成DNA（マスキング剤）を混合した水溶液を適当量加え、0.1N水酸化ナトリウム/1%SDS水溶液を加え混合し、その後、さらに3M酢酸ナトリウム水溶液(pH4.8)を加え混合する工程を実施した後、実施例１に記載のメンブレンタイプＤＮＡマイクロアレイを用いて増幅産物を検出した。なお、対照として、ゲノムＤＮＡを含まない以外は上記試薬と同様の組成（PCR water（フナコシ））でＰＣＲ反応を行って対照試料とし、同様の操作を行った。
（ハイブリダイズ前処理サンプル組成）
PCR完了サンプル　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０μｌ
相補配列1本鎖合成DNA混合水溶液(10μM,each)　　　 １０．０μｌ
0.1N水酸化ナトリウム/1%SDS水溶液　　　　　　　　　 ５．０μｌ
3M酢酸ナトリウム水溶液(pH4.8)　　　　　　　　　 　 ５．０μｌ
合計　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　３０．０μｌ
（検出判定）
　アレイの乾燥後の発色の有無を目視で確認した。結果を図１４に示す。増幅試料については、実施例１と同様、断片1～4が増幅した際に反応するメンブレン上の各プローブ位置（D1-001，002，003，005）にて発色が確認された。一方で、対照試料については、メンブレン上の各プローブ位置（D1-001，002，003，005）には発色が確認されなかった。
　以上のことから、増幅試料及び対照試料に対して、ＰＣＲ反応で用いたプライマー中の識別用配列（ヒトゲノムＤＮＡに対して特異的な配列）に相補な一本鎖合成ＤＮＡの存在下、増幅試料を一旦アルカリ／ＳＤＳ変性後に、中性に戻すことで、偽陽性反応を抑制できることがわかった。すなわち、増幅試料及び対照試料中に存在する可能性のあるプライマーダイマーを一旦変性させ、生じた一本鎖プライマーと一本鎖合成ＤＮＡ（マスキング剤）とをハイブリダイズさせることで偽陽性反応が抑制されたことがわかった。また、これらの結果から、上記前処理によって、プライマーダイマーを解消後、プライマーとマスキング剤とのハイブリダイズ産物を形成することでダイマー形成が抑制されたことがわかった。
　本実施例では、展開型ハイブリダイゼーションに先だってアルカリ／ＳＤＳとマスキング剤とを用いた前処理について評価した。
　実施例１におけるサンプル遺伝子の増幅工程にて得られた増幅試料に対して、以下の手順にて前処理を行った後、実施例２に準じてクロマトグラフィーを用いた検出を実施した。
　実施例１におけるサンプル遺伝子の増幅工程にて得られた各産物に対し、増幅工程にて使用したプライマー配列中の識別配列に相補な配列の１本鎖合成ＤＮＡ（表３）を混合した水溶液を適当量加え、0.1N水酸化ナトリウム/1%SDS水溶液を加え混合し、さらに3M酢酸ナトリウム水溶液(pH4.8)を加え混合させる工程を実施した後、実施例２のクロマトグラフィーを用いた検出に記載された方法にて検出した。なお、対照として、ゲノムＤＮＡを含まない以外は上記試薬と同様の組成（PCR water（フナコシ））でＰＣＲ反応を行って対照試料とし、同様の操作を行った。
（ハイブリダイズ前処理サンプル組成）
PCR完了サンプル　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０μｌ
相補配列1本鎖合成DNA混合水溶液(10μM,each)　　 　１０．０μｌ
0.1N水酸化ナトリウム/1%SDS水溶液　　　　　　　　　 ５．０μｌ
3M酢酸ナトリウム水溶液(pH4.8)　　　　　　　　　　  ５．０μｌ
合計　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　３０．０μｌ
（検出判定）
　アレイの乾燥後の発色の有無を目視で確認した。結果を図１５に示す。増幅試料については、実施例２と同様、断片1～4が増幅した際に反応する各プローブ位置にて発色が確認された。一方で、対照試料については、各プローブ位置には発色が確認されなかった。
　以上のことから、増幅試料及び対照試料に対して、ＰＣＲ反応で用いたプライマー中の識別用配列に相補な一本鎖合成ＤＮＡの存在下、増幅試料を一旦アルカリ／ＳＤＳで変性後に、中性に戻すことで、偽陽性反応を抑制できることがわかった。また、これらの結果から、アルカリ／ＳＤＳを用いた前処理によって、プライマーダイマーを解消後、プライマーとマスキング剤とのハイブリダイズ産物を形成することでダイマー形成が抑制されたことがわかった。
　本実施例では、展開型ハイブリダイゼーションに先だって尿素とマスキング剤とを用いた前処理について評価した。
　実施例１におけるサンプル遺伝子の増幅工程にて得られた各増幅試料に対して、以下の手順にて作業を行った後、クロマトグラフィーを用いた検出を実施した。
　実施例１おけるサンプル遺伝子の増幅工程にて得られた各増幅試料に対し、増幅工程にて使用したプライマー配列（うちヒトゲノムDNA配列に対して特異的な配列）に相補な配列の1本鎖合成DNA(表３)を混合した水溶液を適当量加え（以下組成の一例を記載）、1M尿素水溶液を加え混合し、さらに1%ウレアーゼ水溶液を加え混合する工程を実施した後、実施例２のクロマトグラフィーを用いた検出に記載された方法にて検出した。なお、対照として、ゲノムＤＮＡを含まない以外は上記試薬と同様の組成（PCR water（フナコシ））でＰＣＲ反応を行って対照料とし、同様の操作を行った。
（ハイブリダイズ前処理サンプル組成）
PCR完了サンプル　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０μｌ
相補配列1本鎖合成DNA混合水溶液(10μM,each)　　　   １０．０μｌ
1M尿素水溶液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ５．０μｌ
1%ウレアーゼ水溶液　　　　　　　　　　　　　　　 　　５．０μｌ
合計　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　３０．０μｌ
（検出判定）
　アレイの乾燥後の発色の有無を目視で確認した。結果を図１６に示す。結果は、実施例３、４と同様に、増幅試料については、各プローブ位置にて発色が確認されたが、対照試料については、各プローブ位置には発色が確認されなかった。
　以上のことから、増幅試料及び対照試料に対して、ＰＣＲ反応で用いたプライマー中の識別用配列に相補な一本鎖合成ＤＮＡの存在下、増幅試料を一旦尿素で変性後に、尿素を除去することで、偽陽性反応を抑制できることがわかった。また、これらの結果から、尿素を用いた前処理によって、プライマーダイマーを解消後、プライマーとマスキング剤とのハイブリダイズ産物を形成することでダイマー形成を抑制されたことがわかった。
　本実施例では、展開型ハイブリダイゼーションに先だってＤＭＦとマスキング剤とを用いた前処理について評価した。
　実施例５に準じて、1M尿素水溶液を1Mホルムアミド水溶液に変えて検出を実施したところ、実施例５同様の効果が確認できた。これらの結果から、ＤＭＦを用いた前処理によって、プライマーダイマーを解消後、プライマーとマスキング剤とのハイブリダイズ産物を形成することでダイマー形成を抑制されたことがわかった。
　本実施例では、未反応プライマー自体とクロマトグラフィー上のプローブとのミスハイブリダイゼーションの抑制について評価した。
　以下記載の塩基配列を有する5‘ビオチン標識オリゴDNAをサンプルに用いてクロマトグラフィー上のプローブへのハイブリダイゼーションを実施した。なお、この塩基配列は、プローブＤ１_２に対して完全相補ではない。このサンプルに対して、以下のとおり、マスキング剤として一本鎖合成ＤＮＡ（5’- GCAGTGGCTTGGTTCATATAGGC-3）（配列番号１１８）を含む前処理液を調製しよく混合して前処理を行った。この前処理液につき、実施例２に準じてクロマトグラフィーを実施した。なお、対照として、マスキング剤溶液５μｌに替えてサンプルを４μｌ増量する以外は以下の前処理サンプル組成と同一の組成でクロマトグラフィー用液を調製し、実施例２に準じてクロマトグラフィーを実施した。
　5’biotin-GCCTATATGAACCAAGCCACTGC-3’（配列番号１１７）
（ハイブリダイズ前処理サンプル組成）
サンプル（0.8μM）　　　　　　　　　　　　　　　　　５．０μｌ
相補配列1本鎖合成DNA混合水溶液(10μM,each)　　　  　５．０μｌ
展開液*　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ３０．０μｌ
ラテックス液*　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　２．０μｌ
合計　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４２．０μｌ
 
（検出判定）
　乾燥後の発色の有無を目視で確認した。前処理実施試料についての結果を図１７下段に示し、前処理未実施の対照試料の結果を図１７上段に示す。図１７に示すように、前処理実施試料については、クロマトグラフィー上のプローブのうち（D1-002）おいて発色が確認されなかった。すなわち、ミスハイブリダイゼーションが抑制されていた。これに対し、前処理未実施対照試料については、完全相補でないにも関わらず上記プローブにミスハイブリダイゼーションしていた。
　以上の結果から、増幅試料中に存在する未反応プライマーによるミスハイブリダイゼーションによっても偽陽性となるが、プライマーをターゲットとするマスキング剤によって未反応プライマーによる偽陽性を抑制できることがわかった。
　本実施例では、未反応プライマーとクロマトグラフィー上のプローブとのミスハイブリダイゼーションによる感度低下の抑制について評価した。
　以下記載の各種サンプルを用いての実施例２に準じてクロマトグラフィーへのハイブリダイゼーションを実施した。
　サンプル１：5’- CATCTAAAGCGTTCCCAGTTCCA-biotin-3’（D1-002に相補な配列）（配列番号１１９））
　サンプル２：5’-GCCTATATGAACCAAGCCACTGC-3’（配列番号１２０）
　サンプル３：5’- GCAGTGGCTTGGTTCATATAGGC-3’（サンプル２に相補な配列）（配列番号１２１）
サンプル組成I
展開液　　　　　　　　　　　　３０．０μｌ
ラテックス液　　　　　　　　　　２．０μｌ
サンプル１（0.4μM）　　　　　１０．０μｌ
合計　　　　　　　　　　　　　４２．０μｌ
サンプル組成II
展開液　　　　　　　　　　　　３０．０μｌ
ラテックス液　　　　　　　　　　２．０μｌ
サンプル１(0.8μM)　　　　　　　５．０μｌ
サンプル２（0.8μM）　　　　　　５．０μｌ
合計　　　　　　　　　　　　　４２．０μｌ
サンプル組成III
展開液　　　　　　　　　　　　３０．０μｌ
ラテックス液　　　　　　　　　　２．０μｌ
サンプル１(1.6μM)　　　　　　　２．５μｌ
サンプル２（1.6μM）　　　　　　２．５μｌ
サンプル３（10μM）　　　　　　 ５．０μｌ
合計　　　　　　　　　　　 　 ４２．０μｌ
（検出判定）
　乾燥後の発色の有無を目視で確認した。結果を図１８に示す。サンプル組成Iではクロマトグラフィー上のプローブのうち（D1-002）おいて強い発色が確認され、サンプル組成IIでは発色が薄くなる結果となった。このことは、増幅試料中にプライマーそのものが未反応状態で残っている場合、そのプライマー配列によっては、プローブに非特異的に反応し、反応すべきサンプルの反応を抑制しうることを示している。
　一方、サンプル組成IIIでは、プローブ（D1-002）おいてサンプル組成Iと同等の強い発色が確認された。このことは、未反応状態で残っていたプライマーそのものが相補な配列のマスキング剤によりマスクされたことで、非特異的反応が解消され、反応すべきサンプルの反応結果が適切に得られたことを示している。
　以上説明したように、いずれも５分未満の短い作業時間内でミスハイブリダイゼーションを抑制し、偽陽性を回避できることがわかった。
配列番号１～１００、１０９～１１６：プローブ
配列番号１０１～１０８：プライマー
配列番号１１７～１２１：合成ＤＮＡ

Claims (15)

  1. 　標的核酸の検出方法であって、
    　二本鎖部分と、当該二本鎖の少なくとも一方の端部に突出して位置される一本鎖部分であるタグ鎖と、を備え、標的核酸に関連付けられる核酸増幅産物と、前記タグ鎖の１つとハイブリダイズ可能なプローブとを、目的ハイブリダイズ産物が形成可能な条件で接触させるハイブリダイゼーション工程、
    を備え、
    　前記ハイブリダイゼーション工程において、
    　以下の（ａ）及び（ｂ）；
    （ａ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマー
    （ｂ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマーを含む増幅用プライマーのダイマー由来の増幅産物
    から選択される少なくとも一種の核酸構造体と前記プローブとのと偽陽性を呈する副生ハイブリダイズ産物の形成を抑制する、検出方法。
  2. 　前記ハイブリダイゼーション工程に先立って、
    　前記少なくとも一種の核酸構造体の少なくとも一部と、当該一部とハイブリダイズ可能なマスキング剤と、がハイブリダイズしたクリーンアップハイブリダイズ産物を形成する先行ハイブリダイゼーション工程を備える、請求項１に記載の検出方法。
  3. 　前記先行ハイブリダイゼーション工程は、前記（ｂ）の核酸構造体を融解後、前記（ｂ）の核酸構造体の構成鎖と前記マスキング剤とから前記クリーンアップハイブリダイズ産物を形成する、請求項２に記載の検出方法。
  4. 　前記先行ハイブリダイゼーション工程は、前記（ｂ）の核酸構造体を熱融解する、請求項３に記載の検出方法。
  5. 　前記先行ハイブリダイゼーション工程は、前記（ｂ）の核酸構造体を酸又はアルカリで融解する、請求項３に記載の検出方法。
  6. 　前記先行ハイブリダイゼーション工程は、前記（ｂ）の核酸構造体を核酸変性剤で融解する、請求項３に記載の検出方法。
  7. 　前記マスキング剤は、前記（ａ）の核酸構造体の少なくとも一部とハイブリダイズ可能な核酸であるマスキング剤を含む、請求項２～６のいずれかに記載の方法。
  8. 　前記マスキング剤は、前記（ｂ）の核酸構造体の少なくとも一部と同一又はハイブリダイズ可能な核酸であるマスキング剤を含む、請求項２～７のいずれかに記載の方法。
  9. 　前記核酸増幅産物は、前記二本鎖部分と、前記二本鎖の一方の端部にのみ突出して位置される一本鎖部分であるタグ鎖と、を備える核酸増幅産物を含む、請求項１～８のいずれかに記載の検出方法。
  10. 　前記ハイブリダイゼーション工程は、クロマトグラフィー形態で実施する、請求項１～９のいずれかに記載の検出方法。
  11. 　前記ハイブリダイゼーション工程は、浸漬型ハイブリダイゼーションの形態で実施する、請求項１～９のいずれかに記載の検出方法。
  12. 　核酸増幅産物の精製方法であって、
    　二本鎖部分と、当該二本鎖の少なくとも一方の端部に突出して位置される一本鎖部分であるタグ鎖を備える核酸増幅産物の存在下で、
    以下の（ａ）及び（ｂ）；
    （ａ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマー
    （ｂ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマーを含む増幅用プライマーのダイマー由来の増幅産物
    から選択される少なくとも一種の核酸構造体の少なくとも一部とハイブリダイズ可能なマスキング剤をハイブリダイズ可能に付与する工程
    を備える、精製方法。
  13. 　核酸増幅産物の精製剤であって、
    　前記核酸増幅産物は、二本鎖部分と、当該二本鎖の少なくとも一方の端部に突出して位置される一本鎖部分であるタグ鎖を備える核酸増幅産物であり、
    　以下の（ａ）及び（ｂ）；
    （ａ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマー
    （ｂ）標識物質又は標識物質結合物質を保持しうる増幅用プライマーを含む増幅用プライマーのダイマー由来の増幅産物
    から選択される少なくとも一種の核酸構造体の少なくとも一部とハイブリダイズ可能なマスキング剤を含む、精製剤。
  14. 　二本鎖部分と、当該二本鎖の少なくとも一方の端部に突出して位置される一本鎖部分であるタグ鎖を備える核酸増幅産物を得るための少なくとも一対の増幅用プライマーと、
    　以下の（ａ）及び（ｂ）；
    （ａ）前記核酸増幅産物の増幅用プライマー
    （ｂ）前記増幅用プライマーのダイマー由来の増幅産物、
    から選択される少なくとも一種の核酸構造体の少なくとも一部とハイブリダイズ可能なマスキング剤と、
    を含むキット。
  15. 　さらに、核酸クロマトグラフィーに用いるクロマトグラフィー用プローブ固定化体を含む、請求項１４に記載のキット。
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