JP2010041985A - 核酸配列増幅方法、核酸配列の検出方法及び核酸増幅・検出用基板 - Google Patents
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Abstract
【課題】基板上における高効率な核酸増幅、高感度な核酸検出を可能な核酸検出方法及びそれに適した基板を提供すること。
【解決手段】標的核酸配列に対応するプライマーの5’末端を固定化した基板表面において,標的核酸を含む試料、核酸合成酵素,dNTPの存在下で、前記標的核酸を鋳型とした核酸増幅反応を行い,引き続き基板上において増幅物を検出する。
【選択図】図2
【解決手段】標的核酸配列に対応するプライマーの5’末端を固定化した基板表面において,標的核酸を含む試料、核酸合成酵素,dNTPの存在下で、前記標的核酸を鋳型とした核酸増幅反応を行い,引き続き基板上において増幅物を検出する。
【選択図】図2
Description
本発明は、核酸配列増幅方法、核酸配列の検出方法及び核酸増幅・検出用基板に関する。
標的核酸配列の検出法としては,電気泳動や固相に固定化したプローブにハイブリダイゼーションさせて検出する方法が一般的であった。しかしながら,これらの核酸検出法は感度が低く,低濃度核酸を検出する際には予め核酸増幅を行う必要があった。
核酸の増幅技術としては,PCR(Polymerase Chain Reaction)が一般的である。PCRの問題点としては,その核酸合成反応が複雑な温度制御を必要とすること,数塩基違いの鋳型核酸に対して特異的な増幅が難しいこと等が指摘されている。
LAMP(Loop−mediated isothermal amplificationの略)法は栄研化学株式会社が開発した核酸増幅法であって,増幅生成物の同一鎖上末端に互いに相補的な配列が生成し,これらがアニールしてヘアピン状のループが形成され,そのループを起点としたポリメラーゼによる伸長反応が起きる。同時に,ループ内にアニールしたプライマーからは鎖置換型伸長反応が起こり,先の伸長生成物を1本鎖に解離させていく。解離した1本鎖もまた、末端に相補的配列を有するため、この反応は繰り返し起きる。こうして,固定化プライマーループ増幅法では増幅生成物の同一鎖上の複数の位置で,伸長反応と増幅反応が同時進行するため,DNAの増幅が超指数関数的にしかも等温条件下で達成される。LAMP法に関係する技術が特許文献1に開示されている。
従来,DNA基板上において特定の核酸配列の有無を調べるハイブリダイゼーション法では基板上での核酸増幅の工程がないため,検出の感度が低く,微量核酸の検出には前処理としてPCRによる予備増幅が不可欠であった。
これに対して,核酸増幅反応と核酸検出工程を同一系で行う反応が開発されている。
MPEX(Multiple Primers EXtensionの略)法は住友ベークライトが開発した基板上での核酸増幅法であって、親水性ポリマーからなる層,およびアミノ基と反応する官能基を表面に有する基板上に1種類のプライマーの5’末端を固定化し,標的核酸を1本鎖の状態で添加することで固定化プライマー標的核酸をアニールさせる。この固定化プライマーが標的核酸を鋳型に伸長することで,標的核酸に相補的な配列を基板上に合成する。予め,反応液にヘリカーゼを添加しておくことで再び標的核酸は1本鎖に解離し,次のプライマーにアニールするため,この反応は繰返し起きる。このように,MPEX法では標的核酸を鋳型にした伸長反応が順次起きることで等温条件下において核酸が増幅されるが,その増幅効率は標的核酸の初期濃度に大きく影響を受けることから,低濃度検体からの核酸検出を行うに十分な感度は得られていない。
その他の従来技術として、(US 7,115,400 B1) Methods of nucleic acid amplification and sequencingに示すように、固定化プライマーを用いて架橋構造を形成しながら固相で核酸増幅反応を行う方法が提案されている。この従来例は、プライマー5’末端を基板上に固定化して核酸増幅を行うが、反応温度を制御する必要がある(増幅手法がPCRと同一であるため)。また、標的核酸の検出ではなく,核酸配列の決定を目的としているので、固定化プライマーが標的核酸の相補配列ではない(検出目的でないため)といった特徴を有している。
さらに、(特開2005-218439)核酸検出用チップにおいては、固相核酸増幅を行い,続いて,基板上において核酸増幅反応を等温下で行って増幅産物を検出することを目的しているが、プライマーの固定化方式について具体的な増幅メカニズムの開示がない。
本発明の目的は基板上における高効率な核酸増幅、高感度な核酸検出を,等温下で可能な核酸検出方法及びそれに適した基板を提供することである。
本発明は、標的核酸配列を鋳型として、等温条件下での核酸増幅反応を可能とするプラマーセットの5’末端を固定化したことを特徴とする基板である。
更に、本発明は、次のような標的核酸配列の固相増幅用チップを提案する。
これを、図1(a)〜(d)を参照して説明すると次のようになる。なお、以下の構成要素に付した符号は、本発明の理解を容易にするために便宜上、図面の引用符号を用いたが、この符号に発明が限定されるものではない。
すなわち、本願発明の固相増幅用チップは、基板に5’末端が共有結合により固定化された複数の第1の固定化プライマー(FIP1)と、同じく前記基板に5’末端が共有結合により固定化された複数の第2の固定化プライマー(BIP1)とを備える。そして、前記第1及び第2の固定化プライマーは、異なる配列構造であって、等温反応の下で次の核酸増幅を行うため下記の構造を有する。すなわち、前記第1の固定化プライマー(FIP1)は、試料に含まれる鋳型核酸中の標的核酸配列の3’末端の配列部(F2c)にハイブリダイズして伸長反応して第1の合成鎖を生成可能な第1の配列部(F2)と、核酸合成酵素の鎖置換活性により前記鋳型核酸が前記第1の合成鎖から離れて第1の合成鎖が単鎖化すると、前記第1の合成鎖の一部(F1)と5’末端側で自己相補結合して第1の合成鎖をループ化し得る第2の配列部(F1c)とを備える。
また、前記第2の固定化プライマー(BIP1)は、自己相補結合によりループ化された前記第1の合成鎖の標的核酸配列の3’末端の配列部(B2c)にハイブリダイズして伸長反応して第2の合成鎖を生成する第1の配列部(B2)と、鎖置換により前記第1の合成鎖が前記第2の合成鎖から離れて第2の合成鎖が単鎖化すると、前記第2の合成鎖の一部(B1)と第2の固定化プライマーの5’末端側で自己相補結合して第2の合成鎖をループ化させる第2の配列部(B1c)とを備える。
さらに、固相増幅用チップは、以後、上記のようなループ化を伴って固定化プライマーで生成された合成鎖が、合成鎖未生成の他の第1の固定化プライマー(FIP2)及び第2の固定化プライマー(BIP2)の鋳型核酸に使用されて、この他の第1の固定化プライマー及び第2の固定化プライマーにて、上記同様の伸長反応による核酸増幅、単鎖化、自己相補結合によるループ化を順次繰り返すことが可能にしてあることを特徴とする。
また、上記の複数の固定化第1プライマー及び固定化第2プライマーを有する固相増幅用チップを使用して、且つ鋳型核酸を含む試料、標的核酸配列よりも3’側にある非固定化プライマーおよび鎖置換活性を有する核酸合成酵素を用意して、等温反応の下で、以下の一連の固相核酸増幅工程が行われ核酸増幅方法を提案する。
すなわち、第1の固定化プライマー(FIP1)の第1配列部(F2)が、試料に含まれる鋳型核酸中の標的核酸配列の3’末端の配列部(F2c)にハイブリダイズして伸長反応して前記標的核酸配列と相補の第1の合成鎖を生成する工程、
非固定化プライマーの伸長による鎖置換により前記鋳型核酸を前記第1の合成鎖から離して第1の合成鎖を単鎖化し、第1の固定化プライマー(FIP1)の第2の配列部(F1c)により前記第1の合成鎖の一部(F1)と5’末端側で自己相補結合して第1の合成鎖をループ化する工程、
第2の固定化プライマー(BIP1)の第1の配列部(B2)が、自己相補結合によりループ化された前記第1の合成鎖の標的核酸配列の3’末端の配列部(B2c)にハイブリダイズして伸長反応して第2の合成鎖を生成する工程、
非固定化プライマーの伸長による鎖置換により前記第1の合成鎖を前記第2の合成鎖から離して第2の合成鎖を単鎖化し、第2の固定化プライマー(BIP1)の第2の配列部(B1c)により第2の合成鎖の一部配列(B1)と第2の固定化プライマーの5’末端側で自己相補結合して第2の合成鎖をループ化する工程、
以後、上記のようなループ化を伴って固定化プライマーの伸長によって生成された合成鎖が、合成鎖未生成の他の第1の固定化プライマー(FIP2)及び第2の固定化プライマー(BIP2)の鋳型核酸に使用されて、この他の第1の固定化プライマー及び第2の固定化プライマーにて、上記同様の伸長反応による核酸増幅、単鎖化、自己相補結合によるループ化を順次繰り返すことにより標的核酸を固相増幅することを特徴とする標的核酸配列の固相増幅方法。
非固定化プライマーの伸長による鎖置換により前記鋳型核酸を前記第1の合成鎖から離して第1の合成鎖を単鎖化し、第1の固定化プライマー(FIP1)の第2の配列部(F1c)により前記第1の合成鎖の一部(F1)と5’末端側で自己相補結合して第1の合成鎖をループ化する工程、
第2の固定化プライマー(BIP1)の第1の配列部(B2)が、自己相補結合によりループ化された前記第1の合成鎖の標的核酸配列の3’末端の配列部(B2c)にハイブリダイズして伸長反応して第2の合成鎖を生成する工程、
非固定化プライマーの伸長による鎖置換により前記第1の合成鎖を前記第2の合成鎖から離して第2の合成鎖を単鎖化し、第2の固定化プライマー(BIP1)の第2の配列部(B1c)により第2の合成鎖の一部配列(B1)と第2の固定化プライマーの5’末端側で自己相補結合して第2の合成鎖をループ化する工程、
以後、上記のようなループ化を伴って固定化プライマーの伸長によって生成された合成鎖が、合成鎖未生成の他の第1の固定化プライマー(FIP2)及び第2の固定化プライマー(BIP2)の鋳型核酸に使用されて、この他の第1の固定化プライマー及び第2の固定化プライマーにて、上記同様の伸長反応による核酸増幅、単鎖化、自己相補結合によるループ化を順次繰り返すことにより標的核酸を固相増幅することを特徴とする標的核酸配列の固相増幅方法。
本発明によれば、短時間に多数種の標的核酸を増幅することができ、かつ増幅した核酸を高精度で検出することができる。また、上記増幅、検出に適した基板を提供することができる。
<基板上での固定化に関して>
プライマーの固定化に用いるスペーサー/リンカーとしては,基板上に表面処理されている固定化試剤化合物とプライマーとの間で両者を結びつける2官能性化合物であればよい。スペーサー/リンカーとしての使用に適した化合物には,MMTr-EC Amino-Linker(SIGMA-ALDRICH),NH2(C6) (SIGMA-ALDRICH)等が挙げられるが,特にこれらに限定されるものではない。
<標的核酸配列に関して>
本発明において標的核酸配列とはF2cの3’末端からB2の5’末端までの範囲の配列および前記配列と対となる相補鎖配列,B2cの3’末端からF2の5’末端までの範囲の配列のこととする。
<RNAを標的核酸とする場合>
標的核酸がRNAの場合には,異なる方法によって図1b(4)の状態を実現することができる。すなわち,RNAを鋳型として,配列中のF2cにハイブリダイズするF2からの逆転者反応によって相補鎖(cDNA)合成を固定化状態で行う。続いて,非固定化プライマーF3が鋳型核酸上のF3cにハイブリダイズして相補鎖合成と鎖置換を行うことで,F2から合成された前記相補鎖配列B2cにハイブリダイズするB2の伸長反応を可能とする。この際,使用する核酸合成酵素としては逆転写活性と鎖置換活性を併せ持つBca DNAポリメラーゼのようなDNAポリメラーゼを使用することが望ましいが,以降の核酸合成過程の反応条件下において,前記逆転写酵素にDNA/DNAの鎖置換活性が期待できない場合には,前述の鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼを組み合わせて用いることが望ましい。
プライマーの固定化に用いるスペーサー/リンカーとしては,基板上に表面処理されている固定化試剤化合物とプライマーとの間で両者を結びつける2官能性化合物であればよい。スペーサー/リンカーとしての使用に適した化合物には,MMTr-EC Amino-Linker(SIGMA-ALDRICH),NH2(C6) (SIGMA-ALDRICH)等が挙げられるが,特にこれらに限定されるものではない。
<標的核酸配列に関して>
本発明において標的核酸配列とはF2cの3’末端からB2の5’末端までの範囲の配列および前記配列と対となる相補鎖配列,B2cの3’末端からF2の5’末端までの範囲の配列のこととする。
<RNAを標的核酸とする場合>
標的核酸がRNAの場合には,異なる方法によって図1b(4)の状態を実現することができる。すなわち,RNAを鋳型として,配列中のF2cにハイブリダイズするF2からの逆転者反応によって相補鎖(cDNA)合成を固定化状態で行う。続いて,非固定化プライマーF3が鋳型核酸上のF3cにハイブリダイズして相補鎖合成と鎖置換を行うことで,F2から合成された前記相補鎖配列B2cにハイブリダイズするB2の伸長反応を可能とする。この際,使用する核酸合成酵素としては逆転写活性と鎖置換活性を併せ持つBca DNAポリメラーゼのようなDNAポリメラーゼを使用することが望ましいが,以降の核酸合成過程の反応条件下において,前記逆転写酵素にDNA/DNAの鎖置換活性が期待できない場合には,前述の鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼを組み合わせて用いることが望ましい。
以下の説明において、非固定プライマー、鎖置換型DNAポリメラーゼ、基質等を同一容器に入れて一定の昇温下で、増幅〜核酸検出を行う点を便宜上固定化プライマーループ増幅法と命名して説明するが、本発明においてはプライマーを基板に固定する点で、固定化プライマーループ増幅法とは異なることに留意すべきである。
本発明の最も重要なポイントは、標的核酸配列に対応する配列部を有するプライマーを基板面に固定化した状態で固定化プライマーループ増幅反応を行い,基板上において特定配列を合成する核酸の増幅法、検出法及び増幅・検出用基板にある。
より具体的に課題解決手段を説明すると、プライマー固定化基板を用いた固定化プライマーループ増幅反応を行い,この固定化プライマーを伸長させることによって核酸増幅する。固定化プライマーの伸長なので合成鎖は確実に基板上に固定化されることとなり,検出感度がハイブリダイゼーションの効率によらない。さらに,プライマーを複数使用することによって特定の配列のみを高感度かつ特異的に検出可能とすることを特徴とする。 本発明の好ましい実施形態を例示すると以下のようになる。
(1)リガンド標識したdNTPを核酸増幅反応液に添加することにより、標的核酸を鋳型とした合成鎖をリガンド標識化核酸として、基板上に固定化状態で増幅し、このリガンドと反応する活性物質を用いることによりこれを検出することを特徴とする核酸検出方法。 (2)リガンド又は蛍光基質を標識したdNTPを核酸増幅反応液に添加することにより,標的核酸を鋳型とした合成鎖をリガンド又は蛍光基質標識化核酸として基板上に固定化状態で増幅し,この蛍光によって合成鎖を検出することを特徴とする前記核酸検出方法。
(3)基板上にプライマーを固定化状態で標的核酸を合成・増幅した二本鎖の核酸の検出法であって,合成鎖に対してインターカレーションによって活性物質を取込むことにより発光又は発色させ、これを検出することを特徴とする核酸検出方法。
(4)基板上にプライマーを固定化状態で合成・増幅された標的核酸の一本鎖の検出法であって,合成鎖に対して蛍光基質を標識化したオリゴヌクレオチド鎖をハイブリダイゼーションし、前記蛍光基質を発光させ、これを検出することを特徴とする核酸検出方法。
(5)蛍光基質を標識したdNTPを核酸増幅反応液に添加することにより標的核酸を鋳型とした合成鎖を蛍光基質標識化核酸として基板上に固定化状態で増幅し、この蛍光によって合成鎖を検出する前記核酸検出方法。
(6)放射性物質で標識したdNTPを反応液に添加することにより,標的核酸を鋳型とした合成鎖を標識化核酸として基板上に固定化状態で増幅し,放射線を検出することを特徴とする核酸検出方法。
本発明において標的配列とは、増幅すべきポリヌクレオチドの塩基配列を意味する。一般にポリヌクレオチドの塩基配列は、5’側から3’側に向けてセンス鎖の塩基配列を記載する。本発明において、連続的に新たな標的塩基配列が合成されることを増幅と呼ぶ。本発明において、相補鎖合成の起点を与えることとは、鋳型となるポリヌクレオチドに対して、相補鎖合成に必要なプライマーとして機能するポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることを言う。
本発明による固定化プライマーループ増幅法は、プライマーとして複数種の固定化プライマーを用いる。必要に応じ差置換合成活性により合成鎖を単鎖化するための非固定化プライマーを添加してもよい。
本発明の固定化プライマーループ増幅法は、基板面に固定した複数種の固定化プライマー、鎖置換合成活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素、及びdNTPを用い、熱変性を必要とせずに、ほぼ等温で速やかに特異性の高い遺伝子配列の増幅反応を行うものである。本発明によれば、予めプライマーを基板にスポッティング法などにより固定して、標的核酸を増幅するので、スポット数により同時に複数の標的核酸の増幅及び/又は検出を行うことができる。
図1aに示すように、標的核酸配列の5’末端から当該ポリヌクレオチド鎖の3’末端方向に向かって順に、第1の任意配列F1c、第2の任意配列F2c、第3の任意配列F3cをそれぞれ選択し、標的領域の5’末端から当該ヌクレオチド鎖の5’末端方向に向かって順に、第4の任意配列B1、第5の任意配列B2、第6の任意配列B3をそれぞれ選択する。F1c、F2c、F3cの相補配列をそれぞれF1、F2、F3、またB1、B2、B3の相補鎖をB1c、B2c、B3cと呼ぶ。
固定化プライマーFIP、BIPとは、標的塩基配列上の「ある特定のヌクレオチド配列領域」にハイブリダイズし、かつ合成起点を与える塩基配列を3’末端に有し、同時にこのプライマーを起点とする核酸合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を5’末端に有することを特徴としたオリゴヌクレオチドであり、標的核酸配列に対応するものであり、基板表面に固定化されるものである。ここで、F2cより選ばれた塩基配列、およびF1より選ばれた塩基配列と相補的な塩基配列F2及びF1cを含むプライマーで基板表面に固定されたものを固定プライマーと呼ぶ。
非固定化プライマーとは、『標的核酸配列の下流に存在するある特定のヌクレオチド配列領域』にハイブリダイズして合成起点を与える塩基配列を有することを特徴としたオリゴヌクレオチドであり、基板表面に固定されていないものである。F3cより選ばれた塩基配列を含む非固定化のプライマーを非固定化プライマーF3、B3cより選ばれた塩基配列を含む非固定化のプライマーを非固定化プライマーB3と呼ぶ。固定化プライマー及び非固定化プライマーにおいて、Fは、標的塩基配列のセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマーの表示であり、Bは、標的塩基配列のアンチセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマーの表示である。
標的塩基配列に選択的にハイブリダイズした固定化プライマーからの核酸合成反応が進行すると同時に、固定化プライマーを起点とするその下流からの核酸合成反応によって鎖置換が起こる。そのために固定化プライマーを起点とする伸長鎖が鋳型である標的塩基配列から分離し、自身の5’末端でループ構造を形成する。固定化プライマーの3’末端を起点とした伸長鎖に、もうひとつの固定化プライマーが選択的にハイブリダイズし、合成起点となり核酸合成が進行する。同時にもうひとつの非固定化プライマーを起点とする核酸合成反応によって鎖置換が起こる。その結果、自己を鋳型としながら合成起点となる3’末端を有し、両端にそれぞれループ構造を有する「ダンベル型」ヌクレオチドが形成される。
「ダンベル型」ヌクレオチドのループの塩基配列は、3’末端側のループの一本鎖部分に固定化プライマーが相補的にハイブリダイズし合成起点を与えるので、ループ構造を有する中間産物は連続的に固定化プライマーの鋳型として機能し、核酸合成が進行する。特に、ループ構造を複数有する中間産物は、複数の核酸合成反応が同時多発的に進行する鋳型となりながら、鎖置換反応によってまた新たなループ構造を有する中間産物を生成させる。このように等温条件下で連続的かつ大量に標的遺伝子配列の特定のヌクレオチド配列を増幅することを可能にしたのが固定化プライマーループ増幅法である。 本発明で固定化プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドの長さは、30塩基以上、好ましくは40塩基以上で、化学合成あるいは天然のどちらでもよい。固定化プライマーFIPは、その塩基配列として標的核酸配列の3’末端配列と相補な配列よりなるオリゴヌクレオチドを3'側に、そしてそれより5’側の別の塩基配列よりなるオリゴヌクレオチドを5'側に持ち、その間には0から50塩基よりなる任意のオリゴヌクレオチドを持っても良い。固定化プライマーBIPの塩基配列は、固定化プライマーFIPより5’側の、標的核酸配列の相補鎖の3’末端配列と相補な配列よりなるオリゴヌクレオチドを3'側に、そしてそれより5’側の別の塩基配列を5'側に持ち、その間には0から50塩基よりなる任意の塩基配列を持ってもよい。
鋳型依存性核酸合成反応で使用する酵素は、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素であれば特に限定されない。このような酵素としては、BstDNAポリメラーゼ(ラージフラグメント)、Bca(exo−)DNAポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント、Vent(Exo−)DNAポリメラーゼ(Vent DNAポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの)、DeepVent(Exo−)DNAポリメラーゼ(DeepVent DNAポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの)及びKOD DNAポリメラーゼ等が挙げられ、好ましくはBstDNAポリメラーゼ(ラージフラグメント)が挙げられる。Bst DNAポリメラーゼを用いる場合は、その反応至適温度である65℃付近で反応を行うのが望ましい。
本発明の増幅法において、鋳型依存性核酸合成反応で使用する酵素は、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素であれば特に限定されない。このような酵素としては、Bst DNAポリメラーゼ(ラージフラグメント)、Bca(exo−)DNAポリメラーゼ、大腸菌DNA ポリメラーゼIのクレノウフラグメント、Vent(Exo−)DNAポリメラーゼ(Vent DNAポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの)、DeepVent(Exo−)DNAポリメラーゼ(DeepVent DNAポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの)およびKOD DNAポリメラーゼ等が挙げられ、好ましくはBst DNAポリメラーゼ(ラージフラグメント)が挙げられる。Bst DNAポリメラーゼを用いる場合は、その反応至適温度である65℃付近で反応を行うのが望ましい。
<ミスマッチ結合タンパク質>
反応液は,ミスマッチ結合タンパク質を含んでなるものとすることができ,これにより正確な核酸増幅と検出が可能となる。
<ミスマッチ結合タンパク質>
反応液は,ミスマッチ結合タンパク質を含んでなるものとすることができ,これにより正確な核酸増幅と検出が可能となる。
核酸ポリメラーゼが鋳型配列の相補配列を合成する際,合成鎖中に鋳型配列と部分的に対合できない塩基対(ミスマッチ)を誤って合成することがある。ミスマッチ結合タンパク質は,こうしたミスマッチに結合することで誤った配列の増幅を抑制することが可能である。本発明に用いられるミスマッチ結合タンパク質は,2本鎖核酸に結合することが可能であるタンパク質であればよく,好ましくはMutS(特表平9-504699号公報),MutH(特開2000-300265号公報),MutLまたは酵母に由来されるものとされ,より好ましくはMutS,MutH,MutLとされる。
本発明においてミスマッチとは,アデニン(A),グアニン(G),シトシン(C),およびチミン(T)(RNAの場合はウラシル(U))から選択される一組の塩基対が正常な塩基対(AとTの組合せ,またはGとCの組合せ)ではないことを意味する。ミスマッチには,1つのミスマッチのみならず,複数の連続したミスマッチ,1または複数の塩基の挿入および/または欠失によるミスマッチ,ならびにそれらの組合せが含まれる。
ミスマッチ結合タンパク質は一本鎖核酸にも結合することがあり,このようなミスマッチ結合タンパク質の一本鎖核酸への結合は一本鎖核酸結合タンパク質によって阻害されることが知られている。従って,本発明においてミスマッチ結合タンパク質を用いる場合には,一本鎖核酸結合タンパク質を併用することが望ましい。
以下、図面に基づいて、本発明を説明する。
図1a,図1b及び図1cは本発明の固定化プライマーループ増幅法の概略を説明するフロー図で、まず標的核酸配列を有するオリゴヌクレオチド鎖を準備する。図1aの上では標的核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを示しており、その標的核酸を増幅するために、図1の下に示した標的核酸と相補的なプライマーFIP,BIPを固定化プライマーとして基板表面に固定する。
DNA二本鎖は、図1a(2)に示すように、65℃付近において動的平衡状態となるために、PCRのように熱変性のステップを必要とせず、標的核酸に対して固定化プライマーFIPがハイブリダイズする。ハイブリダイズした固定化プライマーは標的核酸を鋳型として伸長し、図1b(1)に示すように、DNA鎖(合成鎖1)を合成する。但し、BIP伸長から反応開始の場合もある。
標的核酸のプライマー領域よりも下流(3’末端側)に設計された非固定化プライマーF3が標的核酸にハイブリダイズして伸長する。非固定化プライマーが伸長する際、BstDNAポリメラーゼが有する差置換活性によって、合成鎖1から標的核酸が剥ぎ取られることにより、図1b(3)に示すように、合成鎖1は5’側(固定側)から単鎖化していく。
この際、合成鎖1は5’末端領域にF1c,F1の相補領域を持つため、図1b(4)に示すように、5’末端にループ構造を形成する。同様に、合成鎖1の3’末端に対して、BIPがアニールして伸長し、DNA鎖(合成鎖2)がプライマー間を架橋するような形で合成され、非固定化プライマーB3がハイブリダイズして伸長することにより合成鎖2は5’側(固定側)から単鎖化していく。
合成鎖2には5’と3’末端両側に相補領域が存在すため、図1b(5)に示すように、両末端にループ構造を有するダンベル型ヌクレオチドを形成する。この際、3’末端領域の相補領域から自己鎖を鋳型にした伸長反応が起こる。
自己鎖を鋳型とする伸長反応後、図1c(6)に示すように、合成鎖2は内部配列にループ構造をとる。
このループ構造の単鎖部分に、図1c(7)に示すように、次のFIP2がハイブリダイズして伸長することにより、あらたな核酸(合成鎖3)が合成される。なお、合成鎖2については、図1d(8)に示すように、末端3’側で配列B1cとB1とが相補結合して末端3’側の配列B1で伸長し新たな核酸を生成する。合成鎖3については、図1d(9)に示すように、その配列の一部B2cが合成鎖未生成の他の固定化プライマーBIP2の配列B2とハイブリダイズし、固定化プライマーBIP2が自己鎖を鋳型とした伸長反応と、合成鎖に形成されるループ構造に対して固定化プライマが結合・伸長することで、順次核酸が増幅される。
すなわち、図1(a)から(d)は、次のように要約できる。
基板に5’末端が共有結合により固定化された複数の第1の固定化プライマー(FIP1)と、同じく前記基板に5’末端が共有結合により固定化された複数の第2の固定化プライマー(BIP1)とを備え、前記第1及び第2の固定化プライマーは、異なる配列構造であって、等温反応の下で次の核酸増幅を行うため下記の構造を有し、すなわち、
前記第1の固定化プライマー(FIP1)は、試料に含まれる鋳型核酸中の標的核酸配列の3’末端の配列部(F2c)にハイブリダイズして伸長反応して第1の合成鎖を生成可能な第1の配列部(F2)と、鎖置換合成活性により前記鋳型核酸が前記第1の合成鎖から離れて第1の合成鎖が単鎖化すると、前記第1の合成鎖の一部(F1)と5’末端側で自己相補結合して第1の合成鎖をループ化し得る第2の配列部(F1c)とを備え、
前記第2の固定化プライマー(BIP1)は、自己相補結合によりループ化された前記第1の合成鎖の標的核酸配列の3’末端の配列部(B2c)にハイブリダイズして伸長反応して第2の合成鎖を生成する第1の配列部(B2)と、鎖置換合成活性により前記第1の合成鎖が前記第2の合成鎖から離れて第2の合成鎖が単鎖化すると、前記第2の合成鎖の一部(B1)と第2の固定化プライマーの5’末端側で自己相補結合して第2の合成鎖をループ化させる第2の配列部(B1c)とを備え、
以後、上記のようなループ化を伴って固定化プライマーで生成された合成鎖が、合成鎖未合成の他の第1の固定化プライマー(FIP2)及び第2の固定化プライマー(BIP2)の鋳型核酸に使用されて、この他の第1の固定化プライマー及び第2の固定化プライマーにて、上記同様の伸長反応による核酸増幅、単鎖化、自己相補結合によるループ化を順次繰り返すことが可能にしてあることを特徴とする。
前記第1の固定化プライマー(FIP1)は、試料に含まれる鋳型核酸中の標的核酸配列の3’末端の配列部(F2c)にハイブリダイズして伸長反応して第1の合成鎖を生成可能な第1の配列部(F2)と、鎖置換合成活性により前記鋳型核酸が前記第1の合成鎖から離れて第1の合成鎖が単鎖化すると、前記第1の合成鎖の一部(F1)と5’末端側で自己相補結合して第1の合成鎖をループ化し得る第2の配列部(F1c)とを備え、
前記第2の固定化プライマー(BIP1)は、自己相補結合によりループ化された前記第1の合成鎖の標的核酸配列の3’末端の配列部(B2c)にハイブリダイズして伸長反応して第2の合成鎖を生成する第1の配列部(B2)と、鎖置換合成活性により前記第1の合成鎖が前記第2の合成鎖から離れて第2の合成鎖が単鎖化すると、前記第2の合成鎖の一部(B1)と第2の固定化プライマーの5’末端側で自己相補結合して第2の合成鎖をループ化させる第2の配列部(B1c)とを備え、
以後、上記のようなループ化を伴って固定化プライマーで生成された合成鎖が、合成鎖未合成の他の第1の固定化プライマー(FIP2)及び第2の固定化プライマー(BIP2)の鋳型核酸に使用されて、この他の第1の固定化プライマー及び第2の固定化プライマーにて、上記同様の伸長反応による核酸増幅、単鎖化、自己相補結合によるループ化を順次繰り返すことが可能にしてあることを特徴とする。
本発明において特定核酸配列の検出に至るまでの工程は以下の通りである。
(工程1)固定化プライマーループ増幅反応に用いる固定化プライマーのFIPおよびBIPを表面に固定化した基板を作製する。
(工程2)鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ,非固定化プライマーを基板上に添加して等温(固定化プライマーループ増幅反応)で固定化した固定化プライマーを伸長することで核酸増幅を行う。
(工程3)DNA増幅合成の際に,標識化したdNTPを取込ませることにより,当該標識に基づくシグナルを測定することにより合成核酸を検出する。
(工程1)固定化プライマーループ増幅反応に用いる固定化プライマーのFIPおよびBIPを表面に固定化した基板を作製する。
(工程2)鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ,非固定化プライマーを基板上に添加して等温(固定化プライマーループ増幅反応)で固定化した固定化プライマーを伸長することで核酸増幅を行う。
(工程3)DNA増幅合成の際に,標識化したdNTPを取込ませることにより,当該標識に基づくシグナルを測定することにより合成核酸を検出する。
または,基板上に固定化状態で合成された二本鎖に対して,インターカレーター物質を取込むことで,これを検出してもよい。
本発明の最も重要なポイントは、プライマーを固定化した状態で固定化プライマーループ増幅反応を行い,基板上において特定配列を合成する核酸の増幅法およびその検出法にある。より具体的に課題解決手段を説明すると、プライマー固定化基板を用いて固定化プライマーループ増幅反応を行い,この固定化プライマーを伸長させることによって核酸増幅する。固定化プライマーの伸長なので合成鎖は確実に基板上に固定化されることとなり,検出感度がハイブリダイゼーションの効率に依存することはない。さらに,プライマーを複数使用することによって特定の配列のみを高感度かつ特異的に検出可能とすることを特徴とする。
本発明の1つの実施形態は、試料中の標的核酸を基板上において検出する方法にあって,固定化プライマーを用いた固定化プライマーループ増幅法によって特定核酸配列を増幅する方法である。即ち、基板表面に固定化プライマーループ増幅反応で使用する固定化プライマーFIPおよびBIP固定化し,標的核酸を鋳型に当該プライマーを伸長することにより核酸を固定化状態で合成するする方法が利用できる。
標的核酸を含む試料と固定化プライマーループ増幅法で用いる反応液(核酸合成酵素,dNTP,非固定化プライマーを含む)を混合して当該基板上に添加することにより,標的核酸配列を固定化状態で合成・増幅する方法(図1,2)が採用される。この反応を利用することにより、固定化プライマーを伸長させて,基板上に固定化状態で合成・増幅された特定核酸配列を検出する核酸検出方法が提供される。
また、上記核酸増幅工程において,リガンド標識したdNTPを固定化プライマーループ増幅反応液に添加することにより,標的核酸を鋳型とした合成鎖をリガンド標識化核酸として基板上に固定化状態で増幅し,このリガンドと反応する活性物質を用いることでこれを検出する核酸検出方法が提供される。
更に、上記核酸増幅工程において,蛍光基質を標識したdNTPを固定化プライマーループ増幅反応液に添加することにより,標的核酸を鋳型とした合成鎖を蛍光基質標識化核酸として基板上に固定化状態で増幅し,この蛍光によって合成鎖を検出する核酸検出方法が提供される。
又、上記基板上に固定化状態で合成・増幅された二本鎖の核酸の検出法において,基板上の合成鎖に対してインターカレーションによって活性物質を取込むことで,これを検出する核酸検出方法が提供される。
また、上記基板上に固定化状態で合成・増幅された一本鎖の核酸の検出法において,合成鎖に対して蛍光基質を標識化したオリゴヌクレオチド鎖をハイブリダイゼーションすることで,これを検出する核酸検出方法を提供することができる。
以下、本発明の最良の実施形態について,図面等を参照しながら詳細に説明する。
<特定核酸配列検出までの実験フロー>
各工程における詳細説明を以下に記す。
各工程における詳細説明を以下に記す。
(A)オリゴヌクレオチド固定化基板の作製(図1,2を参照)
固定化プライマーループ増幅法では,固定化プライマーFIP,BIPおよび非固定化プライマーF3,B3の2組のプライマーを用いて核酸増幅が行われる。その際,基板には市販のDNAアレイプラスチック基板(住友ベークライト製S−BIO(登録商標)PrimeSurface(登録商標))を用いることができる。
固定化プライマーループ増幅法では,固定化プライマーFIP,BIPおよび非固定化プライマーF3,B3の2組のプライマーを用いて核酸増幅が行われる。その際,基板には市販のDNAアレイプラスチック基板(住友ベークライト製S−BIO(登録商標)PrimeSurface(登録商標))を用いることができる。
(B)標的DNAおよび固定化プライマーループ増幅反応液を基板に添加
反応溶液には、反応溶液のpHを好適な範囲に調整することができる緩衝剤、酵素の触媒活性を維持することができる塩類、タンパク質や核酸が反応容器に吸着することを防いだり、酵素を保護したりする役割を果たす、非イオン性界面活性剤やウシ血清アルブミン等を添加してもよい。
反応溶液には、反応溶液のpHを好適な範囲に調整することができる緩衝剤、酵素の触媒活性を維持することができる塩類、タンパク質や核酸が反応容器に吸着することを防いだり、酵素を保護したりする役割を果たす、非イオン性界面活性剤やウシ血清アルブミン等を添加してもよい。
緩衝剤としては、pHを好ましくは4.0〜9.0、より好ましくは4.5〜8.5、さらに好ましくは5.0〜8.0に調整できるものであれば特に限定されない。例えば、リン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、MOPS(3−モルホリノプロパンスルホン酸)、HEPES(2−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]エタンスルホン酸)、Tris(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)、またはトリシン(N−[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]グリシン)等が挙げられる。
塩類としては例えば、(NH4)2SO4、KCl、HCl、NaCl等を用いることができる。
非イオン性界面活性剤としては例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等を用いることができる。具体的には、ノニデットP−40(NP−40、Shell International Petroleum Company Limitedの登録商標)、Triton−X(Union Carbide Chemicals and Plastics Inc.の登録商標)、TWEEN(ICI Americas Inc.の登録商標)、Brij(ICI Americas Inc.の登録商標)等が挙げられる。
ハイブリダイゼーションに好適な温度条件としては,プライマー配列から算出した融解温度(Tm)に基づいて決定されるが,ハイブリダイザーション温度が高すぎると鋳型にハイブライダイズしづらくなり,逆に低いと非特異的なハイブリダイズをしてしまうといった問題を生じる。この問題を解消するために,融解温度調整剤を添加してもよい。反応液に融解温度調整剤を含有させることにより,ハイブリダイゼーション温度に影響を受けることなく,プライマーが特異的に鋳型にハイブリダイズしやすくなり,増幅反応を効率よく行うことが可能になる。核酸増幅に用いる融解温度調整剤としては,ベタイン(N,N,N−トリメチルグリシン),プロリン,ジメチルスルホキシド,トリメチルアミンN−オキシド,およびテトラアルキルアンモニウム塩,テトラエチルアンモニウムフロライド等が挙げられる。
これらの成分は、反応溶液を増幅反応に好適な条件に調整するために適宜選択して用いることができる。
実際に増幅反応を行う際、相補鎖合成の鋳型となるポリヌクレオチドを含む、または含む可能性のある溶液(以下、テンプレート溶液とする)を用いることができる。テンプレート溶液は、例えば生体試料に含まれるmRNAを検出する場合、生体試料からmRNAを抽出、精製し、テンプレート溶液として用いることができる。生体試料としては例えば、組織、喀痰、尿、生検材料、体腔液、または体腔洗浄液等が挙げられる。
(C)固定化プライマーループ増幅反応温度に基板を保温(65℃付近)
固定化プライマーループ増幅反応温度65℃付近において2本鎖DNAは動的平衡状態にあり,いずれかのプライマーがハイブリダイズしてそこから鎖置換型伸長すると,片側の鎖ははがされて1本鎖状態となる。従って,PCRに必要な熱変性を行わなくてよい。
固定化プライマーループ増幅反応温度65℃付近において2本鎖DNAは動的平衡状態にあり,いずれかのプライマーがハイブリダイズしてそこから鎖置換型伸長すると,片側の鎖ははがされて1本鎖状態となる。従って,PCRに必要な熱変性を行わなくてよい。
固定化プライマーループ増幅法では,増幅生成物の同一鎖上末端に互いに相補的な配列が生成し,これらがハイブリダイズしてヘアピン状のループが形成され,そのループを起点とした鎖置換型ポリメラーゼによる伸長反応が起きる。同時に,ループ内にハイブリダイズしたプライマーからは鎖置換型伸長反応が起こり,先の伸長生成物を1本鎖に解離させていく。
解離した1本鎖もまた,末端に相補的配列を有するため,この反応は繰り返し起きる。こうして,固定化プライマーループ増幅法では増幅生成物の同一鎖上の複数の位置で,伸長反応と増幅反応が同時進行するため,DNAの増幅が超指数関数的にしかも等温条件下で達成される。反応時間は,15分以上,好ましくは60分以上である。理論的には,反応時間を延長すれば,半永久的に核酸増幅が可能である。
(D)洗浄
増幅反応が終わったら、基板上の反応部を洗浄して未結合の酵素を除去する。
増幅反応が終わったら、基板上の反応部を洗浄して未結合の酵素を除去する。
(E)活性物質の投入,反応および検出
洗浄後,活性物質を投入することにより基板上に合成・増幅した核酸を検出する。活性物質を基板上の核酸に取込む方法としては,以下の4つの方法を例示することができる。
洗浄後,活性物質を投入することにより基板上に合成・増幅した核酸を検出する。活性物質を基板上の核酸に取込む方法としては,以下の4つの方法を例示することができる。
(1)前記核酸配列増幅工程において,リガンド標識したdNTPを固定化プライマーループ増幅反応液に添加することにより,標的核酸を鋳型とした合成鎖をリガンド標識化核酸として基板上に固定化状態で増幅し,この基板に活性物質を投入することで基板上に増幅した核酸を検出する方法。
(2)前記核酸増幅工程において,蛍光基質を標識したdNTPを固定化プライマーループ増幅反応液に添加することにより,標的核酸を鋳型とした合成鎖を蛍光基質標識化核酸として基板上に固定化状態で増幅し,この蛍光によって合成鎖を検出する核酸検出方法。
(3)前記基板上に固定化状態で合成・増幅された二本鎖の核酸に対してインターカレーションによって活性物質を取込むことで,これを検出する核酸検出方法。
(4)前記基板上に固定化状態で合成・増幅された一本鎖の核酸の検出法において,合成鎖に対して蛍光基質を標識化したオリゴヌクレオチド鎖をハイブリダイゼーションすることで,これを検出する核酸検出方法。
上記(1)に記述した検出方式において,ビオチン化ヌクレオチド(ビオチン−16−dUTP,ビオチン−11−dUTPなど)を用いる方法がある。このうち,本発明の検出方式としてはビオチン化した核酸の検出には、ビオチンに特異的、強固に結合するタンパクのアビジン(卵白由来)、または、ストレプトアビジン(放線菌由来)を用いる。すなわち、基板上に固定化状態の合成鎖中に取込まれたビオチン化ヌクレオチドに対して,アビジンを加えるとアビジンがビオチンと結合し,これにビオチン化したアルカリホスファターゼを結合させると,ビオチンを介して酵素が結合する方式である。
基板を洗浄して未結合の酵素を除去した後、アルカリホスファターゼの基質である、ニトロブルーテトラゾリウム(NBT)と5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルリン酸(BCIP)液中で反応させると、ビオチン標識プローブのハイブリダイズしたスポットに紫色の発色が見られ、発色シグナルとして検出される。発色用の酵素としては、アルカリホスファターゼ以外にも西洋ワサビのペルオキシダーゼを用いる系もある。また、ペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどの酵素をDNAに間接的に結合させる酵素標識法、DNAのグアニン残基にフルオレン誘導体を結合させる方法もある。
ビオチンの代わりとして,薬用植物ジギタリスから得られる強心配糖体のジゴキシゲニン(DIG:ステロイド系天然物)を結合したdUTP(デオキシウリジン5’−三リン酸)を用いる方法もある。この場合DIG−dUTPで標識されたプローブで標的の核酸とハイブリダイズさせ、アルカリホスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体にて免疫反応を行わせる。これをビオチンの場合と同様にNBTで発色(青色)させることができる。さらに,最近ではあまり使用されないがラジオアイソトープ(RI)標識されたデオキシヌクレオシド三リン酸([α−32P]dCTPなど)を基質として加えておき、固定化プライマー増幅の際に取り込ませ核酸内部に標識される方法もある。
前記(2)に記述した検出方式において使用する蛍光基質としてはCy3が好ましい。
前記(3)に記述した検出方式において,活性物質としては,インターカレーターとしてエチジウムブロマイド(EtBr),アクリルオレンジ(AO),YOYO−1,TOTO−1,Syber Greenなどがある。
前記(4)に記述した検出方式において,オリゴヌクレオチドに標識する蛍光物質としては,FITC,Bodipy493,NBD,TRITIC,Texas,Cy5,Cy7,IR144,FAM,JOE,TAMRA,ROXなどを使用する。
以下、実施例を用いて本発明についてさらに詳細を説明するが,本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
(実施例1)標的核酸検出基板を用いたDNA検出
実験材料
(1)標的核酸溶液(検出対象DNAをそれぞれ10pM、1pM含む溶液:表3)
(2)反応溶液;表1及び表2に示した。
実験材料
(1)標的核酸溶液(検出対象DNAをそれぞれ10pM、1pM含む溶液:表3)
(2)反応溶液;表1及び表2に示した。
(3)DNAアレイプラスチック基板(住友ベークライト製S−BIO(登録商標)PrimeSurface(登録商標))
(4)カバーガラス(住友ベークライト製)
(5)保湿容器(日立ソフトウェアエンジニアリング製はいぶりくん(登録商標))
(6)恒温機(30−80℃に保温可能)
(7)検出用基質溶液(BCIP−NBT,KPL社製)
(4)カバーガラス(住友ベークライト製)
(5)保湿容器(日立ソフトウェアエンジニアリング製はいぶりくん(登録商標))
(6)恒温機(30−80℃に保温可能)
(7)検出用基質溶液(BCIP−NBT,KPL社製)
試験方法
1.基板の作製
市販のDNAアレイプラスチック基板(住友ベークライト製S−BIO(登録商標)PrimeSurface(登録商標))を用いた。本基板は,親水性ポリマーからなる層,及びアミノ基と反応する官能基を表面に有するプラスチック製の基板である。横4×縦6箇所のスポット領域があり,各スポット領域で,各核酸配列の有無を評価する。
1.基板の作製
市販のDNAアレイプラスチック基板(住友ベークライト製S−BIO(登録商標)PrimeSurface(登録商標))を用いた。本基板は,親水性ポリマーからなる層,及びアミノ基と反応する官能基を表面に有するプラスチック製の基板である。横4×縦6箇所のスポット領域があり,各スポット領域で,各核酸配列の有無を評価する。
固定化プライマーは5’末端がアミノ基で修飾されたオリゴヌクレオチド(40mer)であり,これを0.25M炭酸バッファー(pH9.0)に溶解し,1.0μMのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。これらの溶液を混合しスポッタ(日立ソフトウェアエンジニアリング製Marks−I)を用い100クロスカットピンでプラスチック基板の表面上にスポットした。オリゴヌクレオチドをスポットした各基板を,80℃で一時間加熱して,各オリゴヌクレオチドを固定化させた。
2.基板上核酸増幅反応
検体DNA溶液と表1の反応溶液を混合した溶液はカバーガラスを用いてDNAアレイプラスチック基板上に展開し,基板を保湿容器に密閉後,恒温機で63℃に基板を60分間保温する。この際のDNAマイクロアレイ基板には検出対象核酸配列に特異的に増幅するプライマー(FIP,BIP)を固定化したものを使用する。
検体DNA溶液と表1の反応溶液を混合した溶液はカバーガラスを用いてDNAアレイプラスチック基板上に展開し,基板を保湿容器に密閉後,恒温機で63℃に基板を60分間保温する。この際のDNAマイクロアレイ基板には検出対象核酸配列に特異的に増幅するプライマー(FIP,BIP)を固定化したものを使用する。
上記DNAマイクロアレイ基板上における核酸増幅反応系の手順を以下に記す(図2参照)。
(A)固定化プライマー5’末端を固定化した基板を作製する。
(B)標的核酸DNA及び固定化プライマーループ反応液を前記版に添加する。
(C)基板を所定温度に保持する(65℃付近が好ましい)。
(D)基板を洗浄する。
(E)反応系に活性物質を投入し、反応を行わせる。
(F)反応の進み具合をチエックし、更に反応を継続する必要があるときは、反応系に活性物質を投入し、反応を行わせる。
(G)反応が完結したら、基板を洗浄する。
(H)発色、発光により又は放射線により核酸の検出を行う。
3.合成核酸の検出
核酸増幅工程においてdNTPsに対して,標識を施すことにより合成鎖を標識することで合成鎖を検出することが可能である。標識方法に関しては,詳細説明に記したように多岐にわたった方法が存在するが,実施例においてはビオチン標識化dUTPとストレプトアビジン,BCIP−NBTを用いた検出法について記す。
核酸増幅工程においてdNTPsに対して,標識を施すことにより合成鎖を標識することで合成鎖を検出することが可能である。標識方法に関しては,詳細説明に記したように多岐にわたった方法が存在するが,実施例においてはビオチン標識化dUTPとストレプトアビジン,BCIP−NBTを用いた検出法について記す。
本基板上核酸増幅反応において,ビオチン標識化したdUTPを使用することで,ビオチン標識化したDNA鎖を合成する。反応後の基板を洗浄後,0.01mg/mLアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジンを基板上へ投入し,カバーガラスで覆い,37℃で30分反応させた後,洗浄を行った。
ついで、BCIP/NBT(BCIP/NBT Phosphatase Substrate(1−Component System)(KPL))発色試薬中に基板を浸漬し,37℃,30分間反応させ洗浄し,青紫色のスポットを発色させた。発色画像はイメージスキャナ(キヤノン製,PIXUS MP470)でパソコンへ取り込み,画像解析ソフト(住友ベークライト製,誰でもDNAアレイ解析ソフト)で発色強度を数値化した。図3において、(a)の標的核酸濃度は、10pM,(b)は1pM,(c)は0pMである。図4は図3のデータを数値化したものである。
(実施例2)標的核酸検出基板を用いたRNA増幅および検出
RNAを検出するためには,標的RNAを逆転写した後,核酸増幅反応を行う必要がある。その際には,表1組成のBst DNAポリメラーゼの代わりに逆転写活性と鎖置換活性を併せ持つBca DNAポリメラーゼとRNase inhibitorを反応液に添加して反応すればよい。
RNAを検出するためには,標的RNAを逆転写した後,核酸増幅反応を行う必要がある。その際には,表1組成のBst DNAポリメラーゼの代わりに逆転写活性と鎖置換活性を併せ持つBca DNAポリメラーゼとRNase inhibitorを反応液に添加して反応すればよい。
逆転写以降の核酸合成過程の反応条件下において,前記酵素にDNA/DNAの鎖置換活性が期待できない場合には,前述の鎖置換活性を有するBst DNAポリメラーゼ等を組み合わせてもよい。
FIP1…第1の固定化プライマー、BIP1…第2の固定化プライマー。
Claims (6)
- 標的核酸配列を鋳型として、等温条件下での核酸増幅反応を可能とするプラマーセットの5’末端を固定化したことを特徴とする基板。
- 基板に5’末端が共有結合により固定化された複数の第1の固定化プライマー(FIP1)と、同じく前記基板に5’末端が共有結合により固定化された複数の第2の固定化プライマー(BIP1)とを備え、前記第1及び第2の固定化プライマーは、異なる配列構造であって、等温反応の下で次の核酸増幅を行うため下記の構造を有し、すなわち、
前記第1の固定化プライマー(FIP1)は、試料に含まれる鋳型核酸中の標的核酸配列の3’末端の配列部(F2c)にハイブリダイズして伸長反応して第1の合成鎖を生成可能な第1の配列部(F2)と、核酸合成酵素の鎖置換活性により前記鋳型核酸が前記第1の合成鎖から離れて第1の合成鎖が単鎖化すると、前記第1の合成鎖の一部(F1)と5’末端側で自己相補結合して第1の合成鎖をループ化し得る第2の配列部(F1c)とを備え、
前記第2の固定化プライマー(BIP1)は、自己相補結合によりループ化された前記第1の合成鎖の標的核酸配列の3’末端の配列部(B2c)にハイブリダイズして伸長反応して第2の合成鎖を生成する第1の配列部(B2)と、鎖置換により前記第1の合成鎖が前記第2の合成鎖から離れて第2の合成鎖が単鎖化すると、前記第2の合成鎖の一部(B1)と第2の固定化プライマーの5’末端側で自己相補結合して第2の合成鎖をループ化させる第2の配列部(B1c)とを備え、
以後、上記のようなループ化を伴って固定化プライマーで生成された合成鎖が、合成鎖未生成の他の第1の固定化プライマー(FIP2)及び第2の固定化プライマー(BIP2)の鋳型核酸に使用されて、この他の第1の固定化プライマー及び第2の固定化プライマーにて、上記同様の伸長反応による核酸増幅、単鎖化、自己相補結合によるループ化を順次繰り返すことが可能にしてあることを特徴とする標的核酸配列の固相化増幅用チップ。 - 前記固相化増幅用チップは、前記核酸増幅により得られる合成鎖を標識化核酸として基板上に固定化する試料検査用チップとして使用されることを特徴とする請求項2記載の標的核酸配列の固相増幅用チップ。
- 請求項2記載の複数の固定化第1プライマー及び固定化第2プライマーを有する固相増幅用チップを使用して、且つ鋳型核酸を含む試料、標的核酸配列よりも3’側にある非固定化プライマーおよび鎖置換活性を有する核酸合成酵素を用意して、等温反応の下で、以下の一連の固相核酸増幅工程が行われる、すなわち、
第1の固定化プライマー(FIP1)の第1配列部(F2)が、試料に含まれる鋳型核酸中の標的核酸配列の3’末端の配列部(F2c)にハイブリダイズして伸長反応して前記標的核酸配列と相補の第1の合成鎖を生成する工程、
非固定化プライマーの伸長による鎖置換により前記鋳型核酸を前記第1の合成鎖から離して第1の合成鎖を単鎖化し、第1の固定化プライマー(FIP1)の第2の配列部(F1c)により前記第1の合成鎖の一部(F1)と5’末端側で自己相補結合して第1の合成鎖をループ化する工程、
第2の固定化プライマー(BIP1)の第1の配列部(B2)が、自己相補結合によりループ化された前記第1の合成鎖の標的核酸配列の3’末端の配列部(B2c)にハイブリダイズして伸長反応して第2の合成鎖を生成する工程、
非固定化プライマーの伸長による鎖置換により前記第1の合成鎖を前記第2の合成鎖から離して第2の合成鎖を単鎖化し、第2の固定化プライマー(BIP1)の第2の配列部(B1c)により第2の合成鎖の一部配列(B1)と第2の固定化プライマーの5’末端側で自己相補結合して第2の合成鎖をループ化する工程、
以後、上記のようなループ化を伴って固定化プライマーで生成された合成鎖が、合成鎖未生成の他の第1の固定化プライマー(FIP2)及び第2の固定化プライマー(BIP2)の鋳型核酸に使用されて、この他の第1の固定化プライマー及び第2の固定化プライマーにて、上記同様の伸長反応による核酸増幅、単鎖化、自己相補結合によるループ化を順次繰り返すことにより標的核酸を固相増幅することを特徴とする標的核酸配列の固相増幅方法。 - 請求項4の固相増幅方法により生成された標的核酸を鋳型とした合成鎖を標識化核酸として基板上に固定化して試料検査を行うことを特徴とする試料検査方法。
- 前記核酸増幅工程がミスマッチ結合タンパク質存在下において進行する,標的核酸配列の固相増幅方法。
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