WO2013168851A1 - 실시간 중합효소 연쇄반응과 dna 칩이 통합된 검사 시스템 및 이를 이용한 통합 분석방법 - Google Patents

실시간 중합효소 연쇄반응과 dna 칩이 통합된 검사 시스템 및 이를 이용한 통합 분석방법 Download PDF

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이도부
이중환
백문철
구수진
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Definitions

  • the present invention relates to a test system integrated with a real-time polymerase chain reaction and a DNA chip, and an integrated analysis method using the same. More particularly, the present invention relates to a device integrated with a real-time polymerase chain reaction and a DNA chip and an integrated analysis method using the same. will be.
  • the target gene testing method of analyte widely used in molecular diagnosis is largely a relative or absolute quantitative method for measuring the expression level and the copy number of the target gene, the presence or absence of the target gene and the genotype ( There are two types of qualitative methods for analyzing genotyping.
  • the real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR) is a representative method of the quantitative test used to analyze the expression level and the number of genes of the target gene test method of the analyte.
  • the real-time polymerase chain reaction method uses a device in which a polymerase chain cycler and a spectrophotometer are integrated, and during the amplification process, without a separate electrophoresis process to confirm the PCR product after the PCR process.
  • This is a method of analyzing the amount of DNA or RNA initially input or present by monitoring the amplification product generation process of the target gene in real time.
  • real-time PCR is a fluorescent material applied to the PCR technique, the emission of the fluorescent material increases in proportion to the amplification of the target gene present in the sample during the reaction )
  • Real-time detection and quantitative analysis can be used to quickly and accurately analyze the expression pattern and the number of genes.
  • Non-specific detections include phosphors that emit fluorescent signals when inserted between DNA double strands (eg SYBR Green ⁇ , BEBO, BOXTO, EvaGreen, etc.) to measure the entire fluorescence signal of the double strand formed during gene amplification, and specific detection is to conjugate the probe to a short oligonucleotide strand having a specific sequence complementary to the target gene.
  • phosphors that emit fluorescent signals when inserted between DNA double strands (eg SYBR Green ⁇ , BEBO, BOXTO, EvaGreen, etc.) to measure the entire fluorescence signal of the double strand formed during gene amplification
  • specific detection is to conjugate the probe to a short oligonucleotide strand having a specific sequence complementary to the target gene.
  • TaqMan probe attaches FAM as a reporter fluorescent substance at 5 'end, and attaches fluorescent substance TAMRA as a quencher to cancel fluorescence of reporter fluorescent substance at 3' end.
  • FAM fluorescent substance
  • TAMRA fluorescent substance
  • the fluorescent substance FAM is released.
  • the cancellation by the quencher is released to fluoresce, and the amount of amplified products can be measured by analyzing the amount of fluorescence detected.
  • real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR) using SYBR Green I (SYBR Green I) is described in detail, a method for monitoring the total fluorescence. This is based on the principle of intercalating the double stranded DNA chain.
  • the fluorescent material SYBR Green I is added to detect the amount of fluorescence emitted in proportion to the amplification of the PCR product. The production amount of the amplified product can be measured, and the melting temperature of the amplified DNA can be measured.
  • a microarray chip as a method of using a microarray-fixed chip using an oligobase, PNA or cDNA, which can detect a target gene, as a probe. It mainly hybridizes the amplification products after the PCR reaction with the target microarray chip, and binds to various kinds of probes (oligobase, PNA or cDNA) fixed on the chip solid surface (glass, plastic, membrane, silicon, etc.) It can be judged by the method of checking the signal of fluorescent substance labeled on the amplification product, which is useful for analyzing various types of genotypes, but it has the disadvantage of complicated and time-consuming test procedure, and it is impossible to check the result visually. Therefore, a separate fluorescence analyzer is required.
  • a target gene test method of analyte has a copy number of genes for confirming the degree of infection through real-time polymerase chain reaction.
  • Qualitative information on genotyping using microarray chips for quantitative information or identification of infectious agents is required simultaneously and in combination.
  • the real-time polymerase chain reaction and the independent test of the microarray chip are used in parallel.
  • the inventors of the present invention in the target gene test method of the analyte, by quantitative test method and quantitative test method in one step (one-stop) in a single reactor, anyone can easily use the target gene accurately and efficiently An integrated analysis of detectable biomaterials has been found and the present invention has been completed.
  • An object of the present invention is to provide a method for integrated analysis of biomaterials in which a plurality of genes are simultaneously quantitatively or qualitatively analyzed using polymerase chain reaction or real-time polymerase chain reaction and qualitative analysis using DNA chips will be.
  • an object of the present invention is an integrated device that can be performed in a single reactor, by performing simultaneous integration of quantitative or qualitative analysis using polymerase chain reaction or real-time polymerase chain reaction and qualitative analysis using DNA chip, and It is to provide an integrated analysis method of the bio material used.
  • the present invention provides an integrated analysis method for biomaterials and an integrated device for quantitative or qualitative analysis using a polymerase chain reaction or real-time polymerase chain reaction and qualitative analysis using a DNA chip. To provide.
  • the integrated analysis method of the biomaterial according to the present invention is characterized in that quantitative analysis or qualitative analysis using polymerase chain reaction or real-time polymerase chain reaction and qualitative analysis using DNA chips are simultaneously performed in a single reactor.
  • a single reactor having a biochip formed on a rod extending below the coupling portion as a lower portion, a side portion, or a reactor coupling portion inside the reactor is used.
  • the 'reactor' includes both a cap coupled to the top of the reaction vessel and the reaction vessel, the cap may include the reactor coupling portion of the present invention.
  • the present invention is a.
  • the qualitative analysis of the reaction product is simultaneously performed from a biochip to which a probe of a target gene is immobilized.
  • the single reactor provides a biomaterial integrated analysis method, characterized in that the biochip is formed on the rod extending in the lower portion, the side portion, or the bottom of the coupling portion as the reactor coupling portion inside the reactor. See FIGS. 1 and 2.
  • the probe of the target gene may include one or more substances selected from peptides, proteins, nucleic acids, peptide nucleic acid (PNA), aptamer and antibody.
  • PNA peptide nucleic acid
  • the probe according to the present invention is characterized in that it is labeled with a substance which emits fluorescence, phosphorescence or radioactivity of DNA intercalating at one or more positions of any nucleotide sequence of the target gene.
  • Fluorescent material of the probe is Pyrene, Cyanine 2, GFP, Calcein (Calcein), FITC, Alexa 488, FAM, Flororescein Chlorotriazinyl, Florene (Fluorescein), Rhodamine 110, Oregon Green, Magnesium Green, Calcium Green, JOE, Cyanine 3, Tetramethylrhodamine, TRITC, TAMRA, Rhodamine Phalloidin, Pyronin Y, Lysamine, ROX, Calcium Crimson, Texas Red, Nile Red At least one selected from the group consisting of, cyyanine 5, and thiadicarbocyanine can be used.
  • the single reactor may be one or more selected from the elements for detecting biomaterials including a plate having a plurality of wells, a test tube, a tube, and a rod extending below the coupling portion as the reactor coupling portion.
  • any reactor capable of performing PCR may be used.
  • the single reactor is more preferably a device for detecting a biological material including a plate having a plurality of wells, or a rod extending below the coupling portion as the reactor coupling portion.
  • the plate having a plurality of wells according to the present invention is characterized by having two or more well structures, and the plate having a plurality of wells may be separated and used to have a desired number of wells.
  • the plate having a plurality of wells comprises a plurality of wells formed concave on one surface of the plate, the well is a lower diameter than the upper well 210 and the upper well below It includes a well 220, characterized in that the biochip is formed on the bottom of the lower well. See FIG. 3.
  • the plate 1000 having the plurality of wells may have the upper well 210 and the lower well 220 formed in various diameters and depths.
  • the wells are formed in micro units so that a sample for and an oil for protecting the sample can be accommodated thereon.
  • the plate 1000 having the plurality of wells may be manufactured by the following method.
  • a mask pattern such as a resist is formed in a form in which a portion corresponding to the diameter of the upper well 210 is emptied on the upper surface of the plate 100. It may be formed and etched to form the upper well 210 of a specific depth. After the upper well 210 is formed, a donut-shaped mask pattern is formed on the bottom surface of the upper well 210 so that the portion corresponding to the diameter of the lower well 220 is emptied and then etched again to have a specific depth. The lower well 220 may be formed. In addition, the mask patterns may be removed and washed to form a well structure in a desired shape (two stages).
  • the well 200 may be formed through physical processing, and the well 200 may be formed in two stages as described above using various methods according to the material of the plate 100 such as cutting, laser processing, or electric discharge processing. 200) can be formed.
  • the plate 1000 having a plurality of wells of the present invention configured as described above is used for gene amplification reaction, etc.
  • the sample 400 to be tested in the lower well 220 as shown in B of FIG. ) Is injected, and the oil 500 for protecting the sample 400 is injected into the upper well 210 of the upper layer.
  • the sample when the well is formed in the first stage, the sample may be injected to a certain height, and the oil may be injected thereon to cover the upper surface of the sample, but this may cause the oil and the sample to be mixed to one side.
  • the oil and the sample are mixed to one side when heated for the reaction of the sample, thereby reducing the reliability of the biomaterial reaction.
  • the plate 1000 having a plurality of wells according to the present invention is formed in two stages so that the oil is covered on the upper part of the sample, but due to the physical structure, the sample and the oil are not mixed to prevent evaporation due to the heating of the sample. can do.
  • the injection amount of the sample and the injection amount of oil can be made constant, and the oil can be covered on the upper part of the sample, thereby preventing impurities from entering the sample from the outside. Can improve.
  • the biomaterial detection element comprises a rod extending from the lower side of the coupling portion as a coupling portion of the reactor and the reactor, the rod is a biochip formed on the lower side, the coupling of the reactor It is characterized by being detachably formed in a part. See FIG. 4.
  • the biomaterial detection device 2000 may have a head 2100 formed in a flat plate shape or a block shape, and the reaction container 2700 in which a user grabs a hand or moves a sample. It is a part that is configured to be movable when it is applied to the force when it is attached or detached from the automation device.
  • the reactor coupling unit 2200 is formed to protrude to the lower side of the head 2100, the reactor 2700 is formed to be inserted into the outer side can be combined.
  • the outer circumferential surface of the reactor coupling portion 2200 forms a groove along the circumferential direction and couples an elastic sealing member such as an O-ring to the groove, thereby inserting a reactor into the reactor coupling portion 2200.
  • the reaction vessel may be sealed.
  • the rod 3300 is formed to extend in the lower side of the reactor coupling portion 2200, it may be formed in a rod shape extending in the lower direction.
  • the rod 2300 is preferably formed to have a smaller diameter than the reactor coupling portion 2200, and is preferably formed of glass having no reactivity with the sample because the rod 2300 is in contact with the sample such as a biomaterial solution.
  • the rod 300 may be detachably formed on the reactor coupling unit 2200. That is, by forming a hole in the lower side of the reactor coupling portion 2200 and coupled so that the rod 2300 is inserted, it can be formed to replace the rod 2300 as necessary.
  • the biochip 2400 is formed at a lower side of the rod 2300, and is immersed in the sample to cause reaction with the sample and detect a target substance.
  • the biomaterial detection device 21000 includes a head 2100, a reactor coupling part 2200, a rod 2300, and a biochip 2400, and a reactor 2700 in which a sample is contained as illustrated in FIG. 4B.
  • the reactor coupling unit 2200 may be combined to be inserted, wherein the biochip 2400 formed under the rod 300 is immersed in the sample 2800 in the reactor 2700.
  • gene amplification and hybridization may proceed in the reactor 2700, and at the same time, the amplified gene may react with a target gene probe of the biochip 2400 during hybridization to cause conjugation and reaction.
  • Real-time PCR Polymerase Chain Reaction
  • the fluorescence signal generated in the reactor 2700 can be obtained in real time using a monitoring device to obtain a value.
  • hybridization with the probe fixed to the biochip is performed, and separated from the reactor 2700 to wash the rod 2300 and the biochip 2400, and then obtain a fluorescence signal reacted with the probe using a dedicated fluorescence detector to analyze the biochip.
  • a dedicated fluorescence detector to analyze the biochip.
  • the integrated analysis method of the biomaterial according to the present invention can detect the target nucleic acid of Mycobacterium tuberculosis or hepatitis B virus, and more specifically, the diagnosis by the presence or absence of Mycobacterium tuberculosis and the diagnosis of Mycobacterium tuberculosis with antibiotic resistance, or hepatitis B virus. Diagnosis with or without (HBV) and drug resistance variant Hepatitis B virus (HBV) are detected.
  • the primers and probes of the target gene for distinguishing the tuberculosis bacteria and non-tuberculosis bacteria include oligonucleotides comprising a base sequence or a complementary base sequence capable of specifically binding to the target genes of the tuberculosis bacteria It may be more preferably include one or more primers and probes comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to 3 or complementary nucleotide sequence thereof.
  • primers and probes of the target gene for detecting antibiotic resistance may include sequences capable of specifically binding to a target gene causing antibiotic resistance, such as rifampin (RMP), isoniazid, A point mutation sequence of the rpoB gene that is specifically capable of responding to a nucleotide sequence that causes resistance to INH), i.e., complementary nucleotide sequences, but preferably causes rifampin resistance.
  • RMP rifampin
  • INH complementary nucleotide sequences
  • Oligonucleotides comprising the nucleotide sequence may include oligonucleotides comprising the point mutation base sequence of the katG gene and inhA gene or the complementary base sequence of the katG gene and inhA gene to induce resistance, more preferably SEQ ID NO: 4 to 35 One or more sequences containing the nucleotide sequence of or a complementary sequence thereof And primers and probes.
  • Primers and probes of target genes for detecting drug-resistant HBV are oligonucleotides having a nucleotide sequence capable of specifically binding to a target gene that induces resistance to lamivudine, preferably HBV that induces lamivudine resistance. Oligonucleotides comprising the codons 528, 529 and 514 of the B region of the DNA polymerase gene and the point mutation sequences of the codons 552, 548 and 555 of the C region, and more preferably SEQ ID NOs: 36 to 46 It may include one or more primers and probes comprising a base sequence of or a complementary base sequence thereof.
  • the present invention may further include an oligonucleotide comprising a nucleotide sequence related to a newly disclosed antibiotic or a mutant sequence related to drug resistance in order to simultaneously detect resistance to a newly developed antibiotic or drug. You may.
  • the probe according to the present invention hybridizes the fluorescent material of the probe for quantitatively analyzing the amplified reaction product using real-time PCR and the amplified reaction product, and then the probe for qualitative analysis.
  • the fluorescent material is characterized in that the labeling by selecting a material having a different wavelength from each other.
  • the probe according to the present invention used FAM fluorescent material for quantitative analysis of the amplified reaction product using real-time PCR, and hybridized with the amplified reaction product. Cy3 fluorescent material was used for subsequent qualitative analysis.
  • it may be integrated analysis using a plate 1000 or a biomaterial detection device 2000 having a plurality of wells according to the present invention.
  • the real-time PCR reagent and the primer of the target gene in the reactor with the target gene probe as shown in 3 to perform the gene amplification.
  • a reaction such as 4 occurs and the camera acquires a quantitative value of the fluorescent material (ex: FAM) signal generated in the reactor as in 5 in real time, and the gene is amplified.
  • the product undergoes DNA microarray reaction like 6 through temperature change without any additional treatment.
  • the fluorescent material e.g. Cy3 signal, such as 7 different from the phosphor detected by real-time PCR, can be read using a fluorescence detector to obtain a genotype signal such as 8 to perform qualitative analysis.
  • the integrated analysis method of the biomaterial according to the present invention can prevent the contamination by external factors that may occur during the transfer process for the reaction by amplifying the gene in a single reactor and subsequently hybridizing in the state.
  • the integrated analysis method of the biomaterial according to the present invention can shorten the time required for the detection of human harmful microorganisms causing various diseases than the conventional commercialized methods, and is very economical, accurate and efficient in terms of cost. There is an advantage to detect the target gene.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of a method for integrated analysis of a biomaterial according to the present invention
  • FIG. 3 is a perspective view (A) of a plate having a plurality of wells according to the present invention, and a cross-sectional view showing a state in which a sample and oil in the well of the plate having the plurality of wells are accommodated;
  • Figure 4 shows a perspective view (A) of the biomaterial detection element according to the present invention, and the combined cross-sectional view (B) of the reactor containing the biomaterial detection element and the sample,
  • Example 5 is a view showing the antibiotic resistance detection result of Mycobacterium tuberculosis according to Example 4 of the present invention.
  • Figure 6 is a view showing the detection results of the tuberculosis bacteria and non-TB tuberculosis acid bacterium classification and multi-drug resistance of tuberculosis bacteria according to Example 4 of the present invention.
  • reactor coupling portion 2210 protrusion
  • Oligonucleotide primers and real-time PCR probes for the identification of mycobacterium tuberculosis and the rifampin (Rifampin, rpoB), and isoniazid (Isoniazid, inhA, katG) drug resistance diagnostics The DNA chip probes are shown in Table 1 (TB-Specific Primer), Table 2 (Probe for TB-class real-time PCR), Table 3 (Primer for antibiotic resistance diagnostic) and Table 4 (DNA chip-fixed probe for antibiotic resistance diagnostic). .
  • the amplified reaction product was hybridized with a Cy3 fluorescent substance attached to the antibiotic resistance diagnostic primer in Table 3 to confirm the genotype qualitative analysis for antibiotic resistance diagnosis in the DNA chip. This reaction was produced by reacting with the antibiotic resistance diagnostic probe fixed on the surface of the DNA chip.
  • Primers and target probes for the detection of drug-resistant HBV include codons 552, 548, and 555 of the codons 552, 548, and 555 of the YMDD motif in the C region of the HBV DNA polymerase gene that induce lamivudine resistance, and codons 528, 529, and 514 of the B region. Point mutations were made to include the base sequence, and are shown in Tables 5, 6, and 7 below.
  • the following probe used FAM as a fluorescence material for quantitative analysis of amplified reaction products using real-time PCR, and hybridized with the amplified reaction products, followed by Cy3 for qualitative analysis.
  • the probe was prepared by selecting the fluorescent material.
  • Table 5 (primers for detection of hepatitis B virus) and Table 6 (probe for real-time PCR for detection of hepatitis B virus) among the following probes were amplified using real-time PCR.
  • FAM was used as a fluorescent substance
  • TAMRA was used as a quenching substance.
  • the amplified reaction product was hybridized with a Cy3 fluorescent material attached to the antibiotic resistance diagnostic primer of Table 5 below to confirm the DNA type qualitative analysis for antibiotic resistance diagnostic genotyping. This reaction was produced by reacting with the antibiotic resistance diagnostic probe of Table 7 fixed on the surface of the DNA chip.
  • Each of the probes for quantitative and qualitative analysis prepared in Example 1 was diluted to 100 pmol, transferred to a 96-well microplate, and mixed with 50 pmol by adding a spotting solution.
  • the probe was attached to a support such as a slide glass or a membrane using a microarray (Cartesian Technologies, PLXSYS 7500 SQXL Microarryer, USA).
  • the biochip prepared in Example 2 was fixed to the bottom of the rod-shaped rod to manufacture a biomaterial detection device.
  • Mycobacterium tuberculosis used in this experiment was obtained from Korean tuberculosis tuberculosis and National Masan Tuberculosis Hospital. To extract their DNA, an InstaGene matrix (InstaGene matrix, Bio-Rad Co., USA) was used. Strains and clinical specimens were added 100 [mu] l of Instagin matrix to a 1.5 ml tube. In addition, the strain to be used in this experiment was incubated in a solid medium (Ogawa medium) and then suspended in a tube containing an Instagin matrix named after 1 platinum. This was reacted for 30 minutes at 56 ° C.
  • InstaGene matrix InstaGene matrix, Bio-Rad Co., USA
  • Blood collected from hepatitis B patients was immediately refrigerated and coagulated for one hour, and then centrifuged for 5 minutes at 3000 rpm.
  • the obtained serum was stored at -70 °C, and to extract their DNA was used QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN Inc., CA, USA).
  • the kit was used to finally obtain 200 ⁇ l of HBV DNA in serum. This was used as template DNA of the real time PCR reaction.
  • the FAM fluorescence signal generated from the tube is obtained by obtaining a signal in real time from the camera, and then hybridized.Then, the lid is opened, the glass rod attached to the cap is washed, and then reacted with the probe using a dedicated fluorescence detector. One Cy3 fluorescence signal was obtained and DNA chip analysis was performed.
  • the FAM fluorescence signal generated from the tube is obtained by obtaining a signal in real time, and then hybridized.Then, the lid is opened and the glass rod attached to the cap is washed. One Cy3 fluorescence signal was obtained and DNA chip analysis was performed.
  • the integrated analysis method of the biomaterial according to the present invention is an amplification of genes in a single reactor, and in the state, hybridization proceeds in the state, which can occur during the transfer process for reaction. It is possible to prevent contamination by, and has the advantage of automating a series of processes such as sample injection, biological material reaction, result detection and result analysis.
  • the integrated analysis method of the biomaterial according to the present invention can not only shorten the time required for the detection of harmful microorganisms causing various diseases, but also is very economical and accurate in terms of cost than the conventional commercialized methods. There is an advantage that can efficiently detect the target gene.
  • SEQ ID NOs: 1 to 2 are primers for the detection of Mycobacterium tuberculosis / non-TB tuberculosis according to an embodiment of the present invention.
  • SEQ ID NO: 3 is a real-time PCR probe for detecting Mycobacterium tuberculosis / non-tuberculosis according to an embodiment of the present invention.
  • SEQ ID Nos: 4 to 9 are antibiotic resistance diagnostic primers according to embodiments of the present invention.
  • SEQ ID NO: 10 to 35 is a DNA chip fixing probe for antibiotic resistance diagnostic according to an embodiment of the present invention.
  • SEQ ID NOs: 36 to 37 are primers for detecting hepatitis B virus according to an embodiment of the present invention.
  • SEQ ID NO: 38 is a real-time PCR probe for detecting hepatitis B virus according to an embodiment of the present invention.
  • SEQ ID NO: 39 to 46 is a DNA chip fixing probe for antibiotic resistance diagnostic according to an embodiment of the present invention.

Abstract

본 발명은 실시간 중합효소 연쇄반응과 DNA 칩이 통합된 검사 시스템 및 이를 이용한 통합 분석방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 실시간 중합효소 연쇄반응과 DNA 칩이 통합된 장치 및 이를 이용한 통합 분석방법으로, 상기 본 발명에 따른 통합 분석방법은 단일 반응기 내에서 유전자의 증폭이 진행되고, 그 상태에서 후속으로 혼성화가 진행됨으로써 반응을 위해 옮기는 과정 중 발생할 수 있는 외부요인에 의한 오염을 방지할 수 있으며, 시료의 주입, 생체물질의 반응, 결과 탐지 및 결과 분석과 같은 일련의 과정이 자동화되는 장점이 있다.

Description

실시간 중합효소 연쇄반응과 DNA 칩이 통합된 검사 시스템 및 이를 이용한 통합 분석방법
본 발명은 실시간 중합효소 연쇄반응과 DNA 칩이 통합된 검사 시스템 및 이를 이용한 통합 분석방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 실시간 중합효소 연쇄반응과 DNA 칩이 통합된 장치 및 이를 이용한 통합 분석방법에 관한 것이다.
현재 분자진단에서 널리 시행되고 있는 분석물질의 표적 유전자 검사방법은 크게 표적 유전자의 발현정도 및 유전자 개수(copy number)를 측정하는 상대 혹은 절대 정량적 방법(quantitative method)과 표적 유전자의 존재 유무 및 유전자형 (genotyping)을 분석하는 정성적 방법(qualitative method) 두 가지로 나눌 수 있다.
분석물질의 표적 유전자 검사방법 중에서 표적 유전자의 발현정도 및 유전자 개수를 분석하는데 사용하고 있는 정량적 검사의 대표적인 방법으로 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)이 있다.
실시간 중합효소 연쇄반응 방법은 중합효소 연쇄반응 장치(thermal cycler) 와 분광형광광도계(spectrophotometer)가 일체화된 장치를 이용하는 것으로, PCR 과정 후 PCR 산물의 확인을 위한 별도의 전기영동과정 없이, 증폭 과정 중 실시간으로 표적 유전자의 증폭산물 생성과정을 모니터링하여 초기에 투입 혹은 존재하는 DNA 또는 RNA의 양을 분석하는 방법이다. 보다 구체적으로, 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)은 형광물질(fluorescent material)을 PCR 기법에 응용한 것으로 반응 중 검체 내에 존재하는 표적 유전자의 증폭과 비례하게 증가하는 형광물질의 발광(emission) 정도를 실시간으로 검출하고 정량 분석하여 표적 유전자의 발현 양상 및 그 유전자 수를 신속하고 정확하게 분석할 수 있는 방법이다. 실시간 중합효소 연쇄반응에서 형광 신호를 얻는 방법은 크게 비특이 탐지와 특이 탐지가 있는데, 비특이 탐지는 DNA 이중가닥 사이에 삽입되었을 때 형광물질 신호가 나오는 형광체를(예: SYBR Green Ι, BEBO, BOXTO, EvaGreen, 등) 이용하는 방법으로 유전자 증폭 중 이중가닥이 형성된 전체의 형광 신호를 측정하는 것이고, 특이 탐지는 표적 유전자와 상보적 결합 가능한 특이 서열을 지니는 짧은 올리고뉴클레오타이드 가닥에 형광체를 접합하여 프로브를(예: TaqMan probe, Molecular Beacon, Light-Up probe, Hybridization probe, 등) 만들어 표적 유전자와 함께 증폭될 때 유전자 증폭과 비례하게 이 짧은 올리고뉴클레이타이드 프로브로부터 발생되는 형광 신호를 측정하는 방법이다.
상기 특이 탐지 방법 중, TaqMan 프로브를 이용한 실시간 중합효소 연쇄반응을 상세히 설명하면, 일반 PCR과 같이 2개의 프라이머를 이용하는 원리는 같으나 형광물질이 화학적으로 결합되어 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하여야 한다. TaqMan 프로브는 5'말단에는 리포터(reporter) 형광물질로서 FAM 등을 부착하고, 3'말단에는 리포터(reporter) 형광물질의 형광을 상쇄시키는 소광물질(quencher)로서 형광물질인 TAMRA등을 부착한 것이다. TaqMan 프로브를 PCR 반응액에 첨가하면 TaqMan 프로브는 PCR 과정 중 주형과의 결합반응(annealing)으로 주형 DNA에 결합되지만 리포터 및 소광물질의 상쇄작용에 의해 형광이 감지되지 않으며, PCR 과정 중 Taq DNA 폴리머라제(Taq DNA polymerase)에 의한 신장반응(extension)시 Taq DNA 폴리머라제의 5'→ 3' 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성으로 주형에 혼성화된 TaqMan 프로브가 분해되면 형광물질 FAM 등 이 유리됨으로써 소광물질(quencher)에 의한 상쇄가 해제되어 형광을 발하게 되며, 검출되는 형광의 양을 분석하여 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있다.
또한 상기 비특이 탐지 방법 중, SYBR 그린 I(SYBR Green I)를 이용한 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)은 을 상세히 설명하면, 전체 형광을 모니터하는 방법이다. 이는 이중가닥(double strand) DNA 사슬에 결합(intercalating)되는 원리를 이용하는 것으로서 PPCR 반응 시 형광물질 SYBR 그린 I(SYBR Green I)를 첨가하여 PCR 산물의 증폭과 비례하게 발광하는 형광의 양을 검출함으로써 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있으며, 또한 증폭 DNA의 융해온도를 측정할 수 있다.
또한, 분석물질의 표적 유전자 검사방법 중에서 표적 유전자의 유무 및 유전자형(genotyping)을 분석하는데 사용하고 있는 정성적(qualitative) 검사 방법으로 최근, 분자생물학적 기술과 전자공학적 기술의 접목을 통해 한 장의 슬라이드에 수십에서 수만 종류의 유전자를 동시에 검사할 수 있는 DNA 마이크로어레이(DNA 칩) 방법이 있다.
보다 상세하게는 표적 유전자를 탐지할 수 있는 올리고염기, PNA 혹은 cDNA 를 프로브로 하여 마이크로 어레이 고정한 칩을 이용하는 방법으로서 마이크로어레이 칩(Microarray Chip)이 있다. 이는 주로 PCR 반응 후의 증폭 산물을 표적 마이크로어레이 칩과 혼성화하여, 칩 고체 표면에(유리, 플라스틱, 멤브레인, 실리콘, 등) 고정된 여러 종류의 프로브(올리고염기, PNA 혹은 cDNA)와 결합하고, 결합 여부를 증폭 산물에 표지된 형광 물질 신호를 확인하는 방법으로 판단할 수 있어 다양한 형태의 유전자형 분석에 유용하나, 시험과정이 복잡하고 시간이 다소 많이 소요되는 단점을 가지고 있으며, 결과의 육안 확인이 불가능하여 별도의 형광 분석 장치를 필요로 하고 있다.
최근에는 상기와 같은 분자진단 영역 중 감염체 질환의 경우 진단과 치료의 개념이 적용됨에 따라 분석물질의 표적 유전자 검사방법이 실시간 중합효소 연쇄반응을 통한 감염 정도 확인을 위한 유전자 수(copy number)의 정량적 정보, 혹은 감염체 종류 확인을 통해 적절한 치료제 처방을 위한 마이크로어레이 칩 활용 유전자형(genotyping)의 정성적 정보가 동시, 복합적으로 요구되고 있다. 이 목적에 따라 실시간 중합효소 연쇄반응과 마이크로어레이 칩 각각 독립적인 검사를 병행하여 이용하고 있다.
그러나 상기 검사방법들의 접목은 단순히 각 각의 방법들을 서로 다른 반응기에서 실험을 순차적으로 진행하고, 이를 분석하는 것으로, 여전히 많은 노동력과 시간이 요구되고, 불편함이 남아 있다. 또한, 상기 검사방법들을 한 디바이스로 자동화시키기가 힘들 뿐더러 단순 접목된 것을 자동화하기 위한 장비 제작을 한다 하더라도 장비 비치를 위해 넓은 공간이 요구되고 장비 가격 역시 상당히 고가여서 병원에서 분자진단검사에 보편적으로 사용하기에는 용이하지 않아, 이를 위한 발전된 기술 개발이 절실히 요구된다.
이에, 본 발명자들은 분석물질의 표적 유전자 검사방법에 있어, 정량적 검사방법 및 정량적 검사방법을 단일 반응기에서 한 단계(one-stop)로 진행함으로써 누구나 간편하게 이용할 수 있을 뿐 아니라 정확하고 효율적으로 표적 유전자를 검출할 수 있는 바이오 물질의 통합 분석방법을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 다수의 유전자에 대하여, 중합효소 연쇄반응 또는 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용한 정량분석 또는 정성분석과 DNA 칩을 이용한 정성분석이 동시에 수행되는, 바이오 물질의 통합 분석방법을 제공하기 위한 것이다.
보다 상세하게는 본 발명의 목적은 단일 반응기 내에서, 중합효소 연쇄반응 또는 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용한 정량분석 또는 정성분석과 DNA 칩을 이용한 정성분석을 동시에 통합되어 수행될 수 있는 통합장치 및 이를 이용한 바이오 물질의 통합 분석방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 중합효소 연쇄반응 또는 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용한 정량분석 또는 정성분석과 DNA 칩을 이용한 정성분석이 동시에 수행되는, 바이오 물질의 통합 분석방법 및 이를 위한 통합장치를 제공한다.
본 발명에 따른 바이오 물질의 통합 분석방법은 중합효소 연쇄반응 또는 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용한 정량분석 또는 정성분석과 DNA 칩을 이용한 정성분석이 단일 반응기에서 동시에 수행되어 분석되는 것을 특징으로 한다.
상기 통합 분석을 위해서는 반응기 내부의 하부, 측면부, 또는 반응기 결합부로서 결합부의 하측에 연장 형성되는 로드에 바이오 칩이 형성되어 있는 단일 반응기를 이용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어, 상기‘반응기’는 반응용기와 반응용기의 상부에 결합되는 캡을 모두 포함하며, 상기 캡은 본 발명의 반응기 결합부를 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은
하나의 단일 반응기 내에서 중합효소 연쇄반응 또는 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)을 이용하여 증폭된 반응산물의 정량분석 또는 정성분석과
표적 유전자의 프로브가 고정화된 바이오 칩(chip)으로부터 상기 반응산물의 정성분석이 동시에 수행되는 것을 특징으로 하는 분석방법으로,
상기 단일 반응기는 반응기 내부의 하부, 측면부, 또는 반응기 결합부로서 결합부의 하측에 연장 형성되는 로드에 바이오 칩이 형성되어 있는 것을 특징으로 하는, 바이오 물질의 통합 분석방법을 제공한다. 도 1 및 도 2를 참고한다.
본 발명에 있어서, 상기 표적 유전자의 프로브는 펩타이드, 단백질, 핵산, PNA(Peptide Nucleic Acid), 압타머(Aptamer) 및 항체로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 프로브는 타겟 유전자의 임의의 염기서열의 하나 또는 그 이상의 자리에 DNA 삽입(intercalating) 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질로 표지된 것을 특징으로 한다.
상기 프로브의 형광물질은 피레닌(Pyrene), 싸이아닌 2 (Cyanine 2), GFP, 칼세인(Calcein), FITC, 알렉사(Alexa 488), FAM, 플로레씬 클로로트리아지닐(Fluorescein Chlorotriazinyl), 플로레씬(Fluorescein), 로다민(Rhodamine 110), 오레건 그린(Oregon Green), 마그네슘 그린(Magnesium Green), 칼슘 그린(Calcium Green), JOE, 싸이아닌 3(Cyanine 3), 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine), TRITC, TAMRA, 로다민 팔로이딘(Rhodamine Phalloidin), 피로닌 Y(Pyronin Y), 리싸민(Lissamine), ROX, 칼슘크림선(Calcium Crimson), 텍사스 레드(Texas Red), 나일 레드(Nile Red), 싸이아닌 5(Cyanine 5), 및 티아디카복시아닌(Thiadicarbocyanine)으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단일 반응기는 복수개의 웰을 가지는 플레이트, 시험관, 튜브, 및 반응기 결합부로서 결합부의 하측에 연장 형성되는 로드를 포함하는 생체물질 검출용 소자로부터 선택되는 하나 이상인 것을 사용할 수 있으며, PCR을 수행할 수 있는 반응기면 어느 것이라도 사용가능하다.
본 발명에 있어서, 상기 단일 반응기는 보다 바람직하게는 복수개의 웰을 가지는 플레이트, 또는 반응기 결합부로서 결합부의 하측에 연장 형성되는 로드를 포함하는 생체물질 검출용 소자인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 상기 복수개의 웰을 가지는 플레이트는 2단 이상의 웰 구조를 가지는 것을 특징으로 하며, 복수개의 웰을 가지는 플레이트는 원하는 개수의 웰을 가지도록 분리하여 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 복수개의 웰을 가지는 플레이트는 플레이트의 일면에 오목하게 형성되는 복수개의 웰을 포함하여 이루어지며, 상기 웰은 상부 웰(210) 및 그 하측에 상기 상부 웰보다 직경이 작은 하부 웰(220)을 포함하고, 상기 하부 웰의 바닥에 바이오 칩이 형성되어 있는 것을 특징으로 한다. 도 3을 참고한다.
보다 상게하게는 도 3과 같이, 상기 복수개의 웰을 가지는 플레이트(1000)는 상기 상부 웰(210) 및 하부 웰(220)은 다양한 직경 및 깊이로 형성될 수 있으며, 본 발명에서는 생체 물질의 반응을 위한 시료 및 그 상층에 상기 시료를 보호하기 위한 오일이 수용될 수 있도록 마이크로 단위로 웰이 형성된다.
상기 복수개의 웰을 가지는 플레이트(1000)는 하기의 방법으로 제조할 수 있다.
즉, 상기 상부 웰(210)과 하부 웰(220)을 형성하는 방법으로는 우선 상기 플레이트(100)의 상면에 상부 웰(210)의 직경에 해당하는 부분이 비워진 형태로 레지스트 등의 마스크 패턴을 형성하고 식각하여 특정한 깊이의 상부 웰(210)이 형성되도록 할 수 있다. 그리고 상기 상부 웰(210)이 형성된 후 다시 상기 상부 웰(210)의 바닥면에 하부 웰(220)의 직경에 해당하는 부분이 비워지도록 도너츠 형태의 마스크 패턴을 형성하고, 다시 식각하여 특정한 깊이의 하부 웰(220)이 형성되도록 할 수 있다. 그리고 상기 마스크 패턴 들을 제거하고 세척하여 원하는 형상(2단)으로 웰 구조를 형성할 수 있다.
다른 방법으로는 물리적인 가공을 통해 웰(200)이 형성될 수 있으며, 절삭 가공, 레이져 가공 또는 방전 가공 등 상기 플레이트(100)의 재질에 따라 다양한 방법을 이용하여 상기와 같이 2단으로 웰(200)이 형성될 수 있다.
그리고 상기와 같이 구성되는 본 발명의 복수개의 웰을 가지는 플레이트(1000)는 유전자 증폭 반응 등에 사용되며 그 사용 방법으로는, 도 3의 B와 같이 상기 하부 웰(220)에 시험하고자 하는 시료(400)를 주입하고, 그 상층인 상부 웰(210)에 상기 시료(400)를 보호하기 위한 오일(500) 등을 주입한다. 이는 상기 상부 웰(210)에 주입된 오일(500)층이 상기 하부 웰(220)에 수용된 시료(400)를 덮고 있는 상태가 된다. 이때 1단으로 웰이 형성되는 경우에는 시료를 일정 높이로 주입하고, 그 위에 오일을 주입하여 상기 시료의 상면을 오일층이 덮여 있도록 할 수도 있으나, 이는 상기 오일과 시료가 한쪽으로 치우쳐 섞일 수 있으며, 주입시 섞이지 않더라도 시료의 반응을 위한 가열시 오일과 시료가 한쪽으로 치우쳐 섞임으로써 생체 물질 반응의 신뢰성이 저하될 수 있다.
그러므로 본 발명에 따른 복수개의 웰을 가지는 플레이트(1000)는 2단으로 웰이 형성되어 시료의 상부에 오일이 덮여지되 물리적 구조로 인해 시료와 오일이 섞이지 않도록 되어있어 시료의 가열에 따른 증발을 방지할 수 있다. 또한, 2단으로 웰이 형성되므로 시료의 주입량과 오일의 주입량을 일정하게 할 수 있으며, 시료의 상부에 오일이 덮여지도록 할 수 있어 외부에서 시료로 불순물들이 유입되는 것을 방지할 수 있으므로 검사의 신뢰성을 향상시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생물물질 검출용 소자는 반응기 및 반응기의 결합부로서 결합부의 하측에 연장 형성되는 로드를 포함하여 이루어지며, 상기 로드는 하측에 바이오 칩이 형성되어 있는 것으로, 상기 반응기의 결합부에 탈착 가능하게 형성되어 있는 것을 특징으로 한다. 도 4를 참고한다.
보다 상세하게는 도 4와 같이, 상기 생물물질 검출용 소자(2000)는 헤드(2100)가 평판 또는 블록 형태 등으로 형성될 수 있으며, 사용자가 손으로 잡아 이동시키거나 시료가 담긴 반응용기(2700)에 탈착될 때 힘을 가하거나, 자동화장치에 결합되어 이동이 가능하도록 구성되는 부분이다.
상기 반응기 결합부(2200)는 상기 헤드(2100)의 하측에 돌출되도록 형성되며, 상기 반응기(2700)가 외측으로 삽입되어 결합될 수 있도록 형성된다. 이때, 상기 반응기 결합부(2200)의 외주면에는 원주방향을 따라 홈을 형성하고 그 홈에 오링(O-ring)과 같은 탄성 실링부재를 결합하여, 상기 반응기 결합부(2200)에 반응기를 삽입하여 결합시 반응용기 내부가 밀폐되도록 할 수 있다.
상기 로드(3300)는 상기 반응기 결합부(2200)의 하측에 연장 형성되며, 하측 방향으로 길게 막대 형태로 형성될 수 있다. 이때, 상기 로드(2300)는 상기 반응기 결합부(2200) 보다 직경이 작게 형성되는 것이 바람직하며, 생체물질 용액과 같은 시료와 접촉되는 부분이므로 시료와의 반응성이 없는 유리로 형성되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 로드(300)는 상기 반응기 결합부(2200)에 탈착 가능하게 형성될 수 있다. 즉, 상기 반응기 결합부(2200)의 하측에 홀을 형성하고 상기 로드(2300)가 삽입되도록 결합하여, 필요에 따라 상기 로드(2300)를 교체하여 사용할 수 있도록 형성될 수 있다.
그리고 상기 바이오 칩(2400)은 상기 로드(2300)의 하측에 형성되며, 상기 시료에 잠겨 시료와 반응을 일으키며 표적 물질을 검출할 수 있는 부분이다.
상기의 생체물질 검출용 소자(21000)는 헤드(2100), 반응기 결합부(2200), 로드(2300) 및 바이오 칩(2400)을 포함하여 이루어져, 도 4의 B와 같이 시료가 담겨진 반응기(2700)에 상기 반응기 결합부(2200)가 삽입되도록 결합될 수 있으며, 이때 상기 로드(300)의 하측에 형성된 바이오 칩(2400)이 반응기(2700) 내의 시료(2800)에 잠기도록 형성된다. 그리하여 반응기(2700) 내에서 유전자 증폭 및 혼성화가 진행될 수 있으며 동시에 증폭된 유전자는 혼성화 과정 중 바이오 칩(2400)의 표적 유전자 프로브와 반응하여 접합 및 반응을 일으키도록 할 수 있다.
즉, 반응기(2700) 내에서 Real-time PCR(Polymerase Chain Reaction, 유전자 증폭)을 수행하고, 반응기(2700)에서 발생하는 형광신호를 모니터링 장치를 이용하여 실시간으로 신호를 획득하여 값을 얻을 수 있으며, 이후 바이오 칩에 고정된 프로브와 혼성화를 진행하고 반응기(2700)와 분리하여 로드(2300)와 바이오 칩(2400)을 세척한 뒤 전용 형광 탐지기로 프로브와 반응한 형광신호를 얻어 바이오 칩의 분석을 수행할 수 있다. 그러므로 Real-time PCR과 바이오 칩 분석을 단일 반응기 안에서 통합 수행할 수 있는 장점이 있다.
본 발명에 따른 바이오 물질의 통합 분석방법은 결핵균 또는 B형 간염바이러스의 타겟 핵산을 검출할 수 있으며, 보다 상세하게는 결핵균의 유무에 의한 진단 및 항생제 내성을 가진 결핵균의 진단, 또는 B형 간염 바이러스(HBV)의 유무에 의한 진단 및 약제 내성 변이형 B형 간염 바이러스(HBV)를 검출하는 것을 특징으로 한다.
보다 상세하게는 결핵균과 비결핵 균의 구분을 위한 표적 유전자의 프라이머 및 프로브는 결핵균만이 가지는 표적 유전자에 특이적으로 결합 반응할 수 있는 염기서열 이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 서열번호 1 내지 3의 염기서열이나 이의 상보적인 염기서열을 포함하는 하나 이상의 프라이머 및 프로브를 포함할 수 있다.
또한, 항생제 내성을 검출하기 위한 표적 유전자의 프라이머 및 프로브는 항생제 내성을 유발하는 표적 유전자에 특이적으로 결합 반응할 수 있는 염기서열, 예를 들면, 리팜핀(rifampin, RMP), 아이소니아지드(isoniazid, INH)에 대한 내성을 유발하는 염기서열에 특이적으로 반응이 가능한 즉, 상보적인 염기서열의 어떤 올리고뉴클레오티드도 포함하나, 바람직하게는 리팜핀 내성을 유발하는 rpoB 유전자의 점 돌연변이 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 아이소니아지드 내성을 유발하는 katG 유전자와 inhA 유전자의 점 돌연변이 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 서열번호 4 내지 35의 염기서열이나 이의 상보적인 염기서열을 포함하는 하나 이상의 프라이머 및 프로브를 포함할 수 있다.
약제 내성 HBV를 검출하기 위한 표적 유전자의 프라이머 및 프로브는 라미부딘(lamivudine)에 대한 내성을 유도하는 표적 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드, 바람직하게는 라미부딘 내성을 유도하는 HBV DNA polymerase 유전자의 B 영역의 코돈 528, 529와 514 부위와 C 영역의 코돈 552, 548과 555 부위의 점 돌연변이 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 서열번호 36 내지 46의 염기서열이나 이의 상보적인 염기서열을 포함하는 하나 이상의 프라이머 및 프로브를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기에서 제시한 표적 유전자 이외에도 새로이 개발되는 항생제 또는 약제에 대해서도 내성을 동시에 검출하기 위하여 새롭게 밝혀지는 항생제와 관련된 염기서열 또는 약제 내성과 관련된 돌연변이 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 더 포함할 수 도 있다.
본 발명에 따른 프로브는 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)을 이용하여 증폭된 반응산물을 정량분석하기 위한 프로브의 형광물질과 상기 증폭된 반응산물과 혼성화를 진행한 뒤 정성분석을 위한 프로브의 형광물질은 서로 파장이 다른 물질을 선택하여 표지하는 것을 특징으로 한다.
보다 상세하게는 본 발명에 따른 프로브는 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)을 이용하여 증폭된 반응산물의 정량분석을 위하여 FAM 형광물질을 사용하였고, 상기 증폭된 반응산물과 혼성화를 진행한 뒤 정성분석을 위하여 Cy3 형광물질을 사용하였다.
구체적인 일 예로, 본 발명에 따른 복수개의 웰을 가지는 플레이트(1000) 또는 생물물질 검출용 소자(2000)를 이용하여 통합 분석될 수 있다.
도 1과 같이 ①과 ② 표면에 다수개의 표적 유전자 프로브를 어레이한 후, ③과 같이 표적 유전자 프로브가 있는 반응기에 실시간 PCR 시약 및 타겟 유전자의 프라이머를 넣고 유전자 증폭을 수행한다. 유전자 증폭이 진행되는 동안 ④와 같은 반응이 일어나면서 ⑤와 같이 반응기 내에서 발생하는 형광물질(예시; FAM) 신호를 카메라가 실시간으로 신호 획득하여 정량분석 된 값을 얻고, 유전자가 증폭이 된 반응산물은 별도의 처리 없이 온도 변화만을 통해 ⑥과 같이 DNA 마이크로어레이 반응이 진행된다. 상기 결과는 세척 후, 실시간 PCR 에서 탐지했던 형광체와는 다른 종류의 ⑦과 같은 형광물질(예시; Cy3) 신호를 형광 탐지기를 활용해 읽어, ⑧과 같이 유전자형 신호를 얻어 정성 분석을 할 수 있다.
본 발명에 따른 바이오 물질의 통합 분석방법은 단일 반응기 내에서 유전자의 증폭이 진행되고, 그 상태에서 후속으로 혼성화가 진행됨으로써 반응을 위해 옮기는 과정 중 발생할 수 있는 외부요인에 의한 오염을 방지할 수 있으며, 시료의 주입, 생체물질의 반응, 결과 탐지 및 결과 분석과 같은 일련의 과정이 자동화되는 장점이 있다.
본 발명에 따른 바이오 물질의 통합 분석방법은 기존의 상품화된 방법보다 각종 질환의 원인이 되는 인체 유해 미생물들의 검출에 필요한 시간이 훨씬 단축시킬 수 있을 뿐 아니라 비용 면에서도 매우 경제적이며, 정확하고 효율적으로 표적 유전자를 검출할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 본 발명에 따른 바이오 물질의 통합 분석방법의 개략도를 보여주는 것이고,
도 2는 본 발명에 따른 바이오 물질의 통합 분석방법의 작동원리를 보여주는 것이며,
도 3은 본 발명에 따른 복수개의 웰을 가지는 플레이트의 사시도(A), 및 상기 복수개의 웰을 가지는 플레이트의 웰 내 시료와 오일이 수용된 상태를 나타낸 단면도이고,
도 4는 본 발명에 따른 생체물질 검출용 소자의 사시도(A), 및 상기 생체물질 검출용 소자와 시료가 수용된 반응기의 결합 단면도(B)를 보여주는 것이며,
도 5는 본 발명의 실시예 4에 따른 결핵균의 항생제 내성 검출결과를 보여주는 도면이고,
도 6은 본 발명의 실시예 4에 따른 결핵균과 비결핵 항산균 구분과 결핵균의 다중약제내성 의 검출결과를 보여주는 도면이다.
[부호의 설명]
1000 : (본 발명의) 복수개의 웰을 가지는 플레이트
100 : 플레이트
200 : 웰
210 : 상부 웰 220 : 하부 웰
300 : 바이오 칩
400 : 시료
500 : 오일
2000 : (본 발명의) 생체물질 검출용 소자
2100 : 헤드
2200 : 반응기 결합부 2210 : 돌출부
2300 : 로드
2400 : 바이오 칩
2500 : 방향 표시부
2600 : 어댑터
2700 : 반응기
2800 : 시료
본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
[실시예 1] 프라이머 및 프로브의 제작
(1) 결핵균/비결핵 항상균 구분 프라이머 및 real-time PCR 용 프로브, 항생제 내성진단 DNA chip 용 프라이머 및 프로브 제작
본 발명에 사용된 마이코박테리움 투베르쿨로시스의 구분 및 리팜핀 (Rifampin, rpoB), 아이소니아지드(Isoniazid, inhA, katG) 약제내성진단을 하기 위한, 올리고뉴클레오티드 프라이머와 real-time PCR 용 프로브 및 DNA chip 용 프로브를 하기 표 1(결핵균 구분 프라이머), 표 2(결핵균 구분 real-time PCR 용 프로브), 표 3(항생제 내성진단용 프라이머) 및 표 4(항생제 내성진단용 DNA chip 고정 프로브)에 나타내었다.
하기 프로브 중 표 1과 표 2는 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)을 이용하여 증폭된 결핵균의 반응산물의 정량분석을 위함이며, 형광물질로 FAM을, 소광물질로 TAMRA를 사용하였다. 상기 증폭된 반응산물은 혼성화를 진행한 뒤 항생제 내성진단용 유전자형 정성분석을 DNA chip에서 확인하기 위하여 하기 표 3 항생제 내성진단용 프라이머에 Cy3 형광물질을 부착하였으며, 이는 유전자 증폭 과정 중 증폭 반응산물에 Cy3 형광이 부착되어 이미 DNA chip 표면에 고정된 항생제 내성진단용 프로브와 반응하여 신호를 내게끔 제작하였다.
Figure PCTKR2012006554-appb-I000001
Figure PCTKR2012006554-appb-I000002
Figure PCTKR2012006554-appb-I000003
Figure PCTKR2012006554-appb-I000004
(2) 약제내성 B형 간염 바이러스 검출을 위한 프라이머 및 프로브 제작
약제 내성 HBV를 검출하기 위한 프라이머와 표적 프로브는 라미부딘(lamivudine) 내성을 유도하는 HBV DNA polymerase 유전자의 C 영역 내의 YMDD motif의 코돈 552, 548과 555 부위와 B 영역의 코돈 528, 529와 514 부위의 점돌연변이 염기서열을 포함하도록 제작하였고, 하기 표 5, 표 6 및 표 7 에 나타내었다.
하기 프로브는 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)을 이용하여 증폭된 반응산물의 정량분석을 위하여 형광물질로 FAM을 사용하였고, 상기 증폭된 반응산물과 혼성화를 진행한 뒤 정성분석을 위하여 Cy3 형광물질을 선택하여 프로브를 제작하였다.
하기 프로브 중 표 5(B형 간염바이러스 검출을 위한 프라이머) 와 표 6(B형 간염바이러스 검출을 위한 real-time PCR 용 프로브)는 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)을 이용하여 증폭된 B 형 간염바이러스의 반응산물 정량분석을 위함이며, 형광물질로 FAM을, 소광물질로 TAMRA를 사용하였다. 상기 증폭된 반응산물은 혼성화를 진행한 뒤 항생제 내성진단용 유전자형 정성분석을 DNA chip에서 확인하기 위하여 하기 표5 항생제 내성진단용 프라이머에 Cy3 형광물질을 부착하였으며, 이는 유전자 증폭 과정 중 증폭 반응산물에 Cy3 형광이 부착되어 이미 DNA chip 표면에 고정된 표 7의 항생제 내성진단용 프로브와 반응하여 신호를 내게끔 제작하였다.
Figure PCTKR2012006554-appb-I000005
Figure PCTKR2012006554-appb-I000006
Figure PCTKR2012006554-appb-I000007
[실시예 2] 지지체에 프로브 부착
상기 실시예 1에서 제작된 정량분석 및 정성분석을 위한 프로브 각각을 100 pmol로 희석하여 96-well 마이크로 플레이트에 옮겨서 spotting 용액을 첨가하여 50 pmol로 잘 섞었다. 슬라이드 글라스 또는 멤브레인(membrane) 등의 지지체에 프로브를 마이크로어레이어(Cartesian Technologies, PLXSYS 7500 SQXL Microarryer, USA)를 이용하여 부착시켰다.
지지체 표면에 부착되지 않은 프로브를 제거하기 위해 실온에서 0.2% SDS(Sodium dodecyl sulfate) 용액에 세척한 후, 증류수로 세척하였다. Sodium borohydride 용액으로 세척하고 다시 끓는 증류수에 세척하였다. 실온에서 0.2% SDS와 증류수를 이용하여 세척한 후 원심분리기를 이용하여 지지체 표면을 완전하게 건조시켜 마이크로어레이 제작(바이오 칩)을 완료하였다.
[실시예 3] 생체물질 검출용 소자의 제조
상기 실시예 2에서 제조한 바이오칩을 막대형 로드의 바닥에 고정하여 생체물질 검출용 소자의 제조하였다.
[실시예 4] 균주로부터 게놈 DNA 분리
(1) 결핵균으로부터 게놈 DNA 분리
본 실험에 사용된 결핵균은 대한결핵협회에서 분양받은 균주와 국립마산결핵병원을 통해서 검체를 확보하였다. 이들의 DNA를 추출하기 위해서는 인스타진 매트릭스(InstaGene matrix, Bio-Rad Co., USA)를 사용하였다. 균주 및 임상 검체는 1.5 ㎖ 튜브에 인스타진 매트릭스 100 ㎕를 가하였다. 그리고, 본 실험에 사용할 균주를 고체 배지(Ogawa 배지)에서 배양한 후 1 백금이를 따서 인스타진 매트릭스가 들어 있는 튜브에 넣어 부유시켰다. 이것을 항온수조의 56℃에서 30 분 동안 반응시킨 후 10초 동안 잘 혼합되도록 섞어 균질화 시키고, 다시 100 ℃에서 8 분 동안 열처리한 후 10초 동안 잘 섞었다. 혼합물을 12,000 rpm에서 3분 동안 원심분리하여 분리된 상층액을 새로운 튜브에 옮겼다. 이를 실시간 PCR 반응의 주형 DNA로 사용하였다.
(2) B형 간염 바이러스로부터 게놈 DNA 분리
B형 간염 환자로부터 채혈한 혈액은 즉시 냉장 보관하여 한 시간 동안 혈액응고 후, 3000 rpm에서 5분간 혈청을 원심분리하였다. 확보된 혈청은 -70℃에서 보관하였으며, 이들의 DNA를 추출하기 위해서는 QIAamp DNA Blood Mini Kit(QIAGEN Inc., CA, USA)를 사용하였다. 키트를 이용하여 혈청에서 최종적으로 200 ㎕의 HBV DNA를 확보하였다. 이를 실시간 PCR 반응의 주형 DNA로 사용하였다.
[실시예 5] 결과분석
(2) 결핵균 유무 및 항생제 내성 검출
상기 실시예 3에서 제조한 생체물질 검출용 소자를 시료가 담긴 튜브 내 장착한 후, Real-time PCR을 진행하였다.
유전자 증폭 과정 동안 튜브에서 발생하는 FAM 형광신호를 카메라가 실시간으로 신호를 획득하여 값을 얻고 이후 혼성화를 진행한 뒤, 뚜껑을 열어 캡에 부착된 유리막대를 세척 한 후 전용 형광탐지기로 프로브와 반응한 Cy3 형광신호를 얻어 DNA 칩 분석을 수행하였다.
그 결과 도 6에 나타내었다.
(2) 약제내성 B형 간염 바이러스 검출
상기 실시예 3에서 제조한 생체물질 검출용 소자를 시료가 담긴 튜브 내 장착한 후, Real-time PCR을 진행하였다.
유전자 증폭 과정 동안 튜브에서 발생하는 FAM 형광신호를 카메라가 실시간으로 신호를 획득하여 값을 얻고 이후 혼성화를 진행한 뒤, 뚜껑을 열어 캡에 부착된 유리막대를 세척 한 후 전용 형광탐지기로 프로브와 반응한 Cy3 형광신호를 얻어 DNA 칩 분석을 수행하였다.
상기 결과들로부터 확인된 바, 본 발명에 따른 바이오 물질의 통합 분석방법은 단일 반응기 내에서 유전자의 증폭이 진행되고, 그 상태에서 후속으로 혼성화가 진행됨으로써 반응을 위해 옮기는 과정 중 발생할 수 있는 외부요인에 의한 오염을 방지할 수 있으며, 시료의 주입, 생체물질의 반응, 결과 탐지 및 결과 분석과 같은 일련의 과정이 자동화되는 장점이 있다.
또한, 본 발명에 따른 바이오 물질의 통합 분석방법은 기존의 상품화된 방법보다 각종 질환의 원인이 되는 인체 유해 미생물들의 검출에 필요한 시간이 훨씬 단축시킬 수 있을 뿐 아니라 비용 면에서도 매우 경제적이며, 정확하고 효율적으로 표적 유전자를 검출할 수 있는 장점이 있다.
서열번호 1 내지 2는 본 발명의 실시예에 따른 결핵균/비결핵균 검출을 위한 프라이머이다.
서열번호 3은 본 발명의 실시예에 따른 결핵균/비결핵균 검출을 위한 real-time PCR 용 프로브이다.
서열번호 4 내지 9는 본 발명의 실시예에 따른 항생제 내성 진단용 프라이머이다.
서열번호 10 내지 35는 본 발명의 실시예에 따른 항생제 내성 진단용 DNA 칩 고정 프로브이다.
서열번호 36 내지 37은 본 발명의 실시예에 따른 B형 간염바이러스 검출을 위한 프라이머이다.
서열번호 38은 본 발명의 실시예에 따른 B형 간염바이러스 검출을 위한 real-time PCR 용 프로브이다.
서열번호 39 내지 46은 본 발명의 실시예에 따른 항생제 내성 진단용 DNA 칩 고정 프로브이다.

Claims (9)

  1. 하나의 단일 반응기 내에서 중합효소 연쇄반응(PCR) 또는 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)을 이용하여 증폭된 반응산물의 정량분석 또는 정성분석과
    표적 유전자의 프로브가 고정화된 바이오 칩(chip)으로부터 상기 반응산물의 정성분석이 동시에 수행되는 것을 특징으로 하는 분석방법으로,
    상기 단일 반응기는 반응기 내부의 하부, 측면부, 또는 반응기 결합부로서 결합부의 하측에 연장 형성되는 로드에 바이오 칩이 형성되어 있는 것을 특징으로 하는, 바이오 물질의 통합 분석방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 표적 유전자의 프로브는 펩타이드, 단백질, 핵산, PNA(Peptide Nucleic Acid), 압타머(Aptamer) 및 항체로부터 선택되는 하나 이상의 물질인 것을 특징으로 하는 분석방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 단일 반응기는
    복수개의 웰을 가지는 플레이트, 시험관, 튜브, 및 반응기 결합부로서 결합부의 하측에 연장 형성되는 로드를 포함하는 생체물질 검출용 소자로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 분석방법.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 복수개의 웰을 가지는 플레이트는 2단 이상의 웰 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 분석방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 복수개의 웰을 가지는 플레이트는 플레이트의 일면에 오목하게 형성되는 복수개의 웰을 포함하여 이루어지며,
    상기 웰은 상부 웰 및 그 하측에 상기 상부 웰보다 직경이 작은 하부 웰을 포함하고,
    상기 하부 웰의 바닥에 바이오 칩이 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 분석방법.
  6. 제 3항에 있어서,
    상기 생체물질 검출용 소자는 반응기 및 반응기의 결합부로서 결합부의 하측에 연장 형성되는 로드를 포함하여 이루어지며,
    상기 로드는 하측에 바이오 칩이 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 분석방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 로드는 상기 반응기의 결합부에 탈착 가능하게 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 분석방법.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 분석방법은 결핵균 또는 B형 간염바이러스의 타겟 핵산을 검출하기 위한 것을 특징으로 하는 분석방법.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 결핵균 또는 B형 간염바이러스의 타겟 핵산은 서열번호 1 내지 46의 염기서열로 이루어지는 하나 이상의 표적 유전자의 프라이머 및 프로브를 이용하여 검출되는 것을 특징으로 하는 분석방법.
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