WO2013105679A1 - 프라이머를 포함하는 핵산 증폭 장치와 이것의 제조방법 및 이를 이용한 핵산 증폭 방법 - Google Patents

프라이머를 포함하는 핵산 증폭 장치와 이것의 제조방법 및 이를 이용한 핵산 증폭 방법 Download PDF

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WO2013105679A1
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nucleic acid
linker
primer
acid amplification
substrate
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PCT/KR2012/000251
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신용
김다미
심봉주
김지태
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엘지전자 주식회사
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the present invention relates to a device for amplifying and detecting nucleic acids, and more particularly, to a nucleic acid amplification apparatus including a primer, a method for preparing the same, and a method for amplifying a nucleic acid using the same, and more particularly, to prevent amplification of portions other than the primer.
  • the present invention relates to a nucleic acid amplification apparatus capable of stably detecting whether amplification is performed with any detectable label even when a polymerase having an exonuclease function is used.
  • diagnostics is a rapidly growing field in the in vitro diagnostic market for early diagnosis of disease.
  • methods using nucleic acid have been used for diagnosing the causative factors caused by viruses and bacteria based on high specificity and sensitivity.
  • diagnostic methods are used to amplify targets based on the principle of PCR, and in particular, real-time PCR method is widely used. It is a method of detecting based on the amount of amplification of a fluorescent signal by attaching a fluorescent material to a specific probe or primer.
  • a method of detecting the amount simultaneously with PCR amplification is known by the TaqMan method using a reporter die and a quencher dye.
  • 1 is a schematic diagram for explaining a PCR amplification and detection method using the Tagman method according to the prior art. This method uses the 5'-nuclease property of Tap polymerase.
  • a pair of TaqMan probes 100 and a pair of PCR primers 200 and 300 are used for the reaction.
  • the TaqMan probe 100 is covalently coupled to the reporter die 110 at the 5'-end and the quencher die 120 at the 3'-end, and the specific portion of the target 400 and the TaqMan probe 100 are connected. The difference between the match and mismatch between) is determined by using fluorescent material.
  • the reporter die 110 may not emit light by the quencher.
  • the TaqMan probe 100 which is completely complementary to a specific site, is bound to the target 400 in the annealing step of the PCR, and the 5'-nuclease activity of the Taq polymerase is extended by the extension step.
  • the '-terminal reporter die 110 (FAM or VIC) is separated from the quencher die 120 to show inherent fluorescence.
  • the TaqMan probe 100 is mismatched with the target 400, the TaqMan probe 100 is separated from the template so that no further reaction is performed.
  • Figure 2 is a schematic diagram for explaining the PCR amplification and detection method using a primer attached to the reporter die 110 and the quencher die 120 according to the prior art
  • Figure 3 is a fluorescence increase in amplification according to the prior art
  • amplification may be performed using a polymerase having an exonuclease function. Together it is necessary to separate the reporter die 110 from the primer 200. Thus, the degree of amplification is detected through the amount of separated reporter die 110.
  • FIG. 2 is a schematic diagram for explaining the PCR amplification and detection method using a primer attached to the reporter die 110 and the quencher die 120 according to the prior art
  • Figure 3 is a fluorescence increase in amplification according to the prior art
  • FIG. 2 when using the forward primer 200 to which the reporter die 110 and the quencher die 120 are attached, amplification may be performed using a polymerase having an exonuclease function. Together it is necessary to separate the reporter die 110 from the primer 200. Thus, the degree of a
  • the amplification proceeds.
  • the increase in fluorescence of the die 130 is increased, thereby detecting the degree of amplification. That is, the method of attaching the die to the primer as described above has a disadvantage in that the type of the die must be selected differently depending on whether the polymerase has an exonuclease function. If the existing reporter die 110 is to be used, the polymer polymerase having an exonuclease function must be used, and when using the die 130 that increases fluorescence during amplification, the exonuclei must be used.
  • primers 200 and 300 bind to specific portions between successive nucleotide sequences, that is, because there are different nucleotide sequences before and after the primers 200 and 300 are bonded, the primers 200 and 300 are separated by the polymerase. This results in the unwanted portion being amplified by a predetermined length in the direction opposite to the original original direction.
  • Figure 4 is a schematic diagram for explaining a solid phase PCR or Bridge PCR method for fixing the primer on the substrate according to the prior art. That is, the forward primer 200 is attached by using the fixing part 700 on the substrate 500, and the reverse primer 300 floats on the solution inside the PCR reactor. Subsequently, when the target 400 enters, the forward primer 200 and the reverse primer 300 amplify the target 400, and the amplified first product 610 and the second product 620 brige each other. It is amplified while forming.
  • the second product 620 amplified by the reverse primer 300 has a problem of amplifying not only the target 400 but also the base of the fixing part 700 connected to the target 400. Thus, the amplified second product 620 has a disadvantage of additionally including an unwanted portion A in addition to the target.
  • One embodiment of the present invention is to provide a nucleic acid amplification apparatus that can prevent the unwanted portion other than the target is amplified.
  • the present invention is to stably detect whether or not the amplification with any detectable label, regardless of whether the polymerase for amplification has an exonuclease function.
  • the substrate A linker attached to the substrate and consisting of contiguous nucleic acid bases or DNA sequences; A detectable label associated with the linker; And a primer associated with the label.
  • the substrate preferably has a surface made of gold (Au).
  • the linker may have a length in the range of 10 to 1,000 nucleotides.
  • the continuous nucleic acid base may be poly A.
  • the detectable label is preferably a fluorescence dye.
  • the present invention may include two or more amplification units comprising the linker, the detectable label, and the primer.
  • the two or more amplification units each comprise a forward primer or a reverse primer as a primer.
  • the two or more amplification units may include different types of detectable labels.
  • the present invention is present between the substrate and the linker, it is possible to further include one or more functional groups selected from the group consisting of thiols and amines.
  • the present invention may be a thiol attached to the substrate, the amine is connected to the thiol, the linker may be connected to the amine.
  • the nucleic acid amplification apparatus according to the present invention is preferably a real time nucleic acid amplification apparatus.
  • Another aspect of the present invention provides a method for manufacturing a nucleic acid amplification apparatus, the method comprising: attaching a linker composed of a continuous nucleic acid base or DNA sequence to a substrate; Linking a detectable label to the attached linker; And linking a primer to the linked detectable label.
  • Another aspect of the invention the step of reacting the amplification solution containing a target sample and a polymerase (polymerase) to the above-described nucleic acid amplification device; And measuring a detectable change that is changed by the reaction.
  • a polymerase polymerase
  • the nucleic acid amplification apparatus is characterized by amplification means including a detectable label between a linker and a primer consisting of a continuous nucleic acid base or DNA sequence. Thereby, there is an effect that can prevent the unwanted portion other than the target amplified.
  • the present invention can detect any label, regardless of whether the polymerase for amplification has an exonuclease function, that is, even if a polymerase having an exonuclease function is used. Rho also has the effect of stably detecting the amplification.
  • FIG. 1 is a schematic diagram for explaining a PCR amplification and detection method using the Tagman method according to the prior art.
  • FIG. 2 is a schematic diagram illustrating a PCR amplification and detection method using a primer having a reporter die 110 and a quencher die 120 according to the prior art.
  • FIG. 3 is a schematic diagram for explaining a PCR amplification and detection method using a die 130, the fluorescence increases during amplification according to the prior art.
  • Figure 4 is a schematic diagram illustrating a solid phase PCR or Bridge PCR method for fixing a primer on a substrate according to the prior art.
  • Figure 5 is a cross-sectional view for explaining the configuration of the nucleic acid amplification apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a cross-sectional view illustrating a state in which a target is amplified using the nucleic acid amplification apparatus according to the preferred embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a cross-sectional view for explaining an example of a functional group to attach the amplification unit to the substrate in the nucleic acid amplification apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • first and second may be used to describe various components, but the components should not be limited by the terms. The terms are used only for the purpose of distinguishing one component from another.
  • FIG. 5 is a cross-sectional view for explaining the configuration of the nucleic acid amplification apparatus according to an embodiment of the present invention
  • Figure 6 illustrates a state in which a target is amplified using the nucleic acid amplification apparatus according to an embodiment of the present invention It is a section for.
  • the nucleic acid amplification apparatus includes a substrate 10; Linker 21; Detectable label 22; And a primer 23.
  • the linker 21; Detectable label 22; And primer 23 may constitute an amplification unit 20 for amplifying the target by the PCR method.
  • the substrate 10 is for attaching the linker 21 according to the present invention, and it is sufficient to have a solid phase, and includes all plates or substrates known in the art, and in the conventional solid phase PCR method It is preferable to use the board
  • the substrate may be a metal or glass substrate, and the metal that may be used for the metal electrode substrate may be one or more selected from the group consisting of gold, platinum, silver, copper, and indium tin oxide, but is not limited thereto. Do not.
  • the linker 21 according to the invention it is suitable to have a surface which is preferably made of gold (Au).
  • the linker 21 may consist of contiguous nucleic acid bases or DNA sequences, preferably consisting of contiguous identical nucleic acid bases or DNA sequences.
  • one of the nucleic acid bases A, T, C, and G may be arranged in succession, or the same DNA containing such nucleic acid bases may be arranged in succession.
  • the continuous nucleic acid base may be poly A.
  • the same nucleic acid base and DNA sequence are continuously arranged, whereby the detectable label 22 or primer 23 described later can be more stably attached to the surface of the substrate 10, and the polymerase can be attached to the polymerase. Indiscriminate replication or amplification can be minimized.
  • the linker 21 preferably has a length in the range of 10 to 1,000 nucleotides. If the linker 21 is smaller than the above range, the adhesion force on the surface of the substrate 10 is reduced, and the linker 21 is connected thereon. It is not suitable because the primer 23 to be bent may affect other primers 23.
  • the detectable label 22 may be connected to the linker 21, and the primer 23 may be connected to the other side of the detectable label 22. That is, the linker 21; Detectable label 22; And primer 23 will be connected in order.
  • the "primer 23" is for amplifying a target sample, and may be a forward primer and / or a reverse primer, and may include all kinds of primers generally used in a PCR method.
  • detectable label 22 refers to an atom or molecule that allows the specific detection of a molecule comprising a label among molecules of the same kind without a label.
  • the detectable label may be any material that can emit electrons in the detection process, and may include, for example, colored beads, antigenic crystals, enzymes, hybridizable nucleic acids, chromogenic materials, fluorescent materials, phosphorescent materials, It may include, but is not limited to, electrically detectable molecules, molecules that provide altered fluorescence-polarization or altered light-diffusion, and the like.
  • the label may also include radioisotopes such as P 32 and S 35 , chemiluminescent compounds, labeled binding proteins, spectroscopic markers such as heavy metal atoms and dies, and magnetic labels.
  • radioisotopes such as P 32 and S 35
  • chemiluminescent compounds such as labeled binding proteins
  • spectroscopic markers such as heavy metal atoms and dies
  • magnetic labels such as magnetic labels.
  • dies include, but are not limited to, for example, quinoline dies, triarylmethane dies, phthaleins, azo dies and cyanine dies.
  • the detectable label 22 is preferably a fluorescence dye, may be a conventional reporter die or a quencher die, and a die that increases fluorescence upon amplification may be used. Even if a conventional reporter die is used as the detectable label 22 according to the present invention, since the detectable label 22 is connected to the linker 21 in the present invention, it is not separated or separated from the template. .
  • the present invention can detect the amplified amount by using a known die and performing a process of increasing the fluorescence of the die at the time of amplification or using a die having a fluorescence increasing at the time of amplification. In addition, it is also possible to connect a separate die to the primer or to use a conventional TaqMan probe for measuring the amount of amplification.
  • the present invention is characterized in that it comprises a detectable label (23) between the linker 21 and the primer (23), through which it is intended to prevent the unwanted portion amplification other than the target, and also to any detectable label It is to stably detect whether or not amplification.
  • the fluorescent die used as a conventionally detectable label is attached to a primer, and thus polymerizes because it binds to a specific portion between successive nucleotide sequences of the target, that is, because there are different nucleotide sequences before and after the primers are bound.
  • the replication process by enzymes resulted in the amplification of unwanted portions by a predetermined length in the direction opposite to the original direction.
  • the primer is attached to the solid phase by a fixing portion consisting of a nucleotide sequence, since the primer is directly connected to the fixing portion, an unwanted portion is amplified during the replication process by the polymerase.
  • the present invention is characterized in that it comprises a detectable label 23 between the linker 21 and the primer 23, even when amplification by blocking the replication by the detectable label 23, The amplification is performed only to the primer 23, the amplification is not performed toward the linker 21. In addition, even if the copy of the linker 21 is made, the copy is stopped after reaching the part with the detectable label 23, and then the copy is made only toward the primer 23 part or the primer 23 direction. Amplification products for only the desired part can be obtained.
  • the present invention is not limited to whether or not the polymerase for amplification has an exonuclease function, that is, even if a polymerase having exonuclease function is used, the linker 21 and the primer 23 are used. Since the detectable label 23 is included in the label, the detectable label 23 is not cleaved as in the past, so that any detectable label can be stably detected.
  • One embodiment of the present invention may include two or more amplification units 20 including the linker 21, the detectable label 22, and the primer 23. That is, since one substrate 10 includes a plurality of amplifiers 20, a plurality of targets can be amplified at the same time.
  • the two or more amplification units 20 may include different types of detectable labels 22, and in this case, multiple-target detection may be performed by using different fluorescence.
  • the two or more amplification units 20 each comprise a forward primer or a reverse primer as a primer
  • the fluorescent die was conventionally present between consecutive sequential sequences, but in the present invention, the fluorescent die is present between the linker and the primer, thereby preventing the linker from being amplified and related to the exonuclease function. It is possible to prevent the fluorescent die from falling out without.
  • Such a nucleic acid amplification apparatus may be a device for amplifying a nucleic acid using a PCR method, and among them, it is preferable that the nucleic acid amplification apparatus detects an amplification amount in real time together with PCR amplification.
  • the apparatus of the present invention is different from the conventional configuration of the amplification unit 20 as described above, in addition to the configuration, such as a reaction solution containing a PCR reactor, dNTP, temperature control device, detection unit, etc. in the conventional PCR device It may include what was used.
  • FIG. 7 is a cross-sectional view for explaining an example of a functional group for attaching the amplification unit 20 to the substrate 10 in the nucleic acid amplification apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • the present invention is present between the substrate 10 and the linker 21, it is possible to further include one or more functional groups selected from the group consisting of thiols and amines (amine) . That is, thiol and / or amine are first attached to the substrate 10, and the linker 21 is connected thereto. This is because the linker 21 can be more easily and stably attached when the substrate 10 has a gold surface. More preferably, a thiol is attached to the substrate 10 having the Au surface, an amine is connected to the thiol, and a linker 21 is connected to the amine.
  • Another aspect of the present invention provides a method for manufacturing a nucleic acid amplification apparatus, the method comprising: attaching a linker composed of a continuous nucleic acid base or DNA sequence to a substrate; Linking a detectable label to the attached linker; And linking a primer to the linked detectable label.
  • a poly A is attached with a linker 21 on a substrate 10 having a surface made of gold (Au)
  • a fluorescent die is connected with a detectable label 22 to the poly A
  • a fluorescent die is attached to the fluorescent die.
  • the primer 23 is to be linked.
  • the method of attaching the linker 21 to the substrate 10 and then connecting the detectable label 22 and the forward and / or reverse primer 23 is not particularly limited, and has a general knowledge in the art. Any method known to him may be used.
  • attaching the linker 21 may attach one or more functional groups selected from the group consisting of thiols and amines to the substrate 10 and connect the linker 21 to the functional groups. It is possible.
  • the attaching of the linker 21 may include attaching a thiol to the substrate 10, connecting an amine to the thiol, and connecting the linker 21 to the amine.
  • Another aspect of the invention the step of reacting the amplification solution containing a target sample and a polymerase (polymerase) to the above-described nucleic acid amplification device; And measuring a detectable change that is changed by the reaction.
  • a polymerase polymerase
  • the polymerase may be one having or not having an exonuclease function, preferably having an exonuclease function. That is, according to the present invention, regardless of whether the polymerase for amplification has an exonuclease function, that is, even if a polymerase having exonuclease function is used, the linker 21 and the primer 23 are used. Since the detectable label 23 is included in the label, the detectable label 23 is not cleaved as in the past, so that any detectable label can be stably detected.
  • the change detectable by the reaction is preferably a difference in fluorescence intensity expressed by the detectable label 23 of the present invention, but is not limited thereto.

Abstract

본 발명은 프라이머를 포함하는 핵산 증폭 장치와 이것의 제조방법 및 이를 이용한 핵산 증폭 방법에 대한 것으로, 특히 연속된 핵산 염기 또는 DNA 서열로 이루어진 링커(linker); 상기 링커와 연결된 검출 가능한 표지(detectable label); 및 상기 표지와 연결된 프라이머(primer)로 이루어진 증폭 수단이 기판에 부착된 것을 특징으로 하여, 프라이머 이외의 부분이 증폭되는 것을 방지하고, 또한 엑소뉴클레이즈(exonuclease) 기능을 가지는 폴리머중합효소를 사용하더라도 어떠한 검출 가능한 표지로도 증폭 여부를 안정적으로 검출할 수 있는 효과가 있다.

Description

프라이머를 포함하는 핵산 증폭 장치와 이것의 제조방법 및 이를 이용한 핵산 증폭 방법
본 발명은 핵산을 증폭하고 검출하는 장치에 대한 것으로, 특히 프라이머를 포함하는 핵산 증폭 장치와 이것의 제조방법 및 이를 이용한 핵산 증폭 방법에 대한 것이며, 더욱 상세하게는 프라이머 이외의 부분이 증폭되는 것을 방지하고, 또한 엑소뉴클레이즈(exonuclease) 기능을 가지는 폴리머중합효소를 사용하더라도 어떠한 검출 가능한 표지로도 증폭 여부를 안정적으로 검출할 수 있는 핵산 증폭 장치에 대한 것이다.
분자 진단은 현재 질병을 조기 진단하기 위한 체외 진단시장에서 빠르게 성장하고 있는 분야이다. 그 중에서 핵산(nucleic acid)을 이용한 방법들이 높은 특이성과 민감성을 바탕으로 바이러스, 박테리아에 의한 감염 등에 의한 원인 유전 인자를 진단하는데 유용하게 사용되고 있다. 빠르게 성장하는 시장성과는 달리 진단을 하는 방법으로는 PCR 원리를 기본으로 하여 원하는 타겟을 증폭하는 기술들이 이용되고 있으며, 특히 Real-time PCR(실시간 증폭량검출법) 방법이 널리 이용되고 있는데, 이 방법은 특정 프로브 혹은 프라이머에 형광물질을 붙여서 형광 신호의 증폭량을 바탕으로 검출하는 방법이다.
일례로, 리포터 다이(reporter dye)와 퀀칭 다이(quencher dye)를 이용하는 태크맨(TaqMan) 방법으로 PCR 증폭과 동시에 그 양을 검출하는 방법이 알려져 있다. 도 1은 종래기술에 따른 태크맨 방법을 이용한 PCR 증폭 및 검출 방법을 설명하기 위한 모식도이다. 이 방법은 Tap polymerase의 5'-nuclease 성질을 이용하는 방법으로써, 반응에는 한 쌍의 TaqMan 프로브(100)와 한 쌍의 PCR 프라이머(200, 300)가 사용된다. 5'-말단에는 리포터 다이(110)가, 3'-말단에는 퀀처 다이(120)가 공유결합 되어있는 TaqMan 프로브(100)를 이용하며, 타겟(Target, 400)의 특정한 부위와 TaqMan 프로브(100)간의 match와 mismatch의 차이를 형광물질을 이용하여 감별하는 방법이다. TaqMan 프로브(100)에 리포터 다이(110)와 퀀처 다이(120)가 모두 결합되어 있을 때는 리포터 다이(110)가 퀀처에 의해 빛을 발하지 못한다. 그러나 특정한 부위와 상보적으로 완전히 일치하는 TaqMan 프로브(100)는 PCR의 어닐링(annealing) 단계에서 타겟(400)과 결합되고, 익스텐션(extension) 단계에서 Taq 중합효소의 5'-nuclease 활성도에 의하여 5'-말단부의 리포터 다이(110)(FAM 또는 VIC)가 퀀처 다이(120)로부터 분리되어 고유한 형광을 나타내는 것이다. TaqMan 프로브(100)는 타겟(400)과 mismatch되면 TaqMan 프로브(100)가 template로부터 떨어져 나가기 때문에 더 이상의 반응이 진행되지 않는다.
그리고, 도 2는 종래기술에 따라 리포터 다이(110)와 퀀처 다이(120)가 부착된 프라이머를 이용한 PCR 증폭 및 검출 방법을 설명하기 위한 모식도이고, 도 3은 종래기술에 따라 증폭시 형광이 증가하는 다이(130)를 이용한 PCR 증폭 및 검출 방법을 설명하기 위한 모식도이다. 먼저, 도 2에 나타난 바와 같이, 리포터 다이(110)와 퀀처 다이(120)가 부착된 정방향 프라이머(200)를 이용하는 경우에는 엑소뉴클레이즈(exonuclease) 기능을 가지는 중합효소를 이용하여, 증폭과 함께 상기 리포터 다이(110)를 상기 프라이머(200)로부터 분리시키는 것이 필요하다. 그래서, 분리된 리포터 다이(110)의 양을 통하여 증폭정도를 검출하는 것이다. 이와 비교하여, 도 3에 나타난 바와 같이, 증폭시 형광이 증가하는 다이(130)를 이용하는 경우에는 엑소뉴클레이즈(exonuclease) 기능을 가지지 않는 중합효소를 이용하더라도, 증폭이 진행되면 상기 증폭시 형광이 증가하는 다이(130)의 형광이 증가하는바, 이를 통하여 증폭정도를 검출하는 것이다. 즉, 이와 같이 프라이머에 다이를 부착시키는 방법은 폴리머중합효소가 엑소뉴클레이즈(exonuclease) 기능을 가지는지 여부에 따라 다이의 종류를 다르게 선택해야 하는 단점이 있다. 만약, 기존의 리포터 다이(110)를 이용하고자 한다면 반드시 엑소뉴클레이즈(exonuclease) 기능을 가지는 폴리머중합효소를 사용해야만 하고, 증폭시 형광이 증가하는 다이(130)를 이용하는 경우에는 반드시 엑소뉴클레이즈(exonuclease) 기능이 없는 폴리머중합효소를 사용해야만 한다. 이와 함께, 상기 프라이머(200, 300)는 연속적인 염기서열 사이의 특정 부분에 결합하기 때문에, 즉 상기 프라이머(200, 300)가 결합되는 앞뒤로 다른 염기서열이 존재하기 때문에, 폴리머중합효소에 의한 복제과 정시 본래의 방향과는 반대방향으로도 소정의 길이만큼 원하지 않는 부분이 증폭되는 결과를 초래한다.
또한, 도 4는 종래기술에 따라 프라이머를 기판에 고정시키는 solid phase PCR 또는 Bridge PCR 방법을 설명하기 위한 모식도이다. 즉, 기판(500) 위에 고정부(700)이용하여 정방향 프라이머(200)를 부착시키고, 역방향 프라이머(300)는 PCR 반응기 내부의 용액 상에 떠다니도록 한다. 이후, 타겟(400)이 들어오면 상기 정방향 프라이머(200)와 역방향 프라이머(300)는 상기 타겟(400)을 증폭시키고, 증폭된 제1 산물(610)과 제2 산물(620)이 서로 brige 를 형성하면서 증폭되는 것이다. 그러나, 이 경우 상기 역방향 프라이머(300)에 의해 증폭된 제2 산물(620)은 타겟(400) 뿐만 아니라, 상기 타겟(400)과 연결된 고정부(700)의 염기까지 증폭시키는 문제점이 있다. 그래서, 증폭된 제2 산물(620)은 타겟 이외에 원하지 않는 부분(A)까지 추가로 포함하는 단점이 있다.
본 발명의 일 구체예는 타겟 이외에 원하지 않는 부분이 증폭되는 것을 방지할 수 있는 핵산 증폭 장치를 제공하는 것이 목적이다.
또한, 본 발명은 증폭을 위한 폴리머중합효소가 엑소뉴클레이즈(exonuclease) 기능을 가지는지 여부와 상관없이, 어떠한 검출 가능한 표지로도 증폭 여부를 안정적으로 검출하고자 하는 것이다.
본 발명의 일 양상은, 기판; 상기 기판에 부착되고, 연속된 핵산 염기 또는 DNA 서열로 이루어진 링커(linker); 상기 링커와 연결된 검출 가능한 표지(detectable label); 및 상기 표지와 연결된 프라이머(primer)를 포함하는 핵산 증폭 장치이다.
여기서, 상기 기판은 금(Au)으로 이루어진 표면을 가지는 것이 바람직하다.
그리고, 상기 링커는 10~1,000 뉴클레오티드(nucleotide) 범위 내의 길이를 가지는 것이 가능하다.
또한, 상기 연속된 핵산 염기는 폴리 A(poly A)일 수 있다.
또한, 상기 검출 가능한 표지는 형광 다이(fluorescence dye)인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 링커, 검출 가능한 표지 및 프라이머로 이루어진 증폭부를 2개 이상 포함하는 것이 가능하다.
여기서, 상기 2개 이상의 증폭부는 각각 프라이머로써 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머를 포함하여 이루어진 것이 바람직하다.
또한, 상기 2개 이상의 증폭부는 서로 다른 종류의 검출 가능한 표지를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 기판과 링커 사이에 존재하는 것으로써, 싸이올(thiol) 및 아민(amine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 작용기를 더 포함하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명은 상기 기판에 싸이올이 부착되고, 상기 싸이올에 아민이 연결되며, 상기 아민에 링커가 연결된 것일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 핵산 증폭 장치는 실시간(real time) 핵산 증폭 장치인 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 양상은 핵산 증폭 장치의 제조방법으로써, 기판에 연속된 핵산 염기 또는 DNA 서열로 이루어진 링커(linker)를 부착시키는 단계; 상기 부착된 링커에 검출 가능한 표지(detectable label)를 연결하는 단계; 및 상기 연결된 검출 가능한 표지에 프라이머(primer)를 연결하는 단계를 포함하는 것이다.
본 발명의 또 다른 양상은, 상술한 핵산 증폭 장치에 표적 시료와 폴리머중합효소(polymerase)를 포함하는 증폭 용액을 반응시키는 단계; 및 상기 반응에 의해 변하는 검출 가능한 변화를 측정하는 단계를 포함하는 핵산 증폭 방법이다.
기타 실시예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.
본 발명에 따른 핵산 증폭 장치는 연속된 핵산 염기 또는 DNA 서열로 이루어진 링커(linker)와 프라이머(primer) 사이에 검출 가능한 표지(detectable label)를 포함하는 증폭 수단을 특징으로 하여, 상기 검출 가능한 표지에 의해 타겟 이외에 원하지 않는 부분이 증폭되는 것을 방지할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 증폭을 위한 폴리머중합효소가 엑소뉴클레이즈(exonuclease) 기능을 가지는지 여부와 상관없이, 즉 엑소뉴클레이즈(exonuclease) 기능을 가지는 폴리머중합효소를 사용하더라도, 어떠한 검출 가능한 표지로도 증폭 여부를 안정적으로 검출할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 종래기술에 따른 태크맨 방법을 이용한 PCR 증폭 및 검출 방법을 설명하기 위한 모식도이다.
도 2는 종래기술에 따라 리포터 다이(110)와 퀀처 다이(120)가 부착된 프라이머를 이용한 PCR 증폭 및 검출 방법을 설명하기 위한 모식도이다.
도 3은 종래기술에 따라 증폭시 형광이 증가하는 다이(130)를 이용한 PCR 증폭 및 검출 방법을 설명하기 위한 모식도이다.
도 4는 종래기술에 따라 프라이머를 기판에 고정시키는 solid phase PCR 또는 Bridge PCR 방법을 설명하기 위한 모식도이다.
도 5는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 핵산 증폭 장치의 구성을 설명하기 위한 단면도이다.
도 6은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 핵산 증폭 장치를 이용하여 타겟이 증폭되는 상태를 설명하기 위한 단면도이다.
도 7은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 핵산 증폭 장치에서 증폭부를 기판에 부착시키는 작용기의 일례를 설명하기 위한 단면도이다.
<도면의 주요 부분에 대한 기호의 간단한 설명>
10, 500: 기판
20: 증폭부
21: 링커
22: 검출 가능한 표지
23: 프라이머
30, 400: 타겟
41, 610: 제1 산물
42, 620: 제2 산물
100: TaqMan 프로브
110: 리포터 다이
120: 퀀처 다이
130: 증폭시 형광이 증가하는 다이
200: 정방향 프라이머
300: 역방향 프라이머
700: 고정부
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시 예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.
도 5는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 핵산 증폭 장치의 구성을 설명하기 위한 단면도이고, 도 6은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 핵산 증폭 장치를 이용하여 타겟이 증폭되는 상태를 설명하기 위한 단면도이다.
이하, 도 5 및 도 6을 참조하여, 본 발명에 따른 핵산 증폭 장치의 구성 및 기능을 설명한다.
도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 핵산 증폭 장치는 기판(10); 링커(21); 검출 가능한 표지(22); 및 프라이머(23)를 포함하여 이루어진다. 상기 링커(21); 검출 가능한 표지(22); 및 프라이머(23)는 PCR 방법에 의해 타겟을 증폭시키는 증폭부(20)를 구성할 수 있다.
상기 기판(10)은 본 발명에 따른 링커(21)를 부착시키기 위한 것으로, 고체 표면(solid phase)을 가지면 족하고, 이 기술분야에 알려진 모든 플레이트 또는 기판을 포함하며, 종래의 solid phase PCR 방법에서 사용하는 기판을 이용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 상기 기판은 금속 또는 유리 기판일 수 있고, 상기 금속 전극 기판에 사용될 수 있는 금속은 금, 백금, 은, 구리 및 인듐 틴 옥시드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 본 발명에 따른 링커(21) 부착을 위하여 바람직하게는 금(Au)으로 이루어진 표면을 가지는 것이 적합하다.
상기 링커(21)는 연속된 핵산 염기 또는 DNA 서열로 이루어질 수 있고, 바람직하게는 연속된 동일한 핵산 염기 또는 DNA 서열로 이루어지는 것이 적합하다. 예를 들어, 핵산 염기인 A, T, C, G 중 하나가 연속되어 배열된 것일 수 있고, 이러한 핵산 염기를 포함하는 동일한 DNA가 연속되게 배열된 것도 가능하다. 또한, 상기 연속된 핵산 염기는 폴리 A(poly A)일 수 있다. 본 발명의 링커는 이와 같이 동일한 핵산 염기나 DNA 서열이 연속적으로 배열됨으로써, 후술하는 검출 가능한 표지(22)나 프라이머(23)를 더욱 안정적으로 기판(10) 표면에 부착시킬 수 있고, 중합효소에 의한 무분별한 복제나 증폭을 최소화할 수 있다. 이를 위하여, 상기 링커(21)는 10~1,000 뉴클레오티드(nucleotide) 범위 내의 길이를 가지는 것이 바람직한데, 상기 범위보다 작은 경우 기판(10) 표면에의 부착력이 떨어지고, 상기 범위를 넘는 경우에는 그 위에 연결되는 프라이머(23)가 휘어져서 다른 프라이머(23)에 영향을 줄 수 있기 때문에 부적합하다.
상기 검출 가능한 표지(22)는 링커(21)와 연결되고, 상기 검출 가능한 표지(22)의 다른쪽에는 프라이머(23)가 연결될 수 있다. 즉, 링커(21); 검출 가능한 표지(22); 및 프라이머(23) 순으로 연결되는 것이다.
본 명세서에서, "프라이머(23)"는 표적 시료를 증폭시키기 위한 것으로, 정방향 프라이머 및/또는 역방향 프라이머일 수 있으며, 일반적으로 PCR 방법에서 사용되는 모든 종류의 프라이머를 포함하는 것이 가능하다.
본 명세서에서, "검출 가능한 표지(22)"는 표지가 없는 동일한 종류의 분자들 중에서 표지를 포함하는 분자의 특이적으로 검출하도록 하는 원자 또는 분자를 의미하는 것이다. 상기 검출 가능한 표지는 검출 과정에서 전자를 내보낼 수 있는 물질이면 어떠한 것이든 가능하며, 예를 들어, 색깔 비드(colored bead), 항원 결정체, 효소, 혼성화 가능한 핵산, 발색 물질, 형광 물질, 인광 물질, 전기적으로 검출 가능한 분자, 변경된 형광-분극 또는 변경된 빛-확산을 제공하는 분자 또는 양자점 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 또한, 상기 표지는 P32 및 S35와 같은 방사선동위원소, 화학발광 (chemiluminescent) 화합물, 표지된 결합 단백질, 중금속 원자 및 다이와 같은 분광학적 마커, 및 자기 표지물을 포함할 수 있다. 상기 다이는 예를 들어, 퀴놀린 다이, 트리아릴메탄 다이, 프탈레인, 아조 다이 및 시아닌 다이를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 검출 가능한 표지(22)는 형광 다이(fluorescence dye)인 것이 바람직하고, 종래의 리포터 다이 또는 퀸처 다이인 것도 가능하며, 증폭시 형광이 증가하는 다이를 이용할 수도 있다. 종래의 리포터 다이를 본 발명에 따른 검출 가능한 표지(22)로 이용하더라도 본 발명에서 상기 검출 가능한 표지(22)는 링커(21)에 연결되어 있기 때문에, 주형(template)으로부터 떨어져 나가거나 분리되지 않는다. 본 발명은 기존에 알려진 다이를 이용하고 증폭시에 상기 다이의 형광이 증가하는 처리를 수행하거나 기존에 증폭시 형광이 증가하는 다이를 이용하여 증폭된 양을 검출할 수 있다. 또한, 증폭량 측정을 위하여 프라이머에 별도의 다이를 연결시키거나 기존의 TaqMan 프로브를 이용하는 것도 가능하다.
본 발명은 상기 링커(21)와 프라이머(23) 사이에 검출 가능한 표지(23)를 포함하는 것이 특징이고, 이를 통하여 타겟 이외에 원하지 않는 부분이 증폭되는 것을 방지하고자 하는 것이며, 또한 어떠한 검출 가능한 표지로도 증폭 여부를 안정적으로 검출하고자 하는 것이다.
즉, 기존에 검출 가능한 표지로 사용된 형광 다이는 프라이머에 부착되어서, 타겟의 연속적인 염기서열 사이의 특정 부분에 결합하기 때문에, 즉 상기 프라이머가 결합되는 앞뒤로 다른 염기서열이 존재하기 때문에, 폴리머중합효소에 의한 복제과정시 본래의 방향과는 반대방향으로도 소정의 길이만큼 원하지 않는 부분이 증폭되는 결과를 초래하였다. 또한, 상기 프라이머가 염기서열로 이루어진 고정부에 의해 solid phase 에 부착되더라도 상기 프라이머는 고정부와 바로 연결되어 있기 때문에, 폴리머중합효소에 의한 복제과정시 원하지 않는 부분이 증폭되는 결과를 초래하였다.
그러나, 본 발명은 상기 링커(21)와 프라이머(23) 사이에 검출 가능한 표지(23)를 포함하는 것을 특징으로 하여, 상기 검출 가능한 표지(23)에 의해 복제가 이루어지는 것을 차단함으로써, 증폭시에도 상기 프라이머(23)가 있는쪽으로만 증폭이 이루어지고, 상기 링커(21)쪽으로는 증폭이 이루어지지 않게 할 수 있다. 또한, 상기 링커(21) 부분에 대한 복제가 이루어지더라도 상기 검출 가능한 표지(23)가 있는 부분에 이르면 복제가 중단된 후, 다시 프라이머(23) 부분 또는 프라이머(23) 방향쪽으로만 복제가 이루어져서 목적하는 부분만에 대한 증폭산물을 얻을 수 있는 것이다.
또한, 기존에 형광 다이가 부착된 프로브를 이용하는 일부 방법에서는 상기 형광 다이가 원치 않게 끊어지는 것을 막기 위하여 반드시 엑소뉴클레이즈(exonuclease) 기능이 없는 폴리머중합효소를 사용해야 했다. 그러나, 본 발명은 증폭을 위한 폴리머중합효소가 엑소뉴클레이즈 기능을 가지는지 여부와 상관없이, 즉 엑소뉴클레이즈 기능을 가지는 폴리머중합효소를 사용하더라도, 링커(21)와 프라이머(23) 사이에 검출 가능한 표지(23)를 포함하기 때문에 기존처럼 상기 검출 가능한 표지(23)가 절단되지 않아서, 어떠한 검출 가능한 표지로도 증폭 여부를 안정적으로 검출할 수 있는 효과가 있다.
본 발명의 일 구체예는 상기 링커(21), 검출 가능한 표지(22) 및 프라이머(23)로 이루어진 증폭부(20)를 2개 이상 포함하는 것이 가능하다. 즉, 하나의 기판(10)이 다수의 증폭부(20)를 포함함으로써, 동시에 다수의 타겟을 증폭시킬 수 있다.
그리고, 상기 2개 이상의 증폭부(20)는 서로 다른 종류의 검출 가능한 표지(22)를 포함할 수 있고, 이 경우 각각 다른 형광을 이용함으로써 멀티-타켓 검출(multiple-target detection)이 가능하다.
또한, 상기 2개 이상의 증폭부(20)가 각각 프라이머로써 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머를 포함하여 이루어지는 경우에는, bridge PCR 방법을 적용하여 사용할 수 있는 점에서 바람직하다. 즉, 도 6에 나타난 바와 같이, 하나의 타겟(30)에 대하여 정방향(F) 및 역방향(R) 프라이머(23)가 함께 복제를 수행할 수 있고, 본 발명의 검출 가능한 표지(22)에 의해 링커(21) 부분으로의 복제가 차단됨으로써, 복제된 제1 산물(41) 및 제2 산물(42)은 모두 목적하지 않는 부분을 포함하지 않게 된다.
상기와 같이, 종래에는 형광 다이가 연속적인 염기서열 사이에 존재하였지만, 본 발명에서는 링커와 프라이머 사이에 형광 다이가 존재함으로써, 상기 링커가 증폭되는 것을 방지할 수 있고, 엑소뉴클레이즈 기능에 관계없이 상기 형광 다이가 떨어져 나가는 것을 방지할 수 있게 해 준다.
이와 같은 본 발명에 따른 핵산 증폭 장치는 PCR 방법을 이용해서 핵산을 증폭시키는 장치일 수 있고, 그 중에서도 PCR 증폭과 함께 실시간(real time)으로 증폭량을 검출하는 실시간 핵산 증폭 장치인 것이 바람직하다. 그래서, 본 발명의 장치는 상기한 바와 같은 증폭부(20)의 구성이 종래와 상이한 것이고, 이외에 PCR 반응기, dNTP 등을 포함하는 반응용액, 온도조절장치, 검출부 등과 같은 구성은 종래의 PCR 장치에서 이용되던 것을 포함할 수 있다.
도 7은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 핵산 증폭 장치에서 증폭부(20)를 기판(10)에 부착시키는 작용기의 일례를 설명하기 위한 단면도이다.
일 구체예로써, 본 발명은 상기 기판(10)과 링커(21) 사이에 존재하는 것으로써, 싸이올(thiol) 및 아민(amine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 작용기를 더 포함하는 것이 가능하다. 즉, 기판(10)에 먼저 싸이올(thiol) 및/또는 아민(amine)가 부착되고, 그 위에 링커(21)가 연결되는 것이다. 이는 상기 기판(10)이 금(Au) 표면을 가지는 경우 링커(21)를 더욱 용이하고 안정적으로 부착시킬 수 있기 때문이다. 또한, 더욱 바람직하게는 상기 금(Au) 표면을 가지는 기판(10)에 싸이올이 부착되고, 상기 싸이올에 아민이 연결되며, 상기 아민에 링커(21)가 연결된 것이 적합하다.
본 발명의 다른 양상은 핵산 증폭 장치의 제조방법으로써, 기판에 연속된 핵산 염기 또는 DNA 서열로 이루어진 링커(linker)를 부착시키는 단계; 상기 부착된 링커에 검출 가능한 표지(detectable label)를 연결하는 단계; 및 상기 연결된 검출 가능한 표지에 프라이머(primer)를 연결하는 단계를 포함하는 것이다.
예를 들어, 금(Au)으로 이루어진 표면을 가진 기판(10) 위에 링커(21)로써 폴리 A를 부착시키고, 상기 폴리 A에 검출 가능한 표지(22)로써 형광 다이를 연결하며, 상기 형광 다이에 프라이머(23)를 연결시키는 것이다. 이와 같이 기판(10)에 링커(21)를 부착시킨 후 검출 가능한 표지(22)와 정방향 및/또는 역방향 프라이머(23)를 연결시키는 방법은 특별히 제한되지 않고, 이 기술분야에서 보통의 지식을 가진자에게 널리 알려진 모든 방법을 이용할 수 있다.
또한, 상기 링커(21)를 부착시키는 것은, 상기 기판(10)에 싸이올(thiol) 및 아민(amine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 작용기를 부착시키고, 상기 작용기에 링커(21)를 연결하는 것이 가능하다. 또한, 상기 링커(21)를 부착시키는 것은, 상기 기판(10)에 싸이올을 부착시키고, 상기 싸이올에 아민을 연결하며, 상기 아민에 링커(21)를 연결하는 것이 바람직하다.
이에 대한 구체적인 설명은 상술한 바와 같고, 이러한 본 발명에 따른 제조방법을 이용하면, 링커가 증폭되는 것을 방지할 수 있고, 엑소뉴클레이즈 기능에 관계없이 형광 다이가 떨어져 나가는 것을 방지할 수 있는 핵산 증폭 장치를 제조할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은, 상술한 핵산 증폭 장치에 표적 시료와 폴리머중합효소(polymerase)를 포함하는 증폭 용액을 반응시키는 단계; 및 상기 반응에 의해 변하는 검출 가능한 변화를 측정하는 단계를 포함하는 핵산 증폭 방법이다.
여기서, 상기 폴리머중합효소는 엑소뉴클레이즈(exonuclease) 기능을 가지거나 가지지 않는 것일 수 있고, 바람직하게는 엑소뉴클레이즈 기능을 가지는 것이 적합하다. 즉, 본 발명은 증폭을 위한 폴리머중합효소가 엑소뉴클레이즈 기능을 가지는지 여부와 상관없이, 즉 엑소뉴클레이즈 기능을 가지는 폴리머중합효소를 사용하더라도, 링커(21)와 프라이머(23) 사이에 검출 가능한 표지(23)를 포함하기 때문에 기존처럼 상기 검출 가능한 표지(23)가 절단되지 않아서, 어떠한 검출 가능한 표지로도 증폭 여부를 안정적으로 검출할 수 있는 효과가 있다.
그리고, 상기 반응에 의해 변하는 검출 가능한 변화는 본 발명의 검출 가능한 표지(23)에 의해 발현되는 형광 세기의 차이인 것이 바람직하고, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기에서는 본 발명의 일 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 하기의 특허 청구의 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (19)

  1. 기판;
    상기 기판에 부착되고, 연속된 핵산 염기 또는 DNA 서열로 이루어진 링커(linker);
    상기 링커와 연결된 검출 가능한 표지(detectable label); 및
    상기 표지와 연결된 프라이머(primer)를 포함하는 핵산 증폭 장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 기판은 금(Au)으로 이루어진 표면을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장치.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 링커는 10~1,000 뉴클레오티드(nucleotide) 범위 내의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장치.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 연속된 핵산 염기는 폴리 A(poly A)인 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장치.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 검출 가능한 표지는 형광 다이(fluorescence dye)인 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장치.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 링커, 검출 가능한 표지 및 프라이머로 이루어진 증폭부를 2개 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장치.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 2개 이상의 증폭부는 각각 프라이머로써 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장치.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 2개 이상의 증폭부는 서로 다른 종류의 검출 가능한 표지를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장치.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 기판과 링커 사이에 존재하는 것으로써, 싸이올(thiol) 및 아민(amine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 작용기를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장치.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 기판에 싸이올이 부착되고, 상기 싸이올에 아민이 연결되며, 상기 아민에 링커가 연결된 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장치.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 증폭 장치는 실시간(real time) 핵산 증폭 장치인 것을 특징으로 하는 실시간 핵산 증폭 장치.
  12. 기판에 연속된 핵산 염기 또는 DNA 서열로 이루어진 링커(linker)를 부착시키는 단계;
    상기 부착된 링커에 검출 가능한 표지(detectable label)를 연결하는 단계; 및
    상기 연결된 검출 가능한 표지에 프라이머(primer)를 연결하는 단계를 포함하는 핵산 증폭 장치의 제조방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 기판은 금(Au)으로 이루어진 표면을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장치의 제조방법.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 연속된 핵산 염기는 폴리 A(poly A)인 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장치의 제조방법.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 링커를 부착시키는 것은,
    상기 기판에 싸이올(thiol) 및 아민(amine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 작용기를 부착시키고, 상기 작용기에 링커를 연결하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장치의 제조방법.
  16. 제12항에 있어서,
    상기 링커를 부착시키는 것은,
    상기 기판에 싸이올을 부착시키고, 상기 싸이올에 아민을 연결하며, 상기 아민에 링커를 연결하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장치의 제조방법.
  17. 제12항에 있어서,
    상기 핵산 증폭 장치는 실시간(real time) 핵산 증폭 장치인 것을 특징으로 하는 실시간 핵산 증폭 장치의 제조방법.
  18. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 핵산 증폭 장치에 표적 시료와 폴리머중합효소(polymerase)를 포함하는 증폭 용액을 반응시키는 단계; 및
    상기 반응에 의해 변하는 검출 가능한 변화를 측정하는 단계를 포함하는 핵산 증폭 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 폴리머중합효소는 엑소뉴클레이즈(exonuclease) 기능을 가지는 것임을 특징으로 하는 핵산 증폭 방법.
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