WO2018038232A1 - 標的核酸の増幅産物の生産方法及びその利用 - Google Patents

標的核酸の増幅産物の生産方法及びその利用 Download PDF

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WO2018038232A1
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nucleic acid
target nucleic
strand
amplification
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PCT/JP2017/030425
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三雄 川瀬
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国立大学法人東北大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • This specification relates to a method for producing an amplification product of a target nucleic acid and its use.
  • a PCR (Polymerase Chain ⁇ Reaction) method is known as one of the methods for amplifying a target nucleic acid sequence.
  • the PCR method is currently the most common method for nucleic acid amplification in vitro.
  • the PCR method is exponentially repeated by temperature cycling, that is, heating-cooling cycle, to bind the primer to the target nucleic acid, extend the primer, release the extended primer from the target nucleic acid, and bind the new primer to the target nucleic acid.
  • the target nucleic acid can be amplified.
  • the PCR method has been established as an excellent detection method due to its high sensitivity based on its exponential amplification effect, and has been widely applied as an important tool for supporting genetic engineering techniques.
  • nucleic acid amplification methods include transcription amplification system (TAS), ligase chain reaction (LCR), random priming amplification (RPA), and amplification using Qbeta replicase, restriction endonuclease and random hexamer.
  • TAS transcription amplification system
  • LCR ligase chain reaction
  • RPA random priming amplification
  • Qbeta replicase Qbeta replicase
  • restriction endonuclease and random hexamer.
  • some of the target nucleic acid amplification methods may be performed without temperature cycling.
  • a NASBA method also called NucIeic Acid Sequence-based Amplification / TMA method (Transcription Mediated Amplification)
  • SDA method String DispIacement Amplification
  • LAMP method Loop-mediated isothermal amplification
  • the LAMP method uses a primer in which an oligonucleotide having a sequence homologous to a part of a sequence 3 ′ downstream of the primer sequence is bound to the 5 ′ side of a primer complementary to a part of the target nucleic acid. . That is, when the primer is extended, the sequence bonded to the 5 'side has a structure that forms a loop with the extended sequence.
  • a sequence called a dumbbell structure having a loop structure on both the 5 'end and the 3' end is generated.
  • the 3 'end of the loop structure on the 3' side is extended by a polymerase having strand displacement activity using the loop to newly generate a sequence having a loop structure on the 3 'side.
  • a polymerase having such a strand displacement activity by using a polymerase having such a strand displacement activity, the extension reaction from the 3 'end of the loop structure is folded without temperature circulation, thereby causing amplification of the target nucleic acid sequence.
  • the LAMP method is amplified only by a polymerase having strand displacement activity, the cost is not increased as compared with other methods, but a primer having a special structure is required, so that the design is difficult and there is a problem in versatility.
  • This specification provides a method for producing an amplification product of a target nucleic acid based on a novel principle. More specifically, a method is provided that can achieve amplification of a target nucleic acid with substantially no temperature cycling.
  • the present inventors paid attention to the function of temperature circulation in nucleic acid amplification, in particular, the release and recombination between complementary strands in order to omit temperature circulation. That is, the present inventors examined a method by which unreacted primers can be bound by loosening complementary strand pairing in the primer portion of the extension product formed by extending the primer from a completely different angle from the known approach.
  • the target nucleic acid can be amplified by newly producing a bond between the primer and the template strand even under such isothermal conditions, and the present invention has been completed.
  • the present specification provides the following means based on such findings.
  • a method for producing an amplification product of a target nucleic acid An amplification step of performing a nucleic acid amplification reaction on a test sample that may contain the target nucleic acid, using a first primer, a second primer, and a nucleic acid polymerase having strand displacement activity; With The production method, wherein the amplification step is a step using two or more oligonucleotides capable of promoting dissociation of double strands of the target nucleic acid.
  • the first primer hybridizes with the first primer on the first template strand and the second primer hybridizes on the second template strand.
  • each of the second hybridization regions is configured to be capable of existing via hybridization with at least one of the first template strand and the second template strand in the vicinity of each of the second hybridization regions.
  • the two or more oligonucleotides include a third primer that hybridizes to the second template strand in the vicinity of the first hybridization region, and the first primer in the vicinity of the second hybridization region. And a fourth primer that hybridizes to the template strand of (1) or (2).
  • the third primer hybridizes to the second template strand inside the target nucleic acid from the first hybridizing region,
  • the production method according to (3), wherein the fourth primer hybridizes to the first template strand inside the target nucleic acid with respect to the second hybridization region.
  • the two or more oligonucleotides are provided on the 5 ′ end side of the first primer and are independent of a nucleic acid amplification reaction, and the 5 ′ end side of the second primer.
  • (6) The production according to (5), wherein the first primer includes the first tag via a spacer, and the second primer includes the second tag via a spacer. Method.
  • the spacer is capable of suppressing or stopping a nucleic acid synthesis reaction by the nucleic acid polymerase having the strand displacement activity.
  • a method for detecting a target nucleic acid An amplification step of performing a nucleic acid amplification reaction on a test sample that may contain the target nucleic acid, using a first primer, a second primer, and a nucleic acid polymerase having strand displacement activity; Detecting the target nucleic acid via at least a portion of the amplification product obtained in the amplification step; With The detection method, wherein the amplification step is a step using two or more oligonucleotides capable of promoting dissociation of double strands of the target nucleic acid. (12) The detection method according to (11), wherein the detection step includes separation by chromatography through the at least part of the amplification product.
  • kits for detecting a target nucleic acid, A first primer and a second primer; Two or more oligonucleotides capable of promoting dissociation of the double strand of the target nucleic acid; A kit comprising:
  • FIG. 1 It is a figure which shows one aspect
  • the method for producing an amplification product of a target nucleic acid disclosed herein is the “target nucleic acid” in the production method, that is, the target nucleic acid originally present in a test sample.
  • the first template strand to which the first primer as the amplification product of the target nucleic acid generated in the amplification step hybridizes and the first extension strand that is the extension strand of the first primer
  • Two or more oligos that promote dissociation of the “double strand” between the “second strand” and the second template strand to which the second primer hybridizes and the second extension strand that is the extension strand of the second primer Use nucleotides.
  • a region where the first primer hybridizes on the first template strand of the target nucleic acid is defined as the first hybridizing region, and the second primer is defined on the second template strand of the target nucleic acid.
  • the hybridizing region is referred to as a second hybridizing region.
  • Two or more oligonucleotides can be present in the vicinity of each of the first hybridizing region and the second hybridizing region via hybridization with at least one of the first template strand and the second template strand. Can be done. By so doing, new first and second primers can be effectively hybridized to the respective template strands.
  • target nucleic acid represents a nucleic acid containing a target nucleic acid sequence.
  • the target nucleic acid can be either single-stranded or double-stranded, and is often DNA, RNA, a derivative of DNA or RNA, or a combination thereof.
  • Target nucleic acid sequence means a specific sequence comprising all or part of the sequence of a single-stranded nucleic acid.
  • target nucleic acid means a nucleic acid containing a target sequence to be detected.
  • the origin of the target nucleic acid is not particularly limited, and examples thereof include various biological materials (individuals or a part of an individual such as a tissue or an organ thereof, excrement, body fluid, etc.), and artificial materials including artificial nucleic acids.
  • a biological material or artificial material that may contain the target nucleic acid itself or, if necessary, a part or all of the constituent components other than the nucleic acid is removed from such various materials, and a nucleic acid extraction sample is used as a sample. Can be supplied.
  • oligonucleotide refers to a polymer in which two or more nucleosides or analogs thereof are bound.
  • the sugar group of the nucleoside and its analog may be ribose, deoxyribose or its analog, and the base of the nucleoside or its analog is a known natural base or a base analog capable of pairing with a natural base It may be.
  • Oligonucleotides may also be single-stranded or double-stranded, but generally refer to single-stranded forms unless otherwise stated.
  • the oligonucleotide is typically DNA, RNA, or analogs thereof.
  • the number of polymerizations of the nucleoside or its analog in the “oligonucleotide” is not particularly limited. Since the chain length of a primer recognized by a known polymerase that catalyzes a sequence-dependent nucleic acid synthesis reaction is at least about 5 bases, the chain length of the portion to be annealed must be longer. In addition, in order to expect specificity as a base sequence, it is desirable to use a length of 10 bases or more stochastically. On the other hand, it is difficult to prepare an excessively long base sequence by chemical synthesis.
  • the oligonucleotide chain length is, for example, several to 200 bases, for example, about 10 to about 100, for example, about 10 to about 50, for example, 10 About 30 or more.
  • the chain length illustrated here is the chain length of the part annealed with a complementary strand to the last.
  • FIG.1 and FIG.2 is a figure which shows the outline
  • This production method comprises an amplification step of performing a nucleic acid amplification reaction on a test sample that may contain the target nucleic acid, using a first primer, a second primer, and a nucleic acid polymerase having strand displacement activity. Can be provided.
  • the double strands of the target nucleic acid and the extended strands generated from the first primer and the second primer generally used for nucleic acid amplification and their respective template strands are not substantially accompanied by a temperature change.
  • an amplification step comprising performing under substantially isothermal conditions.
  • First primer and second primer As the first primer and the second primer used in this production method, basically, a forward primer and a reverse primer based on the same design as the conventional PCR method can be used.
  • Each of the first and second primers includes an identification sequence that constitutes an identification region for hybridizing to the first template strand and the second template strand that are the respective templates so that the target nucleic acid can be amplified.
  • the identification sequence can be determined by appropriately considering the base sequence of the target nucleic acid and the specificity of the primer itself by a known method.
  • the length of the identification sequence is not particularly limited, but can generally be about 10 to 30 bases long, for example, about 15 to 25 bases long. .
  • the identification regions of the first and second primers hybridize to the first and second hybridizing regions of the first and second template strands, respectively.
  • the first and second primers can be provided with a tag on the 5 ′ end side, if necessary.
  • the tag includes both a tag involved in the nucleic acid amplification reaction and a tag independent of the reaction not involved in the reaction.
  • the tag involved in the nucleic acid amplification reaction is a tag that can function as a template by the nucleic acid amplification reaction and the complementary strand can be extended.
  • the tag independent of the nucleic acid amplification reaction is a nucleic acid amplification. In the reaction, the tag is maintained as a single strand without becoming a template.
  • a primer tag for amplifying the extended strand generated by the first and second primers with another primer can be mentioned.
  • a tag is a tag involved in a nucleic acid amplification reaction.
  • the primer tag is generally designed to be capable of hybridizing to a commonly used primer identification sequence called a universal primer.
  • a detection tag for capturing the amplification product and detecting the target nucleic acid can be mentioned.
  • a tag can be designed as a tag involved in the nucleic acid amplification reaction or as a tag independent of the nucleic acid amplification reaction.
  • the detection tag is designed to be hybridizable with a detection probe that is an oligonucleotide for detecting an amplification product.
  • a labeling tag used for detecting an amplification product can be mentioned.
  • a tag can be designed as a tag involved in the nucleic acid amplification reaction or as a tag independent of the nucleic acid amplification reaction.
  • a labeling tag is designed to be hybridizable with a labeling probe which is an oligonucleotide holding various labeling elements such as a labeling substance and a labeling substance-binding substance. The label element will be described later.
  • the base length of these various tags is not particularly limited, but is preferably 15 bases or more and 50 bases or less. This is because within this range, the specificity and efficiency of hybridization can be ensured.
  • the base length of the tag is more preferably 20 bases or more and 50 bases or less, and even more preferably about 20 bases or 25 bases or less.
  • sequence for the tag sequence particularly the base sequence of the tag independent of the nucleic acid amplification reaction
  • the base sequence described in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 100 or a base sequence complementary to this base sequence is used. Can do. These base sequences all have the same base length (23 base length).
  • These base sequences are also referred to as orthonormalized sequences. For example, a DNA sequence having a predetermined base length obtained from random numbers is used to calculate a continuous match length, melting temperature prediction by Nearest-Neighbor method, Hamming distance, and secondary structure prediction. (H. Yoshida and A.Suyama, “Solution to 3-SAT by breadth first search”, DIMACS Vl.54, 9-20 (2000)).
  • the tags in the first and second probes may be provided via appropriate spacers for the hybridizing region on the 3 'side.
  • a tag independent of the nucleic acid amplification reaction can be provided to the hybridizing region via a “suppression element” capable of suppressing or stopping the nucleic acid polymerase reaction.
  • suppression elements are disclosed, for example, in International Publication No. 2013/039228, International Publication No. 2012/070618, International Publication No. 2006/095550, etc. Primers can be obtained by selecting inhibitory elements.
  • the first and second primers can further comprise at least one of two or more oligonucleotides as defined herein. Such two or more oligonucleotides will be described in detail later.
  • nucleic acid polymerase examples include RNA polymerase and DNA polymerase.
  • the DNA polymerase used in this production method may have strand displacement activity.
  • the strand displacement activity is the process of synthesizing a nucleic acid strand complementary to a template strand. Even if there is a double-stranded region in the extension direction, the activity to continue the synthesis of the complementary strand while dissociating the strand.
  • the nucleic acid polymerase has strand displacement activity, the first and second primers newly hybridized to the template strand have the first extended strand and the second extended strand partially separated from the respective template strands. Even if it is in a hybridized state, a new extended chain can be easily synthesized.
  • the DNA polymerase used in this production method is screened from various known DNA polymerases (including DNA polymerase having strand displacement activity) using a DNA polymerase suitable for this production method as a test polymerase in this production method.
  • the amount of amplification can be selected as an index.
  • the DNA polymerase used in the production method may be a known DNA polymerase mutant.
  • the term “mutant” refers to those obtained by extracting only the structure that provides the catalytic activity required by the enzyme, or those modified in catalytic activity, stability, or heat resistance by amino acid mutation or the like. Can do.
  • Those skilled in the art can appropriately obtain DNA polymerase mutants by screening a protein in which a mutation has been introduced into a certain region of DNA polymerase by a known genetic engineering technique according to the purpose of the mutation. Can do.
  • the DNA polymerase used in this production method may have a 3'-5 'exonuclease activity that degrades DNA from the 3' side, but may be deleted in view of amplification efficiency. Furthermore, it may have 5'-3 'exonuclease activity that degrades DNA from the 5' side as long as there is no problem with amplification in this production method.
  • the DNA polymerase used in the production method preferably has heat resistance.
  • heat resistance with respect to DNA polymerase means that the optimum reaction temperature is 55 ° C. or higher and 80 ° C. or lower, more preferably 60 ° C. or higher and 75 ° C. or lower.
  • the optimum reaction temperature can be based on the activity (or measurement method thereof) defined as the activity unit for commercially available DNA polymerase.
  • regulate that heat resistance is 80 degreeC or more at the temperature after which DNA polymerase activity lose
  • the design of the primer is less likely to be constrained by the heat denaturation temperature of the DNA polymer, and heat denaturation is required, such as the first hybridization between the primer and the template strand. This is because there are cases.
  • suitable DNA polymerases for this production method include Bst DNA polymerase, Bca (exo-) DNA polymerase, Csa DNA polymerase, 96-7 DNA polymerase, Klenow fragment of DNA polymerase I, Vent DNA polymerase, Vent (Exo -) DNA polymerase (excluding 3'-5 'exonuclease activity from Vent DNA polymerase), DeepVent DNA polymerase, DeepVent (Exo-) DNA polymerase (3'-5' exonuclease from DeepVent DNA polymerase) (Excluding the activity), ⁇ 29 phage DNA polymerase, MS-2 phage DNA polymerase, Z-Taq DNA polymerase (Takara Shuzo), KOD DNA polymerase (Toyobo) and the like.
  • Bst-DNA polymerase Bca (exo-) DNA polymerase, and Vent (Exo-) DNA polymerase can be preferably used. These enzymes have moderate heat resistance and high DNA polymerase activity.
  • the target nucleic acid is a target nucleic acid originally present in the test sample, as well as a first template strand generated in the amplification step and an extended strand of the first primer. It is synonymous with a double strand of one extended strand and a double strand of a second template strand and a second extended strand which is an extended strand of the second primer.
  • promoting dissociation of the target nucleic acid includes promoting dissociation of the extended strand and the template strand in addition to the target nucleic acid.
  • to promote dissociation of a target nucleic acid means to at least partially induce or promote dissociation of a double strand of the target nucleic acid.
  • dissociation oligonucleotides By using such two or more oligonucleotides, the dissociation of the double strand of the target nucleic acid is caused or promoted without substantial change in temperature or under substantially isothermal conditions, and a new The first primer and the second primer can be hybridized to each template strand or the like.
  • two or more oligonucleotides will be referred to as dissociation oligonucleotides.
  • the dissociating oligonucleotide promotes hybridization of the first primer to the second template strand and at least one oligonucleotide for promoting hybridization of the first primer to the first template strand. At least one oligonucleotide for
  • the dissociation oligonucleotide is preferably interposed in the vicinity of the hybridizing region on the template strand to which the first and second primers hybridize. By doing so, it is possible to reduce the pairing stability between the first and second extended strands and the respective template strands in these hybridizing regions. As a result, dissociation and single strand formation of the double-stranded portion between the first and second extended strands and the respective hybridizing regions are promoted, and the new first and second primers are effectively used as template strands. Can be hybridized.
  • the dissociation oligonucleotide can be present via hybridization to at least one of the first template strand and the second template strand in the vicinity of each of the first hybridizing region and the second hybridizing region of the target nucleic acid. It is preferable to be configured. By doing so, the dissociation oligonucleotide can be surely present in the vicinity of the first and second hybridizing regions, and the double-strand dissociation of the target nucleic acid in the vicinity of the hybridizing region and the first and second primers. Can be hybridized to each template strand.
  • the oligonucleotide for dissociation can take various forms. In this production method, these various aspects can be used in appropriate combination. Hereinafter, the action of the oligonucleotide for dissociation will be described with reference to the amplification step in this production method. The amplification conditions and the like will be described later.
  • the oligonucleotide for dissociation can be used as a primer, for example.
  • FIG. 1 shows a first primer 10 and a second primer 20, and a third primer 30 and a fourth primer 40 as dissociation oligonucleotides used for these.
  • the third primer 30 is located in the vicinity of the first hybridizing region H1 in the first template strand 100, that is, inside the target nucleic acid T from the first hybridizing region H1, ie, the first
  • the template strand 100 is configured to be capable of hybridizing to the second template strand 200 on the 5 ′ end side.
  • the third primer 30 is configured to be capable of forming an extended chain in the extension direction different from that of the first primer 10 in the vicinity of the first hybridizing region H1. That is, the third primer 30 is present in the vicinity of the first hybridizing region H1 by hybridizing to the second template strand 200 or the first extended strand 12 itself.
  • the fourth primer 40 is located in the vicinity of the second hybridizing region H2 in the first template strand 200, that is, inside the target nucleic acid T from the second hybridizing region H1, that is, the second template strand. It is configured to be capable of hybridizing to the first template strand 100 on the 5 ′ end side of 200.
  • the fourth primer 40 is configured to be capable of forming an extended strand in the extension direction different from that of the second primer 20 in the vicinity of the second hybridizing region H2. That is, the fourth primer 40 is present in the vicinity of the first hybridizing region H2 by hybridizing to the first template strand 100 or the second extended strand 22 itself.
  • the following amplification process is an inference about the operation of the dissociation oligonucleotide of such an embodiment, and does not constrain the disclosure of this specification. Absent.
  • the first and second primers 10 and 20 hybridize to the double-stranded target nucleic acid consisting of the template strands 100 and 200, respectively, and the first extended strand 12 and the second strand The extended strand 22 is synthesized. As a result, double strands A2 and A1 are born from the first and second primers 10 and 20, respectively.
  • the third primer 30 is located in the vicinity of the first hybridizing region H1 in the first template strand 100, that is, the nascent double strand A2 than the first hybridizing region H1. , That is, on the 5 ′ end side of the first template strand 100, hybridizes to the first extension strand 12. In other words, the third primer 30 hybridizes 3 ′ to the portion derived from the first primer 10 in the first extended strand 12. Therefore, the third primer 30 can be extended in the 3 'direction (the direction opposite to the extension direction of the first primer 10) using the first extension strand 12 as a template. Such hybridization of the third primer 30 makes the pairing in the vicinity of the hybridizing region H1 of the nascent double strand A2 unstable and promotes the dissociation thereof.
  • the fourth primer 40 is near the second hybridizing region H2 in the first template strand 200, that is, inside the nascent double strand A1 than the second hybridizing region H2, that is, the second Hybridizes to the second extended strand 22 on the 5 ′ end side of the template strand 200.
  • the fourth primer 40 hybridizes on the 3 ′ side with respect to the portion derived from the second primer 20 in the second extended strand 22. Therefore, the fourth primer 40 can be extended in the 3 'direction (the direction opposite to the extension direction of the second primer 20) using the second extension strand 22 as a template.
  • the third and fourth primers 30, 40 have a third extended strand 32 and a reverse direction opposite to the extension direction of the first and second primers 10, 20, respectively.
  • a fourth elongated strand 42 is formed.
  • the first and second primers 10 and 20 are newly hybridized to the template strands 100 and 200 as shown in FIG. Then, as shown in FIG. 3 (d), the first and second primers 10 and 20 newly hybridized to the template strands 100 and 200 form new extended strands 12 ′ and 22 ′, respectively. Double strands A4 and A3 are born.
  • the second and first primers 20 and 10 are hybridized by using the first and second extended strands 12 and 22 hybridized with the third and fourth primers 30 and 40 or their extended strands 32 and 42 as templates, and a new one is obtained. Extended strands 22 ", 12" are also synthesized.
  • the target nucleic acid is amplified by the first and second primers 10 and 20 hybridizing to the nascent double-stranded hybridizing regions H1 and H2.
  • the third and fourth primers 30, 40 as oligonucleotide fragments are interposed in the vicinity of the first and second hybridizing regions H1, H2, Pairing of the target nucleic acid T and nascent double strands that can occur in the amplification step can be inhibited and destabilized in the vicinity of the hybridizing regions H1 and H2 to promote dissociation.
  • these primers 30 and 40 can produce
  • the third and fourth primers 30 and 40 can promote the dissociation between the extended strands 12 and 22 and the template strands 100 and 200 in the nascent duplex, thereby substantially reducing the temperature change.
  • the target nucleic acid can be amplified without or under substantially isothermal conditions.
  • the first and second primers 10 and 20 hybridize with the templates 100 and 200, and then the extended strands in which the third and fourth primers 30 and 40 are the respective templates. Although described so that it may hybridize to 12 and 22, although the hybridization aspect of these primers is not specifically limited. Hybridization of these primers to each template strand is considered to occur simultaneously or in succession. That is, prior to or simultaneously with the first and second primers 10 and 20 hybridizing to the template strands 100 and 200, the third and fourth primers 30 and 40 are transferred to the template strands 200 and 100.
  • Hybridization is considered to occur in various manners such as hybridization to the extended strands 12 and 22, but in any case, the template strands 100 and 200 and the second strands of the first and second primers 10 and 20 are considered. Hybridization to the extended strand 22 and the first extended strand 12 is promoted.
  • the identification sequence for hybridizing to the second template strand 200 or the first extended strand 12 of the third primer 30 can be set as appropriate in relation to the target nucleic acid sequence and other primers. A highly specific sequence and length can be set in the same manner as in the first and second primers described. The same applies to the identification sequence for the first template strand 100 or the second extended strand 22 of the fourth primer 40.
  • the third primer 30 may partially overlap the hybridizing region H1 as long as it can hybridize to the template strand 200 or the extended strand 12 inside the target nucleic acid T relative to the hybridizing region H1. From the viewpoint of amplification efficiency, it is preferably designed to hybridize to the template strand 200 or the extended strand 12 without completely overlapping the hybridizing region H1.
  • the distance from the 5 ′ end of the hybridizing region H1 to set the hybridizing region of the third primer 30 is not particularly limited.
  • the 5 ′ end of the hybridizing region H1 is not limited.
  • the 5 ′ end of the hybridizing region of the third primer 30 can be located 3 to 20 bases away from the base. More preferably, they are 5 bases or more and 15 bases or less, More preferably, 5 bases or more and 10 bases or less are spaced apart.
  • the fourth primer 40 can take various modes with respect to the hybridizing region H2 in the same manner as the third primer 30.
  • the oligonucleotide for dissociation can also be a tag provided in a part of the first primer and / or the second primer.
  • FIG. 4 shows a form in which the template strands 200 and 100 of the target nucleic acid T are amplified using the first primer 1010 and the second primer 1020, respectively.
  • the first primer 1010 has a first tag 1030 as a dissociation oligonucleotide
  • the second primer 1020 has a second tag 1040 as a dissociation oligonucleotide.
  • the first and second tags 1030 and 1040 are independent of the nucleic acid amplification reaction provided via a deterrent element on the 5 ′ end side of each of the hybridizing regions H1 and H2 of the first and second primers 1010 and 1030.
  • a tag comprising a natural nucleic acid (natural DNA).
  • the first and second tags 1030 and 1040 are configured such that the first and second primers 1010 and 1020 hybridize to the template strands 100 and 200 or the extended strands 22 and 12, respectively. It can exist in the vicinity of the hybridizing regions H1 and H2.
  • the following amplification process is an inference about the operation of the dissociation oligonucleotide of such an embodiment, and does not constrain the disclosure of this specification. Absent.
  • the first and second primers 1010 and 1020 hybridize to the double-stranded target nucleic acid T composed of the template strands 100 and 200, respectively.
  • the first and second tags 1030 and 1040 act to promote dissociation of the template strands 100 and 200 in the vicinity of the first and second hybridizing regions H1 and H2.
  • the first and second primers 1010 and 1020 synthesize the first and second extended strands 1012 and 1022, and two double strands A1 and A2 are born.
  • a second tag 1040 is arranged at the 3 ′ end of the template strand 200 of the nascent double strand A1, that is, near the hybridizing region H2 (on the 3 ′ end side).
  • the first tag 1030 is arranged at the 3 ′ end of the template strand 100 of the nascent double strand A2, that is, in the vicinity of the hybridizing region H1 (the 3 ′ end side).
  • the first and second regions in the vicinity of the second and first hybridizing regions H2 and H1 of the nascent duplex A1 and A2 are destabilized and dissociation is promoted.
  • the first primer 1010 can be newly hybridized to the first hybridizing region H1 of the nascent double strand A2.
  • the second primer 1020 can hybridize to the second hybridizing region H2 of the nascent double strand A1.
  • the newly hybridized first and second primers 1010 and 1020 form new extended strands 1012 ′ and 1022 ′, respectively, and double strands A4, A3 is born.
  • the first and second primers 1010 and 1020 hybridize to the hybridizing regions H1 and H2 on the previously synthesized extended strands 1022 and 1012, respectively, and newly The extended strands 1012 ", 1022" are also synthesized.
  • FIG. 6C double strands A5 and A6 are newly born, and four double strands A3, A4, A5, and A6 are synthesized.
  • the target nucleic acid is amplified by hybridizing the first and second primers 1010 and 1020 to the nascent double-stranded hybridizing regions H1 and H2.
  • the first oligonucleotide which is linked to the first and second primers 1010 and 1020 in the vicinity of the first and second hybridizing regions H1 and H2.
  • the second tags 1030 and 1040 inhibits the destabilization of the target nucleic acid T and the nascent duplex that may occur in the amplification process by using the hybridizing regions H1 and H2, and promotes dissociation. be able to. Since these tags 1030 and 1040 themselves do not hybridize with the target nucleic acid T or the nascent duplex, it is considered that the effect of inhibiting the pairing is higher.
  • the third and fourth tags 1030 and 1040 can promote the dissociation between the extended strands 12 and 22 and the template strands 100 and 200 in the nascent duplex, thereby substantially reducing the temperature change.
  • the target nucleic acid can be amplified without or under substantially isothermal conditions.
  • the primers 1010 and 1020 are nascent double strands. Although described so as to hybridize to the nascent template strands 1022 and 1012 of A1 and A2, these hybridizations are considered to occur simultaneously or in any order, and the substantial interaction is caused by the interaction of the primers 1010 and 1020. It is considered that the nucleic acid amplification reaction proceeds without a significant temperature change.
  • the first and second tags 1030 and 1040 are set to a length that allows nucleic acid amplification under substantially isothermal conditions.
  • the length of such a tag can be several to 25 bases or less, preferably 5 bases or more and 20 bases or less, more preferably 8 bases or more and 18 bases or less. It can be about the base length or less.
  • the base sequences of the first and second tags 1030 and 1040 are not particularly limited, but the base sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 100 described above or a complementary base sequence thereof (23 bases in length) as a whole Alternatively, a partial base sequence can be used.
  • the base length of the tag is, for example, 5 bases or more, for example, 6 bases or more, for example, 7 bases or more, for example, 8 bases or more, for example, 9 bases or more, for example, 10 bases or more, for example, 11 bases or more, Further, for example, it may be 12 bases or more, for example, 13 bases or more, for example, 14 bases, for example, 15 bases, for example, 16 bases, for example, 17 bases, for example, 18 bases.
  • the first and second tags 1030 and 1040 are provided with natural DNA via “suppressing elements”, but the present invention is not limited to this.
  • a natural sugar-phosphate skeleton, GNA skeleton, or PNA skeleton may be provided with a non-natural nucleic acid or a non-natural base that does not pair with or without a spacer generally used in this field.
  • the first and second tags 1030 and 1040 may be proteins, fluorescent substances, coloring substances (which may be labeling elements), or the like that do not have a compatibility or binding property with a natural nucleic acid. It can be provided without particular limitation.
  • the first aspect or only the second aspect may be applied to the amplification of a specific target nucleic acid, or the first aspect and the second aspect are combined, It can also be used to amplify a specific target nucleic acid.
  • the first and second primers are further outside the target (that is, upstream and / or downstream of the target nucleic acid).
  • a hybridizing outer primer or set thereof may be provided.
  • Such an outer primer or a set thereof is effective for dissociating a template strand derived from a target nucleic acid that may be present in a test sample and a complementary extension strand.
  • the outer primer or a set thereof can be set on the upstream side and / or the downstream side within the range of about 0 to 60 bases from the first and second primers.
  • the substantially “isothermal condition” means that there is substantially no change in temperature at which the nucleic acid polymerization reaction is performed, that is, a substantially constant temperature.
  • Substantially isothermal conditions or substantially not accompanied by a temperature change means that the temperature change is preferably within 5 ° C, more preferably within 3 ° C, even more preferably within 2 ° C, and even more preferably within 1 ° C.
  • Isothermal for amplification reactions under isothermal conditions generally refers to the melting temperature of the main product of the reaction (Tm; the temperature at which half of the potentially double-stranded molecules in the mixture are in a single-stranded denatured state. That is, generally 90 ° C. or less, usually about 50-75 ° C., preferably about 55-70 ° C., or 60-70 ° C., or more preferably about 65 ° C.
  • the amplification process consists of a buffer that gives a suitable pH for enzymatic reactions such as DNA polymerase, salts necessary for maintaining the catalytic activity of the enzyme and annealing, an enzyme protecting agent, and, if necessary, a melting temperature (Tm).
  • a buffering agent for example, a neutral to weakly alkaline buffering agent such as Tris-HCl is used.
  • the pH is adjusted according to the DNA polymerase used.
  • Salts for example, KCl, NaCl or (NH4) 2 SO 4 and the like, are suitably added to the melting temperature (Tm) of the adjustment of the active maintenance and nucleic acid enzyme.
  • an enzyme protective agent bovine serum albumin or saccharide is appropriately used.
  • dimethyl sulfoxide (DMSO) or formamide is generally used as a regulator for the melting temperature (Tm).
  • the annealing of the oligonucleotide can be adjusted under limited temperature conditions.
  • betaine N, N, N, -trimethylglycine
  • tetraalkylammonium salts are effective in improving the strand displacement efficiency by their isostabilize action.
  • Betaine can be expected to promote the nucleic acid amplification reaction in this production method by adding about 0.2 to 3.0 M, preferably about 0.5 to 1.5 M, in the reaction solution.
  • These melting temperature regulators act in the direction of lowering the melting temperature, so empirically set conditions that give appropriate stringency and reactivity in consideration of other reaction conditions such as salt concentration and reaction temperature. To do.
  • the amplification step can be performed under isothermal conditions.
  • a heating denaturation step for generating a single-stranded target nucleic acid from a double-stranded target nucleic acid is included prior to the isothermal amplification step. Can do.
  • the first and / or second primer used in the production method can be provided with a labeling element as necessary.
  • the labeling element include a labeling substance and a labeling substance binding substance.
  • the “labeling substance” is a substance that makes it possible to distinguish a substance or molecule to be detected from others.
  • the labeling substance is not particularly limited, but typically, a labeling substance using fluorescence, radioactivity, enzyme (for example, peroxidase, alkaline phosphatase, etc.), phosphorescence, chemiluminescence, coloring and the like can be mentioned.
  • the labeling substance is preferably a luminescent substance, a chromogenic substance or a colored substance that presents luminescence or color development that can be detected visually (with the naked eye). That is, it is preferably a substance that itself can directly generate a signal that is visible to the naked eye without the need for other components. In particular, it is more suitable for chromatography hybridization.
  • the detection process can be performed quickly and easily.
  • Such materials typically include various colorants such as various pigments and dyes.
  • noble metals such as gold and silver
  • various metals or alloys such as copper, or organic compounds containing the metal (may be complex compounds) may be used.
  • inorganic compounds such as mica, which are similar to the colorant, can be used.
  • This kind of labeling substance typically includes various dyes, various pigments, luminol, isoluminol, acridinium compounds, olefins, enol ethers, enamines, aryl vinyl ethers, dioxene, aryl imidazoles, lucigenin, luciferin and eclion.
  • a chemiluminescent substance is mentioned.
  • particles such as latex particles labeled with such a labeling substance are also included.
  • colloids or sols including gold colloids or sols or silver colloids or sols can be mentioned.
  • a metal particle, an inorganic particle, etc. are mentioned.
  • the labeling substance may include particles in a part thereof.
  • the average particle diameter of particles such as latex particles constituting a part of the labeling substance is not particularly limited, and is, for example, from 0.1 nm to 20 ⁇ m, and can be appropriately selected depending on the pore diameter of the solid phase carrier.
  • Preferred particles are particles that can be suspended in an aqueous solution and are made of a water-insoluble polymer material.
  • a water-insoluble polymer material for example, polyethylene, polystyrene, styrene-styrene sulfonate copolymer, acrylic acid polymer, methacrylic acid polymer, acrylonitrile polymer, acrylonitrile-butadiene-styrene, polyvinyl acetate-acrylate, polyvinylpyrrolidone, or vinyl chloride-acrylate may be mentioned. Mention may also be made of latex particles having active groups on their surface, for example carboxyl, amino or aldehyde groups.
  • Examples of the labeling substance binding substance include substances that can finally bind the labeling substance using protein-protein interaction, low molecular weight compound-protein interaction, nucleic acid-nucleic acid interaction, and the like.
  • substances in antigen-antibody reactions biotin in an avidin (streptavidin) -biotin system, digoxigenin in an anti-digoxigenin (DIG) -digoxigenin (DIG) system, haptens represented by FITC in an anti-FITC-FITC system, and the like
  • Examples include oligonucleotides that can be hybridized.
  • the labeling substance finally used for detection is the other molecule or substance that interacts with the labeling substance binding substance (for example, antigen, ie, streptavidin, anti-FITC, oligonucleotide, etc.) It comprises so that it may provide as a site
  • the labeling substance binding substance for example, antigen, ie, streptavidin, anti-FITC, oligonucleotide, etc.
  • Such labeling substances and labeling substance-binding substances are commercially available, and the production of labeling substances and labeling substance-binding substances and methods for labeling labeling substances etc. are also known. And can be obtained. Furthermore, binding between such a labeling substance or particles labeled with a labeling substance or a labeling substance binding substance and an oligonucleotide such as DNA can be appropriately performed via a functional group such as an amino group, and as such is itself in the field. It is well known.
  • the labeling element can be used as a part of the oligonucleotide for dissociation.
  • the target nucleic acid can be amplified with substantially no change in temperature or under substantially isothermal conditions.
  • the method for detecting a target nucleic acid disclosed herein includes the target nucleic acid using a first primer, a second primer, and a nucleic acid polymerase having strand displacement activity.
  • An amplification step of performing a nucleic acid amplification reaction on a possible test sample, and a step of detecting the target nucleic acid via at least a part of the amplification product obtained in the amplification step can be provided.
  • the various aspects as the amplification step in the production method described above can be appropriately employed for the amplification step.
  • the target nucleic acid is detected via at least a part of the amplification product.
  • the amplification product is usually obtained in a double-stranded state. Therefore, this may be appropriately denatured to form a single strand, and the target nucleic acid may be detected using a part thereof and hybridization of a probe or the like.
  • the target nucleic acid is detected through hybridization between the tag and the probe without denaturing the double-stranded amplification product. can do.
  • the target nucleic acid can also be detected by performing amplification using an inner primer set that hybridizes to at least a part of the amplification product and detecting the amplification product.
  • the inner primer can also be used simultaneously in the amplification step in this production method.
  • the inner primer can comprise a labeling element. Thereby, even when the primer is provided with a tag and it is difficult to add a labeling element, the labeling element can be added to the amplification product.
  • Specific embodiments for separating and detecting the target nucleic acid via at least a part of the amplification product include various known methods, for example, an array in which probes are immobilized on a flat solid support in a matrix, and probes are immobilized.
  • a chromatographic carrier or the like in which beads and probes are immobilized on a porous strip or the like in an arbitrary pattern can be appropriately used.
  • solid phase carrier examples include so-called porous materials mainly composed of polymers such as polyethersulfone, nitrocellulose, nylon, and polyvinylidene fluoride.
  • porous materials mainly composed of polymers such as polyethersulfone, nitrocellulose, nylon, and polyvinylidene fluoride.
  • Cellulose materials such as filter paper can also be preferably used.
  • the probe is not particularly limited, and can be appropriately set based on the required specificity.
  • conditions well known to those skilled in the art can be appropriately selected for hybridization conditions between at least a part of the amplification products and probes, for example, pH, salt concentration, temperature, solvent, and the like.
  • hybridization by chromatography is performed by separating and detecting the hybridized product by a very simple operation such as immersing a part of the solid phase carrier in a nucleic acid amplification reaction solution containing the hybridized product. It is preferable in that it can be performed. In addition, it is advantageous in that it can be set to about 5 to 40 ° C., preferably about 15 to 35 ° C., particularly about room temperature without substantially controlling the temperature. Furthermore, the detection time is also preferable in that it can be completed in a very short time, for example, within 2 minutes to 50 minutes, or even about 5 minutes to 30 minutes.
  • a label configured to bind to at least a part of the amplification product in the detection step
  • various detection methods capable of physicochemical detection can be appropriately employed.
  • a method for detecting a target nucleic acid based on a labeling element or the like using at least a part of the amplification product is well known in the art, and a person skilled in the art can select an appropriate method as necessary.
  • the kit for amplifying a target nucleic acid disclosed in the present specification comprises a first primer that hybridizes to the 5 ′ side of the target nucleic acid, a second primer that hybridizes to the 3 ′ side of the target nucleic acid, A first extension strand that is an extension strand of one primer, a second extension strand that is an extension strand of the second primer, and two or more oligonucleotides that can promote dissociation of their respective template strands.
  • the target nucleic acid can be amplified with substantially no temperature change or under substantially isothermal conditions.
  • the various aspects of the production method described above can be applied to the first and second primers and the two or more oligonucleotides in the kit.
  • the kit may include dNTP generally required for DNA amplification and the like.
  • this kit can also be equipped with an outer primer or its set.
  • This kit can also be used as a kit for detecting a target nucleic acid using an amplification product.
  • a probe that hybridizes at least a part of the amplification product, an inner primer, a labeling element, various carriers on which a probe is immobilized, and the like can be appropriately provided.
  • the target nucleic acid was a part of genomic DNA extracted from Mycobacterium tuberculosis. Specifically, genomic DNA extracted from M. tuberculosis was prepared, amplified with the following two primer sets, and separated and detected by chromatography.
  • FIG. 7 shows the configuration of the hybridizing regions of the first primer, the second primer, the third primer, the fourth primer, the fifth primer, and the sixth primer for the target nucleic acid.
  • Each of the third primer and the fourth primer is an example of two or more oligonucleotides disclosed in this specification.
  • the fifth and sixth primers are outer primers for dissociating the extended strands of the first primer and the second primer from the complementary strand.
  • the chromatographic strip comprises a tag sequence (tag 2) (SEQ ID NO: 10) bound to the second primer and a first sequence used in Example 2 described later.
  • Capture probes (tag 2, tag 1) that hybridize with the tag sequence (tag 1) bound to the primer were immobilized in a line. That is, NGK GENESHOT (Registered) using a discharge probe (inkjet method) described in JP-A-2003-75305 on a Hi-Flow Plus membrane sheet (60 mm ⁇ 600 mm) manufactured by Merck Millipore Spotted using a trademark spotter.
  • the target nucleic acid was amplified using the first primer set and the second primer set, respectively.
  • the gene amplification enzyme was Bst DNA polymerase from Nippon Gene, and the thermal cycler was DICE from Takara Bio.
  • the amplification reaction solution was as shown below.
  • the amplification reaction solution 1 is an example disclosed in the present specification, and the amplification reaction solution 2 corresponds to a comparative example.
  • (Amplification reaction solution 1) Sterilized water balance 10 ⁇ Bst reaction buffer 1.0 ⁇ l 10 mM dNTPmix 1.4 ⁇ l ⁇ 3,000SYBRgreenI 1.0 ⁇ l 1st primer 8pmol Second primer 8pmol Third primer 2pmol 4th primer 2pmol 5th primer 2pmol 6th primer 2pmol Bst DNA polymerase (8U / ⁇ l) 0.6 ⁇ l Genomic DNA (20,2,0.2,0.02,0pg / ⁇ l) 1.0 ⁇ l Total 10.0 ⁇ l
  • Amplification reaction solution 2 Sterilized water balance 10 ⁇ Bst reaction buffer 1.0 ⁇ l 10 mM dNTPmix 1.4 ⁇ l ⁇ 3,000SYBRgreenI 1.0 ⁇ l 1st primer 8pmol Second primer 8pmol 5th primer 2pmol 6th primer 2pmol Bst DNA polymerase (8U / ⁇ l) 0.6 ⁇ l Genomic DNA (20,2,0.2,0.02,0pg / ⁇ l) 1.0 ⁇ l Total 10.0 ⁇ l
  • the developing solution was all sucked up to the top of the strip in about 15 minutes, and the reaction was completed. After completion of the reaction, coloration on the detection line on the strip was visually confirmed. The results are shown in FIG.
  • the hybridized product could be detected with a probe complementary to the tag 2. Further, although a band was recognized up to 2 pg / test of template DNA, no band was observed in all reaction solutions in the amplification reaction solution 2.
  • the third and fourth primers an isothermal amplification reaction was efficiently performed and the target nucleic acid was amplified.
  • the amplification reaction liquid 1 when the amplification reaction liquid which does not use the 5th and 6th primer (outer primer set) was separately prepared and the influence of the outer primer set was confirmed, it was almost the same as the amplification reaction liquid 1. The detection sensitivity was confirmed.
  • genomic DNA extracted from Mycobacterium tuberculosis was prepared, amplified with the following primers, and separated and detected by chromatography. Between the tag in the first primer and the second primer and the region complementary to the genomic DNA, it was synthesized according to a normal oligonucleotide synthesis method using Spacer Phophoamidite C3 which is a phosphoramidite reagent of GlenResearch, A propylene group that suppresses the polymerase reaction was introduced as a spacer (suppressing element).
  • the tag (tag1 (SEQ ID NO: 1)) provided in the first primer and the tag (tag2) (SEQ ID NO: 10) provided in the second primer are other than two or more oligonucleotides disclosed in the present specification, respectively.
  • the inner primer with biotin is complementary to tag 1 with a tag (tag 1) that is hybridized inside the amplification product of the first primer and the second primer and attached to the first primer.
  • the third and fourth primers correspond to the outer primer set.
  • chromatographic strip is complementary to the tag sequences (tags 1, 2) bound to the first and second primers, as shown in FIG. 8, according to Example 1.
  • a simple capture probe was immobilized in a line.
  • a target nucleic acid was amplified in the same manner as in Example 1 except that the amplification reaction solution had the following composition.
  • (Amplification reaction solution) Sterilized water balance 10 ⁇ Bst reaction buffer 1.0 ⁇ l 10 mM dNTPmix 1.4 ⁇ l ⁇ 3,000SYBRgreenI 1.0 ⁇ l First primer 16pmol Second primer 16pmol 3rd and 4th primer each 2.0pmol Biotin inner primer: 5pmol Bst DNA polymerase (8U / ⁇ l) 0.6 ⁇ l Genomic DNA (20,2,0.2pg / ⁇ l) 1.0 ⁇ l Total 10.0 ⁇ l
  • the gene was amplified under the following conditions (stored at 65 ° C. for 10 seconds, and then kept at 65 ° C. as it was, measuring fluorescence intensity 90 times per minute). In the case of containing 2 pg or more test DNA, the fluorescence intensity increased with time.
  • the hybridized product could be detected with a probe complementary to tag 1. Further, a band was recognized up to a template DNA of 0.2 pg / test. From the above, it was found that the target nucleic acid was amplified by the isothermal amplification reaction. In addition, in the above amplification reaction solution, an amplification reaction solution that does not use the third and fourth primers (outer primer set) was separately prepared and the influence of the outer primer set was confirmed. The sensitivity was confirmed.
  • the target nucleic acid was a part of genomic DNA extracted from acid-fast bacteria (M.intracellulare). Specifically, genomic DNA extracted from M. tuberculosis was prepared, amplified with the following two primer sets, and separated and detected by chromatography.
  • the first and second primers are primers for amplifying the target nucleic acid
  • the third primer and the fourth primer are examples of two or more dissociation oligonucleotides disclosed in the present specification, respectively.
  • the base sequence of tag2 possessed by the second primer is SEQ ID NO: 10.
  • the fifth and sixth primers are outer primer sets for dissociating the extended strands of the first primer and the second primer from complementary strands.
  • Genomic DNA extracted from acid-fast bacteria was used as a template (sample) and amplified using the first primer set and the second primer set shown below, respectively.
  • the gene amplification enzyme was Bst DNA polymerase from Nippon Gene, and the thermal cycler was DICE from Takara Bio.
  • the amplification reaction solution was as shown below.
  • the amplification reaction solution 1 is an example disclosed in this specification, and the amplification reaction solution 2 corresponds to a comparative example.
  • (Amplification reaction solution 1) Sterilized water balance 10 ⁇ Bst reaction buffer 1.0 ⁇ l 10 mM dNTPmix 1.4 ⁇ l ⁇ 3,000SYBRgreenI 1.0 ⁇ l 1st primer 8pmol Second primer 8pmol 3rd primer 4pmol 4th primer 4pmol 5th primer 2pmol 6th primer 2pmol Bst DNA polymerase (8U / ⁇ l) 0.6 ⁇ l Genomic DNA (100,10,2,0pg / ⁇ l) 1.0 ⁇ l Total 10.0 ⁇ l
  • Amplification reaction solution 2 Sterilized water balance 10 ⁇ Bst reaction buffer 1.0 ⁇ l 10 mM dNTPmix 1.4 ⁇ l ⁇ 3,000SYBRgreenI 1.0 ⁇ l 1st primer 8pmol Second primer 8pmol 5th primer 2pmol 6th primer 2pmol Bst DNA polymerase (8U / ⁇ l) 0.6 ⁇ l Genomic DNA (100,10,2,0pg / ⁇ l) 1.0 ⁇ l Total 10.0 ⁇ l
  • the developing solution was all sucked up to the top of the strip in about 15 minutes, and the reaction was completed. After completion of the reaction, coloration on the detection line on the strip was visually confirmed. The results are shown in FIG.
  • the third and fourth primers an isothermal amplification reaction was efficiently performed, and the target nucleic acid was amplified and detected by nucleic acid chromatography.
  • the amplification reaction liquid 1 when the amplification reaction liquid which does not use the 5th and 6th primer (outer primer set) was separately prepared and the influence of the outer primer set was confirmed, it was almost the same as the amplification reaction liquid 1. The detection sensitivity was confirmed.

Abstract

新規な原理に基づく標的核酸の増幅産物の生産方法を提供する。標的核酸の増幅産物の生産方法を、第１のプライマー、第２のプライマー及び鎖置換活性を有する核酸ポリメラーゼ、を用いて、前記標的核酸を含む可能性のある被験試料に対して核酸増幅反応を実施する増幅工程、を備えるようにする。増幅工程は、前記標的核酸の二本鎖の解離を促進可能な２以上のオリゴヌクレオチドを用いる工程とする。

Description

標的核酸の増幅産物の生産方法及びその利用
　本明細書は、標的核酸の増幅産物の生産方法及びその利用等に関する。
　標的核酸配列を増幅する方法の一つとして、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法が知られている。ＰＣＲ法は、in vitroにおける核酸の増幅技術として現在最も一般的な方法である。ＰＣＲ法は温度循環、すなわち、加熱－冷却のサイクルにより、プライマーと標的核酸の結合、プライマーの伸長、伸長したプライマーの標的核酸からの遊離及び新たなプライマーの標的核酸への結合を繰り返して指数的に標的核酸を増幅することができる。ＰＣＲ法は、その指数的な増幅効果に基づく高い感度により優れた検出方法として定着し、また、遺伝子工学的手法を支える重要なツールとして幅広く応用されている。
　核酸増幅方法としては、他にも、転写増幅システム（ＴＡＳ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ：Ligase Chain Reaction）、ランダムプライミング増幅（ＲＰＡ）、並びにＱベータレプリカーゼ、制限エンドヌクレアーゼ及びランダムヘキサマーを用いる増幅法がある。これらのいずれの方法も、加熱－冷却による相補鎖の変性及び再結合を必要とするため、温度循環装置が必要である。
　一方、標的核酸の増幅法のいくつかは、温度循環せずに実施される方法もある。その一つとしてＮＡＳＢＡ法(NucIeic Acid Sequence-based Amplification／ＴＭＡ法（Transcription Mediated Amplification）とも呼ばれる。)や、ＳＤＡ法(Strand DispIacement Amplification)と呼ばれる方法が知られている。
　また、ＬＡＭＰ法（Loop-mediated isothermal amplification）と呼ばれる温度循環を必要としない増幅法も知られている（特許文献１）。ＬＡＭＰ法は、標的核酸の一部に相補的なプライマーの５’側に、そのプライマー配列の３’下流の配列の一部に相同な配列のオリゴヌクレオチドを結合したプライマーを用いることを特徴とする。すなわち、該プライマーが伸長した場合、５’側に結合させた配列が伸長した配列とループを作る構造になっている。このような特徴を持った1対のプライマーを用いることで、ダンベル構造と呼ばれる５’末端、３’末端側共にループ構造を取る配列が生じる。３’側のループ構造の３’末端はそのループを利用して鎖置換活性を有するポリメラーゼにより伸長され新たに、３’側にループ構造を持つ配列を生じる。ＬＡＭＰ法は、こうした鎖置換活性を持つポリメラーゼを用いることで、温度循環無しにループ構造の３’末端からの伸長反応が折り重なり生じることで標的核酸配列の増幅を生じさせるというものである。
国際公開第２０００／２８０８２号
　ＬＡＭＰ法は、鎖置換活性を有するポリメラーゼだけで増幅するので、他の方法に比べ大きなコストアップにはならないが、特殊な構造のプライマーを必要とするため、設計が難しく汎用性に問題がある。
　本明細書は、新規な原理に基づく標的核酸の増幅産物の生産方法を提供する。より具体的には、温度循環を実質的に省略して標的核酸の増幅を達成できる方法を提供する。
　本発明者らは、温度循環を省略するために、核酸増幅における温度循環の機能、なかでも、相補鎖間の遊離及び再結合に着目した。すなわち、本発明者らは、公知のアプローチとはまったく異なる角度から、プライマーが伸長してできた伸長産物のプライマー部分における相補鎖対合を緩めて未反応のプライマーが結合できる方法について検討した。その結果、標的核酸となる二本鎖ＤＮＡや、増幅工程におけるプライマー伸長鎖と鋳型鎖と二本鎖ＤＮＡなどの二本鎖ＤＮＡ間の相補結合を緩めるためのオリゴヌクレオチドを用いることで、実質的な等温条件下であっても、新たにプライマーと鋳型鎖との結合を生じさせて標的核酸を増幅できることを見いだし、本発明を完成させるに至った。本明細書は、かかる知見に基づき以下の手段を提供する。
（１）標的核酸の増幅産物の生産方法であって、
　第１のプライマー、第２のプライマー及び鎖置換活性を有する核酸ポリメラーゼ、を用いて、前記標的核酸を含む可能性のある被験試料に対して核酸増幅反応を実施する増幅工程、
を備え、
　前記増幅工程は、前記標的核酸の二本鎖の解離を促進可能な２以上のオリゴヌクレオチドを用いる工程である、生産方法。
（２）前記２以上のオリゴヌクレオチドは、第１の鋳型鎖上において前記第１のプライマーがハイブリダイズする第１のハイブリダイズ領域及び第２の鋳型鎖上において前記第２のプライマーがハイブリダイズする第２のハイブリダイズ領域のそれぞれ近傍において、前記第１の鋳型鎖及び前記第２の鋳型鎖の少なくとも一方に対するハイブリダイゼーションを介して存在可能に構成されている、（１）に記載の生産方法。
（３）前記２以上のオリゴヌクレオチドは、前記第１のハイブリダイズ領域の近傍で前記第２の鋳型鎖にハイブリダイズする第３のプライマーと、前記第２のハイブリダイズ領域の近傍で前記第１の鋳型鎖にハイブリダイズする第４のプライマーと、を含む、（１）又は（２）に記載の生産方法。
（４）前記第３のプライマーは、前記第１のハイブリダイズ領域よりも前記標的核酸の内側で前記第２の鋳型鎖にハイブリダイズし、
　前記第４のプライマーは、前記第２のハイブリダイズ領域よりも前記標的核酸の内側で前記第１の鋳型鎖にハイブリダイズする、（３）に記載の生産方法。
（５）前記２以上のオリゴヌクレオチドは、前記第１のプライマーの５’末端側に備えられ、核酸増幅反応に対して独立である第１のタグと、前記第２のプライマーの５’末端側に備えられ、核酸増幅反応に対して独立である第２のタグと、を含む、（１）～（４）のいずれかに記載の生産方法。
（６）前記第１のプライマーは、前記第１のタグを、スペーサを介して備え、前記第２のプライマーは、前記第２のタグを、スペーサを介して備える、（５）に記載の生産方法。
（７）前記スペーサは、前記鎖置換活性を有する核酸ポリメラーゼによる核酸合成反応を抑制又は停止可能である、（６）に記載の生産方法。
（８）前記第１及び前記第２のプライマーの少なくとも一方が、標識要素を備える、（１）～（７）のいずれかに記載の生産方法。
（９）前記標識要素は、標識物質又は標識物質結合物質である、（８）に記載の生産方法。
（１０）前記増幅工程を、実質的な温度変化を伴うことなく実施する、（１）～（９）のいずれかに記載の生産方法。
（１１）標的核酸の検出方法であって、
　第１のプライマー、第２のプライマー及び鎖置換活性を有する核酸ポリメラーゼ、を用いて、前記標的核酸を含む可能性のある被験試料に対して核酸増幅反応を実施する増幅工程と、
　前記増幅工程で得られる増幅産物の少なくとも一部を介して前記標的核酸を検出する工程と、
を備え、
　前記増幅工程は、前記標的核酸の二本鎖の解離を促進可能な２以上のオリゴヌクレオチドを用いる工程である、検出方法。
（１２）前記検出工程は、前記増幅産物の前記少なくとも一部を介してクロマトグラフィーによって分離することを含む、（１１）に記載の検出方法。
（１３）前記検出工程は、前記増幅産物の一部にハイブリダイズするインナープライマーを用いて前記標的核酸を標識要素を付与することを含む、（１１）又は（１２）に記載の検出方法。
（１４）標的核酸を増幅するためのキットであって、
　第１のプライマーと
　第２のプライマーと、
　前記標的核酸の二本鎖の解離を促進可能な２以上のオリゴヌクレオチドと、
を備える、キット。
（１５）前記２以上のオリゴヌクレオチドは、第１の鋳型鎖上において前記第１のプライマーがハイブリダイズする第１のハイブリダイズ領域及び第２の鋳型鎖上において前記第２のプライマーがハイブリダイズする第２のハイブリダイズ領域のそれぞれ近傍において、前記第１の鋳型鎖及び前記第２の鋳型鎖の少なくとも一方に対するハイブリダイゼーションを介して存在可能に構成されている、（１４）に記載のキット。
（１６）標的核酸を検出するためのキットであって、
　第１のプライマーと
　第２のプライマーと、
　前記標的核酸の二本鎖の解離を促進可能な２以上のオリゴヌクレオチドと、
を備える、キット。
本明細書に開示される標的核酸の増幅産物の生産方法における２以上のオリゴヌクレオチドの一態様を示す図である。 図１に示す２以上のオリゴヌクレオチドによる増幅工程における作用の一部を示す図である。 図１に示す２以上のオリゴヌクレオチドによる増幅工程における作用の他の一部を示す図である。 図１に示す２以上のオリゴヌクレオチドによる増幅工程における作用の他の一部を示す図である。 図１に示す２以上のオリゴヌクレオチドによる増幅工程における作用の他の一部を示す図である。 図１に示す２以上のオリゴヌクレオチドによる増幅工程における作用の他の一部を示す図である。 図１に示す２以上のオリゴヌクレオチドによる増幅工程における作用の他の一部を示す図である。 本明細書に開示される標的核酸の増幅産物の生産方法における２以上のオリゴヌクレオチドの他の一態様を示す図である。 図４に示す２以上のオリゴヌクレオチドによる増幅工程における作用の一部を示す図である。 図４に示す２以上のオリゴヌクレオチドによる増幅工程における作用の他の一部を示す図である。 図４に示す２以上のオリゴヌクレオチドによる増幅工程における作用の他の一部を示す図である。 図４に示す２以上のオリゴヌクレオチドによる増幅工程における作用の他の一部を示す図である。 実施例に用いる各種プライマーを示す図である。 実施例で用いる核酸クロマトグラフィー用ストリップを示す図である。 図８に示すストリップを用いた核酸クロマトグラフィーの実施状態を示す図である。 実施例１の結果を示す図である。 実施例２の結果を示す図である。 実施例３の結果を示す図である。 実施例３の他の結果を示す図である。
　本明細書に開示される標的核酸の増幅産物の生産方法（以下、本生産方法ともいう。）は、本生産方法における「標的核酸」、すなわち、被験試料中の本来的に存在する標的核酸としての「二本鎖」、増幅工程で生成される標的核酸の増幅産物としての第１のプライマーがハイブリダイズする第１の鋳型鎖と第１のプライマーの伸長鎖である第１の伸長鎖との「二本鎖」及び第２のプライマーがハイブリダイズする第２の鋳型鎖と第２のプライマーの伸長鎖である第２の伸長鎖との「二本鎖」の解離を促進する２以上のオリゴヌクレオチドを用いる。こうしたオリゴヌクレオチドを用いることで、これら「二本鎖」を熱融解しなくても、「二本鎖」の解離が促進されて、新たな第１のプライマー及び第２のプライマーがそれぞれの鋳型鎖に結合することが促進される。このため、実質的に温度変化を伴うことなく又は実質的な等温条件で、プライマーによる標的核酸の増幅が可能となっている。
　本明細書において、第１のプライマーが、標的核酸の第１の鋳型鎖上においてハイブリダイズする領域を第１のハイブリダイズ領域とし、第２のプライマーが、標的核酸の第２の鋳型鎖上においてハイブリダイズする領域を第２のハイブリダイズ領域というものとする。
　２以上のオリゴヌクレオチドは、第１のハイブリダイズ領域及び第２のハイブリダイズ領域のそれぞれの近傍に、第１の鋳型鎖及び第２の鋳型鎖の少なくとも一方に対するハイブリダイゼーションを介して存在可能に構成されることができる。こうすることで、効果的に、新たな第１のプライマー及び第２のプライマーをそれぞれの鋳型鎖にハイブリダイズさせることができる。
　本明細書において、「標的核酸」は、標的とする核酸配列を含む核酸を表わす。標的核酸は、一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよく、しばしばＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ若しくはＲＮＡの誘導体、又はその組み合わせである。「標的核酸配列」、「標的配列」又は「標的領域」は、一本鎖核酸の配列の全部又は一部を含む特定の配列を意味する。
　また、本明細書において、「標的核酸」とは、検出しようとする標的配列を含む核酸を意味している。標的核酸の由来は、特に限定しないで、各種生物材料（個体またはその組織、器官等の個体の一部のほか、排せつ物、体液等）ほか、人工的な核酸を含む人工材料が挙げられる。
　本検出方法には、標的核酸を含む可能性のある生物材料又は人工材料自体又は必要に応じてこうした各種材料から核酸以外の構成成分の一部又は全部が除去されて核酸抽出試料を、試料として供給することができる。
　本明細書において「オリゴヌクレオチド」とは、２以上のヌクレオシド又はその類似体が結合したポリマーをいう。ヌクレオシド及びその類似体の糖基は、リボース、デオキシリボース又はその類似体であってもよく、ヌクしオシド又はその類似体の塩基は、公知の天然塩基又は天然塩基と対合可能な塩基類似体であってもよい。オリゴヌクレオチドは、また、一本鎖であってもよいし二本鎖であってもよいが、特に言及しない限り概して一本鎖の形態をいう。オリゴヌクレオチドは、典型的には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はこれらの類似体である。
　「オリゴヌクレオチド」におけるヌクレオシド又はその類似体の重合数は特に限定するものではない。配列依存的な核酸合成反応を触媒する公知のポリメラーゼが認識するプライマーの鎖長が、最低５塩基前後であることから、アニールする部分の鎖長はそれ以上である必要がある。加えて、塩基配列としての特異性を期待するためには、確率的に１０塩基以上の長さを利用するのが望ましい。一方、あまりにも長い塩基配列は化学合成によって調製することが困難となる。したがって、例えば、オリゴヌクレオチドの鎖長は、例えば、数個以上２００塩基以下であり、また例えば、１０個以上１００個以下程度であり、また例えば、１０個以上５０個以下程度、また例えば、１０個以上３０個以下程度である。なお、ここで例示した鎖長はあくまでも相補鎖とアニールする部分の鎖長である。
　以下、本明細書に開示される標的核酸の生産方法、検出方法及びキット等について適宜図面を参照しながら詳細に説明する。ここで図１及び図２は、本検出方法の一例の概要を示す図である。
（標的核酸の増幅産物の生産方法）
　本生産方法は、第１のプライマー、第２のプライマー及び鎖置換活性を有する核酸ポリメラーゼ、を用いて、前記標的核酸を含む可能性のある被験試料に対して核酸増幅反応を実施する増幅工程を備えることができる。
　本生産方法は、標的核酸並びに核酸増幅に一般的に用いる第１のプライマー及び第２のプライマーから生じる伸長鎖とそれらの各鋳型鎖との二本鎖を、温度変化を実質的に伴うことなく又は実質的な等温条件下で実施することを含む増幅工程を意図している。以下、かかる増幅工程の要素について説明する。
（第１のプライマー及び第２のプライマー）
　本生産方法で用いる第１のプライマー及び第２のプライマーは、基本的に、従来のＰＣＲ法と同様の設計に基づくフォワードプライマー及びリバースプライマーを使用できる。
　第１及び第２のプライマーは、それぞれ標的核酸を増幅することができるようそれぞれの鋳型である第１の鋳型鎖及び第２の鋳型鎖にハイブリダイズするための識別領域を構成する識別配列を備えている。識別配列は、標的核酸の塩基配列やプライマー自体の特異性を公知の手法により適宜考慮して決定することができる。また、識別配列の長さは、特に限定するものではないが、概して、１０塩基長～３０塩基長程度の長さとすることができ、例えば、１５塩基長から２５塩基長程度とすることができる。
　第１及び第２のプライマーの識別領域が第１及び第２の鋳型鎖の第１及び第２のハイブリダイズ領域にそれぞれハイブリダイズする。
　第１及び第２のプライマーは、必要に応じて、その５’末端側にタグを備えることができる。タグは、核酸増幅反応に関与するタグ及び当該反応に関与しない当該反応とは独立するタグとの双方を含む。本明細書において、核酸増幅反応に関与するタグとは、核酸増幅反応によって当該タグが鋳型として機能して相補鎖が伸長可能なタグであり、核酸増幅反応とは独立するタグとは、核酸増幅反応において、当該タグが鋳型となることなく一本鎖のまま維持されるタグである。
　例えば、第１及び第２のプライマーによって生成する伸長鎖を、別のプライマーで増幅させるためのプライマー用タグが挙げられる。かかるタグは、核酸増幅反応に関与するタグである。プライマー用タグは、概して、ユニバーサルプライマーと称される汎用されるプライマーの識別配列にハイブリダイズ可能に設計される。
　また、例えば、増幅産物を捕捉し標的核酸を検出するための検出用タグが挙げられる。かかるタグは、核酸増幅反応に関与するタグとしても、核酸増幅反応とは独立するタグとしても設計できる。検出用タグは、増幅産物を検出するためのオリゴヌクレオチドである検出用プローブとハイブリダイズ可能に設計されている。
　さらに、例えば、増幅産物を検出するために用いる標識用タグが挙げられる。かかるタグは、核酸増幅反応に関与するタグとしても、核酸増幅反応とは独立するタグとしても設計できる。標識用タグは、概して、標識物質や標識物質結合物質などの各種の標識要素を保持するオリゴヌクレオチドである標識用プローブとハイブリダイズ可能に設計されている。なお、標識要素については後段で説明する。
　こうした各種のタグの塩基長は特に限定するものではないが、１５塩基以上５０塩基以下であることが好ましい。この範囲であると、ハイブリダイゼーションの特異性と効率とをそれぞれ確保できるからである。タグの塩基長は、より好ましくは、２０塩基以上５０塩基以下であり、さらに好ましくは２０塩基長２５塩基以下程度である。
　タグの配列のための配列、特に、核酸増幅反応に独立したタグの塩基配列としては、例えば、配列番号１～配列番号１００に記載の塩基配列又はこの塩基配列に相補的な塩基配列を用いることができる。これらの塩基配列は全て同一塩基長（２３塩基長）である。これらの塩基配列は、正規直交化配列ともいい、たとえば乱数から得られた所定塩基長のＤＮＡ配列に対して連続一致長、Nearest-Neighbor法による融解温度予測、ハミング距離、二次構造予測の計算を行うことにより設計される（H.Yoshida and A.Suyama,“Solution to 3-SAT by breadth first search”,DIMACS Vl.54, 9-20(2000)）。
　第１及び第２のプローブにおけるタグは、３’側にあるハイブリダイズ領域に対して適当なスペーサを介して備えていてもよい。また、核酸増幅反応とは独立するタグは、ハイブリダイズ領域に対して、核酸ポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な「抑止要素」を介して備えることができる。かかる「抑止要素」については、例えば、国際公開第２０１３／０３９２２８号、国際公開第２０１２／０７０６１８号、国際公開第２００６／０９５５５０号等に、開示されており、当業者であれば、適宜好適な抑止要素を選択してプライマーを取得することができる。
　第１の及び第２のプライマーは、さらに、本明細書において規定する２以上のオリゴヌクレオチドの少なくとも一方を備えることができる。かかる２以上のオリゴヌクレオチドについては後段で詳述する。
（核酸ポリメラーゼ）
　本生産方法で使用する、核酸ポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。本生産方法で用いるＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を有していてもよい。鎖置換活性とは、鋳型鎖と相補的な核酸鎖を合成していく過程で、伸長方向に二本鎖領域があっても、その鎖を解離しつつ、相補鎖の合成を継続する活性をいう。核酸ポリメラーゼが鎖置換活性を有することで、新たに鋳型鎖にハイブリダイズした第１のプライマー及び第２のプライマーは、第１の伸長鎖と第２の伸長鎖とがそれぞれの鋳型鎖と部分的にハイブリダイズした状態であっても容易に新たな伸長鎖を合成することができる。
　本生産方法に用いるＤＮＡポリメラーゼは、公知の種々のＤＮＡポリメラーゼ（鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含む）から、本生産方法に好適なＤＮＡポリメラーゼを、本生産方法において被験ポリメラーゼとして用いてスクリーニングを行ってその増幅量等を指標として選択することができる。また、本生産方法に用いるＤＮＡポリメラーゼは、公知のＤＮＡポリメラーゼの変異体であってもよい。本明細書において「変異体」とは、酵素の必要とする触媒活性をもたらす構造のみを取り出したもの、あるいはアミノ酸の変異等によって触媒活性、安定性、あるいは耐熱性を改変したもの等を示すことができる。ＤＮＡポリメラーゼの変異体は当業者であれば、公知の遺伝子工学的手法によりＤＮＡポリメラーゼのある種の領域に変異を導入したタンパク質を、変異の目的に応じた手法でスクリーニングすることで適宜取得することができる。
　また、本生産方法に用いるＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡを３’側から分解する３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有していてもよいが、増幅効率を考慮すると欠失していてもよい。さらに、本生産方法における増幅に問題がない範囲で、５’側からＤＮＡを分解する５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有していてもよい。
　さらに、本生産方法に用いるＤＮＡポリメラーゼは、耐熱性を有していることが好ましい。本明細書において、ＤＮＡポリメラーゼに関して耐熱性とは、反応至適温度が５５℃以上８０℃以下、より好ましくは６０℃以上７５℃以下であることをいう。なお、反応至適温度は、商業的に入手可能なＤＮＡポリメラーゼに関しては、活性単位として定義された活性（又はその測定方法）に基づくことができる。また、耐熱性とは、５分間加熱したとき、その後のＤＮＡポリメラーゼ活性が実質的に消失する温度が８０℃以上であることで規定してもよい。
　ＤＮＡポリメラーゼが耐熱性を有していると、プライマーの設計等がＤＮＡポリマーの熱変性温度に拘束されにくいという利点のほか、プライマーと鋳型鎖との最初のハイブリダイゼーション等など、加熱変性が必要な場合もあるからである。
　例えば、本生産方法に好適なＤＮＡポリメラーゼとしては、Bst DNA ポリメラーゼ、Bca(exo-)DNA ポリメラーゼ、Csa DNA ポリメラーゼ、96-7 DNA ポリメラーゼ、DNA ポリメラーゼＩのクレノウ・フラグメント、Vent DNA ポリメラーゼ、Vent(Exo-)DNA ポリメラーゼ（Vent DNA ポリメラーゼから３’－５’方向のエキソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、DeepVent DNA ポリメラーゼ、DeepVent(Exo-)DNAポリメラーゼ（DeepVent DNA ポリメラーゼから３’－５’方向のエキソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、Φ29ファージDNA ポリメラーゼ、MS-2ファージDNA ポリメラーゼ、Z-Taq DNA ポリメラーゼ（宝酒造）、KOD DNA ポリメラーゼ（東洋紡績）等が挙げられる。
　これらの酵素の中でもBst DNA ポリメラーゼやBca(exo-)DNA ポリメラーゼ及びVent(Exo-)DNAポリメラーゼを好ましく用いることができる。これらの酵素は、適度な耐熱性を持ち、ＤＮＡポリメラーゼ活性も高い。
　ＤＮＡポリメラーゼによる鎖置換を伴う相補鎖（伸長鎖）の合成反応は、１本鎖結合タンパク質(single strand binding protein)の添加によって促進されることが知られている(Paul M.Lizardiet al, Nature Genetics 19, 225-232, July,1998)。この作用を本生産方法に適用して、１本鎖結合タンパク質を添加することによって相補鎖合成の促進効果を期待することができる。たとえばVent(Exo-)DNAポリメラーゼに対しては、１本鎖結合タンパク質としてT4 gene 32が有効である。
（標的核酸の二本鎖の解離を促進可能な２以上のオリゴヌクレオチド）
　本生産方法では、その増幅工程で、標的核酸の二本鎖の解離を促進可能な２以上のオリゴヌクレオチドを用いる。なお、２以上のオリゴヌクレオチドに関して、標的核酸とは、被験試料中に本来的に存在している標的核酸のほか、増幅工程において生じる第１の鋳型鎖と第１のプライマーの伸長鎖である第１の伸長鎖との二本鎖及び第２の鋳型鎖と第２のプライマーの伸長鎖である第２の伸長鎖との二本鎖と同義である。したがって、標的核酸の解離を促進するとは、標的核酸のほか、伸長鎖と鋳型鎖との解離を促進することを含んでいる。また、本明細書において、標的核酸の解離を促進するとは、標的核酸の二本鎖の解離を少なくとも部分的に惹起し又は促進することを意味している。
　このような２以上のオリゴヌクレオチドを用いることで、温度変化を実質的に伴うことなく又は実質的な等温条件下で、標的核酸の二本鎖の解離を生じさせて又は促進して、新たな第１のプライマー及び第２のプライマーを各鋳型鎖等にハイブリダイズさせることができる。以下、２以上のオリゴヌクレオチドを、解離用オリゴヌクレオチドと称して説明する。
　解離用オリゴヌクレオチドは、第１のプライマーが第１の鋳型鎖にハイブリダイズするのを促進するための少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと、第２のプライマーが第２の鋳型鎖にハイブリダイズするのを促進するための少なくとも一つのオリゴヌクレオチドと、を含む。
　本生産方法では、解離用オリゴヌクレオチドを、第１の及び第２のプライマーがハイブリダイズする鋳型鎖上のハイブリダイズ領域の近傍に介在させるようにすることが好ましい。こうすることで、これらハイブリダイズ領域における第１及び第２の伸長鎖とそれぞれの鋳型鎖との対合安定性を低下させることができる。この結果、第１及び第２の伸長鎖とそれぞれのハイブリダイズ領域との二本鎖部分の解離及び一本鎖化を促進して、新たな第１及び第２のプライマーを効果的に鋳型鎖にハイブリダイズさせることができる。
　解離用オリゴヌクレオチドは、標的核酸の第１のハイブリダイズ領域及び第２のハイブリダイズ領域のそれぞれ近傍において、第１の鋳型鎖及び第２の鋳型鎖の少なくとも一方に対するハイブリダイゼーションを介して存在可能に構成されていることが好ましい。こうすることで、確実に、解離用オリゴヌクレオチドを第１及び第２のハイブリダイズ領域近傍に存在させることができ、ハイブリダイズ領域近傍における標的核酸の二本鎖解離及び第１及び第２のプライマーの各鋳型鎖へのハイブリダイズを促進できる。
　解離用オリゴヌクレオチドは、各種態様を採ることができる。本生産方法においては、これらの各種態様を適宜組み合わせて用いることができる。以下、解離用オリゴヌクレオチドの作用について本生産方法における増幅工程を参照しつつ説明する。なお、増幅条件等については後段で説明する。
（解離用オリゴヌクレオチドの第１の態様）
　解離用オリゴヌクレオチドは、例えば、プライマーとすることができる。図１には、第１のプライマー１０及び第２のプライマー２０と、これらに対して用いる解離用オリゴヌクレオチドとしての第３のプライマー３０及び第４のプライマー４０を示す。
　図１において、第３のプライマー３０は、第１の鋳型鎖１００における第１のハイブリダイズ領域Ｈ１の近傍、すなわち、第１のハイブリダイズ領域Ｈ１よりも標的核酸Ｔの内側、すなわち、第１の鋳型鎖１００の５’末端側で、第２の鋳型鎖２００にハイブリダイズ可能に構成されている。第３のプライマー３０は、第１のハイブリダイズ領域Ｈ１の近傍で、第１のプライマー１０とは異なる伸長方向で伸長鎖を形成可能に構成されている。すなわち、第３のプライマー３０は、それ自身が第２の鋳型鎖２００又は第１の伸長鎖１２にハイブリダイズすることで、第１のハイブリダイズ領域Ｈ１近傍に存在するようになっている。
　また、第４のプライマー４０は、第１の鋳型鎖２００における第２のハイブリダイズ領域Ｈ２の近傍、すなわち、第２のハイブリダイズ領域Ｈ１よりも標的核酸Ｔの内側、すなわち、第２の鋳型鎖２００の５’末端側で、第１の鋳型鎖１００にハイブリダイズ可能に構成されている。第４のプライマー４０は、第２のハイブリダイズ領域Ｈ２の近傍で、第２のプライマー２０とは異なる伸長方向で伸長鎖を形成可能に構成されている。すなわち、第４のプライマー４０は、それ自身が第１の鋳型鎖１００又は第２の伸長鎖２２にハイブリダイズすることで、第１のハイブリダイズ領域Ｈ２近傍に存在するようになっている。
　以下、第３及び第４のプライマー３０、４０の作用について説明するが、以下の増幅工程はこうした態様の解離用オリゴヌクレオチドの作用についての推論であって、本明細書の開示を拘束するものではない。
　図２に示すように、第１及び第２のプライマー１０、２０は、鋳型鎖１００、２００からなる二本鎖標的核酸に対してそれぞれハイブリダイズして、第１の伸長鎖１２及び第２の伸長鎖２２を合成する。その結果、第１及び第２のプライマー１０、２０から、それぞれ二本鎖Ａ２、Ａ１が新生される。
　図３（ａ）に示すように、第３のプライマー３０は、第１の鋳型鎖１００における第１のハイブリダイズ領域Ｈ１の近傍、すなわち、第１のハイブリダイズ領域Ｈ１よりも新生二本鎖Ａ２の内側、すなわち、第１の鋳型鎖１００の５’末端側で、第１の伸長鎖１２にハイブリダイズする。換言すると、第３のプライマー３０は、第１の伸長鎖１２における第１のプライマー１０由来部分よりも３’側にハイブリダイズする。このため、第３のプライマー３０は、第１の伸長鎖１２を鋳型として３’方向（第１のプライマー１０の伸長方向とは逆方向）に伸長可能である。こうした第３のプライマー３０のハイブリダイズにより、新生二本鎖Ａ２のハイブリダイズ領域Ｈ１付近の対合は不安定となり、その解離が促進される。
　また、第４のプライマー４０は、第１の鋳型鎖２００における第２のハイブリダイズ領域Ｈ２の近傍、すなわち、第２のハイブリダイズ領域Ｈ２よりも新生二本鎖Ａ１の内側、すなわち、第２の鋳型鎖２００の５’末端側で、第２の伸長鎖２２にハイブリダイズする。換言すると、第４のプライマー４０は、第２の伸長鎖２２における第２のプライマー２０由来部分よりも３’側にハイブリダイズする。このため、第４のプライマー４０は、第２の伸長鎖２２を鋳型として３’方向（第２のプライマー２０の伸長方向とは逆方向）に伸長可能である。こうした第４のプライマー４０のハイブリダイズにより、新生二本鎖Ａ１のハイブリダイズ領域Ｈ２付近の対応は不安定となり、その解離は促進される。
　図３（ｂ）に示すように、かかる第３及び第４のプライマー３０、４０は、それぞれ、第１及び第２のプライマー１０、２０の伸長方向とは逆方向に第３の伸長鎖３２及び第４の伸長鎖４２を形成する。これにより、新生二本鎖Ａ２、Ａ１における第１及び第２のハイブリダイズ領域Ｈ１、Ｈ２の近傍における解離を一層確実に促進される。
　この結果、図３（ｃ）に示すように、新たに第１及び第２のプライマー１０、２０が、鋳型鎖１００、２００にハイブリダイズする。そして、図３（ｄ）に示すように、新たに鋳型鎖１００、２００にハイブリダイズした第１及び第２のプライマー１０、２０は、それぞれ新たな伸長鎖１２’、２２’を形成して、二本鎖Ａ４、Ａ３を新生する。また、第３及び第４のプライマー３０、４０又はその伸長鎖３２、４２がハイブリダイズした当初の伸長鎖１２、２２を鋳型として第２及び第１のプライマー２０、１０がハイブリダイズして新たな伸長鎖２２’’、１２’’も合成される。
　この結果、図３（ｅ）に示すように、新たに二本鎖Ａ５、Ａ６が新生し、併せて４つの二本鎖Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６が合成される。以下、第１及び第２のプライマー１０、２０が、新生二本鎖のハイブリダイズ領域Ｈ１、Ｈ２にハイブリダイズすることで、標的核酸は増幅される。
　以上説明したように、第１の態様によれば、第１及び第２のハイブリダイズ領域Ｈ１、Ｈ２の近傍に、オリゴヌクレオチド断片としての第３及び第４のプライマー３０、４０を介在させて、標的核酸Ｔや増幅工程において生じうる新生二本鎖の対合を、ハイブリダイズ領域Ｈ１、Ｈ２近傍で阻害し不安定化し、解離を促進することができる。また、これらのプライマー３０、４０は、前記対合をより阻害する効果の高い伸長鎖３２、４２を生成することができる。以上のように、こうした第３及び第４のプライマー３０、４０により、新生二本鎖における伸長鎖１２、２２と鋳型鎖１００、２００との解離を促進することができ、温度変化を実質的に伴うことなく又は実質的な等温条件下で標的核酸を増幅することができる。
　なお、図２～図３においては、第１及び第２のプライマー１０、２０が鋳型１００、２００にハイブリダイズし、その後、第３及び第４のプライマー３０、４０がそれぞれの鋳型である伸長鎖１２、２２にハイブリダイズするように記載したが、これらのプライマーのハイブリダイズ態様は特に限定するものではないが。これらのプライマーの各鋳型鎖に対するハイブリダイズは同時進行的にあるいは相前後して生じると考えられる。すなわち、第１及び第２のプライマー１０、２０が鋳型鎖１００、２００にハイブリダイズするのに先行して又は同時的に、第３及び第４のプライマー３０、４０が、鋳型鎖２００、１００や伸長鎖１２、２２に対してハイブリダイズするなど、様々な態様でハイブリダイズが生じると考えられるが、いずれにしても、第１及び第２のプライマー１０、２０の鋳型鎖１００、２００や第２の伸長鎖２２、第１の伸長鎖１２へのハイブリダイズは促進される。
　なお、第３のプライマー３０の第２の鋳型鎖２００又は第１の伸長鎖１２に対してハイブリダイズするための識別配列は、標的核酸配列及び他のプライマーとの関係で適宜設定できるが、既に説明した第１及び第２のプライマーにおけるのと同様の態様で特異性の高い配列及び長さを設定することができる。第４のプライマー４０の第１の鋳型鎖１００又は第２の伸長鎖２２に対する識別配列についても同様である。また、第３のプライマー３０は、ハイブリダイズ領域Ｈ１よりも標的核酸Ｔの内側において鋳型鎖２００又は伸長鎖１２にハイブリダイズ可能であれば、ハイブリダイズ領域Ｈ１と一部重複していてもよいが、増幅効率の観点からは、好ましくはハイブリダイズ領域Ｈ１とは完全に重複しないで鋳型鎖２００又は伸長鎖１２にハイブリダイズするように設計される。なお、ハイブリダイズ領域Ｈ１の５’末端から、どの程度離間して第３のプライマー３０のハイブリダイズ領域を設定するかは、特に限定するものではないが、例えば、ハイブリダイズ領域Ｈ１の５’末端から３塩基以上２０塩基以下離間して第３のプライマー３０のハイブリダイズ領域の５’末端が来るようにすることができる。より好ましくは５塩基以上１５塩基以下、さらに好ましくは５塩基以上１０塩基以下程度離間する。
　また、第４のプライマー４０についても、第３のプライマー３０と同様にしてハイブリダイズ領域Ｈ２に対して各種態様を採ることができる。
（解離用オリゴヌクレオチドの第２の態様）
　解離用オリゴヌクレオチドは、第１のプライマー及び／又は第２のプライマーの一部に備えるタグとすることもできる。図４には、第１のプライマー１０１０及び第２のプライマー１０２０を用いて、それぞれが標的核酸Ｔの鋳型鎖２００、１００をそれぞれ増幅する形態を示す。
　図４に示すように、第１のプライマー１０１０は、解離用オリゴヌクレオチドとして第１のタグ１０３０を有し、第２のプライマー１０２０は、解離用オリゴヌクレオチドとして第２のタグ１０４０を有している。第１及び第２のタグ１０３０、１０４０は、第１及び第２のプライマー１０１０、１０３０の各ハイブリダイズ領域Ｈ１、Ｈ２の５’末端側に抑止要素を介して備えられる核酸増幅反応とは独立した天然核酸（天然ＤＮＡ）からなるタグである。
　第１及び第２のタグ１０３０、１０４０は、第１及び第２のプライマー１０１０、１０２０が、鋳型鎖１００、２００又は伸長鎖２２、１２にハイブリダイズすることで、それぞれ、第１及び第２のハイブリダイズ領域Ｈ１、Ｈ２の近傍に存在することができるようになっている。
　以下、第１及び第２のタグ１０３０、１０４０の作用について説明するが、以下の増幅工程はこうした態様の解離用オリゴヌクレオチドの作用についての推論であって、本明細書の開示を拘束するものではない。
　図５に示すように、第１及び第２のプライマー１０１０、１０２０は、鋳型鎖１００、２００からなる二本鎖の標的核酸Ｔに対してそれぞれハイブリダイズする。この際、第１及び第２のタグ１０３０、１０４０は、鋳型鎖１００、２００を、第１及び第２のハイブリダイズ領域Ｈ１、Ｈ２の近傍でこれらの解離を促進するように作用する。
　そして、第１及び第２のプライマー１０１０、１０２０は、第１及び第２の伸長鎖１０１２、１０２２を合成し、２つの二本鎖Ａ１、Ａ２が新生される。新生二本鎖Ａ１の鋳型鎖２００の３’末端、すなわち、ハイブリダイズ領域Ｈ２近傍（その３’末端側）には、第２のタグ１０４０が配置されている。また、新生二本鎖Ａ２の鋳型鎖１００の３’末端、すなわち、ハイブリダイズ領域Ｈ１の近傍（その３’末端側）には、第１のタグ１０３０が配置されている。こうしたタブ１０４０、１０３０の存在により、新生二本鎖Ａ１、Ａ２の第２及び第１のハイブリダイズ領域Ｈ２、Ｈ１近傍（より具体的には、その３’末端側）で、第１及び第２の伸長鎖１０１２、１０２２とその鋳型鎖１００、２００との対合が不安定化されその解離が促進される。
　その結果、図６（ａ）に示すように、新たに第１のプライマー１０１０は、新生二本鎖Ａ２の第１のハイブリダイズ領域Ｈ１にハイブリダイズすることができる。また、第２のプライマー１０２０は、新生二本鎖Ａ１の第２のハイブリダイズ領域Ｈ２にハイブリダイズすることができる。これにより、図６（ｂ）に示すように、新たにハイブリダイズした第１及び第２のプライマー１０１０、１０２０は、それぞれ新たな伸長鎖１０１２’、１０２２’を形成して、二本鎖Ａ４、Ａ３を新生する。
　また、図６（ｂ）に示すように、第１及び第２のプライマー１０１０、１０２０が、先に合成された伸長鎖１０２２、１０１２上のハイブリダイズ領域Ｈ１、Ｈ２にそれぞれハイブリダイズして、新たな伸長鎖１０１２’’、１０２２’’も合成される。この結果、図６（ｃ）に示すように、新たに二本鎖Ａ５、Ａ６が新生し、併せて４つの二本鎖Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６が合成される。以下、第１及び第２のプライマー１０１０、１０２０は、新生二本鎖のハイブリダイズ領域Ｈ１、Ｈ２にハイブリダイズすることで、標的核酸は増幅される。
　以上説明したように、第２の態様によれば、第１及び第２のハイブリダイズ領域Ｈ１、Ｈ２の近傍に、第１及び第２のプライマー１０１０、１０２０に連結されるオリゴヌクレオチドである第１及び第２のタグ１０３０、１０４０をそれぞれ存在させて、標的核酸Ｔや増幅工程において生じうる新生二本鎖の対合を、ハイブリダイズ領域Ｈ１、Ｈ２でよく阻害し不安定化し、解離を促進することができる。これらのタグ１０３０、１０４０は、それ自体は標的核酸Ｔや新生二本鎖にハイブリダイズしないため、前記対合を阻害する効果がより高いと考えられる。以上のように、こうした第３及び第４のタグ１０３０、１０４０により、新生二本鎖における伸長鎖１２、２２と鋳型鎖１００、２００との解離を促進することができ、温度変化を実質的に伴うことなく又は実質的な等温条件下で標的核酸を増幅することができる。
　なお、図５～図６においては、第１及び第２のプライマー１０１０、１０２０が新生二本鎖Ａ２、Ａ１の鋳型鎖１００、２００にそれぞれハイブリダイズした後、プライマー１０１０、１０２０が新生二本鎖Ａ１、Ａ２の新生鋳型鎖１０２２、１０１２にハイブリダイズするように記載したが、これらのハイブリダイズは同時進行的にあるいは順不問で生じると考えられ、各プライマー１０１０、１０２０の相互作用により、実質的な温度変化を伴うことなく核酸増幅反応が進行するものと考えられる。
　第１及び第２のタグ１０３０、１０４０は、実質的な等温条件下で核酸増幅可能な長さに設定される。特に限定するものではないが、例えば、こうしたタグの長さは、数～２５塩基長以下程度とすることができ、好ましくは５塩基長以上２０塩基長以下程度、より好ましくは８塩基長以上１８塩基長以下程度とすることができる。
　第１及び第２のタグ１０３０、１０４０の塩基配列としては、特に限定しないが、既に説明した配列番号１～１００で表される塩基配列又はその相補的塩基配列（いずれも２３塩基長）の全体又はその一部の塩基配列を用いることができる。タグの塩基長は、例えば、５塩基以上であり、また例えば６塩基以上、また例えば７塩基以上、また例えば８塩基以上、また例えば９塩基以上、また例えば１０塩基以上、また例えば１１塩基以上、また例えば１２塩基以上、また例えば１３塩基以上、また例えば１４塩基長、また例えば１５塩基長、また例えば１６塩基長、また例えば１７塩基長、また例えば１８塩基長などとすることができる。
　また、以上の説明においては、第１及び第２のタグ１０３０、１０４０を、「抑止要素」を介して天然ＤＮＡを備えるものとしたが、これに限定するものではない。本分野で汎用されるスペーサを伴ってあるいは伴うことなく、非天然核酸や対合しない非天然塩基を天然の糖－リン酸骨格やＧＮＡ骨格やＰＮＡ骨格に備えるものであってもよい。また、第１及び第２のタグ１０３０、１０４０には、タンパク質、蛍光物質、発色物質（標識要素であってもよい。）等、天然核酸との対合性や結合性を有しないものであれば特に限定することなく備えることができる。
　また、解離用オリゴヌクレオチドは、第１の態様のみ、あるいは第２の態様のみを、特定の標的核酸の増幅に適用してもよいし、第１の態様と第２の態様とを組合せて、特定の標的核酸の増幅に用いることもできる。
　さらに、本生産方法においては、上記した態様の解離用オリゴリボヌクレオチドのほか、第１及び第２のプライマーがターゲットとするよりもさらに外側（すなわち、標的核酸の上流側及び／又は下流側）にハイブリダイズするアウタープライマー又はそのセットを備えることができる。かかるアウタープライマー又はそのセットは、被験試料中に存在する可能性のある標的核酸に由来する鋳型鎖と相補的な伸長鎖とを解離させるのに効果的である。アウタープライマー又はそのセットは、第１及び第２のプライマーから０～６０塩基程度の範囲で上流側及び／又は下流側に設定することができる。
　本生産方法における、実質的な「等温条件」とは、実質的に一定の温度、すなわち核酸重合反応が行われる実質的に温度変化を伴うことがないことを意味している。実質的な等温条件又は実質的に温度変化を伴わないとは、温度変化が好ましくは５℃以内、より好ましくは３℃以内、さらに好ましくは２℃以内、なお好ましくは１℃以内を意味する。等温条件下での増幅反応のための等温としては、一般に反応の主生成物の融解温度（Ｔｍ；混合物中の潜在的に二本鎖である分子の半分が一本鎖の変性状態にある温度）より低い；すなわち一般に９０℃以下、通常は約５０～７５℃、好ましくは約５５～７０℃、又は６０～７０℃、又はより好ましくは約６５℃である。
　増幅工程は、ＤＮＡポリメラーゼ等の酵素反応に好適なｐＨを与える緩衝剤、酵素の触媒活性の維持やアニールのために必要な塩類、酵素の保護剤、更には必要に応じて融解温度（Ｔｍ）の調整剤等の共存下で行う。緩衝剤としては、例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ等の中性から弱アルカリ性に緩衝作用を持つものが用いられる。ｐＨ は使用するＤＮＡポリメラーゼに応じて調整する。塩類としては、例えば、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、あるいは（ＮＨ４）2ＳＯ4等が、酵素の活性維持と核酸の融解温度（Ｔｍ）調整のために適宜添加される。酵素の保護剤としては、ウシ血清アルブミンや糖類が適宜利用される。さらに、融解温度（Ｔｍ）の調整剤には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）やホルムアミドが一般に利用される。
　また、融解温度（Ｔｍ）の調整剤を利用することによって、前記オリゴヌクレオチドのアニールを限られた温度条件の下で調整することができる。さらに、ベタイン(N,N,N,-trimethylglycine)やテトラアルキルアンモニウム塩は、そのisostabilize作用によって鎖置換効率の向上にも有効である。ベタインは、反応液中０．２～３．０Ｍ、好ましくは０．５～１．５Ｍ程度の添加により、本生産方法における核酸増幅反応の促進作用を期待できる。これらの融解温度の調整剤は、融解温度を下げる方向に作用するので、塩濃度や反応温度等のその他の反応条件を考慮して、適切なストリンジェンシーと反応性を与える条件を経験的に設定する。
　本生産方法では、増幅工程を等温条件で行うことができるが、例えば、等温増幅工程に先立って、二本鎖の標的核酸から一本鎖標的核酸を生成させるための加熱による変性工程を含むことができる。
　本生産方法で用いる第１及び／又は第２のプライマーは、必要に応じて、標識要素を備えることができる。ここで標識要素とは、例えば、標識物質及び標識物質結合物質が挙げられる。本明細書において「標識物質」とは、検出しようとする物質あるいは分子を他と識別することを可能とする物質である。標識物質は、特に限定しないが、典型的には、蛍光、放射能、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等）、燐光、化学発光、着色などを利用した標識物質が挙げられる。
　標識物質は、目視（肉眼）で検出可能な発光又は発色を提示する発光物質又は発色物質若しくは着色物質であることが好ましい。すなわち、直接それ自体が、他の成分を必要としないで肉眼で視認可能なシグナルを生成することができる物質であることが好ましい。特に、クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーションにおいて、より好適である。検出工程で迅速かつ簡易に行うことができる。こうした物質としては、典型的には、各種の顔料や染料などの各種の着色剤が挙げられる。また、これに準ずる、金、銀などの貴金属ほか、銅などの各種金属又は合金、あるいは当該金属を含む有機化合物（錯体化合物であってもよい）が挙げられる。また、着色剤に準ずる、マイカ等の無機化合物が挙げられる。
　この種の標識物質としては、典型的には、各種染料、各種顔料、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウム化合物、オレフィン、エノールエーテル、エナミン、アリールビニルエーテル、ジオキセン、アリールイミダゾール、ルシゲニン、ルシフェリン及びエクリオンを包含する化学発光物質が挙げられる。また、こうした標識物質でラベルされているラテックス粒子などの粒子も挙げられる。さらに、金コロイド若しくはゾル又は銀コロイド若しくはゾルを包含するコロイド若しくはゾル等が挙げられる。さらにまた、金属粒子、無機粒子等が挙げられる。
　標識物質は上記のように、その一部に粒子を備えていてもよい。標識物質の一部を構成するラテックス粒子などの粒子の平均粒子径は、特に限定しないが、例えば、０．１ｎｍ以上２０μｍ以下であり、固相担体の孔径等によって適宜選択することができる。
　好ましい粒子は、水溶液に懸濁でき、そして水不溶性ポリマー材料からなる粒子である。例えばポリエチレン、ポリスチレン、スチレン－スチレンスルホン酸塩共重合体、アクリル酸ポリマー、メタクリル酸ポリマー、アクリロニトリルポリマー、アクリロニトリル－ブタジエン－スチレン、ポリビニルアセテート－アクリレート、ポリビニルピロリドン又は塩化ビニル－アクリレートが挙げられる。それらの表面上に活性基、例えばカルボキシル、アミノ又はアルデヒド基を有するラテックス粒子も挙げられる。
　標識物質結合物質は、タンパク質－タンパク質相互作用、低分子化合物－タンパク質相互作用、核酸－核酸相互作用等を利用して、最終的に標識物質を結合できる物質が挙げられる。例えば、抗原抗体反応における抗体や、アビジン（ストレプトアビジン）－ビオチンシステムにおけるビオチン、抗ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）－ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）システムにおけるジゴキシゲニン、抗ＦＩＴＣ－ＦＩＴＣシステムにおけるＦＩＴＣ等に代表されるハプテン類及び互いにハイブリダイズ可能であるオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。この場合、最終的に検出のために用いられる標識物質は、標識物質結合物質と相互作用する他方の分子又は物質（例えば、抗原、すなわち、ストレプトアビジン、抗ＦＩＴＣ、オリゴヌクレオチドなど）を、標識物質結合物質との結合のための部位として備えるように構成される。
　こうした標識物質や標識物質結合物質は商業的に入手できるほか、標識物質及び標識物質結合物質の製造及び標識物質等を粒子にラベルする方法も公知であり、当業者であれば適宜公知技術を利用して取得することができる。さらに、こうした標識物質又は標識物質でラベル化された粒子や標識物質結合物質と、ＤＮＡ等のオリゴヌクレオチドとの結合もアミノ基等の官能基を介して適宜可能であり、それ自体は当該分野において周知である。
　なお、既述のように、標識要素は、解離用オリゴヌクレオチドの一部として用いることもできる。
　以上説明したように、本生産方法によれば、実質的に温度変化を伴うことなく又は実質的な等温条件で、標的核酸を増幅することができる。
（標的核酸の検出方法）
　本明細書に開示される標的核酸の検出方法（以下、本検出方法という。）は、第１のプライマー、第２のプライマー及び鎖置換活性を有する核酸ポリメラーゼ、を用いて、前記標的核酸を含む可能性のある被験試料に対して核酸増幅反応を実施する増幅工程と、前記増幅工程で得られる増幅産物の少なくとも一部を介して前記標的核酸を検出する工程と、を備えることができる。本検出方法では、増幅工程は、既に説明した、本生産方法における増幅工程としての各種態様を適宜採用することができる。
　本検出方法における検出工程は、増幅産物の少なくとも一部を介して標的核酸を検出する。増幅産物は、通常、二本鎖の状態で得られる。したがって、適宜これを変性して一本鎖の状態とし、その一部とプローブ等のハイブリダイゼーションを用いて標的核酸を検出してもよい。また、第１及び第２のプライマーの少なくとも一方が増幅反応とは独立したタグを有するときには、二本鎖増幅産物を変性することなく当該タグとプローブ等とのハイブリダイゼーションを介して標的核酸を検出することができる。
　さらに、例えば、増幅産物の少なくとも一部にハイブリダイズするインナープライマーセットを用いて増幅して、その増幅産物を検出することによっても、標的核酸を検出することができる。なお、インナープライマーを、本生産方法における増幅工程において同時に用いることもできる。インナープライマーは、標識要素を備えることができる。これにより、プライマーがタグを備えていて標識要素を付与し難い場合においても、増幅産物に標識要素を付与することができる。
　増幅産物の少なくとも一部を介して標的核酸を分離・検出する具体的態様は、公知の各種の方法、例えば、プローブをマトリックス状に平板状固相担体に固定化したアレイ、プローブを固定化したビーズ、プローブを任意のパターンで多孔質性のストリップ等に固定化したクロマトグラフィー担体等を適宜用いることができる。
　アレイに用いる固相担体、ビーズ状体、クロマトグラフィー用の多孔質担体としては、特に限定するものではなく、公知の各種担体を用いることができる。例えば、クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーションに用いる固相担体としては、例えば、ポリエーテルスルホン、ニトロセルロース、ナイロン、ポリフッ化ビニリデンなどのポリマーを主体としたいわゆる多孔質性の材料が挙げられる。また、ろ紙などのセルロース系材料も好ましく用いることができる。
　また、プローブも、特に限定するものではなく、必要な特異性に基づいて適宜設定することができる。また、増幅産物の少なくとも一部とプローブ等とのハイブリダイゼーション条件、例えば、ｐＨ、塩濃度、温度、溶媒等についても当業者において周知の条件を適宜選択することができる。
　検出方法の一部として、特に、クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーションは、ハイブリダイズ産物を含む核酸増幅反応液に固相担体の一部を浸漬するなどの極めて簡易な操作によって、ハイブリダイズ産物の分離・検出を行うことができる点において好ましい。加えて、実質的に温度制御することなく、５～４０℃程度、好ましくは１５～３５℃程度、特に室温程度とすることができる点においても有利である。さらに、その検出時間も、２分～５０分以内、さらには５分～３０分程度等、極めて短時間で終了することができる点においても好ましい。
　また、増幅産物を検出するのにあたっては、第１及び第２のプライマーに予め付与された標識要素に基づくシグナルを検出するほか、検出工程において増幅産物の少なくとも一部に結合するように構成した標識要素を用いることもできるほか、物理化学的に検出可能な各種の検出方法等を適宜採用できる。増幅産物の少なくとも一部を用いて標識要素その他に基づいて標的核酸を検出する方法は、当該分野において周知であり、当業者は必要に応じて適切な方法を選択することができる。
（標的核酸を増幅するためのキット）
　本明細書に開示される標的核酸を増幅するためのキットは、標的核酸の５‘側にハイブリダイズする第１のプライマーと、標的核酸の３’側にハイブリダイズする第２のプライマーと、第１のプライマーの伸長鎖である第１の伸長鎖及び前記第２のプライマーの伸長鎖である第２の伸長鎖とそれらの各鋳型鎖との解離を促進可能な２以上のオリゴヌクレオチドと、を備えることができる。本キットによれば、実質的に温度変化を伴うことなく又は実質的な等温条件で、標的核酸を増幅することができる。
　本キットにおける第１及び第２のプライマー、２以上のオリゴヌクレオチドについては、既に説明した本生産方法におけるこれらの各種態様を適用することができる。さらに、本キットは、ＤＮＡの増幅等に一般的に必要なｄＮＴＰを備えていてもよい。さらにまた、本キットは、アウタープライマー又はそのセットを備えることもできる。
　本キットは、増幅産物を用いて標的核酸を検出するためのキットとしても用いることができる。検出のためのキットとしては、さらに、増幅産物の少なくとも一部をハイブリダイズするプローブ、インナープライマー、標識要素、プローブを固定化した各種担体他を、適宜備えることができる。
　以下、本明細書の開示を具現化した具体例を、実施例を挙げて説明するが、本明細書の開示は以下の実施例に限定されるものではない。
　本実施例では、標的核酸として、結核菌から抽出されたゲノムＤＮＡの一部とした。すなわち、結核菌から抽出されたゲノムＤＮＡを準備し、以下に示す２つのプライマーセットで増幅し、クロマトグラフィーにて分離検出した。図７に、標的核酸に対する第１のプライマー、第２のプライマー、第３のプライマー、第４のプライマーと、第５のプライマー及び第６のプライマーのハイブリダイズ領域の構成を示す。なお、第３のプライマー及び第４のプライマーは、それぞれ本明細書に開示される２以上のオリゴヌクレオチドの一例である。第５及び第６のプライマーは、第１のプライマー及び第２のプライマーの伸長鎖等を相補鎖から解離させるためのアウタープライマーである。
第１のプライマー（Ｆ）：ビオチン-cgc cta cgt ggc ctt tgt cac (21mer)（配列番号１０１）
第２のプライマー（Ｒ）：tag2-aga tcc cct atc cgt atg gtg gat (24mer）（配列番号１０２）
第３のプライマー（Ｆ）：agg atc ctg cga gcg tag (18mer)（配列番号１０３）
第４のプライマー（Ｒ）：aag aag gcg tac tcg acc tg (20mer)（配列番号１０４）
第５のプライマー（Ｆ）：aga cct cac cta tgt gtc ga (20mer)（配列番号１０５）
第６のプライマー（Ｒ）：tcg ctg aac cgg atc ga (17mer)（配列番号１０６）
（１）クロマトグラフィー用ストリップの作製
　クロマトグラフィー用ストリップは、図８に示すように、第２のプライマーに結合したタグ配列（ｔａｇ２）（配列番号１０）及び後述する実施例２において用いる第１のプライマーに結合したタグ配列（ｔａｇ１）にそれぞれハイブリダイズする捕捉プローブ（タグ２、タグ１）をライン状に固定化した。すなわち、メルクミリポア製Hi-Flow Plus メンブレンシート（６０ｍｍ×６００ｍｍ）に捕捉プローブ溶液を、特開２００３－７５３０５号公報に記載されている吐出ユニット（インクジェット法）を用いた日本ガイシ株式会社ＧＥＮＥＳＨＯＴ（登録商標）スポッターを用いて、スポットした。なお、捕捉プローブの３’末端側にpolyT(20)を付加した配列をプローブとして使用し、Spectroline社のＵＶ照射装置（ＸＬ－１５００ＵＶ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ）を用いて、２８０ｎｍの成分を含む波長にて３００ｍＪ／ｃｍ2程度の紫外線光の照射を行って固定化を実施した。
（２）ターゲット遺伝子の増幅
　結核菌から抽出したゲノムＤＮＡを被験試料として用い、第１のプライマーセット及び第２のプライマーセットをそれぞれ用いて標的核酸を増幅した。遺伝子増幅酵素はニッポン・ジーン社のBst DNA polymeraseを用い、サーマルサイクラーはタカラバイオ社のＤＩＣＥを用いた。
　増幅反応液は、以下に示す通りとした。増幅反応液１は、本明細書の開示の実施例であり、増幅反応液２は、比較例に相当する。
（増幅反応液１）
滅菌水       　　　　　　　 残部
10×Bst reaction buffer     1.0μl
10mM dNTPmix                1.4μl
×3,000SYBRgreenI    　　　 1.0μl
第１のプライマー            8pmol
第２のプライマー            8pmol
第３のプライマー            2pmol
第４のプライマー            2pmol
第５のプライマー            2pmol
第６のプライマー            2pmol
Bst DNA polymerase(8U/μl)                   0.6μl
ゲノムＤＮＡ（20,2,0.2,0.02,0pg/μl）        1.0μl
計　                                         10.0μl
（増幅反応液２）
滅菌水       　　　　　　　　      残部
10×Bst reaction buffer            1.0μl
10mM dNTPmix                       1.4μl
×3,000SYBRgreenI                  1.0μl
第１のプライマー                   8pmol
第２のプライマー                   8pmol
第５のプライマー                   2pmol
第６のプライマー                   2pmol
Bst DNA polymerase(8U/μl)                   0.6μl
ゲノムＤＮＡ（20,2,0.2,0.02,0pg/μl）        1.0μl
計　                                         10.0μl
　サーマルサイクラーを用いて下記の条件で遺伝子の増幅反応（６５℃で１０秒保存の後、６５℃で保温しながら、１分ごとに蛍光強度を６０回測定）した。増幅反応液１について、２ｐｇ以上の被検ＤＮＡを含む場合、時間が経つにつれて、蛍光強度が増加していった。
（３）クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション及び検出
　図９に示すようにして、下記の展開液にストリップの下端を浸漬して展開した。なお、ラテックス液には、ストレプトアビジンを結合した青色に着色したビーズを用いた。
（展開液）
増幅反応液　　1.0μl
展開液　      10.0μl
純水　　      9.0μl
ラテックス液  1.0μl
計　          21.0μl 
　展開液はストリップ上部まで約１５分で全て吸い上がり反応は終了した。反応終了後、目視にてストリップ上の検出ラインへの着色を確認した。結果を図１０に示す。
　図１０に示すように、増幅反応液１では、タグ２に相補的なプローブにおいてハイブリダイズ産物を検出することができた。また、鋳型ＤＮＡ２ｐｇ／ｔｅｓｔまでバンドが認められたが、増幅反応液２では、すべての反応液でバンドが認められなかった。
　したがって、第３及び第４のプライマーを加えることで、効率よく等温増幅反応がおこり、標的核酸が増幅されたことがわかった。なお、増幅反応液１において、第５及び第６のプライマー（アウタープライマーセット）を用いない増幅反応液を別途調製して、アウタープライマーセットの影響について確認したところ、増幅反応液１と同程度の検出感度を確認できた。
　本実施例では、実施例１と同様の標的核酸を検出するために、結核菌から抽出されたゲノムＤＮＡを準備し、以下に示すプライマーで増幅し、クロマトグラフィーにて分離検出した。第１のプライマー及び第２のプライマーにおけるタグとゲノムＤＮＡに相補な領域との間には、GlenResearch社のホスホアミダイト試薬であるSpacer PhophoamiditeＣ３を用いて通常のオリゴヌクレオチド合成方法に準じて合成して、ポリメラーゼ反応を抑制するプロピレン基をスペーサ(抑制要素)として導入した。なお、第１のプライマーが備えるタグ（ｔａｇ１（配列番号１）及び第２のプライマーが備えるタグ（ｔａｇ２）（配列番号１０）は、それぞれ本明細書に開示される２以上のオリゴヌクレオチドの他の一例である。また、ビオチン付きインナープライマーは、第１のプライマー及び第２のプライマーによる増幅産物の内部にハイブリダイズして第１のプライマーに付与したタグ（ｔａｇ１）を備えて、タグ１に相補的なプローブで検出可能なＤＮＡ二本鎖を得るためのものである。第３及び第４のプライマーは、アウタープライマーセットに相当する。
第１のプライマー（Ｆ）：tag1-cgc cta cgt ggc ctt tgt cac (21mer)（配列番号１０１）
第２のプライマー（Ｒ）：tag2-aga tcc cct atc cgt atg gtg gat （24mer）（配列番号１０２）
第３のプライマー（Ｆ）：aga cct cac cta tgt gtc ga (20mer)（配列番号１０５）
第４のプライマー（Ｒ）：tcg ctg aac cgg atc ga (17mer)（配列番号１０６）
Biotinインナープライマー：biotin-gct cga tcg cgt cga gga (18mer)（配列番号１０７）
（１）クロマトグラフィー用ストリップの作製
　クロマトグラフィー用ストリップは、実施例１に準じて、図８に示すように、第１及び第２のプライマーに結合させたタグ配列（ｔａｇ１、２）に相補的な捕捉プローブをライン状に固定化した。
（２）ターゲット遺伝子の増幅
　増幅反応液は以下に示す組成とする以外は、実施例１と同様にして標的核酸を増幅した。
（増幅反応液）
滅菌水       　　　　　　　　　    残部
10×Bst reaction buffer            1.0μl
10mM dNTPmix                       1.4μl
×3,000SYBRgreenI                  1.0μl
第１のプライマー                   16pmol
第２のプライマー                   16pmol
第３、第４のプライマー             各2.0pmol
Biotinインナープライマー：　       5pmol
Bst DNA polymerase(8U/μl)         0.6μl
ゲノムDNA（20,2,0.2pg/μl）        1.0μl
計　                               10.0μl 
　サーマルサイクラーを用いて下記の条件で遺伝子の増幅反応（６５℃で１０秒保存後、そのまま６５℃で保温しながら、１分ごとに蛍光強度を９０回測定）した。２ｐｇ以上の被検ＤＮＡを含む場合、時間が経つにつれて、蛍光強度が増加していった。
（３）クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション及び検出
　実施例１と同様にして、ストリップの下端を浸漬して展開した。結果を図１１に示す。
　図１１に示すように、タグ１に相補的なプローブにおいてハイブリダイズ産物を検出することができた。また、鋳型ＤＮＡ０．２ｐｇ／ｔｅｓｔまでバンドが認められた。以上のことから、等温増幅反応により、標的核酸が増幅されることがわかった。なお、上記増幅反応液において、第３及び第４のプライマー（アウタープライマーセット）を用いない増幅反応液を別途調製して、アウタープライマーセットの影響について確認したところ、増幅反応液と同程度の検出感度を確認できた。
　本実施例では、標的核酸を、抗酸菌（M.intracellulare）から抽出されたゲノムＤＮＡの一部とした。すなわち、結核菌から抽出されたゲノムＤＮＡを準備し、以下に示す２つのプライマーセットで増幅し、クロマトグラフィーにて分離検出した。第１及び第２のプライマーは、標的核酸を増幅するためのプライマーであり、第３のプライマー及び第４のプライマーは、それぞれ本明細書に開示される２以上の解離用オリゴヌクレオチドの一例である。なお、第２のプライマーが有するｔａｇ２の塩基配列は、配列番号１０である。第５及び第６のプライマーは、第１のプライマー及び第２のプライマーの伸長鎖等を相補鎖から解離させるためのアウタープライマーセットである。
第１のプライマー（Ｆ）：ビオチン- caa gtc ggc cca gga aaa (18mer)（配列番号１０８）
第２のプライマー（Ｒ）：tag2- gac ctt tgc cgt cga agt c（19mer）（配列番号１０９）
第３のプライマー（Ｆ）：cag tcg att ccg ccg c (16mer) （配列番号１１０）
第４のプライマー（Ｒ）：gag ccc gat cca gca ga (17mer) （配列番号１１１）
第５のプライマー（Ｆ）：acg agg tcg tca gcg ata c (19mer) （配列番号１１２）
第６のプライマー（Ｒ）：gca cgg att ccg agt agc(18mer) （配列番号１１３）
（１）クロマトグラフィー用ストリップの作製
　クロマトグラフィー用ストリップは、実施例１に準じて、ｔａｇ２に相補的なプローブを、ライン状に固定化した。
（２）ターゲット遺伝子の増幅
　抗酸菌（M.intracellulare）から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型（試料）として用い、以下に示す第１のプライマーセット及び第２のプライマーセットをそれぞれ用いて増幅した。遺伝子増幅酵素は、ニッポン・ジーン社のBst DNA polymeraseを用い、サーマルサイクラーはタカラバイオ社のＤＩＣＥを用いた。
　増幅反応液は、以下に示す通りとした。増幅反応液１は、本明細書に開示される実施例であり、増幅反応液２は、比較例に相当する。
（増幅反応液１）
滅菌水       　　　　　　　　      残部
10×Bst reaction buffer            1.0μl
10mM dNTPmix                 　    1.4μl
×3,000SYBRgreenI                  1.0μl
第１のプライマー                   8pmol
第２のプライマー                   8pmol
第３のプライマー                   4pmol
第４のプライマー                   4pmol
第５のプライマー　                 2pmol
第６のプライマー　　　　　         2pmol
Bst DNA polymerase(8U/μl)         0.6μl
ゲノムDNA（100,10,2,0pg/μl）      1.0μl
計                                 10.0μl 
（増幅反応液２）
滅菌水       　　　　　　　　　     残部
10×Bst reaction buffer            1.0μl
10mM dNTPmix                   　　1.4μl
×3,000SYBRgreenI                  1.0μl
第１のプライマー                   8pmol
第２のプライマー                   8pmol
第５のプライマー                   2pmol
第６のプライマー                   2pmol
Bst DNA polymerase(8U/μl)         0.6μl
ゲノムDNA（100,10,2,0pg/μl）      1.0μl
計                                 10.0μl
　サーマルサイクラーを用いて下記の条件で遺伝子の増幅反応（６８℃で１０秒保存の後、６８℃で保温しながら、１分ごとに蛍光強度を６０回測定）した。結果を図１２に示す。図１２に示すように、時間が経つにつれて、蛍光強度が増加していった。
（３）クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション及び検出
　下記の展開液を用いる以外は、実施例１と同様に操作して、にストリップの下端を浸漬して展開した。
（展開液）
増幅反応液　　1.0μｌ
展開液　      10.0μl
純水　　    　9.0μl
ラテックス液  1.0μl
計　          21.0μl 
　展開液はストリップ上部まで約１５分で全て吸い上がり反応は終了した。反応終了後、目視にてストリップ上の検出ラインへの着色を確認した。結果を図１３に示す。
　図１３に示すように、増幅反応液１では、鋳型ＤＮＡ１０ｐｇ／ｔｅｓｔまでバンドが認められたが、増幅反応液２では、すべての反応液でバンドが認められなかった。
　したがって、第３及び第４のプライマーを加えることで、効率よく等温増幅反応がおこり、標的核酸が増幅され、核酸クロマトフラフィーで検出されることがわかった。なお、増幅反応液１において、第５及び第６のプライマー（アウタープライマーセット）を用いない増幅反応液を別途調製して、アウタープライマーセットの影響について確認したところ、増幅反応液１と同程度の検出感度を確認できた。
　本明細書に開示される特許文献及び非特許文献に記載される全内容は、参照により本明細書の組み込まれるものとする。
配列表フリーテキスト
配列番号１～１１３：合成オリゴヌクレオチド

Claims (16)

  1. 　標的核酸の増幅産物の生産方法であって、
    　第１のプライマー、第２のプライマー及び鎖置換活性を有する核酸ポリメラーゼ、を用いて、前記標的核酸を含む可能性のある被験試料に対して核酸増幅反応を実施する増幅工程、
    を備え、
    　前記増幅工程は、前記標的核酸の二本鎖の解離を促進可能な２以上のオリゴヌクレオチドを用いる工程である、生産方法。
  2. 　前記２以上のオリゴヌクレオチドは、第１の鋳型鎖上において前記第１のプライマーがハイブリダイズする第１のハイブリダイズ領域及び第２の鋳型鎖上において前記第２のプライマーがハイブリダイズする第２のハイブリダイズ領域のそれぞれ近傍において、前記第１の鋳型鎖及び前記第２の鋳型鎖の少なくとも一方に対するハイブリダイゼーションを介して存在可能に構成されている、請求項１に記載の生産方法。
  3. 　前記２以上のオリゴヌクレオチドは、前記第１のハイブリダイズ領域の近傍で前記第２の鋳型鎖にハイブリダイズする第３のプライマーと、前記第２のハイブリダイズ領域の近傍で前記第１の鋳型鎖にハイブリダイズする第４のプライマーと、を含む、請求項１又は２に記載の生産方法。
  4. 　前記第３のプライマーは、前記第１のハイブリダイズ領域よりも前記標的核酸の内側で前記第２の鋳型鎖にハイブリダイズし、
    　前記第４のプライマーは、前記第２のハイブリダイズ領域よりも前記標的核酸の内側で前記第１の鋳型鎖にハイブリダイズする、請求項３に記載の生産方法。
  5. 　前記２以上のオリゴヌクレオチドは、前記第１のプライマーの５’末端側に備えられ、核酸増幅反応に対して独立である第１のタグと、前記第２のプライマーの５’末端側に備えられ、核酸増幅反応に対して独立である第２のタグと、を含む、請求項１～４のいずれかに記載の生産方法。
  6. 　前記第１のプライマーは、前記第１のタグを、スペーサを介して備え、前記第２のプライマーは、前記第２のタグを、スペーサを介して備える、請求項５に記載の生産方法。
  7. 　前記スペーサは、前記鎖置換活性を有する核酸ポリメラーゼによる核酸合成反応を抑制又は停止可能である、請求項６に記載の生産方法。
  8. 　前記第１及び前記第２のプライマーの少なくとも一方が、標識要素を備える、請求項１～７のいずれかに記載の生産方法。
  9. 　前記標識要素は、標識物質又は標識物質結合物質である、請求項８に記載の生産方法。
  10. 　前記増幅工程を、実質的な温度変化を伴うことなく実施する、請求項１～９のいずれかに記載の生産方法。
  11. 　標的核酸の検出方法であって、
    　第１のプライマー、第２のプライマー及び鎖置換活性を有する核酸ポリメラーゼ、を用いて、前記標的核酸を含む可能性のある被験試料に対して核酸増幅反応を実施する増幅工程と、
    　前記増幅工程で得られる増幅産物の少なくとも一部を介して前記標的核酸を検出する工程と、
    を備え、
    　前記増幅工程は、前記標的核酸の二本鎖の解離を促進可能な２以上のオリゴヌクレオチドを用いる工程である、検出方法。
  12. 　前記検出工程は、前記増幅産物の前記少なくとも一部を介してクロマトグラフィーによって分離することを含む、請求項１１に記載の検出方法。
  13. 　前記検出工程は、前記増幅産物の一部にハイブリダイズするインナープライマーを用いて前記標的核酸に標識要素を付与することを含む、請求項１１に記載の検出方法。
  14. 　標的核酸を増幅するためのキットであって、
    　第１のプライマーと
    　第２のプライマーと、
    　前記標的核酸の二本鎖の解離を促進可能な２以上のオリゴヌクレオチドと、
    を備える、キット。
  15. 　前記２以上のオリゴヌクレオチドは、第１の鋳型鎖上において前記第１のプライマーがハイブリダイズする第１のハイブリダイズ領域及び第２の鋳型鎖上において前記第２のプライマーがハイブリダイズする第２のハイブリダイズ領域のそれぞれ近傍において、前記第１の鋳型鎖及び前記第２の鋳型鎖の少なくとも一方に対するハイブリダイゼーションを介して存在可能に構成されている、請求項１４に記載のキット。
  16. 　標的核酸を検出するためのキットであって、
    　第１のプライマーと
    　第２のプライマーと、
    　前記標的核酸の二本鎖の解離を促進可能な２以上のオリゴヌクレオチドと、
    を備える、キット。
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