WO2021154042A2 - 결핵균 및 비결핵항산균을 동시에 감별하여 검출할 수 있는 고감도 다중 등온증폭반응용 프라이머 세트 - Google Patents

결핵균 및 비결핵항산균을 동시에 감별하여 검출할 수 있는 고감도 다중 등온증폭반응용 프라이머 세트 Download PDF

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장웅식
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence

Definitions

  • the present invention relates to a primer set for multiple isothermal amplification reactions capable of simultaneously discriminating and detecting Mycobacterium tuberculosis (MTB) and Nontuberculous mycobacteria (NTM).
  • MTB Mycobacterium tuberculosis
  • NTM Nontuberculous mycobacteria
  • the present invention relates to a primer set for multiple isothermal amplification reactions capable of simultaneously discriminating and detecting Mycobacterium tuberculosis (MTB) and Nontuberculous mycobacteria (NTM).
  • MTB Mycobacterium tuberculosis
  • NTM Nontuberculous mycobacteria
  • Tuberculosis is a droplet-infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis (MTB) and is one of the leading causes of death from infectious diseases that have killed millions of people over the past centuries. It is also estimated to cause 10 million new cases and approximately 2 million deaths each year.
  • MTB Mycobacterium tuberculosis
  • NTM Nontuberculous mycobacteria
  • M avium complex accounts for 60-80%, in foreign countries, M. kansasii accounts for 15-20%, and in Korea, M. abscessus accounts for 20-30%, and NTM is isolated from clinical specimens in Korea. The number of patients diagnosed and treated for NTM lung disease is increasing significantly.
  • the tuberculosis guideline also recommends using PCR for identification of suspected patients.
  • MTB and NTM detection using PCR requires skilled inspectors and an advanced laboratory base. Therefore, there are limitations in testing in areas where specialized medical services are not available or where it is necessary to perform a large number of screening tests in a short period of time.
  • LAMP loop-mediated isothermal amplification reaction
  • the present inventors completed the present invention by intensively studying a method for simultaneously identifying MTB and NTM using the LAMP method without an experienced tester and expensive equipment.
  • LAMP Loop-mediated isothermal amplification
  • the technical problem to be achieved by the present invention is to provide a Mycobacterium tuberculosis detection primer set and a Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium tuberculosis detection primer set, and a primer set capable of discriminating and detecting Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium tuberculosis, including each of the primer sets, and To provide a kit and a method for differentially detecting Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium tuberculosis using the same.
  • the present invention provides a LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) primer set for detecting Mycobacterium tuberculosis (MTB) comprising the primers of SEQ ID NOs: 1 to 6.
  • LAMP Loop-mediated isothermal amplification
  • the LAMP primer set for detecting Mycobacterium tuberculosis may include an MTB probe, and the MTB probe may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7.
  • the present invention provides a LAMP primer set for detecting Mycobacterium tuberculosis and Non-tuberculosis bacterium (NTM), comprising the primers of SEQ ID NOs: 8 to 13.
  • the LAMP primer set for detecting Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium tuberculosis may include an NTM probe, and the NTM probe may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14.
  • the present invention provides a LAMP primer kit for differential detection of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium tuberculosis comprising the MTB primer set of SEQ ID NOs: 1 to 6 and the NTM primer set of SEQ ID NOs: 8 to 13.
  • the present invention provides a LAMP kit for diagnosing tuberculosis comprising the MTB primer set of SEQ ID NOs: 1 to 6 and the NTM primer set of SEQ ID NOs: 8 to 13.
  • the kit may further include an internal control (IC) primer set of SEQ ID NOs: 15 to 20.
  • IC internal control
  • the MTB primer set included in the kit may further include an MTB probe comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, and the NTM primer set includes the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14
  • An NTM probe including a nucleotide sequence may be further included, and the IC primer set may further include an IC probe including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21.
  • the MTB probe, the NTM probe and the IC probe are respectively FAM (6-carboxyfluorescein), Texas red (texas red), fluorescein (fluorescein), HEX (2',4',5) ',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), fluorescein chlorotriazinyl, rhodamine green, rhodamine red, tetramethyl rhodamine ( tetramethyl rhodamine), FITC (fluorescein isothiocyanate), oregon green, alexa fluor, JOE (6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX ( 6-Carboxyl-XRhodamine), Tetrachloro-Fluorescein (TET), tertramethylrodamine isothiocyanate (TRITC), 6-carbox
  • FAM 6-carbox
  • the kit may further include a reagent for performing an amplification reaction, and the reagent may include one or more selected from the group consisting of DNA polymerase, dNTPs, and a buffer.
  • the present invention comprises the steps of (1) isolating genomic DNA (gDNA) from a biological sample; (2) MTB primer set of SEQ ID NOs: 1 to 6 using the isolated gDNA as a template; and amplifying the target sequence by performing an isothermal amplification reaction using the MTB and NTM differential diagnostic composition comprising the MTB and NTM primer sets of SEQ ID NOs: 8 to 13; and (3) detecting the amplified product; provides a differential detection method comprising Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium tuberculosis.
  • gDNA genomic DNA
  • MTB primer set of SEQ ID NOs: 1 to 6 using the isolated gDNA as a template
  • amplifying the target sequence by performing an isothermal amplification reaction using the MTB and NTM differential diagnostic composition comprising the MTB and NTM primer sets of SEQ ID NOs: 8 to 13
  • detecting the amplified product provides a differential detection method comprising Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium tubercul
  • the present invention comprises the steps of (1) isolating genomic DNA (gDNA) from a biological sample; (2) MTB primer set of SEQ ID NOs: 1 to 6 using the isolated gDNA as a template; NTM primer set of SEQ ID NOs: 8 to 13; and performing an isothermal amplification reaction using a kit comprising the IC primer set of SEQ ID NOs: 15 to 20 to amplify the target sequence; and (3) detecting the amplified product; provides an information providing method for diagnosing tuberculosis, including.
  • the biological sample may be at least one selected from the group consisting of sputum, bronchial aspiration and bronchial washing, and body fluid.
  • step (3) may be performed by one or more methods selected from the group consisting of DNA chip, gel electrophoresis, radiometric measurement, fluorescence measurement, and phosphorescence measurement, but preferably fluorescence measurement can depend on the method.
  • the method comprises: MTB primer set after step (3); and when all of the products amplified by the NTM primer set are detected, it is interpreted as MTB positive. may additionally include.
  • the method may include the step of interpreting as negative when the amplification product by the internal control primer set is detected and the amplification product by the other primer set is not detected after step (3) there is.
  • the method may further include quantifying MTB and/or NTM by measuring the detection time of step (3) after step (3).
  • the "quantification” may be to quantify the fluorescent material detection time according to the DNA concentration compared to a standard curve when performing an amplification reaction using the primer set according to the present invention, and preferably, the amplification product of step (c) is fluoresced. By detecting using an indicator, the detection time of the fluorescent substance may be measured to quantify the DNA concentration.
  • the primer set of the present invention is based on real-time multiplex LAMP, and shortens the identification time of the causative agent of lung disease compared to conventional PCR and real-time PCR-based detection, and is based on LAMP.
  • LAMP real-time multiplex
  • 1 is a view showing the position of the LAMP primer set in the IS6110 gene sequence, which is a target gene of MTB.
  • FIG. 2 is a view showing the position of the LAMP primer set in the RpoB gene sequence, which is a target gene of NTM.
  • FIG. 3 is a diagram showing the detection test results of the multiplex LAMP kit (Cy5 (MTB), TexasRED (NTM), HEX (GAPDH)) of the present invention.
  • the present inventors have completed the present invention by intensively researching a method for quickly and accurately identifying pathogens of infectious lung disease patients in the field.
  • Mycobacterium tuberculosis was prepared primers specific set the RpoB of:: (NTM Nontuberculous mycobacteria) with LAMP-based (Mycobacterium tuberculosis MTB) and Mycobacterium tuberculosis specific primers and non-tuberculosis mycobacteria in IS6110 gene of.
  • LAMP-based primer set of the present invention does not require a temperature change, so a simple and light amplification device can be used, and the time required for analysis can be dramatically reduced.
  • the present invention can shorten the cell identification time by enabling the detection and differentiation of mycobacteria and non-mycobacteria at the same time by performing a multiplex LAMP including primers specific set to a specific primer set and the RpoB the IS6110.
  • the present invention can improve the reliability of the multiplex LAMP analysis result by preparing a primer set specific for the GAPDH gene and providing it as an internal control primer set.
  • the present invention provides a primer set that specifically acts on MTB (MTB primer set), a primer set that simultaneously acts on 25 types of NTM and MTB (NTM primer set), and a primer capable of confirming whether amplification is performed with an internal control A set (IC primer set) is provided.
  • MTB primer set MTB primer set
  • NTM primer set NTM primer set
  • IC primer set a primer capable of confirming whether amplification is performed with an internal control A set
  • the present invention provides a composition for detecting MTB bacteria comprising the primer set.
  • SEQ ID NOs: 1-6 in Table 1 below are six primer sets for MTB (MTB primers), SEQ ID NOs: 8-13 are 25 kinds of NTM and six primer sets for MTB (NTM primers), and SEQ ID NO: 15 -20 is a set of 6 primers (Internal control primer) that can amplify the GAPDH gene as an internal control.
  • the primer set of Table 1 and the composition including the same can be used for the detection of MTB and NTM bacteria using the Multiplex LAMP method.
  • composition of the multiplex LAMP primer set for differential detection of MTB and NTM of the present invention is shown in Table 3 below, and the reaction time and temperature are shown in Table 4 below.
  • the present invention can provide an LAPM kit for diagnosing tuberculosis including the three primer sets, and the LAMP kit is used to perform multiplex LAMP to obtain a cell identification result in one test. Specifically, when amplified by both the MTB primer and the NTM primer, it is interpreted as MTB. If the NTM primer is amplified but the MTB primer is not amplified, it is interpreted as NTM. When the test result is negative, it is interpreted as true negative if amplification is done by the internal control primer. If the result is negative or the internal control primer is also negative, it is recommended to retest.
  • the three primer sets of the present invention may each independently include a probe, and each probe may have a fluorescent material having a different emission wavelength range attached thereto.
  • cell identification results can be quickly obtained in one test by performing multiplex real-time LAMP using the three primer sets including each probe emitting different fluorescence.
  • the fluorescent material attached to each probe is not limited as long as it emits fluorescence, but non-limiting examples thereof include FAM (6-carboxyfluorescein), Texas red (texas red), fluorescein, HEX (2', 4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), fluorescein chlorotriazinyl, rhodamine green, rhodamine red, tetra methyl rhodamine, FITC (fluorescein isothiocyanate), oregon green, alexa fluor, JOE (6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein) ), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetra
  • the present invention isolates genomic DNA (gDNA) from a biological sample of an individual in need of tuberculosis diagnosis, amplifies a target sequence by performing LAMP using the kit using the gDNA as a template, and detects the amplification product. It is possible to provide a method for diagnosing tuberculosis comprising the steps of:
  • the "individual” is not limited as long as it is a mammal requiring a diagnosis of tuberculosis, but preferably a human.
  • the "biological sample” in the present invention may include cells or tissues of various parts of the body, including sputum, bronchial aspiration and bronchial washing, body fluid, etc. there is.
  • LAMP; Loop-mediated isothermal amplification is a method of performing a reaction under isothermal conditions using polymerases such as Bst and Gsp that do not require a PCR cycle unlike the existing PCR method.
  • a method of verifying the presence or absence of amplification by synthesizing both ends into a loop structure using four primers as Preferably, a reagent for detecting fluorescence may be used, but the present invention is not limited thereto.
  • the "multiplex LAMP" can simultaneously detect various genes, and preferably, simultaneously detect MTB and/or NTM in a sample to determine the presence or absence of MTB and/or NTM in the sample. It can be determined, but is not limited thereto.
  • multiplex real-time LAMP is a method for checking in real time whether or not the various genes are amplified. It is possible to determine the presence or absence of MTB and/or NTM in real time.
  • the kit comprising the primer set of the present invention is preferably used for isothermal amplification (LAMP) for the diagnosis of tuberculosis, and the isothermal amplification reaction is a single-step amplification of target DNA by LAMP It may be a (one-step) LAMP, may be a real-time LAMP (real-time LAMP), or may be a combination thereof.
  • LAMP isothermal amplification
  • the term "primer” means a template under suitable conditions (for example, four different nucleoside triphosphates and a polymerization agent such as DNA, RNA polymerase or reverse transcriptase) in an appropriate buffer and at an appropriate temperature.
  • - refers to a single-stranded oligonucleotide that can serve as a starting point for directing DNA synthesis.
  • the appropriate length of the primer may vary depending on the intended use, but is usually 15 to 30 nucleotides. Short primer molecules generally require lower temperatures to form stable hybrids with the template.
  • the primer sequence need not be completely complementary to the template, but must be sufficiently complementary to hybridize to the template.
  • the primer of the present invention can be chemically synthesized using methods known in the art, such as, for example, phosphoramidite solid support method. In addition, it can be modified by methylation, encapsulation, etc. by a known method.
  • the primer of the present invention may include a label detectable directly or indirectly by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical or chemical means. Examples of labels include enzymes (eg, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase), radioactive isotopes (eg, 32P), fluorescent molecules, chemical groups (eg, biotin), and the like. there is.
  • inner primer refers to a single-stranded oligonucleotide capable of binding to a template DNA and serving as a starting point for synthesis of a new DNA chain.
  • outer primer refers to a single-stranded oligonucleotide that binds to the template DNA outside the position where the inner primer binds to the template DNA. After the chain is elongated, a strand displacement occurs due to the binding of the external primer and the template DNA, and the previously formed chain is separated.
  • the “loop primer” refers to an initial stem loop structure formed by binding the inner primer and the outer primer to the template DNA by increasing the number of loop structures as a result. It refers to a single-stranded oligonucleotide that can act as a starting point for nucleotide synthesis, allowing the reaction to be accelerated.
  • DNA Nucleic acids (DNA) of MTB bacteria and NTM extracted from the sputum and bronchial aspirates of tuberculosis patients and non-tuberculous mycobacterium-infected patients were obtained at Korea University Guro Hospital, and the infection of each sample was confirmed by real-time PCR at the hospital. became
  • SFTS LAMP primer mix composition Name uM IS6110_F3 4 IS6110_B3 4 IS6110_FIP 32 IS6110_BIP 32 IS6110_FLP 10 IS6110_BLP1 4 IS6110_BLP1_PROBE2_Cy5 6 RpoB NTM F3 2 RpoB NTM B3 2 poB NTM FIP 18 poB NTM BIP 18 poB NTM FLP-2 18 RpoB NTM BLP2 18 RPOB NTM- BLP2_TEX 18 Composition of Internal Control LAMP primer mix Name uM GAPDH_DNA_LAMP_F3 4 GAPDH_DNA_LAMP_B3 4 GAPDH_DNA_LAMP_FIP 32 GAPDH_DNA_LAMP_BIP 32 GAPDH_DNA_LAMP_LF 10 GAPDH_DNA_LAMP_LB 4 GAPDH_DNA_LAMP_LB_Probe4 HEX 6
  • the primer/probe set for LAMP of the present invention can simultaneously detect MTB, NTM, and GAPDH genes.
  • the performance evaluation results of the tuberculosis Multiplex LAMP kit for 30 MTB-positive samples are shown in Table 6 below, and the performance evaluation results of the tuberculosis Multiplex LAMP kit for 30 NTM-positive samples are shown in Table 7 below, and Non-infected clinical The performance evaluation results of the tuberculosis Multiplex LAMP kit for 30 specimens are shown in Table 8 below.
  • the primer/probe kit for the multiplex LAMP showed 100% identical results to the hospital results without non-specific reactions for all test samples.
  • the primer set of the present invention was able to detect MTB in a lower dilution sample than the conventional gyrB primer set, and exhibited a significantly faster Ct value than the conventional IS6110 primer set.
  • Performance tests of the primer set of the present invention and the conventional primer set were performed on a total of 30 samples, including 10 MTB, 10 NTM, and 10 tuberculosis-negative samples, provided by Korea University Guro Hospital.
  • the results for the MTB-positive sample are summarized in Table 11 below
  • the results for the NTM-positive sample are shown in Table 12
  • the results for the tuberculosis-negative sample are summarized in Table 13 below.
  • the primer set of the present invention detected non-specifically for all samples, but the conventional IS6110 primer set showed non-specific results in two non-tuberculous myobacterium samples, and the conventional gyrB primer set detected one tuberculosis sample. 4, and 3 non-specific results were obtained from the non-tuberculous myobacterium specimen and 3 from the non-infected specimen.

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Abstract

본 발명은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis: MTB)과 비결핵항산균(Nontuberculous mycobacteria: NTM)을 동시에 감별하여 검출할 수 있는 다중 등온증폭반응용 프라이머 세트 등에 관한 것으로서, 본 발명의 의해 무겁고 복잡한 PCR 기기 없이도 빠르고 정확하게 MTB와 NTM을 검출할 수 있고 이를 감별하여 진단할 수 있는바 본 발명은 기존의 결핵 검출법을 대체하는 분자진단 검사법으로 이용될 것으로 기대된다.

Description

결핵균 및 비결핵항산균을 동시에 감별하여 검출할 수 있는 고감도 다중 등온증폭반응용 프라이머 세트
본 발명은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis: MTB)과 비결핵항산균(Nontuberculous mycobacteria: NTM)을 동시에 감별하여 검출할 수 있는 다중 등온증폭반응용 프라이머 세트 등에 관한 것이다.
본 발명은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis: MTB)과 비결핵항산균(Nontuberculous mycobacteria: NTM)을 동시에 감별하여 검출할 수 있는 다중 등온증폭반응용 프라이머 세트 등에 관한 것이다.
결핵은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis: MTB)에 의한 비말 감염 질환으로 지난 수세기 동안 수백만 명의 사망자가 발생한 감염성 질환 사망의 주요 원인중 하나이다. 또한 매년 1천만 건의 새로운 사례와 약 2백만 건의 사망 원인으로 추정된다.
한편, 비결핵항산균(Nontuberculous mycobacteria: NTM)은 자연수와 토양 등 자연환경에 널리 상재하는 균으로 NTM 감염증은 폐질환이 가장 흔하며 대부분의 경우 균이 공기를 통해 호흡기에 감염되어 발생한다. 역학적으로 M, avium complex가 60-80%를 차지하며, 외국의 경우 M. kansasii가 15-20%를, 국내의 경우 M. abscessus가 20-30%를 차지하며 국내에서 임상 검체에서 NTM이 분리되는 빈도와 NTM 폐질환으로 진단, 치료 받는 환자들이 크게 늘고 있다.
기존의 결핵 검출법으로는 흉부방사선 검사, 직접도말 표본의 항산성염색 (Acid fast stain), 고체 배지 및 액체 배지 배양법이 있다. 배양에서 양성을 확인하는 것이 확진 방법이나, 배양 기간이 6-8주로 매우 길다는 점에서 그 한계가 있다. 또한 직접도말 표본의 항산성염색의 경우 MTB와 NTM을 구분할 수 없다는 단점이 있다. 따라서 최근에는 MTB, NTM 구분 및 진단을 위해 결핵균 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)검사가 이러한 도말검사와 배양검사의 단점을 보완하여 민감하고 신속하게 MTB 및 NTM 검출 및 동정을 위하여 사용되고 있으며 결핵진료지침에도 의심되는 환자의 경우 균동정을 위해 PCR을 사용할 것을 권고하고 있다. 하지만, PCR을 이용한 MTB 및 NTM 검출법은 숙련된 검사자 및 고급 실험실 기반을 필요로 한다. 따라서 전문적인 의료 서비스를 이용할 수 없는 지역이나 단기간에 많은 수의 선별 검사를 해야 할 필요가 있는 곳에서는 검사에 한계점이 있다.
최근, 온도 변화 없이 일정한 온도에서 유전자를 증폭하는 등온 증폭 반응법(loop-mediated isothermal amplification reaction, LAMP)이 개발되었다. LAMP법은 주형에 상보적인 프라이머 6개를 사용하여 각기 다른 8개의 부위를 인식하여 유전자 증폭을 진행한다. 기존의 PCR법과 비교하였을 때, 온도의 변화 없이 증폭할 수 있다는 점에서 검사 시간을 단축할 수 있고, 온도 변화를 위한 값비싼 장비 없이 검사를 진행할 수 있다.
이에, 본 발명자들은 LAMP법을 이용하여 숙련된 검사자 및 값비싼 장비 없이도 MTB 및 NTM을 동시에 동정하는 방법에 대해 예의 연구하여 본 발명을 완성하였다.
선행기술문헌
Norihiro, T. et. al. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nature protocols. 2008;3:5.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 결핵균 검출 프라이머 세트와 결핵균 및 비결핵항산균 검출 프라이머 세트를 제공하고, 상기 각각의 프라이머 세트를 포함하여 결핵균과 비결핵항산균을 감별하여 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 키트와 이를 이용하여 결핵균 및 비결핵항상균을 감별하여 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 6의 프라이머를 포함하는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis: MTB) 검출용 LAMP(Loop-mediated isothermal amplification) 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 결핵균 검출용 LAMP 프라이머 세트는 MTB 프로브를 포함할 수 있으며, 상기 MTB 프로브는 서열번호 7의 염기서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 8 내지 13의 프라이머를 포함하는, 결핵균 및 비결핵항산균(Non-tuberculosis bacterium: NTM) 검출용 LAMP 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 결핵균 및 비결핵항상균 검출용 LAMP 프라이머 세트는 NTM 프로브를 포함할 수 있으며, 상기 NTM 프로브는 서열번호 14의 염기서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 6의 MTB 프라이머 세트 및 서열번호 8 내지 13의 NTM 프라이머 세트를 포함하는 결핵균 및 비결핵항산균 감별 검출용 LAMP 프라이머 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 6의 MTB 프라이머 세트 및 서열번호 8 내지 13의 NTM 프라이머 세트를 포함하는 결핵 진단용 LAMP 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 키트는 서열번호 15 내지 20의 내부대조군 (internal control: IC) 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 키트에 포함된 상기 MTB 프라이머 세트는 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 MTB 프로브(probe)를 추가로 포함할 수 있고, 상기 NTM 프라이머 세트는 서열번호 14의 염기서열을 포함하는 NTM 프로브를 추가로 포함할 수 있고, 상기 IC 프라이머 세트는 서열번호 21의 염기서열을 포함하는 IC 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 MTB 프로브, NTM 프로브 및 IC 프로브는각각FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸 로다민(tetramethyl rhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 형광물질이 부착된 것일 수 있고, 상기 각 프로브는 서로 다른 파장을 발하는 형광물질이 부착된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 시약에는 DNA 중합효소, dNTPs 및 버퍼로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 (1) 생물학적 시료의 게놈 DNA(gDNA)를 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 gDNA를 주형으로 하고 서열번호 1 내지 6의 MTB primer set; 및 서열번호 8 내지 13의 MTB 및 NTM primer set;를 포함하는 MTB 및 NTM 감별 진단용 조성물을 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (3) 상기 증폭된 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 결핵균 및 비결핵항산균 감별 검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 생물학적 시료의 게놈 DNA(gDNA)를 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 gDNA를 주형으로 하고 서열번호 1 내지 6의 MTB primer set; 서열번호 8 내지 13의 NTM primer set; 및 서열번호 15 내지 20의 IC primer set;를 포함하는 키트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (3) 상기 증폭된 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 결핵 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 생물학적 시료는 객담(sputum), 기관지 흡인(bronchial aspiration) 및 기관지세척액(bronchial washing), 및 체액(body fluid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 (3) 단계는 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정, 및 인광 측정으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있으나, 바람직하게는 형광 측정 방법에 의할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 방법은 (3) 단계 이후에 MTB primer set; 및 NTM primer set에 의해 증폭된 산물이 모두 검출되는 경우 MTB 양성으로 해석하고, MTB primer set에 의한 증폭 산물은 검출되지 않았으나 NTM primer set에 의해 증폭된 산물은 검출되는 경우 NTM 양성으로 해석하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 방법은 (3) 단계 이후에 internal control primer set에 의한 증폭산물이 검출되고 다른 primer set에 의한 증폭 산물은 검출되지 않는 경우 음성으로 해석하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 방법은 (3) 단계 이후에 (3) 단계의 검출 시간을 측정하여 MTB 및/또는 NTM을 정량화 하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 “정량화”는 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용한 증폭반응 수행 시의 표준곡선과 비교하여 DNA 농도에 따른 형광물질 검출 시간을 정량화하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 단계 (c)의 증폭 산물을 형광지표를 이용하여 검출함으로써 형광물질 검출 시간을 측정하여 DNA 농도를 정량화하는 것일 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트는 실시간 다중 등온증폭반응(real-time multiplex LAMP)을 기반으로 하여 종래에 PCR, real time PCR 기반의 검출 보다 폐질환의 원인균 동정 시간을 단축시키고, LAMP을 기반으로 하기 때문에 검사에 온도변화가 필요치 않아 종래 PCR 기기와 비교하여 단순하고 경제적이고 가벼운 기기를 이용할 수 있는 장점이 있다. 또한, 본 발명은 multiplex로 검사하여 MTB 및 NTM을 모두 검출하고 동시에 이를 감별할 수 있다는 점에서 시간과 비용 측면에 유리하여 기존의 결핵 검출법을 대체하는 분자진단검사방법으로 이용될 것으로 기대된다.
도 1은 MTB의 타겟유전자인 IS6110 gene 서열에서 LAMP 프라이머 세트의 위치를 나타낸 도면이다.
도 2는 NTM의 타겟유전자인 RpoB gene 서열에서 LAMP 프라이머 세트의 위치를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 multiplex LAMP 키트(Cy5 (MTB), TexasRED (NTM), HEX (GAPDH))의 검출 테스트 결과 도면이다.
본 발명자들은 현장에서 감염성 폐질환 환자의 병원균을 빠르고 정확하게 동정할 수 있는 방법에 대해 예의 연구하여 본 발명을 완성하였다.
구체적으로, 본 발명자들은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis: MTB)의 IS6110 유전자에 특이적인 프라이머와 결핵균과 비결핵항산균(Nontuberculous mycobacteria: NTM)의 RpoB에 특이적인 프라이머 세트를 LAMP 기반으로 제작하였다. 본 발명의 LAMP 기반의 프라이머 세트는 전통적인 PCR과 달리 온도변화를 요구하지 아니하여 단순하고 가벼운 증폭 기기를 이용할 수 있고 분석에 소요되는 시간을 획기적으로 감소시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 IS6110에 특이적인 프라이머 세트와 상기 RpoB에 특이적인 프라이머 세트를 포함하여 multiplex LAMP를 수행함으로써 결핵균과 비결핵균을 동시에 감별하여 검출할 수 있도록 함으로써 균체 동정 시간을 단축시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 GAPDH 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 제작하여 Internal control primer set로 제공함으로써 상기 multiplex LAMP 분석 결과에 신뢰도를 향상시킬 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 MTB에 특이적으로 작용하는 프라이머 세트 (MTB primer set), 25종의 NTM 및 MTB에 동시에 작용하는 프라이머 세트 (NTM primer set) 및 internal control로 증폭 여부를 확인 할 수 있는 프라이머 세트 (IC primer set)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 MTB 박테리아 검출용 조성물을 제공한다. 하기 표 1의 서열번호 1-6은 MTB를 위한 6개의 프라이머 세트이며 (MTB primer), 서열번호 8-13은 25종의 NTM 및 MTB를 위한 6개의 프라이머 세트 (NTM primer) 이며, 서열번호 15-20은 internal control로 GAPDH 유전자를 증폭할 수 있는 6개의 프라이머 (Internal control primer) 세트이다. 표 1의 프라이머 세트 및 이를 포함하는 조성물은 Multiplex LAMP 법을 이용한 MTB, NTM 박테리아 검출법에 사용될 수 있다.
본 발명의 MTB 및 NTM 감별 검출을 위한 multiplex LAMP 프라이머 세트의 구성은 하기 표 3과 같으며, 반응 시간 및 온도는 하기 표 4과 같다.
본 발명은 상기 3개의 프라이머 세트를 포함하는 결핵 진단용 LAPM 키트를 제공할 수 있으며, 상기 LAMP 키트는 multiplex LAMP 수행에 이용되어 한 번의 검사로 균체 동정 결과를 얻을 수 있다. 구체적으로, MTB primer 및 NTM primer에서 모두 증폭된 경우 MTB로 해석한다. NTM primer는 증폭이 되었으나 MTB primer에서 증폭이 되지 않은 경우 NTM으로 해석한다. 검사결과가 음성으로 나왔을 때 internal control primer에서 증폭이 된 경우 참 음성으로 해석하며, 결과가 음성이나 internal control primer도 음성인 경우 재검할 것을 권고한다.
한편, 본 발명의 상기 세개의 프라이머 세트는 각각 독립적으로 프로브를 포함할 수 있으며, 상기 각 프로브는 발하는 파장범위가 상이한 형광물질이 부착된 것일 수 있다.
본 발명은 서로 다른 형광을 발하는 각각의 프로브를 포함하는 상기 3개 프라이머 세트를 이용하여 multiplex real-time LAMP를 수행함으로써 한 번의 검사로 빠르게 균체 동정 결과를 얻을 수 있다.
상기 각 프로브에 부착되는 형광물질은 형광을 발하는 것이라면 제한되지 아니하나, 그 비제한적인 예로서 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸 로다민(tetramethyl rhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 등이 있다.
또한, 본 발명은 결핵 진단이 필요한 개체의 생물학적 시료에서 게놈 DNA(gDNA)를 분리하고, 상기 gDNA를 주형으로 하여 상기 키트를 이용하여 LAMP를 수행함으로써 표적 서열을 증폭하고, 그 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 결핵 진단 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 있어서 “개체”는 결핵의 진단이 필요한 포유류라면 제한되지 아니하나, 바람직하게는 인간일 수 있다. 또한, 본 발명에서 “생물학적 시료”는 객담(sputum), 기관지 흡인(bronchial aspiration) 및 기관지세척액(bronchial washing), 체액(body fluid) 등을 포함하는 신체의 다양한 부분의 세포 또는 조직을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서 “등온증폭반응(LAMP; Loop-mediated isothermal amplification)”은 기존 PCR법과 달리 PCR 사이클이 필요 없는 Bst, Gsp 등의 중합효소를 이용하여 등온의 조건에서 반응을 수행하는 방법으로, 기본적으로 4개의 프라이머를 이용하여, 양끝을 고리(loop) 구조로 합성하여 유전자의 특정 부위를 무한대로 증폭하고, 증폭된 DNA 산물을 형광 검출용 시약을 이용하거나 침전 반응시켜 증폭 유무를 확인하는 방법으로서, 바람직하게는 형광 검출용 시약을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 있어서 “다중 등온증폭반응(multiplex LAMP)”은 다양한 유전자를 동시에 검출할 수 있으며, 바람직하게는 시료에서 MTB 및/또는 NTM를 동시에 검출하여 시료에 MTB 및/또는 NTM의 유무를 판별할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 있어서 “실시간 다중 등온증폭반응(multiplex real-time LAMP)”는 상기 다양한 유전자의 증폭 유무를 실시간으로 확인하는 방법으로서 상기 3종의 프라이머 세트는 각각 형광 표지된 프라이머를 포함하여 시료에서 MTB 및/또는 NTM의 유무를 실시간으로 판별할 수 있다.
본 발명의 상기 프라이머 세트를 포함하는 키트는 결핵의 진단을 위한 등온증폭반응(LAMP; Loop-mediated isothermal amplification)에 사용되는 것이 바람직하며, 등온증폭반응은 표적 DNA를 LAMP에 의하여 증폭하는 단일-단계(one-step) LAMP일 수 있고, 실시간 LAMP (real-time LAMP)일 수 있으며, 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머 (primer)"란 적절한 완충용액 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.
본 발명의 프라이머는 예를 들면, 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법과 같은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
본 발명에 있어서, “내부 프라이머(inner primer)”는 주형 DNA에 결합하여 새로운 DNA 사슬 합성의 시작점으로 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
본 발명에 있어서, “외부 프라이머(outer primer)”는 내부 프라이머가 주형 DNA에 결합한 위치보다 더 바깥쪽 에서 주형 DNA에 결합하는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 내부 프라이머가 주형 DNA에 결합 하여 DNA 사슬이 신장된 이후, 외부 프라이머와 주형 DNA의 결합으로 사슬 변위(strand displacement)가 발생하여 먼저 형성된 사슬이 떨어져 나오게 된다.
본 발명에 있어서, “고리 프라이머(loop primer)”는 상기 내부 프라이머 및 외부 프라이머가 주형 DNA에 결합 하여 형성된 초기 줄기 고리(stem loop) 구조 사슬이 고리(loop) 구조 생성 횟수를 증가시켜 결과적으로 전체 반응을 가속화시킬 수 있도록 하는, 뉴클레오티드 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
[재료 및 방법]
1. MTB 박테리아 및 NTM의 DNA
고려대학교 구로병원에서 결핵환자와 비결핵항산균 감염환자의 객담 및 기관지 흡인액에서 추출된 MTB 박테리아와 NTM의 핵산을 (DNA) 확보하였으며, 각 샘플의 감염 여부는 병원에서 real-time PCR로 확인되었다.
2. 임상 검체
MTB 30개, NTM 30개, 결핵음성 30개, 총 90개의 검체는 고려대학교 구로병원에서 받아 사용하였다.
3. MTB 및 NTM 검출용 프라이머 세트, LAMP 혼합물 조성 및 반응 조건
MTB 박테리아의 IS6110 유전자 서열과 Mycobacterium 박테리아 (MTB, NTM 모두 포함)의 rpoB 유전자 서열을 바탕으로 MTB 박테리아 및 25종의 NTM 검출용 프라이머/프로브 세트를 설계하여 제작하였다(도 1 및 도 2 참조). 내부 대조군으로 GAPDH 유전자 증폭 프라이머/프로브 세트를 제작하였다. 각 프라이머/프로브 세트의 구체적인 정보는 하기 표 1에 정리하였다. real-time LAMP primer mix 조성은 하기 표 2에 나타내었으며, real-time LAMP를 위한 반응 혼합물의 시약(M-monitor LAMP kit 사용) 조성은 하기 표 3에 나타내었고, real-time LAMP는 하기 표 4의 반응 조건하에서 수행되었다.
서열번호 Name Sequence (5'-3') length
MTB primer/probe set 1 IS6110_F3 GGT CGG AAG CTC CTA TGA CA 20
2 IS6110_B3 TAG GCA GCC TCG AGT TCG 18
3 IS6110_FIP AGG GCT TGC CGG GTT TGA TCA TGC ACT AGC CGA GAC GA 38
4 IS6110_BIP CGG TCC ATC GAG GAT GTC GAG TCG CCG CAG TAC TGG TAG A 40
5 IS6110_FLP CTC GGT CTT GTA TAG GCC GT 20
6 IS6110_BLP1 ACC GCG CGC TGG GTC GA 17
7 IS6110_BLP1_PROBE2_Cy5 GTC AGT GCA GGC TCC CGT GTT AGG ACG AGG GTA GGA CCG CGC GCT GGG TCG A 52
NTM primer/probe set 8 RpoB NTM F3 CCG GTC ACC GTG CTG 15
9 RpoB NTM B3 GTA RCG CTT CTC CTT GAA GAA C 22
10 RpoB NTM FIP TGT TGT CCT TCT CCA GIG TII GCT GGA CCA ICG AGC A 37
11 RpoB NTM BIP TGG ACA TCT ACC GCA AGC TGC GTT YTC CAR CAG GGT CTG C 40
12 RpoB NTM FLP-2 CGG AGA AIC CGA AIC GCT C 17
13 RpoB NTM BLP2 CCG CCG ACC AAA GAG TCA GC 20
14 RPOB NTM-BLP2_TEX TEXASRED-CCG CCG ACC AAA GAG TCA GC-BHQ1 20
IC primer/probe set 15 GAPDH_DNA_LAMP_F3 TCC GCA CAT CCC GGT ATG 18
16 GAPDH_DNA_LAMP_B3 TCT GCA GAT AGG AAG GGC TT 20
17 GAPDH_DNA_LAMP_FIP TGG GGG CAT TGA AGG GGT GAT GAG GGT TCT TTG TGC TGA G 40
18 GAPDH_DNA_LAMP_BIP CTG TGG CAT CCC TGG GAC TGG TGA GGA ACT GGG AGA TCC A 40
19 GAPDH_DNA_LAMP_LF ATG GGC CTT TCT CCC CTG C 19
20 GAPDH_DNA_LAMP_LB GGG GAA GGT TGA GCC TTT ACT 21
21 GAPDH_DNA_LAMP_LB_Probe4 HEX CGG GCC CGT ACA AAG GGA ACA CCC ACA CTC CGG GGG AAG GTT GAG CCT TTA CT 53
22 lamp_PROBE2_QUANCHER CCT ACC CTC GTC CTA ACA CGG GAG CCT GCA CTG AC-BHQ2 35
23 lamp_PROBE4_QUANCHER GAG TGT GGG TGT TCC CTT TGT ACG GGC CCG-BHQ1 30
SFTS LAMP primer mix 조성
Name uM
IS6110_F3 4
IS6110_B3 4
IS6110_FIP 32
IS6110_BIP 32
IS6110_FLP 10
IS6110_BLP1 4
IS6110_BLP1_PROBE2_Cy5 6
RpoB NTM F3 2
RpoB NTM B3 2
poB NTM FIP 18
poB NTM BIP 18
poB NTM FLP-2 18
RpoB NTM BLP2 18
RPOB NTM-BLP2_TEX 18
Internal Control LAMP primer mix 조성
Name uM
GAPDH_DNA_LAMP_F3 4
GAPDH_DNA_LAMP_B3 4
GAPDH_DNA_LAMP_FIP 32
GAPDH_DNA_LAMP_BIP 32
GAPDH_DNA_LAMP_LF 10
GAPDH_DNA_LAMP_LB 4
GAPDH_DNA_LAMP_LB_Probe4 HEX 6
구분 부피
RM 12.5
EM 2
Distilled water 3.625
Primer mix 0.5 (IS6110 MTB)
1.5 (RpoB NTM)
0.5 (GAPDH Internal control)
QUANCHER P4 2.5
Template 2.5
TOTAL 25
원스텝 RT-LAMP 반응 온도 및 시간 조건
온도 반응시간
65 ℃ 1분 60 Cycle
80 ℃ 5분
전체반응시간 65분
[실험결과]
실시예 1. LAMP 프라이머/프로브 세트의 검출 테스트
실제 MTB 양성 검체, MTB 및 NTM양성 검체, 및 음성 검체, 증류수(DW)를 대상으로 각기 다른 형광(Cy5, Texas Red, Hex)으로 표지한 상기 MTB, NTM, 및 IC primer/probe set를 이용하여 real-time LAMP를 수행하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 LAMP용 프라이머/프로브 세트는 MTB, NTM, 및 GAPDH 유전자를 동시에 검출할 수 있음을 확인하였다.
실시예 2. LAMP 프라이머/프로브 세트의 NTM에 대한 교차 반응 확인
MTB의 IS6110 유전자를 삽입한 plasmid DNA를 제작하고 상기 plasmid DNA를 3차 증류수로 101까지 희석하여 1X107~101 농도별 MTB primer/probe set의 민감도를 확인하였다. 테스트에 사용된 핵산은 비사용 시 -50℃에 보관하였다. 10분의 1희석배수를 이용하여 농도별 분석능을 검증한 결과 105 copy (대략 5 x 102 cells)에서 증폭이 확인되었다. . 하기 표 4는 희석농도에 따른 Mycobacterium tuberculosis LAMP 프라이머 세트의 Ct 값을 나타낸 것이다.
　sample IS6110 (Cy5)
CT RFU
IS6110　 Plasmid　 10^7 13.7 1479
IS6110　 Plasmid　 10^6 16.31 1624
IS6110　 Plasmid　 10^5 20.88 1602
IS6110　 Plasmid　 10^4 N/A -1.18
IS6110　 Plasmid　 10^3 N/A -1.2
IS6110　 Plasmid　 10^2 N/A 0.643
IS6110　 Plasmid　 10^1 N/A -1.12
DW N/A 1.68
실시예 3. LAMP 프라이머/프로브 세트의 MTB, NTM, 및 결핵음성 임상 검체에서의 검출 Ct 값 확인
고려대학교 구로 병원에서 제공받은 MTB 30개, NTM 30개, 결핵음성 30개, 총 90개의 검체로 임상실험을 실시하였다. 상기 검체에서 추출된 DNA 샘플을 대상으로 real-time LAMP을 수행하고 Mycobacterium tuberculosis 박테리아의 검출 결과를 확인하였다.
MTB 양성 검체 30개에 대한 결핵 Multiplex LAMP kit의 성능평가 결과는 하기 표 6에 나타내었고, NTM 양성 검체 30개에 대한 결핵 Multiplex LAMP kit의 성능평가 결과는 하기 표 7에 나타내었고, Non-infected 임상 검체 30개에 대한 결핵 Multiplex LAMP kit의 성능평가 결과는 하기 표 8에 나타내었다.
Samples IS6110 (Cy5) RPOBNTM (Texas Red) GAPDH (Hex)
Ct RFU Ct RFU Ct RFU
MTB-Positive 01 21 1646 26.99 1677 31.37 1595
MTB-Positive 05 22.02 1277 35.98 1207 29.93 1993
MTB-Positive 06 18.42 1954 23.89 6200 26.34 447
MTB-Positive 08 20.07 1382 26.33 3971 23.7 2004
MTB-Positive 12 22.57 1396 34.06 3037 26.62 2279
MTB-Positive 13 22.07 1354 34.05 1392 26.42 2277
MTB-Positive 14 20.02 1384 22.9 5005 26.55 875
MTB-Positive 15 28.7 949 40.48 1382 27.26 1855
MTB-Positive 17 19.67 1785 21.83 6588 26.48 182
MTB-Positive 18 18.02 1514 30.2 4514 N/A 56.6
MTB-Positive 19 24.33 1181 26.11 6148 28.79 136
MTB-Positive 21 21.08 1817 26.65 1908 30.92 1708
MTB-Positive 24 27.28 1129 40.5 1513 28.33 2111
MTB-Positive 25 20.22 1882 26.82 1650 32.13 457
MTB-Positive 27 27.12 1068 38.98 1478 26.44 2032
MTB-Positive 29 20.43 1817 29.94 6378 28.16 1625
MTB-Positive 30 20.44 1228 34.74 1203 31.44 1712
MTB-Positive 31 21.24 1435 36.22 1456 31.48 2015
MTB-Positive 32 20.14 1277 33.79 1296 26.73 2091
MTB-Positive 33 22.19 1232 36.95 1289 28.55 2041
MTB-Positive 34 21 1317 27.55 4130 27.89 170
MTB-Positive 36 18.35 1710 25.77 5231 45.61 173
MTB-Positive 38 20.32 1558 32.39 1324 40.86 1694
MTB-Positive 38 24.18 1136 36.22 1453 23.99 2264
MTB-Positive 39 22.77 1567 36.34 1288 38.83 1862
MTB-Positive 40 25.78 1620 38.43 1294 38.9 1932
MTB-Positive 49 33.11 2183 39.55 1667 25.29 2802
MTB-Positive 54 19.28 1977 27.68 6246 35.51 1055
MTB-Positive 58 20.56 1984 29.51 1759 28.73 2219
MTB-Positive 60 18.48 2137 27.07 1863 29.21 2314
Samples IS6110 (Cy5) RPOBNTM (Texas Red) GAPDH (Hex)
Ct RFU Ct RFU Ct RFU
NTM-Positive 006 N/A 95.5 19.6 3675 N/A 75.1
NTM-Positive 017 N/A 71.2 19.27 2907 N/A 62.4
NTM-Positive 074 N/A 109 23.3 2809 27.62 1058
NTM-Positive077 N/A 75.8 21.78 3778 29.21 159
NTM-Positive 079 N/A 131 22.27 4871 28.16 170
NTM-Positive 080 N/A 105 22.15 3316 27.02 176
NTM-Positive 081 N/A 142 19.96 4821 26.22 171
NTM-Positive 086 N/A 128 19.39 3788 25.23 130
NTM-Positive088 N/A 98.2 24.66 4039 30.9 141
NTM-Positive 089 N/A 77.7 21.89 2973 27.18 92.1
NTM-Positive 090 N/A 76.9 20.12 3579 25.87 116
NTM-Positive 091 N/A 85.6 28.89 3558 31.31 195
NTM-Positive 132 N/A 92.6 25.42 3496 30.63 143
NTM-Positive 134 N/A 125 22.71 3707 27.99 164
NTM-Positive 135 N/A 103 24.17 3927 30.26 144
NTM-Positive 136 N/A 94.6 21.04 3680 24.15 169
NTM-Positive 137 N/A 119 22.32 4125 27.76 157
NTM-Positive 138 N/A 38.8 21.67 3138 28.53 133
NTM-Positive 139 N/A 77.1 20.16 3288 26.97 135
NTM-Positive 140 N/A 99.7 23.23 4042 30.56 128
NTM-Positive 141 N/A 91.1 24.57 3768 31.68 207
NTM-Positive 142 N/A 90.1 22.7 3570 29.14 140
NTM-Positive143 N/A 74.2 28.93 3573 29.44 686
NTM-Positive 144 N/A 94.2 18.76 3641 N/A 73.2
NTM-Positive 145 N/A 111 18.13 3224 N/A 74
NTM-Positive 146 N/A 77.7 23.26 2997 51.33 170
NTM-Positive 152 N/A 129 19.45 3992 20.01 204
NTM-Positive 153 N/A 91.8 27.81 4871 30.02 415
NTM-Positive 154 N/A 105 26.23 4753 29.36 559
NTM-Positive 155 N/A 80.4 28.02 3940 29.63 455
Samples IS6110 (Cy5) RPOBNTM (Texas Red) GAPDH (Hex)
Ct RFU Ct RFU Ct RFU
TB negative 090 N/A 0.99 N/A 51.7 35.14 2047
TB negative 091 N/A 3.44 N/A 53.3 33.4 2084
TB negative 092 N/A 3.86 N/A 63.4 34.14 2139
TB negative 093 N/A 2.36 N/A 92.5 38.14 1869
TB negative 094 N/A 0.824 N/A 72.2 32.31 2090
TB negative 095 N/A 2.13 N/A 45.6 31.49 2324
TB negative 096 N/A 3.61 N/A 383 30.17 2178
TB negative 097 N/A 3.96 N/A 82 28.49 2590
TB negative 098 N/A 1.6 N/A 93.2 27.47 2396
TB negative 100 N/A 6.54 N/A 187 25.99 2412
TB negative 101 N/A 2.79 N/A 558 26.19 2287
TB negative 102 N/A 0.751 N/A 51.3 29.51 2200
TB negative 103 N/A 1.73 N/A 553 29.06 2189
TB negative 104 N/A 3.61 N/A 123 24.98 2303
TB negative 105 N/A 1.81 N/A 105 38.61 2049
TB negative 106 N/A -0.087 N/A 37.1 30.23 2135
TB negative 107 N/A 2.25 N/A 60 29.91 2315
TB negative 108 N/A 2.2 N/A 43.2 29.55 2440
TB negative 109 N/A 1.53 N/A 42.7 29.47 2371
TB negative 110 N/A 2.09 N/A 51.7 29.8 2222
TB negative 111 N/A 2.95 N/A 68.4 28.16 2282
TB negative 112 N/A -0.0576 N/A 56.3 30.86 2482
TB negative 113 N/A 0.954 N/A 58.4 31.96 2330
TB negative 114 N/A 1.41 N/A 71.9 33.82 2239
TB negative 115 N/A 5.06 N/A 163 25.98 2437
TB negative 131 N/A 4.06 N/A 59.1 28.19 2201
TB negative 132 N/A -0.876 N/A 344 31.26 2605
TB negative 133 N/A 3.53 N/A 100 26.37 2364
TB negative 134 N/A 1.86 N/A 86.3 30.41 2108
TB negative 135 N/A 5.48 N/A 136 25.12 2106
상기 표 6 내지 8의 결과로부터 알 수 있듯이, 상기 multiplex LAMP용 프라이머/프로브 키트는 모든 테스트 샘플에 대하여 비특이 반응 없이 병원 결과와 100% 동일한 결과를 나타내었다.
실시예 4. 종래 LAMP 프라이머 세트와 효과 비교 확인
결핵 진단을 위해 개발된 종래의 LAMP 프라이머 세트로는 MTB의 gyrB 유전자를 증폭 타겟으로 하는 것(KR 10-2017-0038995)과, MTB의 IS6110 유전자를 증폭 타겟으로 하는 것(KR 10-2017-0038995)이 있다. 이에, 본 발명의 프라이머 세트가 종래의 프라이머 세트보다 결핵 진단에 보다 우수한 효과를 갖는지 확인하고자 하였다. 본 발명의 프라이머 세트와 비교실험 대상인 종래 LAMP 프라이머 세트의 구체적인 정보는 하기 표 9에 나타내었다.
서열번호 Name Sequence (5'-3') length
MTB (KR 10-2017-0038995) gyrB primer set 24 gyrB_F3 GTGAACAAGTACGCCAAG 18
25 gyrB _B3 CACAGCCTTGTTCACAAC 18
26 gyrB _FIP TGACCTTCACCGAGATCACAGCTACTGAAGGACAAGGA 38
27 gyrB _BIP GCCAGACCAAGACCAAGTTGTGTTCGTTACAGACCTTCT 39
28 gyrB _FLP CCTTCCCGGATATCGTCA 18
29 gyrB _BLP1 GCAACACCGAGGTCAAAT 18
MTB (KR 10-2017-0038995) IS6110 primer set 30 IS6110_F3 TTCGCAATTCGGCGTTGT 18
31 IS6110_B3 ATGTCAGGTGGTTCATCG 18
32 IS6110_FIP TCTACTTGGTGTTGGCTGCGGATTCTTCGGTCGTGGTC 38
33 IS6110_BIP GACCTCACTGATCGCTGCCGGATGGTCGCAGAGATCC 37
34 IS6110_FLP GAGACGGTGCGTAAGTGG 18
35 IS6110_BLP1 ACTCCGAATCGTGCTGAC 18
4-1. 검출한계 (Limit of detection: LOD) 확인
본 발명의 LAMP 프라이머 세트와 종래의 LAMP 프라이머 세트의 결핵 검출 민감도를 비교 확인하고자 하였다. 구체적으로, MTB의 genomic DNA 1 ng/μL를 3차 증류수로 10까지 희석하여 각 프라이머 세트의 민감도를 확인하였다. 테스트에 사용된 핵산은 비사용 시 -50℃에 보관하였다. 10분의 1희석배수를 이용하여 농도별 분석능을 확인하였다. 하기 표 10은 그 결과를 비교하여 나타낸 것이다.
MTB-Positive 34 Multiplex MTB/NTM LAMP assay 기존 특허 LAMP primer set
IS6110 (Cy5) RPOBNTM:BLP2CG(TEX) IC(HEX) GyrB IS6110
CT RFU CT RFU CT RFU Ct RFU Ct RFU
1 21 1317 27.55 4130 27.89 170 28.2 6440 22.62 21559
10-1 30.86 3956 48.33 1159 46.79 81.2 52.48 13201 26.8 15645
10-2 32.06 4190 50.36 1009 46.84 86.3 N/A 6840 41.77 17078
10-3 N/A 4.08 N/A 41.1 N/A 3.78 N/A 5906 N/A 6009
10-4 N/A 4.77 N/A 52 N/A 4.29 N/A 5612 N/A 3729
10-5 N/A 2.5 N/A 37.3 N/A 5.11 N/A 3797 N/A 4845
N.C(hg DNA) N/A 9.44 N/A 168 35.04 2236 N/A 6393 N/A 2724
D.W N/A 0.967 N/A 30.9 N/A 0.384 N/A 8280 N/A 684
그 결과, 본 발명의 프라이머 세트는 종래의 gyrB 프라이머 세트보다 낮은 희석 샘플에서 MTB를 검출할 수 있었으며, 종래의 IS6110 프라이머 세트보다 현저하게 빠른 Ct 값을 나타냄을 확인할 수 있었다.
4-2. MTB, NTM, 및 결핵음성 임상 검체에서의 Ct 값 확인
고려대학교 구로 병원에서 제공받은 MTB 10개, NTM 10개, 결핵음성 10개, 총 30개의 검체를 대상으로 본 발명의 프라이머 세트와 종래의 프라이머 세트의 성능 테스트를 진행하였다. MTB 양성 검체를 대상으로 한 결과는 하기 표 11에, NTM 양성 검체를 대상으로 한 결과는 하기 표 12에, 결핵 음성 검체를 대상으로 한 결과는 하기 표 13에 정리하였다.
sample IS6110 (Cy5) RPOBNTM:BLP2CG(TEX) IC(HEX) Re-IS6110 Re-GyrB
CT RFU CT RFU CT RFU Ct RFU Ct RFU
TB-Positive 4 25.24 4573 30.56 2333 19.03 2377 25.62 7182 38.46 11475
TB-Positive 10 20.29 4476 30.46 2031 34.44 1662 29.29 20662 42.72 15880
TB-Positive 35 23.33 4540 32.85 2429 26.79 2018 35.11 19761 58.57 4870
TB-Positive 37 18.14 5148 29.1 2048 22.03 2368 21.22 13496 18.36 19058
TB-Positive 38 54.41 2240 56.99 1503 21.51 2460 38.07 6451 N/A 4257
MTB-Positive 31 21.24 1435 36.22 1456 31.48 2015 24.62 14989 20.32 8328
MTB-Positive 32 20.14 1277 33.79 1296 26.73 2091 24.61 20674 21.21 9507
MTB-Positive 33 22.19 1232 36.95 1289 28.55 2041 22.52 20020 25.86 2935
MTB-Positive 34 21 1317 27.55 4130 27.89 170 22.62 21559 28.2 6440
MTB-Positive 38 20.32 1558 32.39 1324 40.86 1694 22.47 16505 18.3 6935
NTM-Positive 065 N/A 68.7 26.59 4206 N/A 154 32.33 6982 N/A 1167
NTM-Positive 066 N/A 71 30.68 4438 N/A 161 N/A 948 58.09 6773
NTM-Positive 070 N/A 77.6 31.6 2403 26.88 2139 N/A 3257 N/A 1146
NTM-Positive 073 N/A 74.1 26.69 4146 N/A 176 N/A 3345 N/A 4579
NTM-Positive 074 N/A 109 23.3 2809 27.62 1058 N/A 2663 57.59 5043
NTM-Positive 086 N/A 128 19.39 3788 25.23 130 N/A 5753 N/A 347
NTM-Positive 088 N/A 98.2 24.66 4039 30.9 141 N/A 3218 51.74 5601
NTM-Positive 089 N/A 77.7 21.89 2973 27.18 92.1 N/A 5783 N/A -235
NTM-Positive 090 N/A 76.9 20.12 3579 25.87 116 N/A 4401 49.33 8589
NTM-Positive 091 N/A 48.3 54.48 1966 42.07 2744 45.39 12169 N/A 323
TB negative 146 N/A 6.94 N/A 185 28.22 2552 N/A 734 N/A 785
TB negative 147 N/A 5.12 N/A 890 26.96 3397 N/A 796 N/A 853
TB negative 148 N/A 8.28 N/A 203 26.97 2635 N/A 1066 N/A 796
TB negative 149 N/A 6.5 N/A 216 27.55 2948 N/A 943 44.22 20866
TB negative 150 N/A 6.52 N/A 189 26.69 2675 N/A 856 N/A 927
TB negative 105 N/A 1.81 N/A 105 38.61 2049 N/A 5105 41.23 9186
TB negative 106 N/A -0.087 N/A 37.1 30.23 2135 N/A 338 48.37 8730
TB negative 107 N/A 2.25 N/A 60 29.91 2315 N/A 213 N/A 838
TB negative 108 N/A 2.2 N/A 43.2 29.55 2440 N/A 223 N/A 635
TB negative 109 N/A 1.53 N/A 42.7 29.47 2371 N/A 8031 N/A 937
테스트 결과, 본 발명의 프라이머 세트는 모든 검체에 대해 비특이 없이 검출하였으나 종래의 IS6110 프라이머 세트는 2개의 비결핵 항상균 검체에서 비특이적 결과를 나타내었고, 종래의 gyrB 프라이머 세트는 1개의 결핵샘플을 검출하지 못했고 비결핵 항상균 검체에서 4개, 비감염 검체에서 3개의 비특이적 결과를 나타내었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (14)

  1. 서열번호 1 내지 6의 프라이머를 포함하는, 결핵균(Mycobacterium tuberculosis: MTB) 검출용 LAMP(Loop-mediated isothermal amplification) 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 결핵균 검출용 LAMP 프라이머 세트.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 프로브는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸 로다민(tetramethyl rhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 형광물질이 부착된 것을 특징으로 하는, 결핵균 검출용 LAMP 프라이머 세트.
  4. 서열번호 8 내지 13의 프라이머를 포함하는, 비결핵항산균(Non-tuberculosis bacterium: NTM) 검출용 LAMP(Loop-mediated isothermal amplification) 프라이머 세트.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 비결핵항상균 검출용 LAMP 프라이머 세트.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 프로브는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸 로다민(tetramethyl rhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 형광물질이 부착된 것을 특징으로 하는, 비결핵항상균 검출용 LAMP 프라이머 세트.
  7. 제1항의 프라이머 세트 및 제4항의 프라이머 세트를 포함하는, 결핵균 및 비결핵항상균 감별 검출용 LAMP 프라이머 키트.
  8. 서열번호 1 내지 6의 결핵균(MTB) 검출용 프라이머 세트, 서열번호 8 내지 13의 비결핵항상균(NTM) 검출용 프라이머 세트, 서열번호 15 내지 20의 내부대조군(IC) 프라이머 세트, 서열번호 7의 MTB 프로브, 서열번호 14의 NTM 프로브, 및 서열번호 21의 IC 프로브를 포함하는 결핵 감별용 LAMP 키트.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 MTB 프로브, NTM 프로브, 및 IC 프로브는 각각 독립적으로 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸 로다민(tetramethyl rhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 형광물질이 부착된 것을 특징으로 하는, 결핵 진단용 LAMP 키트.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 각 프로브는 서로 다른 파장을 발하는 형광물질이 부착된 것을 특징으로 하는, 결핵 진단용 LAMP 키트.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 추가로 포함하는 것을 특징으로하는, 결핵 진단용 LAMP 키트
  12. 제11에 있어서,
    상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 중합효소, dNTPs 및 버퍼로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 결핵 진단용 LAMP 키트.
  13. (1) 생물학적 시료의 게놈 DNA(gDNA)를 분리하는 단계;
    (2) 상기 분리된 gDNA를 주형으로 하고 제8항의 LAMP 키트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    (3) 상기 증폭된 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 결핵 진단을 위한 정보제공방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 (1) 단계의 생물학적 시료는 객담(sputum), 기관지 흡인(bronchial aspiration) 및 기관지세척액(bronchial washing), 및 체액(body fluid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 결핵균 및 비결핵항상균 감별 검출 방법.
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KR20230165623A (ko) 2022-05-27 2023-12-05 커넥타젠(주) Lamp를 이용한 손발톱진균증 진단용 프라이머 세트, 이를 이용한 진단 방법 및 진단 키트

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100950495B1 (ko) * 2008-04-23 2010-03-31 단국대학교 산학협력단 특정 프라이머 세트를 포함하는 결핵균을 검출하기 위한등온증폭반응용 프라이머 조성물, 키트 및 상기 프라이머세트를 이용하여 결핵균을 검출하는 방법
KR20100031188A (ko) * 2008-09-12 2010-03-22 주식회사 엘지생명과학 결핵균군 또는 마이코박테리아 속 검출용 조성물 및 이를 이용한 실시간 다중 중합효소 연쇄반응에 의한 결핵균 및 마이코박테리아 속의 동시 분석 방법
CN111344419A (zh) * 2017-08-11 2020-06-26 和平基因生物有限公司 用于结核病诊断的试剂盒和用于通过使用所述试剂盒来诊断结核病的方法

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