JPWO2018038232A1 - 標的核酸の増幅産物の生産方法及びその利用 - Google Patents

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Abstract

新規な原理に基づく標的核酸の増幅産物の生産方法を提供する。標的核酸の増幅産物の生産方法を、第１のプライマー、第２のプライマー及び鎖置換活性を有する核酸ポリメラーゼ、を用いて、前記標的核酸を含む可能性のある被験試料に対して核酸増幅反応を実施する増幅工程、を備えるようにする。増幅工程は、前記標的核酸の二本鎖の解離を促進可能な２以上のオリゴヌクレオチドを用いる工程とする。

Description

本明細書は、標的核酸の増幅産物の生産方法及びその利用等に関する。
標的核酸配列を増幅する方法の一つとして、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法が知られている。ＰＣＲ法は、in vitroにおける核酸の増幅技術として現在最も一般的な方法である。ＰＣＲ法は温度循環、すなわち、加熱−冷却のサイクルにより、プライマーと標的核酸の結合、プライマーの伸長、伸長したプライマーの標的核酸からの遊離及び新たなプライマーの標的核酸への結合を繰り返して指数的に標的核酸を増幅することができる。ＰＣＲ法は、その指数的な増幅効果に基づく高い感度により優れた検出方法として定着し、また、遺伝子工学的手法を支える重要なツールとして幅広く応用されている。
核酸増幅方法としては、他にも、転写増幅システム（ＴＡＳ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ：Ligase Chain Reaction）、ランダムプライミング増幅（ＲＰＡ）、並びにＱベータレプリカーゼ、制限エンドヌクレアーゼ及びランダムヘキサマーを用いる増幅法がある。これらのいずれの方法も、加熱−冷却による相補鎖の変性及び再結合を必要とするため、温度循環装置が必要である。
一方、標的核酸の増幅法のいくつかは、温度循環せずに実施される方法もある。その一つとしてＮＡＳＢＡ法(NucIeic Acid Sequence-based Amplification／ＴＭＡ法（Transcription Mediated Amplification）とも呼ばれる。)や、ＳＤＡ法(Strand DispIacement Amplification)と呼ばれる方法が知られている。
また、ＬＡＭＰ法（Loop-mediated isothermal amplification）と呼ばれる温度循環を必要としない増幅法も知られている（特許文献１）。ＬＡＭＰ法は、標的核酸の一部に相補的なプライマーの５’側に、そのプライマー配列の３’下流の配列の一部に相同な配列のオリゴヌクレオチドを結合したプライマーを用いることを特徴とする。すなわち、該プライマーが伸長した場合、５’側に結合させた配列が伸長した配列とループを作る構造になっている。このような特徴を持った1対のプライマーを用いることで、ダンベル構造と呼ばれる５’末端、３’末端側共にループ構造を取る配列が生じる。３’側のループ構造の３’末端はそのループを利用して鎖置換活性を有するポリメラーゼにより伸長され新たに、３’側にループ構造を持つ配列を生じる。ＬＡＭＰ法は、こうした鎖置換活性を持つポリメラーゼを用いることで、温度循環無しにループ構造の３’末端からの伸長反応が折り重なり生じることで標的核酸配列の増幅を生じさせるというものである。
国際公開第２０００／２８０８２号
ＬＡＭＰ法は、鎖置換活性を有するポリメラーゼだけで増幅するので、他の方法に比べ大きなコストアップにはならないが、特殊な構造のプライマーを必要とするため、設計が難しく汎用性に問題がある。
本明細書は、新規な原理に基づく標的核酸の増幅産物の生産方法を提供する。より具体的には、温度循環を実質的に省略して標的核酸の増幅を達成できる方法を提供する。
本発明者らは、温度循環を省略するために、核酸増幅における温度循環の機能、なかでも、相補鎖間の遊離及び再結合に着目した。すなわち、本発明者らは、公知のアプローチとはまったく異なる角度から、プライマーが伸長してできた伸長産物のプライマー部分における相補鎖対合を緩めて未反応のプライマーが結合できる方法について検討した。その結果、標的核酸となる二本鎖ＤＮＡや、増幅工程におけるプライマー伸長鎖と鋳型鎖と二本鎖ＤＮＡなどの二本鎖ＤＮＡ間の相補結合を緩めるためのオリゴヌクレオチドを用いることで、実質的な等温条件下であっても、新たにプライマーと鋳型鎖との結合を生じさせて標的核酸を増幅できることを見いだし、本発明を完成させるに至った。本明細書は、かかる知見に基づき以下の手段を提供する。
（１）標的核酸の増幅産物の生産方法であって、
第１のプライマー、第２のプライマー及び鎖置換活性を有する核酸ポリメラーゼ、を用いて、前記標的核酸を含む可能性のある被験試料に対して核酸増幅反応を実施する増幅工程、
を備え、
前記増幅工程は、前記標的核酸の二本鎖の解離を促進可能な２以上のオリゴヌクレオチドを用いる工程である、生産方法。
（２）前記２以上のオリゴヌクレオチドは、第１の鋳型鎖上において前記第１のプライマーがハイブリダイズする第１のハイブリダイズ領域及び第２の鋳型鎖上において前記第２のプライマーがハイブリダイズする第２のハイブリダイズ領域のそれぞれ近傍において、前記第１の鋳型鎖及び前記第２の鋳型鎖の少なくとも一方に対するハイブリダイゼーションを介して存在可能に構成されている、（１）に記載の生産方法。
（３）前記２以上のオリゴヌクレオチドは、前記第１のハイブリダイズ領域の近傍で前記第２の鋳型鎖にハイブリダイズする第３のプライマーと、前記第２のハイブリダイズ領域の近傍で前記第１の鋳型鎖にハイブリダイズする第４のプライマーと、を含む、（１）又は（２）に記載の生産方法。
（４）前記第３のプライマーは、前記第１のハイブリダイズ領域よりも前記標的核酸の内側で前記第２の鋳型鎖にハイブリダイズし、
前記第４のプライマーは、前記第２のハイブリダイズ領域よりも前記標的核酸の内側で前記第１の鋳型鎖にハイブリダイズする、（３）に記載の生産方法。
（５）前記２以上のオリゴヌクレオチドは、前記第１のプライマーの５’末端側に備えられ、核酸増幅反応に対して独立である第１のタグと、前記第２のプライマーの５’末端側に備えられ、核酸増幅反応に対して独立である第２のタグと、を含む、（１）〜（４）のいずれかに記載の生産方法。
（６）前記第１のプライマーは、前記第１のタグを、スペーサを介して備え、前記第２のプライマーは、前記第２のタグを、スペーサを介して備える、（５）に記載の生産方法。
（７）前記スペーサは、前記鎖置換活性を有する核酸ポリメラーゼによる核酸合成反応を抑制又は停止可能である、（６）に記載の生産方法。
（８）前記第１及び前記第２のプライマーの少なくとも一方が、標識要素を備える、（１）〜（７）のいずれかに記載の生産方法。
（９）前記標識要素は、標識物質又は標識物質結合物質である、（８）に記載の生産方法。
（１０）前記増幅工程を、実質的な温度変化を伴うことなく実施する、（１）〜（９）のいずれかに記載の生産方法。
（１１）標的核酸の検出方法であって、
第１のプライマー、第２のプライマー及び鎖置換活性を有する核酸ポリメラーゼ、を用いて、前記標的核酸を含む可能性のある被験試料に対して核酸増幅反応を実施する増幅工程と、
前記増幅工程で得られる増幅産物の少なくとも一部を介して前記標的核酸を検出する工程と、
を備え、
前記増幅工程は、前記標的核酸の二本鎖の解離を促進可能な２以上のオリゴヌクレオチドを用いる工程である、検出方法。
（１２）前記検出工程は、前記増幅産物の前記少なくとも一部を介してクロマトグラフィーによって分離することを含む、（１１）に記載の検出方法。
（１３）前記検出工程は、前記増幅産物の一部にハイブリダイズするインナープライマーを用いて前記標的核酸を標識要素を付与することを含む、（１１）又は（１２）に記載の検出方法。
（１４）標的核酸を増幅するためのキットであって、
第１のプライマーと
第２のプライマーと、
前記標的核酸の二本鎖の解離を促進可能な２以上のオリゴヌクレオチドと、
を備える、キット。
（１５）前記２以上のオリゴヌクレオチドは、第１の鋳型鎖上において前記第１のプライマーがハイブリダイズする第１のハイブリダイズ領域及び第２の鋳型鎖上において前記第２のプライマーがハイブリダイズする第２のハイブリダイズ領域のそれぞれ近傍において、前記第１の鋳型鎖及び前記第２の鋳型鎖の少なくとも一方に対するハイブリダイゼーションを介して存在可能に構成されている、（１４）に記載のキット。
（１６）標的核酸を検出するためのキットであって、
第１のプライマーと
第２のプライマーと、
前記標的核酸の二本鎖の解離を促進可能な２以上のオリゴヌクレオチドと、
を備える、キット。
本明細書に開示される標的核酸の増幅産物の生産方法における２以上のオリゴヌクレオチドの一態様を示す図である。 図１に示す２以上のオリゴヌクレオチドによる増幅工程における作用の一部を示す図である。 図１に示す２以上のオリゴヌクレオチドによる増幅工程における作用の他の一部を示す図である。 図１に示す２以上のオリゴヌクレオチドによる増幅工程における作用の他の一部を示す図である。 図１に示す２以上のオリゴヌクレオチドによる増幅工程における作用の他の一部を示す図である。 図１に示す２以上のオリゴヌクレオチドによる増幅工程における作用の他の一部を示す図である。 図１に示す２以上のオリゴヌクレオチドによる増幅工程における作用の他の一部を示す図である。 本明細書に開示される標的核酸の増幅産物の生産方法における２以上のオリゴヌクレオチドの他の一態様を示す図である。 図４に示す２以上のオリゴヌクレオチドによる増幅工程における作用の一部を示す図である。 図４に示す２以上のオリゴヌクレオチドによる増幅工程における作用の他の一部を示す図である。 図４に示す２以上のオリゴヌクレオチドによる増幅工程における作用の他の一部を示す図である。 図４に示す２以上のオリゴヌクレオチドによる増幅工程における作用の他の一部を示す図である。 実施例に用いる各種プライマーを示す図である。 実施例で用いる核酸クロマトグラフィー用ストリップを示す図である。 図８に示すストリップを用いた核酸クロマトグラフィーの実施状態を示す図である。 実施例１の結果を示す図である。 実施例２の結果を示す図である。 実施例３の結果を示す図である。 実施例３の他の結果を示す図である。
本明細書に開示される標的核酸の増幅産物の生産方法（以下、本生産方法ともいう。）は、本生産方法における「標的核酸」、すなわち、被験試料中の本来的に存在する標的核酸としての「二本鎖」、増幅工程で生成される標的核酸の増幅産物としての第１のプライマーがハイブリダイズする第１の鋳型鎖と第１のプライマーの伸長鎖である第１の伸長鎖との「二本鎖」及び第２のプライマーがハイブリダイズする第２の鋳型鎖と第２のプライマーの伸長鎖である第２の伸長鎖との「二本鎖」の解離を促進する２以上のオリゴヌクレオチドを用いる。こうしたオリゴヌクレオチドを用いることで、これら「二本鎖」を熱融解しなくても、「二本鎖」の解離が促進されて、新たな第１のプライマー及び第２のプライマーがそれぞれの鋳型鎖に結合することが促進される。このため、実質的に温度変化を伴うことなく又は実質的な等温条件で、プライマーによる標的核酸の増幅が可能となっている。
本明細書において、第１のプライマーが、標的核酸の第１の鋳型鎖上においてハイブリダイズする領域を第１のハイブリダイズ領域とし、第２のプライマーが、標的核酸の第２の鋳型鎖上においてハイブリダイズする領域を第２のハイブリダイズ領域というものとする。
２以上のオリゴヌクレオチドは、第１のハイブリダイズ領域及び第２のハイブリダイズ領域のそれぞれの近傍に、第１の鋳型鎖及び第２の鋳型鎖の少なくとも一方に対するハイブリダイゼーションを介して存在可能に構成されることができる。こうすることで、効果的に、新たな第１のプライマー及び第２のプライマーをそれぞれの鋳型鎖にハイブリダイズさせることができる。
本明細書において、「標的核酸」は、標的とする核酸配列を含む核酸を表わす。標的核酸は、一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよく、しばしばＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ若しくはＲＮＡの誘導体、又はその組み合わせである。「標的核酸配列」、「標的配列」又は「標的領域」は、一本鎖核酸の配列の全部又は一部を含む特定の配列を意味する。
また、本明細書において、「標的核酸」とは、検出しようとする標的配列を含む核酸を意味している。標的核酸の由来は、特に限定しないで、各種生物材料（個体またはその組織、器官等の個体の一部のほか、排せつ物、体液等）ほか、人工的な核酸を含む人工材料が挙げられる。
本検出方法には、標的核酸を含む可能性のある生物材料又は人工材料自体又は必要に応じてこうした各種材料から核酸以外の構成成分の一部又は全部が除去されて核酸抽出試料を、試料として供給することができる。
本明細書において「オリゴヌクレオチド」とは、２以上のヌクレオシド又はその類似体が結合したポリマーをいう。ヌクレオシド及びその類似体の糖基は、リボース、デオキシリボース又はその類似体であってもよく、ヌクしオシド又はその類似体の塩基は、公知の天然塩基又は天然塩基と対合可能な塩基類似体であってもよい。オリゴヌクレオチドは、また、一本鎖であってもよいし二本鎖であってもよいが、特に言及しない限り概して一本鎖の形態をいう。オリゴヌクレオチドは、典型的には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はこれらの類似体である。
「オリゴヌクレオチド」におけるヌクレオシド又はその類似体の重合数は特に限定するものではない。配列依存的な核酸合成反応を触媒する公知のポリメラーゼが認識するプライマーの鎖長が、最低５塩基前後であることから、アニールする部分の鎖長はそれ以上である必要がある。加えて、塩基配列としての特異性を期待するためには、確率的に１０塩基以上の長さを利用するのが望ましい。一方、あまりにも長い塩基配列は化学合成によって調製することが困難となる。したがって、例えば、オリゴヌクレオチドの鎖長は、例えば、数個以上２００塩基以下であり、また例えば、１０個以上１００個以下程度であり、また例えば、１０個以上５０個以下程度、また例えば、１０個以上３０個以下程度である。なお、ここで例示した鎖長はあくまでも相補鎖とアニールする部分の鎖長である。
以下、本明細書に開示される標的核酸の生産方法、検出方法及びキット等について適宜図面を参照しながら詳細に説明する。ここで図１及び図２は、本検出方法の一例の概要を示す図である。
（標的核酸の増幅産物の生産方法）
本生産方法は、第１のプライマー、第２のプライマー及び鎖置換活性を有する核酸ポリメラーゼ、を用いて、前記標的核酸を含む可能性のある被験試料に対して核酸増幅反応を実施する増幅工程を備えることができる。
本生産方法は、標的核酸並びに核酸増幅に一般的に用いる第１のプライマー及び第２のプライマーから生じる伸長鎖とそれらの各鋳型鎖との二本鎖を、温度変化を実質的に伴うことなく又は実質的な等温条件下で実施することを含む増幅工程を意図している。以下、かかる増幅工程の要素について説明する。
（第１のプライマー及び第２のプライマー）
本生産方法で用いる第１のプライマー及び第２のプライマーは、基本的に、従来のＰＣＲ法と同様の設計に基づくフォワードプライマー及びリバースプライマーを使用できる。
第１及び第２のプライマーは、それぞれ標的核酸を増幅することができるようそれぞれの鋳型である第１の鋳型鎖及び第２の鋳型鎖にハイブリダイズするための識別領域を構成する識別配列を備えている。識別配列は、標的核酸の塩基配列やプライマー自体の特異性を公知の手法により適宜考慮して決定することができる。また、識別配列の長さは、特に限定するものではないが、概して、１０塩基長〜３０塩基長程度の長さとすることができ、例えば、１５塩基長から２５塩基長程度とすることができる。
第１及び第２のプライマーの識別領域が第１及び第２の鋳型鎖の第１及び第２のハイブリダイズ領域にそれぞれハイブリダイズする。
第１及び第２のプライマーは、必要に応じて、その５’末端側にタグを備えることができる。タグは、核酸増幅反応に関与するタグ及び当該反応に関与しない当該反応とは独立するタグとの双方を含む。本明細書において、核酸増幅反応に関与するタグとは、核酸増幅反応によって当該タグが鋳型として機能して相補鎖が伸長可能なタグであり、核酸増幅反応とは独立するタグとは、核酸増幅反応において、当該タグが鋳型となることなく一本鎖のまま維持されるタグである。
例えば、第１及び第２のプライマーによって生成する伸長鎖を、別のプライマーで増幅させるためのプライマー用タグが挙げられる。かかるタグは、核酸増幅反応に関与するタグである。プライマー用タグは、概して、ユニバーサルプライマーと称される汎用されるプライマーの識別配列にハイブリダイズ可能に設計される。
また、例えば、増幅産物を捕捉し標的核酸を検出するための検出用タグが挙げられる。かかるタグは、核酸増幅反応に関与するタグとしても、核酸増幅反応とは独立するタグとしても設計できる。検出用タグは、増幅産物を検出するためのオリゴヌクレオチドである検出用プローブとハイブリダイズ可能に設計されている。
さらに、例えば、増幅産物を検出するために用いる標識用タグが挙げられる。かかるタグは、核酸増幅反応に関与するタグとしても、核酸増幅反応とは独立するタグとしても設計できる。標識用タグは、概して、標識物質や標識物質結合物質などの各種の標識要素を保持するオリゴヌクレオチドである標識用プローブとハイブリダイズ可能に設計されている。なお、標識要素については後段で説明する。
こうした各種のタグの塩基長は特に限定するものではないが、１５塩基以上５０塩基以下であることが好ましい。この範囲であると、ハイブリダイゼーションの特異性と効率とをそれぞれ確保できるからである。タグの塩基長は、より好ましくは、２０塩基以上５０塩基以下であり、さらに好ましくは２０塩基長２５塩基以下程度である。
タグの配列のための配列、特に、核酸増幅反応に独立したタグの塩基配列としては、例えば、配列番号１〜配列番号１００に記載の塩基配列又はこの塩基配列に相補的な塩基配列を用いることができる。これらの塩基配列は全て同一塩基長（２３塩基長）である。これらの塩基配列は、正規直交化配列ともいい、たとえば乱数から得られた所定塩基長のＤＮＡ配列に対して連続一致長、Nearest-Neighbor法による融解温度予測、ハミング距離、二次構造予測の計算を行うことにより設計される（H.Yoshida and A.Suyama,“Solution to 3-SAT by breadth first search”,DIMACS Vl.54, 9-20(2000)）。
第１及び第２のプローブにおけるタグは、３’側にあるハイブリダイズ領域に対して適当なスペーサを介して備えていてもよい。また、核酸増幅反応とは独立するタグは、ハイブリダイズ領域に対して、核酸ポリメラーゼ反応を抑制又は停止可能な「抑止要素」を介して備えることができる。かかる「抑止要素」については、例えば、国際公開第２０１３／０３９２２８号、国際公開第２０１２／０７０６１８号、国際公開第２００６／０９５５５０号等に、開示されており、当業者であれば、適宜好適な抑止要素を選択してプライマーを取得することができる。
第１の及び第２のプライマーは、さらに、本明細書において規定する２以上のオリゴヌクレオチドの少なくとも一方を備えることができる。かかる２以上のオリゴヌクレオチドについては後段で詳述する。
（核酸ポリメラーゼ）
本生産方法で使用する、核酸ポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。本生産方法で用いるＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を有していてもよい。鎖置換活性とは、鋳型鎖と相補的な核酸鎖を合成していく過程で、伸長方向に二本鎖領域があっても、その鎖を解離しつつ、相補鎖の合成を継続する活性をいう。核酸ポリメラーゼが鎖置換活性を有することで、新たに鋳型鎖にハイブリダイズした第１のプライマー及び第２のプライマーは、第１の伸長鎖と第２の伸長鎖とがそれぞれの鋳型鎖と部分的にハイブリダイズした状態であっても容易に新たな伸長鎖を合成することができる。
本生産方法に用いるＤＮＡポリメラーゼは、公知の種々のＤＮＡポリメラーゼ（鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含む）から、本生産方法に好適なＤＮＡポリメラーゼを、本生産方法において被験ポリメラーゼとして用いてスクリーニングを行ってその増幅量等を指標として選択することができる。また、本生産方法に用いるＤＮＡポリメラーゼは、公知のＤＮＡポリメラーゼの変異体であってもよい。本明細書において「変異体」とは、酵素の必要とする触媒活性をもたらす構造のみを取り出したもの、あるいはアミノ酸の変異等によって触媒活性、安定性、あるいは耐熱性を改変したもの等を示すことができる。ＤＮＡポリメラーゼの変異体は当業者であれば、公知の遺伝子工学的手法によりＤＮＡポリメラーゼのある種の領域に変異を導入したタンパク質を、変異の目的に応じた手法でスクリーニングすることで適宜取得することができる。
また、本生産方法に用いるＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡを３’側から分解する３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有していてもよいが、増幅効率を考慮すると欠失していてもよい。さらに、本生産方法における増幅に問題がない範囲で、５’側からＤＮＡを分解する５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有していてもよい。
さらに、本生産方法に用いるＤＮＡポリメラーゼは、耐熱性を有していることが好ましい。本明細書において、ＤＮＡポリメラーゼに関して耐熱性とは、反応至適温度が５５℃以上８０℃以下、より好ましくは６０℃以上７５℃以下であることをいう。なお、反応至適温度は、商業的に入手可能なＤＮＡポリメラーゼに関しては、活性単位として定義された活性（又はその測定方法）に基づくことができる。また、耐熱性とは、５分間加熱したとき、その後のＤＮＡポリメラーゼ活性が実質的に消失する温度が８０℃以上であることで規定してもよい。
ＤＮＡポリメラーゼが耐熱性を有していると、プライマーの設計等がＤＮＡポリマーの熱変性温度に拘束されにくいという利点のほか、プライマーと鋳型鎖との最初のハイブリダイゼーション等など、加熱変性が必要な場合もあるからである。
例えば、本生産方法に好適なＤＮＡポリメラーゼとしては、Bst DNA ポリメラーゼ、Bca(exo-)DNA ポリメラーゼ、Csa DNA ポリメラーゼ、96-7 DNA ポリメラーゼ、DNA ポリメラーゼＩのクレノウ・フラグメント、Vent DNA ポリメラーゼ、Vent(Exo-)DNA ポリメラーゼ（Vent DNA ポリメラーゼから３’−５’方向のエキソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、DeepVent DNA ポリメラーゼ、DeepVent(Exo-)DNAポリメラーゼ（DeepVent DNA ポリメラーゼから３’−５’方向のエキソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、Φ29ファージDNA ポリメラーゼ、MS-2ファージDNA ポリメラーゼ、Z-Taq DNA ポリメラーゼ（宝酒造）、KOD DNA ポリメラーゼ（東洋紡績）等が挙げられる。
これらの酵素の中でもBst DNA ポリメラーゼやBca(exo-)DNA ポリメラーゼ及びVent(Exo-)DNAポリメラーゼを好ましく用いることができる。これらの酵素は、適度な耐熱性を持ち、ＤＮＡポリメラーゼ活性も高い。
ＤＮＡポリメラーゼによる鎖置換を伴う相補鎖（伸長鎖）の合成反応は、１本鎖結合タンパク質(single strand binding protein)の添加によって促進されることが知られている(Paul M.Lizardiet al, Nature Genetics 19, 225-232, July,1998)。この作用を本生産方法に適用して、１本鎖結合タンパク質を添加することによって相補鎖合成の促進効果を期待することができる。たとえばVent(Exo-)DNAポリメラーゼに対しては、１本鎖結合タンパク質としてT4 gene 32が有効である。
（標的核酸の二本鎖の解離を促進可能な２以上のオリゴヌクレオチド）
本生産方法では、その増幅工程で、標的核酸の二本鎖の解離を促進可能な２以上のオリゴヌクレオチドを用いる。なお、２以上のオリゴヌクレオチドに関して、標的核酸とは、被験試料中に本来的に存在している標的核酸のほか、増幅工程において生じる第１の鋳型鎖と第１のプライマーの伸長鎖である第１の伸長鎖との二本鎖及び第２の鋳型鎖と第２のプライマーの伸長鎖である第２の伸長鎖との二本鎖と同義である。したがって、標的核酸の解離を促進するとは、標的核酸のほか、伸長鎖と鋳型鎖との解離を促進することを含んでいる。また、本明細書において、標的核酸の解離を促進するとは、標的核酸の二本鎖の解離を少なくとも部分的に惹起し又は促進することを意味している。
このような２以上のオリゴヌクレオチドを用いることで、温度変化を実質的に伴うことなく又は実質的な等温条件下で、標的核酸の二本鎖の解離を生じさせて又は促進して、新たな第１のプライマー及び第２のプライマーを各鋳型鎖等にハイブリダイズさせることができる。以下、２以上のオリゴヌクレオチドを、解離用オリゴヌクレオチドと称して説明する。
解離用オリゴヌクレオチドは、第１のプライマーが第１の鋳型鎖にハイブリダイズするのを促進するための少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと、第２のプライマーが第２の鋳型鎖にハイブリダイズするのを促進するための少なくとも一つのオリゴヌクレオチドと、を含む。
本生産方法では、解離用オリゴヌクレオチドを、第１の及び第２のプライマーがハイブリダイズする鋳型鎖上のハイブリダイズ領域の近傍に介在させるようにすることが好ましい。こうすることで、これらハイブリダイズ領域における第１及び第２の伸長鎖とそれぞれの鋳型鎖との対合安定性を低下させることができる。この結果、第１及び第２の伸長鎖とそれぞれのハイブリダイズ領域との二本鎖部分の解離及び一本鎖化を促進して、新たな第１及び第２のプライマーを効果的に鋳型鎖にハイブリダイズさせることができる。
解離用オリゴヌクレオチドは、標的核酸の第１のハイブリダイズ領域及び第２のハイブリダイズ領域のそれぞれ近傍において、第１の鋳型鎖及び第２の鋳型鎖の少なくとも一方に対するハイブリダイゼーションを介して存在可能に構成されていることが好ましい。こうすることで、確実に、解離用オリゴヌクレオチドを第１及び第２のハイブリダイズ領域近傍に存在させることができ、ハイブリダイズ領域近傍における標的核酸の二本鎖解離及び第１及び第２のプライマーの各鋳型鎖へのハイブリダイズを促進できる。
解離用オリゴヌクレオチドは、各種態様を採ることができる。本生産方法においては、これらの各種態様を適宜組み合わせて用いることができる。以下、解離用オリゴヌクレオチドの作用について本生産方法における増幅工程を参照しつつ説明する。なお、増幅条件等については後段で説明する。
（解離用オリゴヌクレオチドの第１の態様）
解離用オリゴヌクレオチドは、例えば、プライマーとすることができる。図１には、第１のプライマー１０及び第２のプライマー２０と、これらに対して用いる解離用オリゴヌクレオチドとしての第３のプライマー３０及び第４のプライマー４０を示す。
図１において、第３のプライマー３０は、第１の鋳型鎖１００における第１のハイブリダイズ領域Ｈ１の近傍、すなわち、第１のハイブリダイズ領域Ｈ１よりも標的核酸Ｔの内側、すなわち、第１の鋳型鎖１００の５’末端側で、第２の鋳型鎖２００にハイブリダイズ可能に構成されている。第３のプライマー３０は、第１のハイブリダイズ領域Ｈ１の近傍で、第１のプライマー１０とは異なる伸長方向で伸長鎖を形成可能に構成されている。すなわち、第３のプライマー３０は、それ自身が第２の鋳型鎖２００又は第１の伸長鎖１２にハイブリダイズすることで、第１のハイブリダイズ領域Ｈ１近傍に存在するようになっている。
また、第４のプライマー４０は、第１の鋳型鎖２００における第２のハイブリダイズ領域Ｈ２の近傍、すなわち、第２のハイブリダイズ領域Ｈ１よりも標的核酸Ｔの内側、すなわち、第２の鋳型鎖２００の５’末端側で、第１の鋳型鎖１００にハイブリダイズ可能に構成されている。第４のプライマー４０は、第２のハイブリダイズ領域Ｈ２の近傍で、第２のプライマー２０とは異なる伸長方向で伸長鎖を形成可能に構成されている。すなわち、第４のプライマー４０は、それ自身が第１の鋳型鎖１００又は第２の伸長鎖２２にハイブリダイズすることで、第１のハイブリダイズ領域Ｈ２近傍に存在するようになっている。
以下、第３及び第４のプライマー３０、４０の作用について説明するが、以下の増幅工程はこうした態様の解離用オリゴヌクレオチドの作用についての推論であって、本明細書の開示を拘束するものではない。
図２に示すように、第１及び第２のプライマー１０、２０は、鋳型鎖１００、２００からなる二本鎖標的核酸に対してそれぞれハイブリダイズして、第１の伸長鎖１２及び第２の伸長鎖２２を合成する。その結果、第１及び第２のプライマー１０、２０から、それぞれ二本鎖Ａ２、Ａ１が新生される。
図３（ａ）に示すように、第３のプライマー３０は、第１の鋳型鎖１００における第１のハイブリダイズ領域Ｈ１の近傍、すなわち、第１のハイブリダイズ領域Ｈ１よりも新生二本鎖Ａ２の内側、すなわち、第１の鋳型鎖１００の５’末端側で、第１の伸長鎖１２にハイブリダイズする。換言すると、第３のプライマー３０は、第１の伸長鎖１２における第１のプライマー１０由来部分よりも３’側にハイブリダイズする。このため、第３のプライマー３０は、第１の伸長鎖１２を鋳型として３’方向（第１のプライマー１０の伸長方向とは逆方向）に伸長可能である。こうした第３のプライマー３０のハイブリダイズにより、新生二本鎖Ａ２のハイブリダイズ領域Ｈ１付近の対合は不安定となり、その解離が促進される。
また、第４のプライマー４０は、第１の鋳型鎖２００における第２のハイブリダイズ領域Ｈ２の近傍、すなわち、第２のハイブリダイズ領域Ｈ２よりも新生二本鎖Ａ１の内側、すなわち、第２の鋳型鎖２００の５’末端側で、第２の伸長鎖２２にハイブリダイズする。換言すると、第４のプライマー４０は、第２の伸長鎖２２における第２のプライマー２０由来部分よりも３’側にハイブリダイズする。このため、第４のプライマー４０は、第２の伸長鎖２２を鋳型として３’方向（第２のプライマー２０の伸長方向とは逆方向）に伸長可能である。こうした第４のプライマー４０のハイブリダイズにより、新生二本鎖Ａ１のハイブリダイズ領域Ｈ２付近の対応は不安定となり、その解離は促進される。
図３（ｂ）に示すように、かかる第３及び第４のプライマー３０、４０は、それぞれ、第１及び第２のプライマー１０、２０の伸長方向とは逆方向に第３の伸長鎖３２及び第４の伸長鎖４２を形成する。これにより、新生二本鎖Ａ２、Ａ１における第１及び第２のハイブリダイズ領域Ｈ１、Ｈ２の近傍における解離を一層確実に促進される。
この結果、図３（ｃ）に示すように、新たに第１及び第２のプライマー１０、２０が、鋳型鎖１００、２００にハイブリダイズする。そして、図３（ｄ）に示すように、新たに鋳型鎖１００、２００にハイブリダイズした第１及び第２のプライマー１０、２０は、それぞれ新たな伸長鎖１２’、２２’を形成して、二本鎖Ａ４、Ａ３を新生する。また、第３及び第４のプライマー３０、４０又はその伸長鎖３２、４２がハイブリダイズした当初の伸長鎖１２、２２を鋳型として第２及び第１のプライマー２０、１０がハイブリダイズして新たな伸長鎖２２’’、１２’’も合成される。
この結果、図３（ｅ）に示すように、新たに二本鎖Ａ５、Ａ６が新生し、併せて４つの二本鎖Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６が合成される。以下、第１及び第２のプライマー１０、２０が、新生二本鎖のハイブリダイズ領域Ｈ１、Ｈ２にハイブリダイズすることで、標的核酸は増幅される。
以上説明したように、第１の態様によれば、第１及び第２のハイブリダイズ領域Ｈ１、Ｈ２の近傍に、オリゴヌクレオチド断片としての第３及び第４のプライマー３０、４０を介在させて、標的核酸Ｔや増幅工程において生じうる新生二本鎖の対合を、ハイブリダイズ領域Ｈ１、Ｈ２近傍で阻害し不安定化し、解離を促進することができる。また、これらのプライマー３０、４０は、前記対合をより阻害する効果の高い伸長鎖３２、４２を生成することができる。以上のように、こうした第３及び第４のプライマー３０、４０により、新生二本鎖における伸長鎖１２、２２と鋳型鎖１００、２００との解離を促進することができ、温度変化を実質的に伴うことなく又は実質的な等温条件下で標的核酸を増幅することができる。
なお、図２〜図３においては、第１及び第２のプライマー１０、２０が鋳型１００、２００にハイブリダイズし、その後、第３及び第４のプライマー３０、４０がそれぞれの鋳型である伸長鎖１２、２２にハイブリダイズするように記載したが、これらのプライマーのハイブリダイズ態様は特に限定するものではないが。これらのプライマーの各鋳型鎖に対するハイブリダイズは同時進行的にあるいは相前後して生じると考えられる。すなわち、第１及び第２のプライマー１０、２０が鋳型鎖１００、２００にハイブリダイズするのに先行して又は同時的に、第３及び第４のプライマー３０、４０が、鋳型鎖２００、１００や伸長鎖１２、２２に対してハイブリダイズするなど、様々な態様でハイブリダイズが生じると考えられるが、いずれにしても、第１及び第２のプライマー１０、２０の鋳型鎖１００、２００や第２の伸長鎖２２、第１の伸長鎖１２へのハイブリダイズは促進される。
なお、第３のプライマー３０の第２の鋳型鎖２００又は第１の伸長鎖１２に対してハイブリダイズするための識別配列は、標的核酸配列及び他のプライマーとの関係で適宜設定できるが、既に説明した第１及び第２のプライマーにおけるのと同様の態様で特異性の高い配列及び長さを設定することができる。第４のプライマー４０の第１の鋳型鎖１００又は第２の伸長鎖２２に対する識別配列についても同様である。また、第３のプライマー３０は、ハイブリダイズ領域Ｈ１よりも標的核酸Ｔの内側において鋳型鎖２００又は伸長鎖１２にハイブリダイズ可能であれば、ハイブリダイズ領域Ｈ１と一部重複していてもよいが、増幅効率の観点からは、好ましくはハイブリダイズ領域Ｈ１とは完全に重複しないで鋳型鎖２００又は伸長鎖１２にハイブリダイズするように設計される。なお、ハイブリダイズ領域Ｈ１の５’末端から、どの程度離間して第３のプライマー３０のハイブリダイズ領域を設定するかは、特に限定するものではないが、例えば、ハイブリダイズ領域Ｈ１の５’末端から３塩基以上２０塩基以下離間して第３のプライマー３０のハイブリダイズ領域の５’末端が来るようにすることができる。より好ましくは５塩基以上１５塩基以下、さらに好ましくは５塩基以上１０塩基以下程度離間する。
また、第４のプライマー４０についても、第３のプライマー３０と同様にしてハイブリダイズ領域Ｈ２に対して各種態様を採ることができる。
（解離用オリゴヌクレオチドの第２の態様）
解離用オリゴヌクレオチドは、第１のプライマー及び／又は第２のプライマーの一部に備えるタグとすることもできる。図４には、第１のプライマー１０１０及び第２のプライマー１０２０を用いて、それぞれが標的核酸Ｔの鋳型鎖２００、１００をそれぞれ増幅する形態を示す。
図４に示すように、第１のプライマー１０１０は、解離用オリゴヌクレオチドとして第１のタグ１０３０を有し、第２のプライマー１０２０は、解離用オリゴヌクレオチドとして第２のタグ１０４０を有している。第１及び第２のタグ１０３０、１０４０は、第１及び第２のプライマー１０１０、１０３０の各ハイブリダイズ領域Ｈ１、Ｈ２の５’末端側に抑止要素を介して備えられる核酸増幅反応とは独立した天然核酸（天然ＤＮＡ）からなるタグである。
第１及び第２のタグ１０３０、１０４０は、第１及び第２のプライマー１０１０、１０２０が、鋳型鎖１００、２００又は伸長鎖２２、１２にハイブリダイズすることで、それぞれ、第１及び第２のハイブリダイズ領域Ｈ１、Ｈ２の近傍に存在することができるようになっている。
以下、第１及び第２のタグ１０３０、１０４０の作用について説明するが、以下の増幅工程はこうした態様の解離用オリゴヌクレオチドの作用についての推論であって、本明細書の開示を拘束するものではない。
図５に示すように、第１及び第２のプライマー１０１０、１０２０は、鋳型鎖１００、２００からなる二本鎖の標的核酸Ｔに対してそれぞれハイブリダイズする。この際、第１及び第２のタグ１０３０、１０４０は、鋳型鎖１００、２００を、第１及び第２のハイブリダイズ領域Ｈ１、Ｈ２の近傍でこれらの解離を促進するように作用する。
そして、第１及び第２のプライマー１０１０、１０２０は、第１及び第２の伸長鎖１０１２、１０２２を合成し、２つの二本鎖Ａ１、Ａ２が新生される。新生二本鎖Ａ１の鋳型鎖２００の３’末端、すなわち、ハイブリダイズ領域Ｈ２近傍（その３’末端側）には、第２のタグ１０４０が配置されている。また、新生二本鎖Ａ２の鋳型鎖１００の３’末端、すなわち、ハイブリダイズ領域Ｈ１の近傍（その３’末端側）には、第１のタグ１０３０が配置されている。こうしたタブ１０４０、１０３０の存在により、新生二本鎖Ａ１、Ａ２の第２及び第１のハイブリダイズ領域Ｈ２、Ｈ１近傍（より具体的には、その３’末端側）で、第１及び第２の伸長鎖１０１２、１０２２とその鋳型鎖１００、２００との対合が不安定化されその解離が促進される。
その結果、図６（ａ）に示すように、新たに第１のプライマー１０１０は、新生二本鎖Ａ２の第１のハイブリダイズ領域Ｈ１にハイブリダイズすることができる。また、第２のプライマー１０２０は、新生二本鎖Ａ１の第２のハイブリダイズ領域Ｈ２にハイブリダイズすることができる。これにより、図６（ｂ）に示すように、新たにハイブリダイズした第１及び第２のプライマー１０１０、１０２０は、それぞれ新たな伸長鎖１０１２’、１０２２’を形成して、二本鎖Ａ４、Ａ３を新生する。
また、図６（ｂ）に示すように、第１及び第２のプライマー１０１０、１０２０が、先に合成された伸長鎖１０２２、１０１２上のハイブリダイズ領域Ｈ１、Ｈ２にそれぞれハイブリダイズして、新たな伸長鎖１０１２’’、１０２２’’も合成される。この結果、図６（ｃ）に示すように、新たに二本鎖Ａ５、Ａ６が新生し、併せて４つの二本鎖Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６が合成される。以下、第１及び第２のプライマー１０１０、１０２０は、新生二本鎖のハイブリダイズ領域Ｈ１、Ｈ２にハイブリダイズすることで、標的核酸は増幅される。
以上説明したように、第２の態様によれば、第１及び第２のハイブリダイズ領域Ｈ１、Ｈ２の近傍に、第１及び第２のプライマー１０１０、１０２０に連結されるオリゴヌクレオチドである第１及び第２のタグ１０３０、１０４０をそれぞれ存在させて、標的核酸Ｔや増幅工程において生じうる新生二本鎖の対合を、ハイブリダイズ領域Ｈ１、Ｈ２でよく阻害し不安定化し、解離を促進することができる。これらのタグ１０３０、１０４０は、それ自体は標的核酸Ｔや新生二本鎖にハイブリダイズしないため、前記対合を阻害する効果がより高いと考えられる。以上のように、こうした第３及び第４のタグ１０３０、１０４０により、新生二本鎖における伸長鎖１２、２２と鋳型鎖１００、２００との解離を促進することができ、温度変化を実質的に伴うことなく又は実質的な等温条件下で標的核酸を増幅することができる。
なお、図５〜図６においては、第１及び第２のプライマー１０１０、１０２０が新生二本鎖Ａ２、Ａ１の鋳型鎖１００、２００にそれぞれハイブリダイズした後、プライマー１０１０、１０２０が新生二本鎖Ａ１、Ａ２の新生鋳型鎖１０２２、１０１２にハイブリダイズするように記載したが、これらのハイブリダイズは同時進行的にあるいは順不問で生じると考えられ、各プライマー１０１０、１０２０の相互作用により、実質的な温度変化を伴うことなく核酸増幅反応が進行するものと考えられる。
第１及び第２のタグ１０３０、１０４０は、実質的な等温条件下で核酸増幅可能な長さに設定される。特に限定するものではないが、例えば、こうしたタグの長さは、数〜２５塩基長以下程度とすることができ、好ましくは５塩基長以上２０塩基長以下程度、より好ましくは８塩基長以上１８塩基長以下程度とすることができる。
第１及び第２のタグ１０３０、１０４０の塩基配列としては、特に限定しないが、既に説明した配列番号１〜１００で表される塩基配列又はその相補的塩基配列（いずれも２３塩基長）の全体又はその一部の塩基配列を用いることができる。タグの塩基長は、例えば、５塩基以上であり、また例えば６塩基以上、また例えば７塩基以上、また例えば８塩基以上、また例えば９塩基以上、また例えば１０塩基以上、また例えば１１塩基以上、また例えば１２塩基以上、また例えば１３塩基以上、また例えば１４塩基長、また例えば１５塩基長、また例えば１６塩基長、また例えば１７塩基長、また例えば１８塩基長などとすることができる。
また、以上の説明においては、第１及び第２のタグ１０３０、１０４０を、「抑止要素」を介して天然ＤＮＡを備えるものとしたが、これに限定するものではない。本分野で汎用されるスペーサを伴ってあるいは伴うことなく、非天然核酸や対合しない非天然塩基を天然の糖−リン酸骨格やＧＮＡ骨格やＰＮＡ骨格に備えるものであってもよい。また、第１及び第２のタグ１０３０、１０４０には、タンパク質、蛍光物質、発色物質（標識要素であってもよい。）等、天然核酸との対合性や結合性を有しないものであれば特に限定することなく備えることができる。
また、解離用オリゴヌクレオチドは、第１の態様のみ、あるいは第２の態様のみを、特定の標的核酸の増幅に適用してもよいし、第１の態様と第２の態様とを組合せて、特定の標的核酸の増幅に用いることもできる。
さらに、本生産方法においては、上記した態様の解離用オリゴリボヌクレオチドのほか、第１及び第２のプライマーがターゲットとするよりもさらに外側（すなわち、標的核酸の上流側及び／又は下流側）にハイブリダイズするアウタープライマー又はそのセットを備えることができる。かかるアウタープライマー又はそのセットは、被験試料中に存在する可能性のある標的核酸に由来する鋳型鎖と相補的な伸長鎖とを解離させるのに効果的である。アウタープライマー又はそのセットは、第１及び第２のプライマーから０〜６０塩基程度の範囲で上流側及び／又は下流側に設定することができる。
本生産方法における、実質的な「等温条件」とは、実質的に一定の温度、すなわち核酸重合反応が行われる実質的に温度変化を伴うことがないことを意味している。実質的な等温条件又は実質的に温度変化を伴わないとは、温度変化が好ましくは５℃以内、より好ましくは３℃以内、さらに好ましくは２℃以内、なお好ましくは１℃以内を意味する。等温条件下での増幅反応のための等温としては、一般に反応の主生成物の融解温度（Ｔｍ；混合物中の潜在的に二本鎖である分子の半分が一本鎖の変性状態にある温度）より低い；すなわち一般に９０℃以下、通常は約５０〜７５℃、好ましくは約５５〜７０℃、又は６０〜７０℃、又はより好ましくは約６５℃である。
増幅工程は、ＤＮＡポリメラーゼ等の酵素反応に好適なｐＨを与える緩衝剤、酵素の触媒活性の維持やアニールのために必要な塩類、酵素の保護剤、更には必要に応じて融解温度（Ｔｍ）の調整剤等の共存下で行う。緩衝剤としては、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の中性から弱アルカリ性に緩衝作用を持つものが用いられる。ｐＨ は使用するＤＮＡポリメラーゼに応じて調整する。塩類としては、例えば、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、あるいは（ＮＨ４）2ＳＯ4等が、酵素の活性維持と核酸の融解温度（Ｔｍ）調整のために適宜添加される。酵素の保護剤としては、ウシ血清アルブミンや糖類が適宜利用される。さらに、融解温度（Ｔｍ）の調整剤には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）やホルムアミドが一般に利用される。
また、融解温度（Ｔｍ）の調整剤を利用することによって、前記オリゴヌクレオチドのアニールを限られた温度条件の下で調整することができる。さらに、ベタイン(N,N,N,-trimethylglycine)やテトラアルキルアンモニウム塩は、そのisostabilize作用によって鎖置換効率の向上にも有効である。ベタインは、反応液中０．２〜３．０Ｍ、好ましくは０．５〜１．５Ｍ程度の添加により、本生産方法における核酸増幅反応の促進作用を期待できる。これらの融解温度の調整剤は、融解温度を下げる方向に作用するので、塩濃度や反応温度等のその他の反応条件を考慮して、適切なストリンジェンシーと反応性を与える条件を経験的に設定する。
本生産方法では、増幅工程を等温条件で行うことができるが、例えば、等温増幅工程に先立って、二本鎖の標的核酸から一本鎖標的核酸を生成させるための加熱による変性工程を含むことができる。
本生産方法で用いる第１及び／又は第２のプライマーは、必要に応じて、標識要素を備えることができる。ここで標識要素とは、例えば、標識物質及び標識物質結合物質が挙げられる。本明細書において「標識物質」とは、検出しようとする物質あるいは分子を他と識別することを可能とする物質である。標識物質は、特に限定しないが、典型的には、蛍光、放射能、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等）、燐光、化学発光、着色などを利用した標識物質が挙げられる。
標識物質は、目視（肉眼）で検出可能な発光又は発色を提示する発光物質又は発色物質若しくは着色物質であることが好ましい。すなわち、直接それ自体が、他の成分を必要としないで肉眼で視認可能なシグナルを生成することができる物質であることが好ましい。特に、クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーションにおいて、より好適である。検出工程で迅速かつ簡易に行うことができる。こうした物質としては、典型的には、各種の顔料や染料などの各種の着色剤が挙げられる。また、これに準ずる、金、銀などの貴金属ほか、銅などの各種金属又は合金、あるいは当該金属を含む有機化合物（錯体化合物であってもよい）が挙げられる。また、着色剤に準ずる、マイカ等の無機化合物が挙げられる。
この種の標識物質としては、典型的には、各種染料、各種顔料、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウム化合物、オレフィン、エノールエーテル、エナミン、アリールビニルエーテル、ジオキセン、アリールイミダゾール、ルシゲニン、ルシフェリン及びエクリオンを包含する化学発光物質が挙げられる。また、こうした標識物質でラベルされているラテックス粒子などの粒子も挙げられる。さらに、金コロイド若しくはゾル又は銀コロイド若しくはゾルを包含するコロイド若しくはゾル等が挙げられる。さらにまた、金属粒子、無機粒子等が挙げられる。
標識物質は上記のように、その一部に粒子を備えていてもよい。標識物質の一部を構成するラテックス粒子などの粒子の平均粒子径は、特に限定しないが、例えば、０．１ｎｍ以上２０μｍ以下であり、固相担体の孔径等によって適宜選択することができる。
好ましい粒子は、水溶液に懸濁でき、そして水不溶性ポリマー材料からなる粒子である。例えばポリエチレン、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、アクリル酸ポリマー、メタクリル酸ポリマー、アクリロニトリルポリマー、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン、ポリビニルアセテート−アクリレート、ポリビニルピロリドン又は塩化ビニル−アクリレートが挙げられる。それらの表面上に活性基、例えばカルボキシル、アミノ又はアルデヒド基を有するラテックス粒子も挙げられる。
標識物質結合物質は、タンパク質−タンパク質相互作用、低分子化合物−タンパク質相互作用、核酸−核酸相互作用等を利用して、最終的に標識物質を結合できる物質が挙げられる。例えば、抗原抗体反応における抗体や、アビジン（ストレプトアビジン）−ビオチンシステムにおけるビオチン、抗ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）−ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）システムにおけるジゴキシゲニン、抗ＦＩＴＣ−ＦＩＴＣシステムにおけるＦＩＴＣ等に代表されるハプテン類及び互いにハイブリダイズ可能であるオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。この場合、最終的に検出のために用いられる標識物質は、標識物質結合物質と相互作用する他方の分子又は物質（例えば、抗原、すなわち、ストレプトアビジン、抗ＦＩＴＣ、オリゴヌクレオチドなど）を、標識物質結合物質との結合のための部位として備えるように構成される。
こうした標識物質や標識物質結合物質は商業的に入手できるほか、標識物質及び標識物質結合物質の製造及び標識物質等を粒子にラベルする方法も公知であり、当業者であれば適宜公知技術を利用して取得することができる。さらに、こうした標識物質又は標識物質でラベル化された粒子や標識物質結合物質と、ＤＮＡ等のオリゴヌクレオチドとの結合もアミノ基等の官能基を介して適宜可能であり、それ自体は当該分野において周知である。
なお、既述のように、標識要素は、解離用オリゴヌクレオチドの一部として用いることもできる。
以上説明したように、本生産方法によれば、実質的に温度変化を伴うことなく又は実質的な等温条件で、標的核酸を増幅することができる。
（標的核酸の検出方法）
本明細書に開示される標的核酸の検出方法（以下、本検出方法という。）は、第１のプライマー、第２のプライマー及び鎖置換活性を有する核酸ポリメラーゼ、を用いて、前記標的核酸を含む可能性のある被験試料に対して核酸増幅反応を実施する増幅工程と、前記増幅工程で得られる増幅産物の少なくとも一部を介して前記標的核酸を検出する工程と、を備えることができる。本検出方法では、増幅工程は、既に説明した、本生産方法における増幅工程としての各種態様を適宜採用することができる。
本検出方法における検出工程は、増幅産物の少なくとも一部を介して標的核酸を検出する。増幅産物は、通常、二本鎖の状態で得られる。したがって、適宜これを変性して一本鎖の状態とし、その一部とプローブ等のハイブリダイゼーションを用いて標的核酸を検出してもよい。また、第１及び第２のプライマーの少なくとも一方が増幅反応とは独立したタグを有するときには、二本鎖増幅産物を変性することなく当該タグとプローブ等とのハイブリダイゼーションを介して標的核酸を検出することができる。
さらに、例えば、増幅産物の少なくとも一部にハイブリダイズするインナープライマーセットを用いて増幅して、その増幅産物を検出することによっても、標的核酸を検出することができる。なお、インナープライマーを、本生産方法における増幅工程において同時に用いることもできる。インナープライマーは、標識要素を備えることができる。これにより、プライマーがタグを備えていて標識要素を付与し難い場合においても、増幅産物に標識要素を付与することができる。
増幅産物の少なくとも一部を介して標的核酸を分離・検出する具体的態様は、公知の各種の方法、例えば、プローブをマトリックス状に平板状固相担体に固定化したアレイ、プローブを固定化したビーズ、プローブを任意のパターンで多孔質性のストリップ等に固定化したクロマトグラフィー担体等を適宜用いることができる。
アレイに用いる固相担体、ビーズ状体、クロマトグラフィー用の多孔質担体としては、特に限定するものではなく、公知の各種担体を用いることができる。例えば、クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーションに用いる固相担体としては、例えば、ポリエーテルスルホン、ニトロセルロース、ナイロン、ポリフッ化ビニリデンなどのポリマーを主体としたいわゆる多孔質性の材料が挙げられる。また、ろ紙などのセルロース系材料も好ましく用いることができる。
また、プローブも、特に限定するものではなく、必要な特異性に基づいて適宜設定することができる。また、増幅産物の少なくとも一部とプローブ等とのハイブリダイゼーション条件、例えば、ｐＨ、塩濃度、温度、溶媒等についても当業者において周知の条件を適宜選択することができる。
検出方法の一部として、特に、クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーションは、ハイブリダイズ産物を含む核酸増幅反応液に固相担体の一部を浸漬するなどの極めて簡易な操作によって、ハイブリダイズ産物の分離・検出を行うことができる点において好ましい。加えて、実質的に温度制御することなく、５〜４０℃程度、好ましくは１５〜３５℃程度、特に室温程度とすることができる点においても有利である。さらに、その検出時間も、２分〜５０分以内、さらには５分〜３０分程度等、極めて短時間で終了することができる点においても好ましい。
また、増幅産物を検出するのにあたっては、第１及び第２のプライマーに予め付与された標識要素に基づくシグナルを検出するほか、検出工程において増幅産物の少なくとも一部に結合するように構成した標識要素を用いることもできるほか、物理化学的に検出可能な各種の検出方法等を適宜採用できる。増幅産物の少なくとも一部を用いて標識要素その他に基づいて標的核酸を検出する方法は、当該分野において周知であり、当業者は必要に応じて適切な方法を選択することができる。
（標的核酸を増幅するためのキット）
本明細書に開示される標的核酸を増幅するためのキットは、標的核酸の５‘側にハイブリダイズする第１のプライマーと、標的核酸の３’側にハイブリダイズする第２のプライマーと、第１のプライマーの伸長鎖である第１の伸長鎖及び前記第２のプライマーの伸長鎖である第２の伸長鎖とそれらの各鋳型鎖との解離を促進可能な２以上のオリゴヌクレオチドと、を備えることができる。本キットによれば、実質的に温度変化を伴うことなく又は実質的な等温条件で、標的核酸を増幅することができる。
本キットにおける第１及び第２のプライマー、２以上のオリゴヌクレオチドについては、既に説明した本生産方法におけるこれらの各種態様を適用することができる。さらに、本キットは、ＤＮＡの増幅等に一般的に必要なｄＮＴＰを備えていてもよい。さらにまた、本キットは、アウタープライマー又はそのセットを備えることもできる。
本キットは、増幅産物を用いて標的核酸を検出するためのキットとしても用いることができる。検出のためのキットとしては、さらに、増幅産物の少なくとも一部をハイブリダイズするプローブ、インナープライマー、標識要素、プローブを固定化した各種担体他を、適宜備えることができる。
以下、本明細書の開示を具現化した具体例を、実施例を挙げて説明するが、本明細書の開示は以下の実施例に限定されるものではない。
本実施例では、標的核酸として、結核菌から抽出されたゲノムＤＮＡの一部とした。すなわち、結核菌から抽出されたゲノムＤＮＡを準備し、以下に示す２つのプライマーセットで増幅し、クロマトグラフィーにて分離検出した。図７に、標的核酸に対する第１のプライマー、第２のプライマー、第３のプライマー、第４のプライマーと、第５のプライマー及び第６のプライマーのハイブリダイズ領域の構成を示す。なお、第３のプライマー及び第４のプライマーは、それぞれ本明細書に開示される２以上のオリゴヌクレオチドの一例である。第５及び第６のプライマーは、第１のプライマー及び第２のプライマーの伸長鎖等を相補鎖から解離させるためのアウタープライマーである。
第１のプライマー（Ｆ）：ビオチン-cgc cta cgt ggc ctt tgt cac (21mer)（配列番号１０１）
第２のプライマー（Ｒ）：tag2-aga tcc cct atc cgt atg gtg gat (24mer）（配列番号１０２）
第３のプライマー（Ｆ）：agg atc ctg cga gcg tag (18mer)（配列番号１０３）
第４のプライマー（Ｒ）：aag aag gcg tac tcg acc tg (20mer)（配列番号１０４）
第５のプライマー（Ｆ）：aga cct cac cta tgt gtc ga (20mer)（配列番号１０５）
第６のプライマー（Ｒ）：tcg ctg aac cgg atc ga (17mer)（配列番号１０６）
（１）クロマトグラフィー用ストリップの作製
クロマトグラフィー用ストリップは、図８に示すように、第２のプライマーに結合したタグ配列（ｔａｇ２）（配列番号１０）及び後述する実施例２において用いる第１のプライマーに結合したタグ配列（ｔａｇ１）にそれぞれハイブリダイズする捕捉プローブ（タグ２、タグ１）をライン状に固定化した。すなわち、メルクミリポア製Hi-Flow Plus メンブレンシート（６０ｍｍ×６００ｍｍ）に捕捉プローブ溶液を、特開２００３−７５３０５号公報に記載されている吐出ユニット（インクジェット法）を用いた日本ガイシ株式会社ＧＥＮＥＳＨＯＴ（登録商標）スポッターを用いて、スポットした。なお、捕捉プローブの３’末端側にpolyT(20)を付加した配列をプローブとして使用し、Spectroline社のＵＶ照射装置（ＸＬ−１５００ＵＶ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ）を用いて、２８０ｎｍの成分を含む波長にて３００ｍＪ／ｃｍ2程度の紫外線光の照射を行って固定化を実施した。
（２）ターゲット遺伝子の増幅
結核菌から抽出したゲノムＤＮＡを被験試料として用い、第１のプライマーセット及び第２のプライマーセットをそれぞれ用いて標的核酸を増幅した。遺伝子増幅酵素はニッポン・ジーン社のBst DNA polymeraseを用い、サーマルサイクラーはタカラバイオ社のＤＩＣＥを用いた。
増幅反応液は、以下に示す通りとした。増幅反応液１は、本明細書の開示の実施例であり、増幅反応液２は、比較例に相当する。
（増幅反応液１）
滅菌水 残部
10×Bst reaction buffer 1.0μl
10mM dNTPmix 1.4μl
×3,000SYBRgreenI 1.0μl
第１のプライマー 8pmol
第２のプライマー 8pmol
第３のプライマー 2pmol
第４のプライマー 2pmol
第５のプライマー 2pmol
第６のプライマー 2pmol
Bst DNA polymerase(8U/μl) 0.6μl
ゲノムＤＮＡ（20,2,0.2,0.02,0pg/μl） 1.0μl
計 10.0μl
（増幅反応液２）
滅菌水 残部
10×Bst reaction buffer 1.0μl
10mM dNTPmix 1.4μl
×3,000SYBRgreenI 1.0μl
第１のプライマー 8pmol
第２のプライマー 8pmol
第５のプライマー 2pmol
第６のプライマー 2pmol
Bst DNA polymerase(8U/μl) 0.6μl
ゲノムＤＮＡ（20,2,0.2,0.02,0pg/μl） 1.0μl
計 10.0μl
サーマルサイクラーを用いて下記の条件で遺伝子の増幅反応（６５℃で１０秒保存の後、６５℃で保温しながら、１分ごとに蛍光強度を６０回測定）した。増幅反応液１について、２ｐｇ以上の被検ＤＮＡを含む場合、時間が経つにつれて、蛍光強度が増加していった。
（３）クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション及び検出
図９に示すようにして、下記の展開液にストリップの下端を浸漬して展開した。なお、ラテックス液には、ストレプトアビジンを結合した青色に着色したビーズを用いた。
（展開液）
増幅反応液 1.0μl
展開液 10.0μl
純水 9.0μl
ラテックス液 1.0μl
計 21.0μl
展開液はストリップ上部まで約１５分で全て吸い上がり反応は終了した。反応終了後、目視にてストリップ上の検出ラインへの着色を確認した。結果を図１０に示す。
図１０に示すように、増幅反応液１では、タグ２に相補的なプローブにおいてハイブリダイズ産物を検出することができた。また、鋳型ＤＮＡ２ｐｇ／ｔｅｓｔまでバンドが認められたが、増幅反応液２では、すべての反応液でバンドが認められなかった。
したがって、第３及び第４のプライマーを加えることで、効率よく等温増幅反応がおこり、標的核酸が増幅されたことがわかった。なお、増幅反応液１において、第５及び第６のプライマー（アウタープライマーセット）を用いない増幅反応液を別途調製して、アウタープライマーセットの影響について確認したところ、増幅反応液１と同程度の検出感度を確認できた。
本実施例では、実施例１と同様の標的核酸を検出するために、結核菌から抽出されたゲノムＤＮＡを準備し、以下に示すプライマーで増幅し、クロマトグラフィーにて分離検出した。第１のプライマー及び第２のプライマーにおけるタグとゲノムＤＮＡに相補な領域との間には、GlenResearch社のホスホアミダイト試薬であるSpacer PhophoamiditeＣ３を用いて通常のオリゴヌクレオチド合成方法に準じて合成して、ポリメラーゼ反応を抑制するプロピレン基をスペーサ(抑制要素)として導入した。なお、第１のプライマーが備えるタグ（ｔａｇ１（配列番号１）及び第２のプライマーが備えるタグ（ｔａｇ２）（配列番号１０）は、それぞれ本明細書に開示される２以上のオリゴヌクレオチドの他の一例である。また、ビオチン付きインナープライマーは、第１のプライマー及び第２のプライマーによる増幅産物の内部にハイブリダイズして第１のプライマーに付与したタグ（ｔａｇ１）を備えて、タグ１に相補的なプローブで検出可能なＤＮＡ二本鎖を得るためのものである。第３及び第４のプライマーは、アウタープライマーセットに相当する。
第１のプライマー（Ｆ）：tag1-cgc cta cgt ggc ctt tgt cac (21mer)（配列番号１０１）
第２のプライマー（Ｒ）：tag2-aga tcc cct atc cgt atg gtg gat （24mer）（配列番号１０２）
第３のプライマー（Ｆ）：aga cct cac cta tgt gtc ga (20mer)（配列番号１０５）
第４のプライマー（Ｒ）：tcg ctg aac cgg atc ga (17mer)（配列番号１０６）
Biotinインナープライマー：biotin-gct cga tcg cgt cga gga (18mer)（配列番号１０７）
（１）クロマトグラフィー用ストリップの作製
クロマトグラフィー用ストリップは、実施例１に準じて、図８に示すように、第１及び第２のプライマーに結合させたタグ配列（ｔａｇ１、２）に相補的な捕捉プローブをライン状に固定化した。
（２）ターゲット遺伝子の増幅
増幅反応液は以下に示す組成とする以外は、実施例１と同様にして標的核酸を増幅した。
（増幅反応液）
滅菌水 残部
10×Bst reaction buffer 1.0μl
10mM dNTPmix 1.4μl
×3,000SYBRgreenI 1.0μl
第１のプライマー 16pmol
第２のプライマー 16pmol
第３、第４のプライマー 各2.0pmol
Biotinインナープライマー： 5pmol
Bst DNA polymerase(8U/μl) 0.6μl
ゲノムDNA（20,2,0.2pg/μl） 1.0μl
計 10.0μl
サーマルサイクラーを用いて下記の条件で遺伝子の増幅反応（６５℃で１０秒保存後、そのまま６５℃で保温しながら、１分ごとに蛍光強度を９０回測定）した。２ｐｇ以上の被検ＤＮＡを含む場合、時間が経つにつれて、蛍光強度が増加していった。
（３）クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション及び検出
実施例１と同様にして、ストリップの下端を浸漬して展開した。結果を図１１に示す。
図１１に示すように、タグ１に相補的なプローブにおいてハイブリダイズ産物を検出することができた。また、鋳型ＤＮＡ０．２ｐｇ／ｔｅｓｔまでバンドが認められた。以上のことから、等温増幅反応により、標的核酸が増幅されることがわかった。なお、上記増幅反応液において、第３及び第４のプライマー（アウタープライマーセット）を用いない増幅反応液を別途調製して、アウタープライマーセットの影響について確認したところ、増幅反応液と同程度の検出感度を確認できた。
本実施例では、標的核酸を、抗酸菌（M.intracellulare）から抽出されたゲノムＤＮＡの一部とした。すなわち、結核菌から抽出されたゲノムＤＮＡを準備し、以下に示す２つのプライマーセットで増幅し、クロマトグラフィーにて分離検出した。第１及び第２のプライマーは、標的核酸を増幅するためのプライマーであり、第３のプライマー及び第４のプライマーは、それぞれ本明細書に開示される２以上の解離用オリゴヌクレオチドの一例である。なお、第２のプライマーが有するｔａｇ２の塩基配列は、配列番号１０である。第５及び第６のプライマーは、第１のプライマー及び第２のプライマーの伸長鎖等を相補鎖から解離させるためのアウタープライマーセットである。
第１のプライマー（Ｆ）：ビオチン- caa gtc ggc cca gga aaa (18mer)（配列番号１０８）
第２のプライマー（Ｒ）：tag2- gac ctt tgc cgt cga agt c（19mer）（配列番号１０９）
第３のプライマー（Ｆ）：cag tcg att ccg ccg c (16mer) （配列番号１１０）
第４のプライマー（Ｒ）：gag ccc gat cca gca ga (17mer) （配列番号１１１）
第５のプライマー（Ｆ）：acg agg tcg tca gcg ata c (19mer) （配列番号１１２）
第６のプライマー（Ｒ）：gca cgg att ccg agt agc(18mer) （配列番号１１３）
（１）クロマトグラフィー用ストリップの作製
クロマトグラフィー用ストリップは、実施例１に準じて、ｔａｇ２に相補的なプローブを、ライン状に固定化した。
（２）ターゲット遺伝子の増幅
抗酸菌（M.intracellulare）から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型（試料）として用い、以下に示す第１のプライマーセット及び第２のプライマーセットをそれぞれ用いて増幅した。遺伝子増幅酵素は、ニッポン・ジーン社のBst DNA polymeraseを用い、サーマルサイクラーはタカラバイオ社のＤＩＣＥを用いた。
増幅反応液は、以下に示す通りとした。増幅反応液１は、本明細書に開示される実施例であり、増幅反応液２は、比較例に相当する。
（増幅反応液１）
滅菌水 残部
10×Bst reaction buffer 1.0μl
10mM dNTPmix 1.4μl
×3,000SYBRgreenI 1.0μl
第１のプライマー 8pmol
第２のプライマー 8pmol
第３のプライマー 4pmol
第４のプライマー 4pmol
第５のプライマー 2pmol
第６のプライマー 2pmol
Bst DNA polymerase(8U/μl) 0.6μl
ゲノムDNA（100,10,2,0pg/μl） 1.0μl
計 10.0μl
（増幅反応液２）
滅菌水 残部
10×Bst reaction buffer 1.0μl
10mM dNTPmix 1.4μl
×3,000SYBRgreenI 1.0μl
第１のプライマー 8pmol
第２のプライマー 8pmol
第５のプライマー 2pmol
第６のプライマー 2pmol
Bst DNA polymerase(8U/μl) 0.6μl
ゲノムDNA（100,10,2,0pg/μl） 1.0μl
計 10.0μl
サーマルサイクラーを用いて下記の条件で遺伝子の増幅反応（６８℃で１０秒保存の後、６８℃で保温しながら、１分ごとに蛍光強度を６０回測定）した。結果を図１２に示す。図１２に示すように、時間が経つにつれて、蛍光強度が増加していった。
（３）クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション及び検出
下記の展開液を用いる以外は、実施例１と同様に操作して、にストリップの下端を浸漬して展開した。
（展開液）
増幅反応液 1.0μｌ
展開液 10.0μl
純水 9.0μl
ラテックス液 1.0μl
計 21.0μl
展開液はストリップ上部まで約１５分で全て吸い上がり反応は終了した。反応終了後、目視にてストリップ上の検出ラインへの着色を確認した。結果を図１３に示す。
図１３に示すように、増幅反応液１では、鋳型ＤＮＡ１０ｐｇ／ｔｅｓｔまでバンドが認められたが、増幅反応液２では、すべての反応液でバンドが認められなかった。
したがって、第３及び第４のプライマーを加えることで、効率よく等温増幅反応がおこり、標的核酸が増幅され、核酸クロマトフラフィーで検出されることがわかった。なお、増幅反応液１において、第５及び第６のプライマー（アウタープライマーセット）を用いない増幅反応液を別途調製して、アウタープライマーセットの影響について確認したところ、増幅反応液１と同程度の検出感度を確認できた。
本明細書に開示される特許文献及び非特許文献に記載される全内容は、参照により本明細書の組み込まれるものとする。
配列表フリーテキスト
配列番号１〜１１３：合成オリゴヌクレオチド

Claims (16)

  1. 標的核酸の増幅産物の生産方法であって、
    第１のプライマー、第２のプライマー及び鎖置換活性を有する核酸ポリメラーゼ、を用いて、前記標的核酸を含む可能性のある被験試料に対して核酸増幅反応を実施する増幅工程、
    を備え、
    前記増幅工程は、前記標的核酸の二本鎖の解離を促進可能な２以上のオリゴヌクレオチドを用いる工程である、生産方法。
  2. 前記２以上のオリゴヌクレオチドは、第１の鋳型鎖上において前記第１のプライマーがハイブリダイズする第１のハイブリダイズ領域及び第２の鋳型鎖上において前記第２のプライマーがハイブリダイズする第２のハイブリダイズ領域のそれぞれ近傍において、前記第１の鋳型鎖及び前記第２の鋳型鎖の少なくとも一方に対するハイブリダイゼーションを介して存在可能に構成されている、請求項１に記載の生産方法。
  3. 前記２以上のオリゴヌクレオチドは、前記第１のハイブリダイズ領域の近傍で前記第２の鋳型鎖にハイブリダイズする第３のプライマーと、前記第２のハイブリダイズ領域の近傍で前記第１の鋳型鎖にハイブリダイズする第４のプライマーと、を含む、請求項１又は２に記載の生産方法。
  4. 前記第３のプライマーは、前記第１のハイブリダイズ領域よりも前記標的核酸の内側で前記第２の鋳型鎖にハイブリダイズし、
    前記第４のプライマーは、前記第２のハイブリダイズ領域よりも前記標的核酸の内側で前記第１の鋳型鎖にハイブリダイズする、請求項３に記載の生産方法。
  5. 前記２以上のオリゴヌクレオチドは、前記第１のプライマーの５’末端側に備えられ、核酸増幅反応に対して独立である第１のタグと、前記第２のプライマーの５’末端側に備えられ、核酸増幅反応に対して独立である第２のタグと、を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の生産方法。
  6. 前記第１のプライマーは、前記第１のタグを、スペーサを介して備え、前記第２のプライマーは、前記第２のタグを、スペーサを介して備える、請求項５に記載の生産方法。
  7. 前記スペーサは、前記鎖置換活性を有する核酸ポリメラーゼによる核酸合成反応を抑制又は停止可能である、請求項６に記載の生産方法。
  8. 前記第１及び前記第２のプライマーの少なくとも一方が、標識要素を備える、請求項１〜７のいずれかに記載の生産方法。
  9. 前記標識要素は、標識物質又は標識物質結合物質である、請求項８に記載の生産方法。
  10. 前記増幅工程を、実質的な温度変化を伴うことなく実施する、請求項１〜９のいずれかに記載の生産方法。
  11. 標的核酸の検出方法であって、
    第１のプライマー、第２のプライマー及び鎖置換活性を有する核酸ポリメラーゼ、を用いて、前記標的核酸を含む可能性のある被験試料に対して核酸増幅反応を実施する増幅工程と、
    前記増幅工程で得られる増幅産物の少なくとも一部を介して前記標的核酸を検出する工程と、
    を備え、
    前記増幅工程は、前記標的核酸の二本鎖の解離を促進可能な２以上のオリゴヌクレオチドを用いる工程である、検出方法。
  12. 前記検出工程は、前記増幅産物の前記少なくとも一部を介してクロマトグラフィーによって分離することを含む、請求項１１に記載の検出方法。
  13. 前記検出工程は、前記増幅産物の一部にハイブリダイズするインナープライマーを用いて前記標的核酸に標識要素を付与することを含む、請求項１１に記載の検出方法。
  14. 標的核酸を増幅するためのキットであって、
    第１のプライマーと
    第２のプライマーと、
    前記標的核酸の二本鎖の解離を促進可能な２以上のオリゴヌクレオチドと、
    を備える、キット。
  15. 前記２以上のオリゴヌクレオチドは、第１の鋳型鎖上において前記第１のプライマーがハイブリダイズする第１のハイブリダイズ領域及び第２の鋳型鎖上において前記第２のプライマーがハイブリダイズする第２のハイブリダイズ領域のそれぞれ近傍において、前記第１の鋳型鎖及び前記第２の鋳型鎖の少なくとも一方に対するハイブリダイゼーションを介して存在可能に構成されている、請求項１４に記載のキット。
  16. 標的核酸を検出するためのキットであって、
    第１のプライマーと
    第２のプライマーと、
    前記標的核酸の二本鎖の解離を促進可能な２以上のオリゴヌクレオチドと、
    を備える、キット。
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