JP2017042112A - 核酸増幅基板、該基板を用いた核酸増幅方法、及び核酸検出キット - Google Patents
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Abstract
【課題】簡便でありながら、配列特異際の優れた核酸増幅基板、該基板を用いた核酸増幅方法、及び核酸検出キットを提供する。【解決手段】本発明は、基板および該基板に固定されたプローブを備えた核酸増幅基板であって、前記プローブは、前記基板に固定された第１のオリゴ核酸と、５’末端領域に前記第１のオリゴ核酸にハイブリダイズし得る配列からなる核酸Ａと、３’末端領域に標的核酸増幅用のフォワードプライマーとなり得る配列からなる核酸Ｂと、を備え、少なくとも前記核酸Ａにブリッジド核酸を含む第２のオリゴ核酸と、を有することを特徴とする核酸増幅基板である。【選択図】なし
Description
本発明は、核酸増幅基板、該基板を用いた核酸増幅方法、及び核酸検出キットに関する。
従来、細胞内の遺伝子発現量を測定する手段としてｍＲＮＡをターゲットとしたＤＮＡマイクロアレイが広く用いられている。あらかじめ塩基配列の明らかな１本鎖のＤＮＡを多種、基板上に配置しておき、これに検体を反応させれば、検体のＤＮＡ配列と相補的な塩基配列の部分にのみ検体のＤＮＡ鎖が結合する。結合位置を蛍光や電流によって検出し、最初の配置から検体に含まれるＤＮＡ配列を知る事が出来る。検体の塩基配列が予測できる場合には、効率的にその配列が特定できる。
ＤＮＡマイクロアレイには技術内容により、以下の２つの方式が存在する。
一つ目は、Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社のＧｅｎｅＣｈｉｐであり、フォトリソグラフィ技術と固相反応化学技術を使用して、基板上で２０−２５ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを人工的に合成することにより作成される。このオリゴヌクレオチドは、あらかじめ遺伝子の特異的な塩基配列を特定するためにコンピュータを用いて位置や長さなどがデザインされている。特定遺伝子と完全に相補的になるようデザインされたプローブパーフェクトマッチ（ＰＭ）だけでなく、ミスマッチ（ＭＭ）と呼ばれる非特異的な塩基配列もプローブとして配置することによって、非特異的なクロスハイブリダイゼーションの定量値をシグナル値から減算できる。このマイクロアレイを利用する場合、１種類のサンプルからｍＲＮＡを抽出し、逆転写によって合成したｃＤＮＡをビオチン標識して、基板上のＤＮＡとハイブリダイゼーションを行い、Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社製の専用スキャナーで蛍光強度を読み取る。この蛍光色素に特有の波長を持つ光を照射し、発光量の割合を測定することで、ｍＲＮＡの発現量を計測することができる（例えば、特許文献１参照）。
一つ目は、Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社のＧｅｎｅＣｈｉｐであり、フォトリソグラフィ技術と固相反応化学技術を使用して、基板上で２０−２５ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを人工的に合成することにより作成される。このオリゴヌクレオチドは、あらかじめ遺伝子の特異的な塩基配列を特定するためにコンピュータを用いて位置や長さなどがデザインされている。特定遺伝子と完全に相補的になるようデザインされたプローブパーフェクトマッチ（ＰＭ）だけでなく、ミスマッチ（ＭＭ）と呼ばれる非特異的な塩基配列もプローブとして配置することによって、非特異的なクロスハイブリダイゼーションの定量値をシグナル値から減算できる。このマイクロアレイを利用する場合、１種類のサンプルからｍＲＮＡを抽出し、逆転写によって合成したｃＤＮＡをビオチン標識して、基板上のＤＮＡとハイブリダイゼーションを行い、Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社製の専用スキャナーで蛍光強度を読み取る。この蛍光色素に特有の波長を持つ光を照射し、発光量の割合を測定することで、ｍＲＮＡの発現量を計測することができる（例えば、特許文献１参照）。
二つ目は、Ｓｔａｎｆｏｒｄ大学により開発された、あらかじめ調製したＤＮＡを高精度分注機で基板にスポットし、高密度ＤＮＡチップを製造する技術を活用したＤＮＡマイクロアレイである。スポット方法にはピン先端の固相への機械的な接触によるピン方式、インクジェットプリンターの原理を利用したインクジェット方式、スポッター内に加熱によって泡を生じさせ、その圧力を利用してサンプルを噴出させるバブルジェット（登録商標）方式、毛細管によるキャピラリー方式などがある。近年は、ｃＤＮＡ断片を打ち付ける方式よりも、Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社の方法と同様にコンピュータ上で遺伝子の特異的な配列をデザインした２５ｍｅｒ−６０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを高密度に配置したタイプが主流となっている。このマイクロアレイを利用する場合、２種類の異なるサンプルからｍＲＮＡを抽出し、逆転写によって合成したｃＤＮＡを、それぞれ異なる蛍光色素で標識することによってターゲットを調製する。蛍光色素は通常、Ｃｙ３（緑）、Ｃｙ５（赤）が利用されており、この２つの試料をガラス基板上で競合的にプローブとハイブリダイゼーションさせて、スキャナーで蛍光強度を検出する（例えば、特許文献２参照）。
ところで、天然核酸（ＤＮＡやＲＮＡ）は化学構造上、形の自由度（コンホメーションの自由度）が大きく、主として、Ａ型と呼ばれているコンフォメーションとＢ型コンフォメーションとの平衡状態で存在している。そのためにＤＮＡ−ＤＮＡ，ＤＮＡ−ＲＮＡ，ＲＮＡ−ＲＮＡ間の二重鎖形成（ハイブリダイズ）では熱力学的に不利となっており、結合親和性（ハイブリダイズ能）に改善の余地が残されている。
天然核酸分子を架橋構造化した人工の合成核酸であるブリッジド核酸は、天然核酸の「形の自由度」を束縛して標的となるＤＮＡやＲＮＡに対する結合親和性を高め、さらにヌクレアーゼ（核酸分解酵素）耐性をも獲得したものである。
これらの人工核酸ＢＮＡを天然オリゴヌクレオチド中に組み入れたＢＮＡ含有オリゴ核酸は、一本鎖ＤＮＡやＲＮＡのみならず、二本鎖ＤＮＡに対して選択的で高い結合親和性を有する。特に、本発明者らが開発した３’−ａｍｉｎｏ−２’，４’−ＢＮＡ、５’−ａｍｉｎｏ−２’，４’−ＢＮＡ、２’，４’−ＢＮＡＣＯＣ、２’，４’−ＢＮＡＮＣなどの第２世代以降のＢＮＡ類を含有するオリゴ核酸は、一本鎖ＲＮＡ及び二本鎖ＤＮＡに対して卓越した結合親和性を獲得した優れた人工核酸であり、ヌクレア−ゼ耐性も非常に高い特性を有する（例えば、特許文献３参照）。
天然核酸分子を架橋構造化した人工の合成核酸であるブリッジド核酸は、天然核酸の「形の自由度」を束縛して標的となるＤＮＡやＲＮＡに対する結合親和性を高め、さらにヌクレアーゼ（核酸分解酵素）耐性をも獲得したものである。
これらの人工核酸ＢＮＡを天然オリゴヌクレオチド中に組み入れたＢＮＡ含有オリゴ核酸は、一本鎖ＤＮＡやＲＮＡのみならず、二本鎖ＤＮＡに対して選択的で高い結合親和性を有する。特に、本発明者らが開発した３’−ａｍｉｎｏ−２’，４’−ＢＮＡ、５’−ａｍｉｎｏ−２’，４’−ＢＮＡ、２’，４’−ＢＮＡＣＯＣ、２’，４’−ＢＮＡＮＣなどの第２世代以降のＢＮＡ類を含有するオリゴ核酸は、一本鎖ＲＮＡ及び二本鎖ＤＮＡに対して卓越した結合親和性を獲得した優れた人工核酸であり、ヌクレア−ゼ耐性も非常に高い特性を有する（例えば、特許文献３参照）。
特許文献１および２に記載されているＤＮＡマイクロアレイでは、スポットするオリゴヌクレオチドを標的とする核酸によって変える必要があり、大量生産に不向きであり、オーダーメイド対応が難しい。
さらに、特許文献３に記載されているような、ブリッジド核酸を含有するオリゴヌクレオチドをスポットしたＤＮＡチップの開発も進められているが、これも先ほどと同様にスポットするオリゴヌクレオチドを標的とする核酸によって変える必要があり、大量生産に不向きであり、オーダーメイド対応が難しい。
また、標的となるｍＲＮＡを鋳型とした逆転写反応と、該逆転写反応において作製されたｃＤＮＡの検出を別の工程において行うため、操作が煩雑となり、コンタミネーションのリスクがある。
さらに、特許文献３に記載されているような、ブリッジド核酸を含有するオリゴヌクレオチドをスポットしたＤＮＡチップの開発も進められているが、これも先ほどと同様にスポットするオリゴヌクレオチドを標的とする核酸によって変える必要があり、大量生産に不向きであり、オーダーメイド対応が難しい。
また、標的となるｍＲＮＡを鋳型とした逆転写反応と、該逆転写反応において作製されたｃＤＮＡの検出を別の工程において行うため、操作が煩雑となり、コンタミネーションのリスクがある。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、簡便でありながら、配列特異性の優れた核酸増幅基板、該基板を用いた核酸増幅方法、及び核酸検出キットを提供することを目的とする。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ブリッジド核酸を含むプローブを固定化した核酸増幅基板を用いることで、課題を解決できることを見出した。
すなわち、本発明は、下記（１）〜（１４）を提供するものである。
（１）基板および該基板に固定されたプローブを備えた核酸増幅基板であって、前記プローブは、
前記基板に固定された第１のオリゴ核酸と、
５’末端領域に前記第１のオリゴ核酸にハイブリダイズし得る配列からなる核酸Ａと、３’末端領域に標的核酸増幅用のフォワードプライマーとなり得る配列からなる核酸Ｂと、を備え、少なくとも前記核酸Ａにブリッジド核酸を含む第２のオリゴ核酸と、
を有することを特徴とする核酸増幅基板。
（２）前記基板は１つ以上の区画を有し、１つの区画には１種類の前記プローブが１つ以上固定される（１）に記載の核酸増幅基板。
（３）前記第２のオリゴ核酸中のブリッジド核酸の割合が、６６％以上である（１）又は（２）に記載の核酸増幅基板。
（４）前記基板に固定された第１のオリゴ核酸がＤＮＡである（１）〜（３）のいずれか一つに記載の核酸増幅基板。
（５）前記標的核酸がｇＤＮＡ又はｃＤＮＡである（１）〜（４）のいずれか一つに記載の核酸増幅基板。
（１）基板および該基板に固定されたプローブを備えた核酸増幅基板であって、前記プローブは、
前記基板に固定された第１のオリゴ核酸と、
５’末端領域に前記第１のオリゴ核酸にハイブリダイズし得る配列からなる核酸Ａと、３’末端領域に標的核酸増幅用のフォワードプライマーとなり得る配列からなる核酸Ｂと、を備え、少なくとも前記核酸Ａにブリッジド核酸を含む第２のオリゴ核酸と、
を有することを特徴とする核酸増幅基板。
（２）前記基板は１つ以上の区画を有し、１つの区画には１種類の前記プローブが１つ以上固定される（１）に記載の核酸増幅基板。
（３）前記第２のオリゴ核酸中のブリッジド核酸の割合が、６６％以上である（１）又は（２）に記載の核酸増幅基板。
（４）前記基板に固定された第１のオリゴ核酸がＤＮＡである（１）〜（３）のいずれか一つに記載の核酸増幅基板。
（５）前記標的核酸がｇＤＮＡ又はｃＤＮＡである（１）〜（４）のいずれか一つに記載の核酸増幅基板。
（６）（１）〜（５）のいずれか一つに記載の核酸増幅基板を用いた核酸増幅方法。
（７）プローブが固定された基板および標的核酸増幅用のリバースプライマーを備えた核酸検出キットであって、前記プローブは、
前記基板に固定された第１のオリゴ核酸と、
５’末端領域に前記核酸にハイブリダイズし得る配列からなる核酸Ａと、３’末端領域に標的核酸増幅用のフォワードプライマーとなり得る配列からなる核酸Ｂと、を備え、少なくとも核酸Ａにブリッジド核酸を含む第２のオリゴ核酸と、
を有することを特徴とする核酸検出キット。
（８）前記第２のオリゴ核酸中のブリッジド核酸の割合が、６６％以上である（７）に記載の核酸検出キット。
（９）前記基板に固定された第１のオリゴ核酸がＤＮＡである（７）又は（８）に記載の核酸検出キット。
（１０）前記標的核酸がｇＤＮＡ又はｃＤＮＡである（７）〜（９）のいずれか一つに記載の核酸検出キット。
（７）プローブが固定された基板および標的核酸増幅用のリバースプライマーを備えた核酸検出キットであって、前記プローブは、
前記基板に固定された第１のオリゴ核酸と、
５’末端領域に前記核酸にハイブリダイズし得る配列からなる核酸Ａと、３’末端領域に標的核酸増幅用のフォワードプライマーとなり得る配列からなる核酸Ｂと、を備え、少なくとも核酸Ａにブリッジド核酸を含む第２のオリゴ核酸と、
を有することを特徴とする核酸検出キット。
（８）前記第２のオリゴ核酸中のブリッジド核酸の割合が、６６％以上である（７）に記載の核酸検出キット。
（９）前記基板に固定された第１のオリゴ核酸がＤＮＡである（７）又は（８）に記載の核酸検出キット。
（１０）前記標的核酸がｇＤＮＡ又はｃＤＮＡである（７）〜（９）のいずれか一つに記載の核酸検出キット。
本発明の核酸増幅基板および該基板を用いた核酸増幅方法によれば、簡便に標的核酸を高選択的に増幅することができる。また、本発明の核酸検出キットによれば、簡便に標的核酸を高感度、高精度に検出できる。
＜核酸増幅基板＞
１．第一実施形態
図１は、本発明に係る核酸増幅基板の第１実施形態の模式図である。本実施形態の核酸増幅基板１０は、基板１および基板１に固定されたプローブ２を備えた核酸増幅基板であって、プローブ２は、基板１に固定された第１のオリゴ核酸３と、５’末端領域に第１のオリゴ核酸にハイブリダイズし得る配列からなる核酸Ａ（核酸５）と、３’末端領域に標的核酸増幅用のフォワードプライマーとなり得る配列からなる核酸Ｂ（核酸６）と、を有し、少なくとも核酸Ａ（核酸５）にブリッジド核酸を含む第２のオリゴ核酸４と、を有する。
１．第一実施形態
図１は、本発明に係る核酸増幅基板の第１実施形態の模式図である。本実施形態の核酸増幅基板１０は、基板１および基板１に固定されたプローブ２を備えた核酸増幅基板であって、プローブ２は、基板１に固定された第１のオリゴ核酸３と、５’末端領域に第１のオリゴ核酸にハイブリダイズし得る配列からなる核酸Ａ（核酸５）と、３’末端領域に標的核酸増幅用のフォワードプライマーとなり得る配列からなる核酸Ｂ（核酸６）と、を有し、少なくとも核酸Ａ（核酸５）にブリッジド核酸を含む第２のオリゴ核酸４と、を有する。
本実施形態における標的核酸としては、特に限定されないが、ｇＤＮＡ又はｃＤＮＡ等の安定なＤＮＡが好ましい。ｇＤＮＡとは、「ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ」の略称であり、主に核内のＤＮＡを意味する。ｃＤＮＡとは、「ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ」の略称であり、ｍＲＮＡから逆転写酵素を用いた逆転写反応によって合成されたＤＮＡを意味する。ｇＤＮＡにおいては、イントロンとエクソンを有するため、塩基配列から作られるタンパク質のアミノ酸配列を推定することは困難であるが、ｃＤＮＡはエクソンのみを有するため、塩基配列からタンパク質のアミノ酸配列を推定することは容易である。
基板としては、特に限定されないが、ＰＣＲ反応を行うため耐熱性を有する素材で作られた基板であることが好ましく、例えば、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板等が挙げられる。
図２は、本発明に係る核酸増幅基板上の区画の一例を示した模式図である。本実施形態の核酸増幅基板３０において、基板１は１つ以上の区画を有し、１つの区画には１種類のプローブ２が１つ以上固定されている。基板１上に同じ種類のプローブが複数固定されていることにより、標的核酸を効率的に増幅することが可能となる。また、プローブが基板上に固定化されているため、増幅された標的核酸を区画内に保持することが可能となる。
また、従来では基板上に固定化する核酸と標的核酸を特異的に認識する核酸は同一であり、区画ごとに異なる塩基配列からなる核酸を固定する必要があったため、大量生産には不向きであり、オーダーメイド対応することが困難であった。
しかしながら、本実施形態では、標的核酸を特異的に認識し増幅するのは第２のオリゴ核酸の役割であるため、第１のオリゴ核酸３は統一規格化された塩基配列からなるものを基板１上に固定化することができ、第１のオリゴ核酸３が固定化された基板１を容易に大量生産することが可能となる。また、使用する第２のオリゴ核酸を変更することで容易にオーダーメイド対応することが可能となる。
また、従来では基板上に固定化する核酸と標的核酸を特異的に認識する核酸は同一であり、区画ごとに異なる塩基配列からなる核酸を固定する必要があったため、大量生産には不向きであり、オーダーメイド対応することが困難であった。
しかしながら、本実施形態では、標的核酸を特異的に認識し増幅するのは第２のオリゴ核酸の役割であるため、第１のオリゴ核酸３は統一規格化された塩基配列からなるものを基板１上に固定化することができ、第１のオリゴ核酸３が固定化された基板１を容易に大量生産することが可能となる。また、使用する第２のオリゴ核酸を変更することで容易にオーダーメイド対応することが可能となる。
図１に示すように、プローブ２は第１のオリゴ核酸３及び第２のオリゴ核酸４からなる。さらに、第２のオリゴ核酸４は、５’末端領域に第１のオリゴ核酸にハイブリダイズし得る配列からなる核酸Ａ（核酸５）と、３’末端領域に標的核酸増幅用のフォワードプライマーとなり得る配列からなる核酸Ｂ（核酸６）と、を有する。
なお、本発明および本願明細書において、「ハイブリダイズし得る」とは、本発明に用いられるプライマーやプローブ等の一方の核酸が、ストリジェントな条件下で標的核酸等の他方の核酸にハイブリダイズし、他方の核酸以外の核酸分子にはハイブリダイズしないことを意味する。「ストリンジェントな条件」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＳＥＣＯＮＤ ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に記載の条件が挙げられる。また、一方の核酸が他方の核酸にハイブリダイズし得る場合、一方の核酸は、他方の核酸を構成する塩基配列と相補的な塩基配列と、相同性（塩基配列の同一性）が好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さら好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である塩基配列からなる。
本実施形態において、第１のオリゴ核酸３は、特に限定はないが、標的核酸を高選択的に増幅する観点から、標的核酸とハイブリダイズしないように標的核酸と相補的な配列を有さないことが好ましい。また、第１のオリゴ核酸３は、ＤＮＡまたはＲＮＡであれば特に限定されず、天然のものであっても合成されたものであってもよいが、ＤＮＡであることが好ましい。
第１のオリゴ核酸３において、第２のオリゴ核酸４中の核酸Ａ（核酸５）と相補的な塩基配列からなる核酸３ａの長さは１３塩基以上が好ましく、１８塩基以上がさらに好ましい。また、第２のオリゴ核酸４中の核酸Ｂ（核酸６）が、標的核酸とハイブリダイズするためには、分子的な自由度が必要であることから、第１のオリゴ核酸３中の基板に固定された核酸３ｂの長さは、特に限定されないが、３〜５０塩基が好ましく、５〜２５塩基がより好ましい。
第１のオリゴ核酸３において、第２のオリゴ核酸４中の核酸Ａ（核酸５）と相補的な塩基配列からなる核酸３ａの長さは１３塩基以上が好ましく、１８塩基以上がさらに好ましい。また、第２のオリゴ核酸４中の核酸Ｂ（核酸６）が、標的核酸とハイブリダイズするためには、分子的な自由度が必要であることから、第１のオリゴ核酸３中の基板に固定された核酸３ｂの長さは、特に限定されないが、３〜５０塩基が好ましく、５〜２５塩基がより好ましい。
本実施形態において、核酸Ａ（核酸５）はブリッジド核酸を含むことが好ましい。また、核酸Ｂ（核酸６）は、ブリッジド核酸を含んでいてもかまわない。本発明および本願明細書において、「ブリッジド核酸」とは、糖の２’位と４’位を架橋しコンフォメーションをＮ型に固定した人工核酸を示し、天然の核酸にみられるＮ型とＳ型のコンフォメーション変換を抑えることができる。具体的には、２’，４’−ＢＮＡ（ＬＮＡ）の第１世代ＢＮＡ類が好ましく、３’−ａｍｉｎｏ−２’，４’−ＢＮＡ、５’−ａｍｉｎｏ−２’，４’−ＢＮＡ、２’，４’−ＢＮＡＣＯＣなどの第２世代ＢＮＡ類がより好ましく、２’，４’−ＢＮＡＮＣなどの第３世代ＢＮＡ類がさらに好ましい。
また、ブリッジド核酸は、天然の核酸と比較してＴｍ値（二本鎖ＤＮＡの５０%がかい離して一本鎖ＤＮＡになる温度の値）が、１〜３℃高い。さらに、ブリッジド核酸はハイブリダイズし得る配列を有する核酸との親和性が高く、ＤＮＡ分解酵素やＲＮＡ分解酵素に認識されにくい。
このため、核酸Ａ（核酸５）中にブリッジド核酸を含むことで、第１のオリゴ核酸３および第２のオリゴ核酸４のハイブリダイズは耐熱性および優れた親和性を有する。また、核酸Ｂ（核酸６）がブリッジド核酸を含む場合においては、標的核酸と選択的にハイブリダイズし、増幅させることができる。
また、核酸Ａ（核酸５）の長さは、第１のオリゴ核酸３中の核酸３ａと同様に、１３塩基以上が好ましく、１８塩基以上がさらに好ましい。
また、ブリッジド核酸は、天然の核酸と比較してＴｍ値（二本鎖ＤＮＡの５０%がかい離して一本鎖ＤＮＡになる温度の値）が、１〜３℃高い。さらに、ブリッジド核酸はハイブリダイズし得る配列を有する核酸との親和性が高く、ＤＮＡ分解酵素やＲＮＡ分解酵素に認識されにくい。
このため、核酸Ａ（核酸５）中にブリッジド核酸を含むことで、第１のオリゴ核酸３および第２のオリゴ核酸４のハイブリダイズは耐熱性および優れた親和性を有する。また、核酸Ｂ（核酸６）がブリッジド核酸を含む場合においては、標的核酸と選択的にハイブリダイズし、増幅させることができる。
また、核酸Ａ（核酸５）の長さは、第１のオリゴ核酸３中の核酸３ａと同様に、１３塩基以上が好ましく、１８塩基以上がさらに好ましい。
また、第２のオリゴ核酸４中のブリッジド核酸の割合が、６１％以上であることが好ましく、６６％以上であることがより好ましい。さらに、第２のオリゴ核酸４において、核酸Ａ（核酸５）中のブリッジド核酸の割合が、６１％以上であることが好ましく、６６％以上であることがより好ましい。たとえば、１８塩基中１２塩基のブリッジド核酸を含むオリゴ核酸の場合、Ｔｍ値は９５℃となる。上述の通り、天然の核酸と比較してＴｍ値が高いことで、ブリッジド核酸を含む核酸Ａ（核酸５）および第１のオリゴ核酸３中の核酸３ａのハイブリダイズは高い親和性を有し、プローブ２全体を基板１上に固定することができる。
「標的核酸増幅用のフォワードプライマーになり得る」とは、標的核酸に相補的な配列を有し、特異的にハイブリダイズし、さらに核酸合成酵素による標的核酸の伸長反応における起点になることが可能であることを意味する。したがって、核酸Ｂの長さは、標的核酸増幅用のフォワードプライマーとしての観点から、５〜４０塩基が好ましく、１５〜３０塩基がより好ましく、１８〜２５塩基が特に好ましい。また、増幅する際に使用する標的核酸増幅用のリバースプライマーとＴｍ値が大きく異ならないことが好ましい。さらに、全体的に塩基の偏りがなく、部分的に、特に３’末端領域において、ＧＣリッチあるいはＡＴリッチな配列は避けることが好ましい。さらに、プライマー内部およびリバースプライマーとの間での３塩基以上の相補的配列を避け、３’末端領域が２塩基以上相補する配列を避けることが好ましい。
本実施形態の核酸増幅基板によれば、容易に標的核酸を増幅することができ、さらに増幅後の標的核酸を基板上に維持したまま検出工程を行うことができる。
＜核酸増幅方法＞
次に、本発明の核酸増幅基板を用いた核酸増幅方法について、詳細に説明する。まず、標的核酸を含む核酸試料と、核酸増幅反応液と、を核酸増幅基板に接触させる。
次に、本発明の核酸増幅基板を用いた核酸増幅方法について、詳細に説明する。まず、標的核酸を含む核酸試料と、核酸増幅反応液と、を核酸増幅基板に接触させる。
本発明において、「標的核酸を含む核酸試料」とは、増幅が所望される核酸を含むと想定されるものであれば特に限定されない。変異を有する核酸の増幅を目的とする場合は、変異を有する核酸を含むと想定されるものであれば特に限定されない。核酸試料は、典型的には、哺乳動物、好ましくはヒトから採取可能なものであり、血液、胸水、気管支洗浄液、骨髄液、リンパ液等の液体試料、リンパ節、血管、骨髄、脳、脾臓、皮膚等の固形試料が挙げられる。本発明の方法は非常に高い選択性で核酸を増幅し得るため、例えば癌等の病変部位から試料を直接採取することなく、血液等の核酸試料が微量しか含まれない液体試料を用いることが可能である。そのため、好ましい核酸試料としては、血液等の液体試料である。
また、本発明の核酸増幅方法において、反応液中の標的核酸の含有量は、１０２〜１０６分子に相当する量含まれていることが好ましく、例えば、ヒトの遺伝子では０．３ｎｇ〜３μｇ程度である。標的核酸の量が多すぎると非特異的増幅の頻度が増すので、標的核酸の含有量は、１００μＬあたり０．５μｇ以下に抑えることが好ましい。
また、本発明の核酸増幅方法において、反応液中の標的核酸の含有量は、１０２〜１０６分子に相当する量含まれていることが好ましく、例えば、ヒトの遺伝子では０．３ｎｇ〜３μｇ程度である。標的核酸の量が多すぎると非特異的増幅の頻度が増すので、標的核酸の含有量は、１００μＬあたり０．５μｇ以下に抑えることが好ましい。
本発明において、「核酸増幅用反応液」とは、前記核酸増幅反応を行う上で必要な試薬等を含有する溶液である。核酸増幅用反応液の組成は、使用する核酸増幅方法によって異なるが、例えば、基質としての４種のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ：以下まとめてｄＮＴＰとする）と、酵素としてＤＮＡポリメラーゼと、前記酵素の補因子としてのマグネシウムイオンと、伸長増幅用のリバースプライマーと、を反応液中に含むことが挙げられる。また、詳細は後述するが、本工程と、増幅された核酸を検出する工程とを一括して行うことができるリアルタイムＰＣＲ法等の方法を核酸増幅方法として用いる場合は、インターカレーター、蛍光標識プローブ、サイクリングプローブ等の適当な検出用試薬も核酸増幅用反応液中に共存させる。ｄＮＴＰの濃度は、４種の各終濃度が１００〜４００μＭの範囲で最適な濃度を検討すればよい。ＤＮＡポリメラーゼは、用いる核酸増幅方法に適する性質を有したものを使用する。例えば、ＰＣＲ法であれば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、その他バイオサイエンス関連の各社により開発されたもの等の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが好ましく使用される。マグネシウムイオン濃度は、終濃度が１〜６ｍＭの範囲で最適な濃度を検討すればよい。前記反応液は、前記ＤＮＡポリメラーゼの活性が得られる至適ｐＨおよび至適塩濃度を有する。さらに、使用する核酸増幅方法によって、さらに、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅＨ）や逆転写酵素（ＲＴ）などを含んでいてもよい。
次に、標的核酸に、核酸増幅基板に固定されたプローブ中の標的核酸増幅用のフォワードプライマーとなり得る配列からなる核酸Ｂおよび標的核酸増幅用のリバースプライマーをハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼにより標的核酸の伸長反応が進む。核酸Ｂとリバースプライマーは対になって、標的核酸を増幅する。リバースプライマーの長さは、核酸Ｂと同様に、５〜４０塩基が好ましく、１５〜３０塩基がより好ましく、１８〜２５塩基が特に好ましい。
また、核酸増幅効率の観点から、標的核酸増幅用のフォワードプライマーとなり得る配列からなる核酸Ｂおよび標的核酸増幅用のリバースプライマーは、増幅産物の塩基数が５０〜１０００となるように設計されることが好ましく、５０〜３００となるように設計されることがより好ましい。また、標的核酸増幅用のフォワードプライマーとなり得る配列からなる核酸Ｂおよび標的核酸増幅用のリバースプライマーのＴｍ値は、５０〜６６℃であることが好ましく、５５〜６０℃であることが好ましい。なお、核酸Ｂが、少なくとも１塩基の変異を認識し、ブリッジド核酸を含む核酸Ｃを有する場合には、ブリッジド核酸１塩基に対して１〜３℃高くなるため、Ｔｍ値はブリッジド核酸の数に応じて通常のプライマーの温度よりも高くなる。
また、核酸増幅効率の観点から、標的核酸増幅用のフォワードプライマーとなり得る配列からなる核酸Ｂおよび標的核酸増幅用のリバースプライマーは、増幅産物の塩基数が５０〜１０００となるように設計されることが好ましく、５０〜３００となるように設計されることがより好ましい。また、標的核酸増幅用のフォワードプライマーとなり得る配列からなる核酸Ｂおよび標的核酸増幅用のリバースプライマーのＴｍ値は、５０〜６６℃であることが好ましく、５５〜６０℃であることが好ましい。なお、核酸Ｂが、少なくとも１塩基の変異を認識し、ブリッジド核酸を含む核酸Ｃを有する場合には、ブリッジド核酸１塩基に対して１〜３℃高くなるため、Ｔｍ値はブリッジド核酸の数に応じて通常のプライマーの温度よりも高くなる。
本発明の核酸増幅方法としては、標的核酸を増幅できるものである限り制限されない。例えば、ＰＣＲ法（最も基本的な原理に基づくＰＣＲ法のみならず、それを基にして開発された、ホットスタートＰＣＲ法、マルチプレックスＰＣＲ法、ネステッドＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、デジタルＰＣＲ法などの定量ＰＣＲ法等の様々なバリエーションを含む）、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（例えば、特許第２６５０１５９号公報参照）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（例えば、特許第３２４１７１７号公報参照）、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法（例えば、特開２０００−１４４００号公報参照）、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（例えば、国際公開第２０００／２８０８２号参照）、ＩＣＡＮ法（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）法（例えば、特許第３４３３９２９号公報参照）、ＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法（例えば、欧州特許出願番号３２０３２８号参照）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（例えば、特公平７−１１４７１８号公報参照）、等を用いることができる。ＰＣＲ法は最も広く用いられている核酸増幅方法であることから当該方法に最適化された様々な試薬や機器が容易に入手できるだけでなく、上記の通り様々なバリエーションの方法があり、汎用性が極めて高いため、本工程のために好適な手法として挙げられる。ＰＣＲを含む核酸増幅反応の条件、操作等は、この分野で通常行われている常法に従えばよい。
図３は、本実施形態における核酸増幅基板を用いた核酸増幅方法の模式図である。図３に示すように、標的核酸のセンス鎖の３’末端領域に標的核酸増幅用のフォワードプライマーとなり得る配列からなる核酸Ｂ（核酸６）がアニール（ハイブリダイズ）し（図３（ａ）参照）、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長反応が行われ、標的核酸の増幅産物Ｘ（増幅産物９）が合成される（図３（ｂ）参照）。また、標的核酸のアンチセンス鎖の３’末端領域に標的核酸増幅用のリバースプライマーがアニールし（図３（ａ）参照）、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長反応が行われ、標的核酸の増幅産物Ｙ（増幅産物１１）が合成される（図３（ｂ）参照）。
次いで、標的核酸のセンス鎖の３’末端領域に標的核酸増幅用のフォワードプライマーとなり得る配列からなる核酸Ｂ（核酸６）がアニール（ハイブリダイズ）し、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長反応が行われ、標的核酸の増幅産物Ｘ（増幅産物９）が合成される（図３（ｃ）参照）。また、標的核酸のアンチセンス鎖の３’末端領域に標的核酸増幅用のリバースプライマーがアニールし、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長反応が行われ、標的核酸の増幅産物Ｙ（増幅産物１１）が合成される（図３（ｃ）参照）。
以後、標的核酸の増幅産物Ｘが合成される工程と、増幅産物Ｙが合成される工程と、を繰り返すことにより、標的核酸の増幅産物が多数得られる。
核酸増幅反応終了後、標的核酸の増幅産物Ｘ（増幅産物９）は、５’末端領域に第２のオリゴ核酸４を有し、この第２のオリゴ核酸４中の核酸Ａ（核酸５）はブリッジド核酸を含み、第１のオリゴ核酸３と特異的にハイブリダイズしているため、基板上に保持される（図３（ｄ）参照）。一方、標的核酸の増幅産物Ｙは遊離の状態で多数存在する（図３（ｄ）参照）。必要に応じて、後述の検出工程を実施する。
次いで、標的核酸のセンス鎖の３’末端領域に標的核酸増幅用のフォワードプライマーとなり得る配列からなる核酸Ｂ（核酸６）がアニール（ハイブリダイズ）し、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長反応が行われ、標的核酸の増幅産物Ｘ（増幅産物９）が合成される（図３（ｃ）参照）。また、標的核酸のアンチセンス鎖の３’末端領域に標的核酸増幅用のリバースプライマーがアニールし、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長反応が行われ、標的核酸の増幅産物Ｙ（増幅産物１１）が合成される（図３（ｃ）参照）。
以後、標的核酸の増幅産物Ｘが合成される工程と、増幅産物Ｙが合成される工程と、を繰り返すことにより、標的核酸の増幅産物が多数得られる。
核酸増幅反応終了後、標的核酸の増幅産物Ｘ（増幅産物９）は、５’末端領域に第２のオリゴ核酸４を有し、この第２のオリゴ核酸４中の核酸Ａ（核酸５）はブリッジド核酸を含み、第１のオリゴ核酸３と特異的にハイブリダイズしているため、基板上に保持される（図３（ｄ）参照）。一方、標的核酸の増幅産物Ｙは遊離の状態で多数存在する（図３（ｄ）参照）。必要に応じて、後述の検出工程を実施する。
本実施形態においては、標的核酸増幅用のフォワードプライマーとなり得る配列からなる核酸Ｂを有するプローブが基板上に固定されていることから、核酸の増幅および検出を閉鎖系において同時又は連続的に実施することが可能となる。したがって、増幅反応中に経時的に増幅を確認する方法が好ましい。
増幅反応中に経時的に増幅を確認する方法としては、増幅産物の増加を反映する蛍光強度の増加を経時的に検出する方法が挙げられる。具体的には、例えば、インターカレーター法（Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０，４１３−４１７（１９９２））、サイクリングプローブ法（Ｂｅｋｋａｏｕｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２０，２４０−２４８（１９９６））等のリアルタイムＰＣＲ法が挙げられ、検出の感度および精度に優れる点でサイクリングプローブ法が好ましい。リアルタイムＰＣＲ法のためには、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化した専用の装置が必要である。そのような装置としては例えば、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（ＡＢＩ社）、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＮａｎｏ（Ｒｏｃｈｅ社）等が挙げられる。
本実施形態において、図３（ｄ）に示したように、プローブ２中の核酸Ｂ（核酸６）と完全に相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸である検出用プローブ１２を用いた検出方法が好ましい。検出用プローブ１２の５’末端領域には、標識物質が結合されている。具体的には、例えばサイクリングプローブ法等において、そのような塩基配列を有するように設計された検出用プローブを用いる方法である。標識物質については、後述の核酸検出キットにおいて詳細に説明する。
本実施形態において用いられる検出用プローブ１２は、プローブ２中の核酸Ｂ（核酸６）と完全に相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸である蛍光標識プローブが好ましい。一般に、検出用プローブ１２の長さを長くすることで相補的な配列への結合力は強くなるため、ある程度の長さが必要であるが、一方で検出用プローブ１２が長くなると塩基特異性が低くなる傾向があるため、長過ぎないことが必要である。具体的な検出用プローブ１２の長さとしては、５〜４０塩基が好ましく、８〜３５塩基がより好ましく、１０〜２５塩基がさらに好ましい。また、検出用プローブ１３は、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸、またはＬＮＡやＢＮＡ等のブリッジド核酸、またはそれらの組み合わせによって構成される。上述の通り、ブリッジド核酸は相補的な配列への結合力、塩基認識力、および分解酵素耐性の点でＤＮＡやＲＮＡ等よりも優れているため、検出用プローブ１２は、ブリッジド核酸を含むことが好ましい。
「サイクリングプローブ法」とは、ＲＮＡとＤＮＡからなるキメラプローブとＲＮａｓｅ Ｈの組み合わせによる高感度な検出方法である。キメラプローブは、ＲＮＡ部分を挟んで一方が蛍光物質（リポーター）で、もう一方が蛍光を消光する物質（クエンチャー）で標識されている。このキメラプローブは、インタクトな状態ではクエンチングにより蛍光を発しないが、配列が相補的な増幅産物とハイブリッドを形成した後にＲＮａｓｅ ＨによりＲＮＡ部分が切断されると、強い蛍光を発するようになる。この蛍光強度を測定することで、増幅産物の量をモニターすることができる。サイクリングプローブのＲＮＡ付近にミスマッチが存在すると、ＲＮａｓｅ Ｈによる切断は起こらないため、一塩基の違いも認識できる非常に特異性の高い検出が可能である。
サイクリングプローブについては、適当な業者に設計・合成を委託する等して取得することができる。
サイクリングプローブについては、適当な業者に設計・合成を委託する等して取得することができる。
その他の検出方法としては、インターカレーター法が挙げられ、インターカレーターは、二本鎖核酸の塩基対間に特異的に結合して蛍光を発する試薬であり、励起光を照射すると蛍光を発する。インターカレーターに由来する蛍光強度の検出に基づいて、標的核酸の増幅産物の量を知ることができる。本実施形態においては、通常この分野で用いられる任意のインターカレーターを用いることができるが、例えば、ＳＹＢＲＴＭ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社）、エチジウムブロマイド、フルオレン等である。
よって、本実施形態の核酸増幅方法によれば、上述の大量生産可能な核酸増幅基板を用いて、核酸の増幅および検出を閉鎖系において、同時又は連続的に行うことができる。また、簡便かつ低コストで行うことができる。また、個々人にあわせた核酸増幅基板を用いた検査を行うことで、オーダーメイド治療に役立てることができる。
＜核酸検出キット＞
本実施形態の核酸検出キットは、プローブが固定された基板および標的核酸増幅用のリバースプライマーを備えた核酸検出キットであって、前記プローブは、前記基板に固定された第１のオリゴ核酸と、５’末端領域に前記第１のオリゴ核酸にハイブリダイズし得る配列からなる核酸Ａと、３’末端領域に標的核酸増幅用のフォワードプライマーとなり得る配列からなる核酸Ｂと、を有し、少なくとも前記核酸Ａにブリッジド核酸を含む第２のオリゴ核酸と、を有する。
本実施形態の核酸検出キットは、プローブが固定された基板および標的核酸増幅用のリバースプライマーを備えた核酸検出キットであって、前記プローブは、前記基板に固定された第１のオリゴ核酸と、５’末端領域に前記第１のオリゴ核酸にハイブリダイズし得る配列からなる核酸Ａと、３’末端領域に標的核酸増幅用のフォワードプライマーとなり得る配列からなる核酸Ｂと、を有し、少なくとも前記核酸Ａにブリッジド核酸を含む第２のオリゴ核酸と、を有する。
本実施形態において、標的核酸としては、特に限定されないが、ｇＤＮＡ又はｃＤＮＡ等の安定なＤＮＡが好ましい。
プローブが固定された基板は、上述の核酸増幅基板のとおりである。また、リバースプライマーについても、上述のとおり、長さは、５〜４０塩基が好ましく、１５〜３０塩基がより好ましく、１８〜２５塩基が特に好ましい。
また、核酸増幅効率の観点から、標的核酸増幅用のフォワードプライマーとなり得る配列からなる核酸Ｂおよび標的核酸増幅用のリバースプライマーは、増幅産物の塩基数が５０〜５０００となるように設計されることが好ましく、１００〜２０００となるように設計されることがより好ましい。また、標的核酸増幅用のフォワードプライマーとなり得る配列からなる核酸Ｂおよび標的核酸増幅用のリバースプライマーのＴｍ値は、５０〜６６℃であることが好ましく、５５〜６０℃であることが好ましい。なお、核酸Ｂが、少なくとも１塩基の変異を認識し、ブリッジド核酸を含む核酸Ｃを備える場合には、ブリッジド核酸１塩基に対して１〜３℃高くなるため、Ｔｍ値はブリッジド核酸の数に応じて通常のプライマーの温度よりも高くなる。
また、核酸増幅効率の観点から、標的核酸増幅用のフォワードプライマーとなり得る配列からなる核酸Ｂおよび標的核酸増幅用のリバースプライマーは、増幅産物の塩基数が５０〜５０００となるように設計されることが好ましく、１００〜２０００となるように設計されることがより好ましい。また、標的核酸増幅用のフォワードプライマーとなり得る配列からなる核酸Ｂおよび標的核酸増幅用のリバースプライマーのＴｍ値は、５０〜６６℃であることが好ましく、５５〜６０℃であることが好ましい。なお、核酸Ｂが、少なくとも１塩基の変異を認識し、ブリッジド核酸を含む核酸Ｃを備える場合には、ブリッジド核酸１塩基に対して１〜３℃高くなるため、Ｔｍ値はブリッジド核酸の数に応じて通常のプライマーの温度よりも高くなる。
さらに、本実施形態の核酸検出キットは、使用する核酸増幅方法によって異なるが、基質としてのヌクレオチド三リン酸、核酸合成酵素、増幅反応用緩衝液の１つ以上を含むことが好ましい。ヌクレオチド三リン酸は、核酸合成酵素に応じた基質（ｄＮＴＰ、ｒＮＴＰ等）である。核酸合成酵素は、使用する核酸増幅方法に応じた酵素であり、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等である。増幅反応用緩衝液としては、例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられ、ｐＨも特に限定されない。
増幅産物の標識は、あらかじめ標識した標的核酸増幅用のリバースプライマーを用いることにより行ってもよく、増幅産物事態を標識することにより行ってもよい。
標的核酸増幅用のリバースプライマーを標識する標識物質としては、例えば、蛍光色素、蛍光ビーズ、量子ドット、ビオチン、抗体、抗原、エネルギー吸収性物質、ラジオアイソトープ、化学発光体、酵素等が挙げられる。蛍光色素としては、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’,５’−ジクロロ２’ ,７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（５'−ヘキサクロロ−フルオレセイン−ＣＥホスホロアミダイト）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ５６８、Ａｌｅｘａ６４７等が挙げられる。
また、増幅産物の標識に用いられる標識物質としては、上述した、蛍光色素、蛍光ビーズ、量子ドット、ビオチン、抗体、抗原、エネルギー吸収性物質、ラジオアイソトープ、化学発光体、酵素等が挙げられる。これらの中でも、標識物質としては、蛍光色素が好ましく、インターカレーターがより好ましい。インターカレーターとしては、蛍光やＵＶで検出可能な、二本鎖ＤＮＡにインターカレートして蛍光を発する物質であれば特に限定されることなく、例えば、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、ＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＢＥＲ Ｇｏｌｄ等が挙げられる。ｃＤＮＡを鋳型にした核酸合成を行う場合には、これらインターカレーター１６を核酸合成の反応溶液中に添加するだけで、増幅産物と蛍光試薬とがインターカーレーションし、蛍光検出が可能となる。上述した標識物質を使用することで、標的核酸を定量的に検出することが可能となる。
標的核酸増幅用のリバースプライマーを標識する標識物質としては、例えば、蛍光色素、蛍光ビーズ、量子ドット、ビオチン、抗体、抗原、エネルギー吸収性物質、ラジオアイソトープ、化学発光体、酵素等が挙げられる。蛍光色素としては、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’,５’−ジクロロ２’ ,７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（５'−ヘキサクロロ−フルオレセイン−ＣＥホスホロアミダイト）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ５６８、Ａｌｅｘａ６４７等が挙げられる。
また、増幅産物の標識に用いられる標識物質としては、上述した、蛍光色素、蛍光ビーズ、量子ドット、ビオチン、抗体、抗原、エネルギー吸収性物質、ラジオアイソトープ、化学発光体、酵素等が挙げられる。これらの中でも、標識物質としては、蛍光色素が好ましく、インターカレーターがより好ましい。インターカレーターとしては、蛍光やＵＶで検出可能な、二本鎖ＤＮＡにインターカレートして蛍光を発する物質であれば特に限定されることなく、例えば、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、ＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＢＥＲ Ｇｏｌｄ等が挙げられる。ｃＤＮＡを鋳型にした核酸合成を行う場合には、これらインターカレーター１６を核酸合成の反応溶液中に添加するだけで、増幅産物と蛍光試薬とがインターカーレーションし、蛍光検出が可能となる。上述した標識物質を使用することで、標的核酸を定量的に検出することが可能となる。
よって、本実施形態の核酸検出キットによれば、上述の大量生産可能な核酸増幅基板を用いて、核酸の増幅および検出を閉鎖系において、同時又は連続的に行うことができる。また、簡便かつ低コストで行うことができる。また、個々人にあわせた核酸増幅基板を用いた検査を行うことで、オーダーメイド治療に役立てることができる。
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
（２本鎖ＢＮＡ／ＤＮＡオリゴの合成）
以下、表１に記載の（Ｉ）〜（ＩＶ）のセンス鎖およびアンチセンス鎖を設計し、合成した。各センス鎖において、大文字で記載されたＡ，Ｔ，Ｇ，Ｃがブリッジド核酸であり、Ａ，Ｇは、ＢＮＡ−ＮＣ（Ｎ−Ｍｅ）、Ｃ，Ｔは、ＢＮＡ−ＮＣ（Ｎ−Ｈ）である。
（２本鎖ＢＮＡ／ＤＮＡオリゴの合成）
以下、表１に記載の（Ｉ）〜（ＩＶ）のセンス鎖およびアンチセンス鎖を設計し、合成した。各センス鎖において、大文字で記載されたＡ，Ｔ，Ｇ，Ｃがブリッジド核酸であり、Ａ，Ｇは、ＢＮＡ−ＮＣ（Ｎ−Ｍｅ）、Ｃ，Ｔは、ＢＮＡ−ＮＣ（Ｎ−Ｈ）である。
（２本鎖ＢＮＡ／ＤＮＡオリゴの形成）
各センス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれ２．５μＭとなるよう、バッファー中に添加した。バッファーの組成は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ ｍＭ ＭｇＣｌ２である。サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社Ｖｅｒｉｔｉ）を用い、９５℃、５分間熱変性後、２５℃まで１分間に１℃ずつ温度を下げながら、各センス鎖およびアンチセンス鎖をアニーリングさせた。
各センス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれ２．５μＭとなるよう、バッファー中に添加した。バッファーの組成は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ ｍＭ ＭｇＣｌ２である。サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社Ｖｅｒｉｔｉ）を用い、９５℃、５分間熱変性後、２５℃まで１分間に１℃ずつ温度を下げながら、各センス鎖およびアンチセンス鎖をアニーリングさせた。
（Ｔｍ値測定）
３０℃から９８℃まで１分間に１℃ずつ温度を上昇させ、０．２℃ごとに吸光度（２６０ ｎｍ）を測定した。図４は、２本鎖ＢＮＡ／ＤＮＡの温度上昇による吸光度（２６０ｎｍ）の変化を示したグラフである。また、各２本鎖ＢＮＡ／ＤＮＡオリゴのＴｍ値を表２に示した。
３０℃から９８℃まで１分間に１℃ずつ温度を上昇させ、０．２℃ごとに吸光度（２６０ ｎｍ）を測定した。図４は、２本鎖ＢＮＡ／ＤＮＡの温度上昇による吸光度（２６０ｎｍ）の変化を示したグラフである。また、各２本鎖ＢＮＡ／ＤＮＡオリゴのＴｍ値を表２に示した。
図４から、長さが１８塩基である（ＩＩＩ）および（ＩＶ）は、長さが１２塩基である（Ｉ）および（ＩＩ）と比較して、Ｔｍ値が高かった。また、塩基の長さが同じもの同士を比較すると、ＢＮＡの含有量の多い（ＩＩ）および（ＩＶ）のほうが、（Ｉ）および（ＩＩＩ）よりもＴｍ値が高かった。
したがって、オリゴ鎖が長く、さらにＢＮＡの含有量が多いものほどＴｍ値が高く、結合力が強いことが推察される。
したがって、オリゴ鎖が長く、さらにＢＮＡの含有量が多いものほどＴｍ値が高く、結合力が強いことが推察される。
［実施例２］
（ＢＮＡ／ＤＮＡオリゴの合成）
以下、表３に記載の第１のオリゴ核酸、第２のオリゴ核酸及びＲｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒを設計し、合成した。第２のオリゴ核酸において、大文字で記載されたＡ，Ｔ，Ｃがブリッジド核酸であり、Ａは、ＢＮＡ−ＮＣ（Ｎ−Ｍｅ）、Ｃ，Ｔは、ＢＮＡ−ＮＣ（Ｎ−Ｈ）である。さらに、第２のオリゴ核酸において、５’末端から数えて１番目から１５番目までの１５塩基が核酸Ａであり、第１のオリゴ核酸とアニーリングし、５’末端から数えて１６番目から３９番目までの２４塩基が核酸Ｂであり、鋳型のセンス鎖（後述のＡｌｌｅｌｅ１のセンス鎖の塩基配列のうち、１４５番目から１６８番目までの２４塩基）に対して相補的なＦｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒである。また、Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒは、鋳型のアンチセンス鎖（後述のＡｌｌｅｌｅ１のアンチセンス鎖の塩基配列のうち、１９９番目から２２０番目までの２１塩基）に対して相補的なＲｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒである。
（ＢＮＡ／ＤＮＡオリゴの合成）
以下、表３に記載の第１のオリゴ核酸、第２のオリゴ核酸及びＲｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒを設計し、合成した。第２のオリゴ核酸において、大文字で記載されたＡ，Ｔ，Ｃがブリッジド核酸であり、Ａは、ＢＮＡ−ＮＣ（Ｎ−Ｍｅ）、Ｃ，Ｔは、ＢＮＡ−ＮＣ（Ｎ−Ｈ）である。さらに、第２のオリゴ核酸において、５’末端から数えて１番目から１５番目までの１５塩基が核酸Ａであり、第１のオリゴ核酸とアニーリングし、５’末端から数えて１６番目から３９番目までの２４塩基が核酸Ｂであり、鋳型のセンス鎖（後述のＡｌｌｅｌｅ１のセンス鎖の塩基配列のうち、１４５番目から１６８番目までの２４塩基）に対して相補的なＦｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒである。また、Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒは、鋳型のアンチセンス鎖（後述のＡｌｌｅｌｅ１のアンチセンス鎖の塩基配列のうち、１９９番目から２２０番目までの２１塩基）に対して相補的なＲｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒである。
（２本鎖ＢＮＡ／ＤＮＡオリゴの形成）
合成した第１のオリゴ核酸と第２のオリゴ核酸とを混合し、室温で３０分間インキュベーションし、アニーリングさせた。続いて、アニーリングの確認のために、第１のオリゴ核酸、第２のオリゴ核酸及びアニーリング後の２本鎖ＢＮＡ／ＤＮＡオリゴを非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動した。さらに、電気泳動後の非変性ポリアクリルアミドゲルに紫外線（波長約２５４ｎｍ）を照射して撮影した。結果を図５に示した。
図５から、合成した第１のオリゴ核酸と第２のオリゴ核酸とがアニーリングし、二本鎖オリゴ核酸を形成していることが確かめられた。
合成した第１のオリゴ核酸と第２のオリゴ核酸とを混合し、室温で３０分間インキュベーションし、アニーリングさせた。続いて、アニーリングの確認のために、第１のオリゴ核酸、第２のオリゴ核酸及びアニーリング後の２本鎖ＢＮＡ／ＤＮＡオリゴを非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動した。さらに、電気泳動後の非変性ポリアクリルアミドゲルに紫外線（波長約２５４ｎｍ）を照射して撮影した。結果を図５に示した。
図５から、合成した第１のオリゴ核酸と第２のオリゴ核酸とがアニーリングし、二本鎖オリゴ核酸を形成していることが確かめられた。
（Ｔｍ値測定）
１℃から１００℃まで１分間に１℃ずつ温度を上昇させ、１℃ごとに吸光度（２６０ ｎｍ）を測定した。図６は、２本鎖ＢＮＡ／ＤＮＡの温度上昇による吸光度（２６０ｎｍ）の変化を示したグラフである。また、Ｔｍ値７４℃のコントロール２本鎖オリゴについても同様に実験を行った。
１℃から１００℃まで１分間に１℃ずつ温度を上昇させ、１℃ごとに吸光度（２６０ ｎｍ）を測定した。図６は、２本鎖ＢＮＡ／ＤＮＡの温度上昇による吸光度（２６０ｎｍ）の変化を示したグラフである。また、Ｔｍ値７４℃のコントロール２本鎖オリゴについても同様に実験を行った。
図６から、コントロール２本鎖オリゴでは温度上昇に伴う吸光度の変化にピークが見られ、Ｔｍ値が７４．７７℃と算出された。一方、２本鎖ＢＮＡ／ＤＮＡでは吸光度の変化に一定のピークが見られず、明確なＴｍ値が得られなかった。
以上のことから、２本鎖ＢＮＡ／ＤＮＡでは測定範囲内（１℃〜１００℃）で２本鎖が解離しないことが確認された。
以上のことから、２本鎖ＢＮＡ／ＤＮＡでは測定範囲内（１℃〜１００℃）で２本鎖が解離しないことが確認された。
（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ）
鋳型として、配列番号１２（センス鎖）及び配列番号１３（アンチセンス鎖）の塩基配列からなる２本鎖ＤＮＡテンプレート（Ａｌｌｅｌｅ１）と、配列番号１４（センス鎖）及び配列番号１５（アンチセンス鎖）の塩基配列からなる２本鎖ＤＮＡテンプレート（Ａｌｌｅｌｅ２）との混合物６０ｎｇを使用した。Ａｌｌｅｌｅ２はＡｌｌｅｌｅ１の１３１番目から１４５番目の１５塩基が欠損した配列である。以下の表４のようにＡｌｌｅｌｅ１及びＡｌｌｅｌｅ２の混合比率を変更したテンプレートを５種類準備し、それぞれについてＰＣＲ反応を行った。括弧内のコピー数は３ｐｇのｇＤＮＡに１コピー含まれると想定した際の理論値である。
鋳型として、配列番号１２（センス鎖）及び配列番号１３（アンチセンス鎖）の塩基配列からなる２本鎖ＤＮＡテンプレート（Ａｌｌｅｌｅ１）と、配列番号１４（センス鎖）及び配列番号１５（アンチセンス鎖）の塩基配列からなる２本鎖ＤＮＡテンプレート（Ａｌｌｅｌｅ２）との混合物６０ｎｇを使用した。Ａｌｌｅｌｅ２はＡｌｌｅｌｅ１の１３１番目から１４５番目の１５塩基が欠損した配列である。以下の表４のようにＡｌｌｅｌｅ１及びＡｌｌｅｌｅ２の混合比率を変更したテンプレートを５種類準備し、それぞれについてＰＣＲ反応を行った。括弧内のコピー数は３ｐｇのｇＤＮＡに１コピー含まれると想定した際の理論値である。
続いて、以下の表５に示したＰＣＲ組成物となるようにそれぞれ混合した。
また、ＰＣＲ反応サイクルは、表６に示したとおりである。７２℃において、毎回増幅産物の計測を行った。結果を図７に示した。図７中、ＮＴＣとは、Ｎｏ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｃｏｎｔｒｏｌの略であり、プライマーダイマーの有無を調べるためのものである。
図７から、Ａｌｌｅｌｅ１が１００％である（Ｖ）が最初に増幅曲線が立ち上がり、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）と続いている。Ａｌｌｅｌｅ１の含有量に比例して、増幅曲線の立ち上がりが早くなっていることが推察される。また、Ａｌｌｅｌｅ２が１００％である（ＩＸ）についても増幅が見られるが、Ａｌｌｅｌｅ１を０．１％含む（ＶＩＩＩ）は、（ＩＸ）と比較すると、増幅曲線の立ち上がりに有意な差がある。よって、２本鎖ＢＮＡ／ＤＮＡオリゴは、Ａｌｌｅｌｅ１を特異的に増幅することができることが確かめられた。
以上の結果から、本発明によれば、標的核酸を簡便に且つ高選択的に増幅することができることが明らかである。
１…基板、２…プローブ、３…第１のオリゴ核酸、３ａ…核酸Ａと相補的な塩基配列からなる核酸、３ｂ…基板に固定された核酸、４…第２のオリゴ核酸、５…核酸Ａ、６…核酸Ｂ、７…標的核酸増幅用のリバースプライマー、８…標的核酸、８ａ…標的核酸のセンス鎖、９…標的核酸の増幅産物Ｘ、８ｂ…標的核酸のアンチセンス鎖、１０，２０…核酸増幅基板、１１…標的核酸の増幅産物Ｙ、１２…検出用プローブ、２１…区画
Claims (10)
- 基板および該基板に固定されたプローブを備えた核酸増幅基板であって、前記プローブは、
前記基板に固定された第１のオリゴ核酸と、
５’末端領域に前記第１のオリゴ核酸にハイブリダイズし得る配列からなる核酸Ａと、３’末端領域に標的核酸増幅用のフォワードプライマーとなり得る配列からなる核酸Ｂと、を備え、少なくとも前記核酸Ａにブリッジド核酸を含む第２のオリゴ核酸と、
を有することを特徴とする核酸増幅基板。 - 前記基板は１つ以上の区画を備え、１つの区画には１種類の前記プローブが１つ以上固定される請求項１に記載の核酸増幅基板。
- 前記第２のオリゴ核酸中のブリッジド核酸の割合が、６６％以上である請求項１又は２に記載の核酸増幅基板。
- 前記第１のオリゴ核酸がＤＮＡである請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸増幅基板。
- 前記標的核酸がｇＤＮＡ又はｃＤＮＡである請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸増幅基板。
- 請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸増幅基板を用いた核酸増幅方法。
- プローブが固定された基板および標的核酸増幅用のリバースプライマーを備えた核酸検出キットであって、前記プローブは、
前記基板に固定された第１のオリゴ核酸と、
５’末端領域に前記第１のオリゴ核酸にハイブリダイズし得る配列からなる核酸Ａと、３’末端領域に標的核酸増幅用のフォワードプライマーとなり得る配列からなる核酸Ｂと、を備え、少なくとも前記核酸Ａにブリッジド核酸を含む第２のオリゴ核酸と、
を有することを特徴とする核酸検出キット。 - 前記第２のオリゴ核酸中のブリッジド核酸の割合が、６６％以上である請求項７に記載の核酸検出キット。
- 前記第１のオリゴ核酸がＤＮＡである請求項７又は８に記載の核酸検出キット。
- 前記標的核酸がｇＤＮＡ又はｃＤＮＡである請求項７〜９のいずれか一項に記載の核酸検出キット。
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-
2015
- 2015-08-27 JP JP2015168225A patent/JP6523874B2/ja active Active
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| COMBINATORIAL CHEMISTRY & HIGH THROUGHPUT SCREENING, vol. 9, no. 8, JPN6019012172, 2006, pages 591 - 597, ISSN: 0004015093 * |
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