KR102643238B1 - 2019 신종 코로나 바이러스 및 이의 돌연변이 동시 감별 검출용 프라이머 및 프로브 세트 - Google Patents
2019 신종 코로나 바이러스 및 이의 돌연변이 동시 감별 검출용 프라이머 및 프로브 세트 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102643238B1 KR102643238B1 KR1020210039087A KR20210039087A KR102643238B1 KR 102643238 B1 KR102643238 B1 KR 102643238B1 KR 1020210039087 A KR1020210039087 A KR 1020210039087A KR 20210039087 A KR20210039087 A KR 20210039087A KR 102643238 B1 KR102643238 B1 KR 102643238B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- primer
- probe
- present
- seq
- coronavirus
- Prior art date
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 76
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 title claims abstract description 48
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 32
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 19
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 claims description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 11
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 claims description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 4
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 claims 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 abstract description 34
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 abstract description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 3
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 4
- 101710118046 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VGIRNWJSIRVFRT-UHFFFAOYSA-N 2',7'-difluorofluorescein Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(F)C(=O)C=C2OC2=CC(O)=C(F)C=C21 VGIRNWJSIRVFRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- COCMHKNAGZHBDZ-UHFFFAOYSA-N 4-carboxy-3-[3-(dimethylamino)-6-dimethylazaniumylidenexanthen-9-yl]benzoate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC(C([O-])=O)=CC=C1C(O)=O COCMHKNAGZHBDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 101150016678 RdRp gene Proteins 0.000 description 3
- 101150010882 S gene Proteins 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- QCPFFGGFHNZBEP-UHFFFAOYSA-N 4,5,6,7-tetrachloro-3',6'-dihydroxyspiro[2-benzofuran-3,9'-xanthene]-1-one Chemical compound O1C(=O)C(C(=C(Cl)C(Cl)=C2Cl)Cl)=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 QCPFFGGFHNZBEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IDLISIVVYLGCKO-UHFFFAOYSA-N 6-carboxy-4',5'-dichloro-2',7'-dimethoxyfluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=C(C(O)=O)C=C2C21C1=CC(OC)=C(O)C(Cl)=C1OC1=C2C=C(OC)C(O)=C1Cl IDLISIVVYLGCKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NULAJYZBOLVQPQ-UHFFFAOYSA-N N-(1-naphthyl)ethylenediamine Chemical compound C1=CC=C2C(NCCN)=CC=CC2=C1 NULAJYZBOLVQPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 2
- 208000037847 SARS-CoV-2-infection Diseases 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 2
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 2
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 2
- -1 nucleoside triphosphates Chemical class 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 2
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine thiocyanate Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=C(SC#N)C=C1C(O)=O JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 206010003757 Atypical pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000008904 Betacoronavirus Species 0.000 description 1
- 108700002099 Coronavirus Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010061994 Coronavirus Spike Glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000342334 Human metapneumovirus Species 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 206010035737 Pneumonia viral Diseases 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241001678561 Sarbecovirus Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 238000009832 plasma treatment Methods 0.000 description 1
- 239000012985 polymerization agent Substances 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 238000013102 re-test Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 208000009421 viral pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
- C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
- C12Q2565/10—Detection mode being characterised by the assay principle
- C12Q2565/101—Interaction between at least two labels
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 SARS-CoV-2와 SARS-CoV-2의 spike D614G 돌연변이를 동시에 감별하여 검출할 수 있는 프라이머와 프로브를 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 조성물은 코로나바이러스 감염 여부를 정확하고 신속하게 검출할 수 있으며, spike D614G 돌연변이 코로나바이러스를 감별하여 검출할 수 있는바, 빠른 진단이 필요한 현장에서 임상진단을 위해 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 2019 신종 코로나바이러스(SARS-CoV-2)와 spike D614G 변종 코로나바이러스 감염 환자를 신속하고 정확하게 진단하기 위한 방법으로 인후도말 RNA 샘플로부터 코로나19 바이러스 뉴클레오티드 및/또는 spike D614G 돌연변이 서열을 검출할 수 있는 real-time PCR 프라이머 및 프로브 세트 등에 관한 것이다.
2019 년 12 월, 우한의 도매 시장과 역학적으로 연결된 비정형 폐렴 환자 집단이 발견되었고, 이들 중에서 SARS-CoV-2로 명명된 새로운 베타-코로나 바이러스의 감염이 일부 확인되었다. 이 바이러스는 Sarbecovirus 속의 박쥐 바이러스와 유전적으로 유사하며 2020년 2월 13일 전세계적으로 46997명이 감염환자로 확인되었고, 중국에서는 46550명 감염환자중에서 1368명이 사망한 것으로 보고되었다. 중국 이외에 한국, 일본, 싱가폴, 스페인, 미국, 독일, 베트남, 프랑스 말레이시아 등의 나라에서도 감염이 확인되어 사람간 감염 및 다중 감염이 발생하고 있는 상황이지만 인간 사이에서 이 질병의 스펙트럼은 아직 완전히 결정되지 않았다. SARS-CoV-2의 감염 징후는 비 특이적이며 호흡기 증상, 열, 기침, 호흡 곤란 및 바이러스 성 폐렴 증상을 나타낸다. SARS-CoV-2의 감염 확산을 막고, 환자를 치료하려면 빠른 COVID-19 진단 검사가 절실히 필요하다. 현재 2019 신종 코로나바이러스의 진단은 WHO 분자진단 검사법으로서 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)을 이용하여 SARS-CoV-2를 진단하는 방법이 제공되고 있는 상황이나 실시간 PCR법은 숙련된 검사자 및 고급 실험실 기반을 필요로 하며 검사결과 확인까지 2시간 정도의 시간이 소요되어 현장에서 빠르게 진단까지 어려움이 있다.
SARS-CoV-2는 세계보건기구(WHO)는 유전자 염기서열 차이로 인한 아미노산 변화를 기준으로 코로나 바이러스를 6개 유형으로 분류하고 있다. 먼저 S, L 유형으로 분류되었다가 다시 L, V, G 유형으로 나뉘고 G가 GH와 GR, GV로 나뉘면서 S, L, V, G, GH, GR, GV의 총 7개 유형으로 분류하고 있다. 코로나19 발생 초기에 중국 우한을 비롯한 아시아 지역에는 S와 V 유형이 유행하였고, 이후 대륙별로 서로 다른 유형이 발견되었다. 이 중 GH 유형이 전파력이 높게 나타날 가능성이 있다고 보고된 바 있다. 국내의 경우 코로나바이러스 감염증 환자에서 채취한 유전자를 분류한 결과, 대부분은 유럽과 미국에서 유행한 G형의 변종인 GH형인 것으로 나타났고, 이 유형은 바이러스 전파력이 높은 것으로 알려져 있다. 이 중 바이러스의 세포 내 침입 시 중요한 역할을 하는 스파이크 단백질의 614번 아미노산을 아스파트산 (D)에서 글리신 (G)로 바뀐 G형의 바이러스는 3월 이후 유럽과 미국에서 급격히 증가해 현재는 거의 대부분 지역에서 나타나고 있다. 최근 보고된 바에 따르면 70여개 넘는 코로나바이러스 변이가 발생한 것으로 확인되었고, 전파력이 증가된 변이가 8개 (D614G 등), 중화항체를 회피하는 변이가 10개 (A841V 등), 혈장치료 효과가 낮은 변이 17개 (I472V 등)가 확인되었다.
SARS-CoV-2의 'spike D614G' 돌연변이는 작년 2월초부터 유럽을 시작으로 미국, 캐나다 등 전 세계에서 가장 지배적인 바이러스 형태가 되었다. 최근 영국에서 발생한 돌연변이 또한 D614G 돌연변이에서 파생된 것이다. 이러한 D614G 돌연변이는 전염력이 높다고 알려져 있지만 증상의 중증도의 영향을 미치는지 또는 사망률을 증가시키는지에 대한 여부는 아직 불분명하다. 하지만 유럽이 아시아에 비해 사망률이 상대적으로 높은 이유는 D614G 돌연변이 때문일 가능성들이 시사되어 지고 있다. 또한 최악의 경우, 향후 COVID-19의 치료제나 백신이 D614G 돌연변이에 효과가 제한된다면, 현재 개발된 COVID-19 진단 키트는 무용지물이 될 수 있다. 그렇기 때문에 본 발명은 D614G 돌연변이를 진단할 수 있는 프라이머 및 프로브 세트를 제공하고, 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 검출용 조성물 및 키트를 제공하여 위와 같은 문제가 발생한다면, D614G 돌연변이를 구분함과 동시에 그에 따른 치료제와 백신을 개발하는데 있어 도움이 될 수 있을 것이다. 또한 앞으로 계속 진화하는 바이러스의 아형을 진단하는 키트를 연구 개발하는데 있어 첫 걸음이 될 것이라고 예상된다.
본 발명자들은 SARS-CoV-2 감염과 특히 공격적인 전파력을 갖는 spike D614G 돌연변이 감염을 신속하고 정확하게 감별하여 검출할 수 있는 방법에 대해 예의연구하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 호흡기 질환 원인균을 신속하게 진단할 수 있는 조성물을 제공하는 것으로서, 본 발명은 2019 신종 코로나바이러스(SARS-CoV-2) 검출용 조성물과 spike D614G 변종 코로나바이러스 검출용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 양 바이러스 검출용 조성물을 모두 포함하여 SARS-CoV-2 및 spike D614G 변종 코로나바이러스를 동시에 감별하여 검출할 수 있는 조성물 제공을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 코로나 바이러스 검출용 PCR 키트와 야생형과 돌연변이(D614G) 동시 감별 검출용 PCR 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 2019 신종 코로나바이러스와 변종 코로나바이러스 동시 검출 방법 제공을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 3의 프라이머 및 프로브를 포함하는 2019 신종 코로나바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 4 내지 6의 프라이머 및 프로브를 포함하는 2019 신종 코로나바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 7 내지 9의 프라이머 및 프로브를 포함하는 spike D614G 변종 코로나바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 6의 프라이머 및 프로브를 포함하는 2019 신종 코로나바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 9의 프라이머 및 프로브를 포함하는 2019 신종 코로나 바이러스 및 spike D614G 변종 코로나바이러스 감별 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 각각 2019 신종 코로나 바이러스 및/또는 spike D614G 변종 코로나 바이러스 검출을 위한 PCR 키트로 제공될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 각각 2019 신종 코로나바이러스 및/또는 spike D614G 변종 코로나바이러스 감염 진단을 위한 정보제공방법에 제공될 수 있다.
구체적으로, 코로나바이러스 감염 진단을 위한 정보제공방법은 하기 단계를 포함한다:
(1) 생물학적 시료로부터 RNA를 추출하는 단계; 및
(2) 상기 추출된 RNA를 서열번호 1 내지 3의 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 4 내지 6의 프라이머 및 프로브 세트; 및 서열번호 7 내지 9의 프라이머 및 프로브 세트; 로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 각 조성물에서 서열번호 3, 6, 및 9의 염기서열의올리고뉴클레오티드는 프로브로 기능하며, 각 프로브의 5' 말단은 형광물질로 표지된 것일 수 있으며, 각 프로브의 3'-말단은 소광자(quencher)가 추가로 표지된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 형광물질은 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸 로다민(tetramethyl rhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 서열번호 3, 6, 및 9의 프로브는 서로 상이한 형광물질로 표지된 것일 수 있다.
구체적으로 서열번호 3 및 6의 프로브는 FAM으로 표지된 것일 수 있으며, 서열번호 9의 프로브는 ROX로 표지된 것일 수 있다.
본 발명의 코로나바이러스 감염 진단을 위한 정보제공방법에 있어서, 각 프로브가 형광물질로 표지된 경우 상기 정보제공방법은 (2) 단계 이후에 형광 검출을 통해 PCR 증폭 산물을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 서열번호 3 및 6의 프로브에 표지된 형광이 검출되는 경우 코로나바이러스에 감염된 것으로 판정할 수 있고, 서열번호 9의 프로브에 표지된 형광이 검출되는 경우 spike D614G 변종 코로나바이러스에 감염된 것으로 판정할 수 있다.
한편, 상기 (2) 단계에서 서열번호 1 내지 6의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 PCR을 수행하고, 서열번호 3 및 6의 프로브에 표지된 형광물질이 서로 상이한 경우, 서열번호 3의 프로브 및 서열번호 6의 프로브 중에서 하나의 프로브에 표지된 형광만 검출되는 경우 신속하게 COVID-19 환자로 분류하되 재검을 통해 보다 검사 결과에 신뢰도를 높일 수 있다.
또한, 상기 (2) 단계에서 서열번호 1 내지 9의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 경우 서열번호 3 및 6의 프로브에 표지된 형광만이 검출되는 경우 신종 코로나바이러스에 감염된 것으로 판정할 수 있고, 서열번호 3, 6, 및 9의 프로브에 표지된 형광이 모두 검출되는 경우 spike D614G 변종 코로나바이러스에 감염된 것으로 판정할 수 있다. 한편, 서열번호 9의 프로브에 표지된 형광만 검출되는 경우 재검을 권장한다.
본 발명의 조성물은 종래 PCR 기반의 검출과 달리 2019 신종 및 spike D614G 변종 코로나바이러스를 정확하고 신속하게 검출할 수 있으며, 혈청형에 따른 인플루엔자의 감별하여 검출할 수 있는바, 호흡기 질환 원인균의 빠른 진단이 필요한 현장에서 임상진단을 위해 이용될 수 있다. 또한, 본 발명은 형광프로브를 이용하여 위양성/위음성 결과를 배제할 수 있고, 아울러의 복수 유전자를 타겟으로 하는 프라이머 세트를 제공하여 검사 결과의 신뢰도를 높일 수 있는바 현장에서 기존의 검출법을 대체하는 분자진단검사법으로 즉시 적용가능하다.
도 1은 이중 형광 리포터를 이용하여 SARS-CoV-2 검출뿐만 아닌 'spike D614G' 돌연변이를 진단할 수 있는 원리를 설명해 놓은 것이다. SARS-CoV-2의 RdRp, N gene 타겟 프로브에 라벨링된 FAM 형광만 검출이 될 경우, SARS-CoV-2 감염자이지만 D614G 돌연변이가 존재하지 않은 것이고, FAM 형광과 S gene 타겟 프로브에 라벨링된 ROX 형광이 모두 검출이 될 경우, D614G 돌연변이가 존재하는 SARS-CoV-2 감염자인 것이다. 이러한 원리를 통해서 SARS-CoV-2 검출뿐만이 아니라 D614G 돌연변이 또한 진단할 수 있다.
도 2a는 2019 신종 코로나바이러스 RdRp gene 서열에서 프라이머 및 프로브 세트의 위치를 나타낸 도면이다.
도 2b는 2019 신종 코로나바이러스 N gene 서열에서 프라이머 및 프로브 세트의 위치를 나타낸 도면이다.
도 2c는 변종 코로나바이러스 S gene 서열에서 프라이머 및 프로브 세트의 위치를 나타낸 도면이다.
도 2a 내지 도 2c에서 노란색으로 표시된 부분은 프라이머의 위치이고, 초록색으로 표시한 부분은 프로브의 위치이다.
도 3은 합성 유전자에서 3종 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 증폭 산물 검출 결과이다.
도 4은 합성 유전자에서 3종 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 증폭 산물 검출 결과이다.
도 5a 및 도 5b은 임상샘플에서 3종 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 증폭 산물 검출 결과이다.
도 2a는 2019 신종 코로나바이러스 RdRp gene 서열에서 프라이머 및 프로브 세트의 위치를 나타낸 도면이다.
도 2b는 2019 신종 코로나바이러스 N gene 서열에서 프라이머 및 프로브 세트의 위치를 나타낸 도면이다.
도 2c는 변종 코로나바이러스 S gene 서열에서 프라이머 및 프로브 세트의 위치를 나타낸 도면이다.
도 2a 내지 도 2c에서 노란색으로 표시된 부분은 프라이머의 위치이고, 초록색으로 표시한 부분은 프로브의 위치이다.
도 3은 합성 유전자에서 3종 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 증폭 산물 검출 결과이다.
도 4은 합성 유전자에서 3종 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 증폭 산물 검출 결과이다.
도 5a 및 도 5b은 임상샘플에서 3종 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 증폭 산물 검출 결과이다.
본 발명자들은 현장에서 신속하고 빠른 호흡기 질환의 원인균 동정 방법에 대해 예의 연구하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 Real-time RT PCR 방법을 이용함으로써 종래에 conventional RT-PCR에 비해 인플루엔자 검출 시간을 단축시켰다. 본 발명은 기존의 일반 PCR법으로 발생될 수 있는 결과 분석의 에러와 소요 시간을 줄이고, 1회 실험으로 혈청형에 따른 인플루엔자 바이러스의 감별 검출이 가능하다.
본 발명자들은 2019 신종 코로나바이러스의 전장 염기서열 데이터베이스를 이용하여 상호간 또는 타종 간에 간섭이 없고 타겟 유전자에 민감하게 반응하여 정확한 검사결과를 제공할 수 있는 것으로 예측되는 복수개의 프라이머 및 프로브의 타겟 영역을 설정하고, 가장 효과적인 영역을 확인하여 본 발명을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 2019 신종 코로나바이러스 검출용 조성물은 코로나 바이러스의RdRp gene을 타겟으로 하여, 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 3의 프로브를 포함한다.
또한, 본 발명의 2019 신종 코로나바이러스 검출용 조성물은 코로나 바이러스의 N gene을 타겟으로 하여, 서열번호 4의 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 6의 프로브를 포함한다.
또한, 본 발명의 변종 코로나바이러스 검출용 조성물은 코로나 바이러스이 spike gene을 타겟으로 하여, 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 9의 프로브를 포함한다.
본 발명에서 2019 신종 코로나바이러스(coronavirus disease-19: COVID-19)는 사스 코로나바이러스(SARS-CoV-2)라고도 불리운다.
본 발명에서 변종 코로나바이러스 및 돌연변이체는 2019 신종 코로나바이러스의 spike gene에서 D614G 변이가 발생한 것을 의미하고, 본 명세서에서 D614G 돌연변이가 발생한 코로나바이러스는 그 구분을 위하여 '변종', '돌연변이', 또는 'D614G'로 표시하였다.
한편, 변종 코로나바이러스도 큰 범주안에서 코로나바이러스에 속하므로 본 명세서에서 신종 또는 변종의 언급이 없으면 '코로나바이러스'는 신종 및 변종 코로나바이러스를 포함하는 의미로 사용된다.
한편, 본 발명은 서열번호 1 내지 9의 프라이머 및 프로브를 포함하는 조성물을이용하여 2019 신종 및 변종 코로나바이러스를 동시에 검출할 수 있다.
본 발명에 있어서, 서열번호 3, 6, 및 9의 프로브는 각각 형광 물질로 표지되어 코로나바이러스의 검출에 이용될 수 있으며, 형광의 강도 또는 형광의 파장을 통해 샘플 내에 코로나바이러스의 존재 여부와 변종 코로나 바이러스 인지 여부의 감별이 가능하다. 본 발명의 각 프로브는 바람직하게는 서로 다른 파장을 발하는 형광물질로 표지될 수 있으며, 이 경우 검사 결과의 신뢰도를 향상시키고 변종 코로나바이러스와 2019 신종 코로나바이러스 감별 검출이 보다 용이할 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머 (primer)"란 적절한 완충용액 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.
본 발명의 프라이머는 예를 들면, 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법과 같은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
본 발명에서 “프로브 (probe)”란 염기서열과 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기로 이루어진 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어 특정 핵산 존재여부를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드 프로브, 단쇄 DNA 프로브, 이중쇄 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고 비오틴, FITC, 로다민, DIG 등으로 표지되거나 방사선 동위 원소등으로 표지될 수 있다.
본 발명의 프로브는 바람직하게는 5'-말단에 형광물질로 표지될 수 있으며, 3'-말단은 소광자(quencher)가 접합된 것일 수 있다. 본 발명에서 상기 형광물질은 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸 로다민(tetramethyl rhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 등일 수 있으며, 또한 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1(black hole quencher 1), BHQ2(black hole quencher 2), BHQ3(black hole quencher 3), NFQ(nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ(Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black) 등일 수 있다.
본 발명에서 생물학적 시료는 객담(sputum) 또는 비인두(nasopharyngeal swab) 에서 swab을 통해 검체에서 채취한 시료일 수 있다
본 발명의 조성물은 2019 신종 코로나바이러스 및 변종 코로나바이러스 검출을 위한 PCR에 이용될 수 있으며 상기 PCR에는 멀티플렉스 PCR (multiplex PCR), 실시간 PCR (real-time PCR) 또는 이들의 조합이 포함될 수 있다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
[실시예]
실시예 1. 프라이머 및 프로브 설계
COVID-19 표적 유전자의 특이적인 프라이머 및 프로브 세트의 서열은 표 1과 같이 제작을 하였다(도 2a 내지 도 2c).
| Target | Primers or probes | Sequence(5'->3') | 서열번호 |
| RdRp gene | Forward primer | TGGTCATGTGTGGCGGT | 1 |
| Reverse primer | ACAGCTTGACAAATGTTAAAAACACTATT | 2 | |
| Probe | FAM-AACCTCATCAGGAGATGCCACAAC-BHQ-1 | 3 | |
| N gene | Forward primer | GCCAACAACAACAAGGCCA | 4 |
| Reverse primer | TGTATGCTTTAGTGGCAGTACGT | 5 | |
| Probe | FAM-CTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGG-BHQ-1 | 6 | |
| S gene | Forward primer | AACACCAGGAACAAATACTTCTAACC | 7 |
| Reverse primer | GGAGTAAGTTGATCTGCATGAATAGC | 8 | |
| Probe | ROX-TTCTTTATCAGGGTGTTAACTGC-BHQ-2 | 9 |
실시예 2. PCR 수행
먼저 합성 유전자를 101~105 copies/㎕로 희석하여 검출 한계를 확인하였다. Multiplex PCR을 진행하기 위해 각 표적유전자에 해당하는 프라이머 및 프로브 세트는 모두 혼합한 후에 사용하였다. GENECHECKER® Model UF-300 Real-time PCR System을 이용한 반응 당 10ul의 반응 혼합물로 표 2와 같은 반응 생성물로 2X Rapi:Spec™ Probe Master Mix 5㎕, forward, reverse primers 0.5uM, Probe 0.25uM, template(101~105 copies/㎕) 1㎕, 나머지 부피는 distilled water로 채워주었다. 그 다음 표 3과 같이 real-time PCR condition은 pre-denaturation 95℃에서 30s, denaturation 95℃에서 5s, annealing/extension 60℃에서 30s 45cycle로 진행하였다. 현장 적용 가능성을 확인하기 위해 아산병원에서 제공받은 SARS-CoV-2의 RNA 샘플 (n=16)에 프라이머 및 프로브 세트를 적용하였다. GENECHECKER® Model UF-300 Real-time PCR System을 이용한 반응 당 10ul의 반응 혼합물로 표 4와 같은 반응 생성물로 2X GENECHECKER® one step RT-PCR master mix 5㎕, forward, reverse primers 0.5uM, Probe 0.25uM , template 4㎕, 나머지 부피는 distilled water로 채워주었다. 그 다음 표 5와 같이 real-time RT-PCR condition은 reverse transcription 45℃에서 10min, pre-denaturation 95℃에서 30s, denaturation 95℃에서 5s, annealing/extension 60℃에서 30s 45cycle로 진행하였다. 본 실험은 모두 이미 정확성을 검증받은 실험 장비인 BioRad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System을 사용하여 결과 확인 후 진행하였다.
| Reagent | Final concentration | Volume(ul) |
| Master mix (2x) | 1x | 5 |
| Primer(F/R) | 0.5uM | 1 |
| Probe | 0.25uM | |
| Template | 101~105 copies/㎕ | 1 |
| Distilled water | 3 | |
| 1 reaction | 10㎕ final volume | |
| Step | Cycle | Temperature(℃) | Time(s) |
| Pre-denaturation | 1 | 95 | 30 |
| Denaturation | 1 | 95 | 5 |
| Annealing/extension | 45 | 60 | 30 |
| Reagent | Final concentration | Volume(ul) |
| Master mix (2x) | 1x | 5 |
| Primer(F/R) | 0.5uM | 1 |
| Probe | 0.25uM | |
| Template | 미지의 농도 | 4 |
| Distilled water | 0 | |
| 1 reaction | 10㎕ final volume | |
| Step | Cycle | Temperature(℃) | Time |
| Reverse transcription | 1 | 45 | 10min |
| Pre-denaturation | 1 | 95 | 30sec |
| Denaturation | 1 | 95 | 5sec |
| Annealing/extension | 45 | 60 | 30sec |
실시예 3. 민감도 및 교차반응 테스트
아래의 방법을 이용하여 우선적으로 Spike D614G가 존재하는 것과 존재하지 않는 합성 샘플 (DNA)를 제작하고 각 샘플을 1x105 ~ 1x101 copies/㎕ (10-fold dilution series)의 총 5단계로 희석한 후 sensitivity를 측정하였다.
그 결과, 도 3에서 spike D614G 돌연변이가 존재하지 않은 합성유전자를 이용하였을 때는 FAM 형광만 검출되었고, 도 4에서는 spike D614G 돌연변이가 존재하는 합성유전자를 이용하였을 때는 FAM, ROX 형광이 모두 검출되었다. 각각 프라이머 및 프로브 세트의 검출한계는 1x101 copy number로 높은 민감도를 가지는 것을 알 수 있었다. 또한, spike D614G 돌연변이가 없는 샘플에서는 ROX 형광을 검출할 수 없었는바 야생형과 돌연변이간에 교차반응이 발생하지 않음을 확인할 수 있었다. 또한 매년 주기적으로 발생하는 다른 호흡기 바이러스 9종(HBoV, HRV, RSVB, ADV, HMPV, PIV1, PIV2, PIV3, PIV4)에 대한 교차반응성을 평가하기 위해서 아산병원에서 RNA 샘플을 제공받아 교차반응 실험을 진행하여 양성 반응이 나타나지 않은 것을 확인하였다.
실시예 4. 임상샘플에서 신종 및 변종 코로나바이러스의 검출
2019 신종 코로나바이러스 감염으로 확인된 검체(n=16)로 상기 실시예 1에서 설계한 3종 프라이머 및 프로브 세트를 모두 혼합하여 2019 신종 코로나바이러스 검출 테스트를 진행하였다. 각 샘플은 sputum, nasopharyngeal swab이며, 추출된 RNA 샘플로 아산병원에서 제공받아 사용하였다.
그 결과, 도 5a 및 도 5b에 나타낸 바와 같이, FAM 및 ROX 형광이 모두 검출되었고, 실제로 해당 감염자들의 임상샘플의 시퀀싱을 통해 모두 D614G의 돌연변이가 존재한다는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University ERICA Campus
<120> Primer and probe set for detection and identification of
SARS-CoV-2 and mutant thereof
<130> DHP21-K113
<160> 9
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RdRp gene_primer_F
<400> 1
tggtcatgtg tggcggt 17
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RdRp gene_primer_R
<400> 2
acagcttgac aaatgttaaa aacactatt 29
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RdRp gene_probe
<400> 3
aacctcatca ggagatgcca caac 24
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N gene_primer_F
<400> 4
gccaacaaca acaaggcca 19
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N gene_primer_R
<400> 5
tgtatgcttt agtggcagta cgt 23
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N gene_probe
<400> 6
ctgtcactaa gaaatctgct gctgagg 27
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S gene_primer_F
<400> 7
aacaccagga acaaatactt ctaacc 26
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S gene_primer_R
<400> 8
ggagtaagtt gatctgcatg aatagc 26
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S gene_probe
<400> 9
ttctttatca gggtgttaac tgc 23
Claims (15)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 서열번호 1 내지 9의 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는, 2019 신종 코로나바이러스와 spike D614G 돌연변이 2019 신종 코로나바이러스 감별 검출용 조성물로서,
상기 서열번호 3, 6 및 9의 프로브는 5' 말단에 형광물질로 표지된 것이며,
상기 서열번호 9의 프로브는 서열번호 3 및 6의 프로브와 다른 파장을 발하는 형광물질로 표지된 것을 특징으로 하는, 조성물. - 제11항에 있어서,
상기 프로브의 3'-말단은 소광자(quencher)가 추가로 표지된 것을 특징으로 하는, 2019 신종 코로나바이러스 및 spike D614G 돌연변이 2019 신종 코로나바이러스 감별 검출용 조성물. - 제11항의 조성물을 포함하는 2019 신종 코로나바이러스 및 spike D614G 돌연변이 2019 신종 코로나바이러스 동시 감별 검출용 PCR 키트.
- (1) 생물학적 시료로부터 RNA를 추출하는 단계; 및
(2) 상기 추출된 RNA를 제11항의 조성물을 이용하여 PCR을 수행하는 단계;를 포함하는 2019 신종 코로나바이러스 및 spike D614G 돌연변이 2019 신종 코로나바이러스 감염의 감별 진단을 위한 정보제공방법. - 제14항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 인두 면봉 스와브(throat swabs)인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210039087A KR102643238B1 (ko) | 2021-03-25 | 2021-03-25 | 2019 신종 코로나 바이러스 및 이의 돌연변이 동시 감별 검출용 프라이머 및 프로브 세트 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210039087A KR102643238B1 (ko) | 2021-03-25 | 2021-03-25 | 2019 신종 코로나 바이러스 및 이의 돌연변이 동시 감별 검출용 프라이머 및 프로브 세트 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220133681A KR20220133681A (ko) | 2022-10-05 |
| KR102643238B1 true KR102643238B1 (ko) | 2024-03-05 |
Family
ID=83596799
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210039087A KR102643238B1 (ko) | 2021-03-25 | 2021-03-25 | 2019 신종 코로나 바이러스 및 이의 돌연변이 동시 감별 검출용 프라이머 및 프로브 세트 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102643238B1 (ko) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102109196B1 (ko) | 2020-02-11 | 2020-05-11 | 대한민국 | 2019 신종코로나바이러스 검출용 lamp 조성물 및 이의 용도 |
-
2021
- 2021-03-25 KR KR1020210039087A patent/KR102643238B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Hashemi 등, Infection, Genetics and Evolution, Vol. 86, No. 104625 페이지 1-4 (2020.11.07.)* |
| Park 등, Experimental & Molecular Medicine, Vol. 52, 페이지 963-977 (2020.06.16.)* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20220133681A (ko) | 2022-10-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112063756B (zh) | 多重检测呼吸道病毒核酸的方法及试剂盒 | |
| KR101939336B1 (ko) | 호흡기 바이러스 검출용 조성물 및 이를 포함하는 호흡기 바이러스 검출용 키트 | |
| KR20190002894A (ko) | 다중 실시간 중합효소연쇄 반응을 이용한 모기 매개 바이러스 검출세트 및 검출방법 | |
| KR20220024252A (ko) | 신종 코로나바이러스 검출용 고감도 다중 루프매개등온증폭 프라이머 세트 | |
| WO2022257002A1 (en) | Rt-pcr detection reagent for detecting novel coronavirus, kit and detection method thereof | |
| KR101857684B1 (ko) | 중동호흡기증후군 코로나바이러스를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 검출방법 | |
| KR20230062511A (ko) | 코로나바이러스-19 검출용 조성물 및 이의 검출용 키트 | |
| KR102643238B1 (ko) | 2019 신종 코로나 바이러스 및 이의 돌연변이 동시 감별 검출용 프라이머 및 프로브 세트 | |
| CN111471800A (zh) | 检测新型冠状病毒的试剂盒及其扩增引物组合物 | |
| KR102293563B1 (ko) | 돼지 장염 코로나바이러스 동시 검출용 조성물 및 이의 용도 | |
| KR102278402B1 (ko) | 홍역 바이러스 및 백신주의 검출용 프라이머 및 프로브와 이를 이용한 검출 방법 | |
| KR102252750B1 (ko) | 아프리카돼지열병 바이러스 진단용 프라이머 및 프로브 세트와 이의 용도 | |
| KR102334343B1 (ko) | 결핵균 및 비결핵항산균을 동시에 감별하여 검출할 수 있는 고감도 다중 등온증폭반응용 프라이머 세트 | |
| KR102572368B1 (ko) | 파라인플루엔자 바이러스 1형 및 3형 동시 감별 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도 | |
| KR20210073220A (ko) | 중증열성혈소판감소증후군 및 쯔쯔가무시증 동시 검출용 프라이머 및 프로브 세트 | |
| KR102516022B1 (ko) | 아프리카돼지열병 및 돼지열병 동시감별 실시간유전자 진단법 | |
| KR20220132418A (ko) | 인플루엔자 바이러스 a형 및 b형 동시 감별 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도 | |
| KR20200004267A (ko) | 조류인플루엔자 바이러스 검사용 조성물 및 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 위한 칩 및 이를 이용한 조류인플루엔자 바이러스 검사방법 | |
| KR102461006B1 (ko) | 코로나바이러스 오미크론 변이 검출용 프라이머와 프로브 및 이의 용도 | |
| KR20220102529A (ko) | C형 인플루엔자 바이러스 검출용 프라이머 및 프로브 세트 | |
| KR102332008B1 (ko) | 모기 매개 바이러스 검출용 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 모기 매개 바이러스의 검출 방법 | |
| US20230043710A1 (en) | Methods and kits for the detection of sars-cov-2 | |
| KR20210136779A (ko) | 코로나바이러스-19 검출용 조성물 및 이의 검출용 키트 | |
| KR102395969B1 (ko) | 코로나바이러스의 검출을 위한 루프-매개 등온증폭반응용 프라이머 세트 및 이의 용도 | |
| KR102453357B1 (ko) | 형광 프로브를 이용한 칸디다 알비칸, 칸디다 아우리스, 및 칸디다 글라브라타를 감별하여 검출할 수 있는 동시다중 등온증폭반응 프라이머 세트 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |