KR102293563B1 - 돼지 장염 코로나바이러스 동시 검출용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

돼지 장염 코로나바이러스 동시 검출용 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 돼지에서 확인된 신종 코로나바이러스인 돼지 델타코로나바이러스 뿐만 아니라 돼지 유행성설사바이러스 및 돼지 전염성위장염바이러스를 동시에 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 돼지 장염 코로나바이러스 동시 검출용 조성물에 관한 것으로 상기 조성물을 이용하여 멀티플렉스 RT-PCR 방법을 통해 한번의 PCR 반응으로 상기 3종 바이러스를 동시에 검출 및 감별할 수 있다. 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용할 경우, 높은 민감도 및 특이도로 돼지 장염 코로나바이러스를 검출할 수 있을 뿐 아니라 검출에 소모되는 시간과 비용을 절감하고 검사의 정확성과 용이성을 확보할 수 있으므로 돼지 장염 코로나바이러스 검출 및 감시체계(surveillance)에 유용한 기법으로 활용가능하다.

Description

돼지 장염 코로나바이러스 동시 검출용 조성물 및 이의 용도{Composition for simultaneous detection of swine enteric coronavirus and use thereof}
본 발명은 돼지 장염 코로나바이러스 동시 검출용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 돼지 델타코로나바이러스, 돼지 유행성설사바이러스 및 돼지 전염성위장염바이러스 각각에 대하여 특이적으로 결합하는 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 돼지 장염 코로나바이러스 동시 검출용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 돼지 장염 코로나바이러스 동시 검출용 키트, 상기 조성물을 이용하여 돼지 장염 코로나바이러스를 검출하는 방법에 관한 것이다.
돼지의 코로나바이러스(coronavirus)는 돼지의 주요 바이러스성 전염병의 원인체로서, 돼지 델타코로나바이러스(porcine deltacorona virus: PDCoV), 돼지 유행성설사바이러스(porcine epidemic diarrhea virus: PEDV), 돼지 전염성위장염바이러스(transmissible gastroenteritis virus: TGEV) 등을 말하는 것으로 국내에서도 매년 발생하면서 양돈 산업에 막대한 피해를 입히고 있다.
미국 오하이오주의 양돈장에서 2014년 1월부터 PDCoV가 발생되어 약 20개 주로 전파되었고, 후향적 조사에서 2013년 8월, 아이오와주 및 일리노이스주 시료에서도 PDCoV 유전자가 확인되었으며, 최초 발생 농장은 모돈 및 자돈에 수양성 설사와 30-40%의 치사율을 유발할 만큼 전염성이 매우 강한 병원체로 알려져 있다. 미국에서 발생한 PDCoV는 2012년 홍콩에서 발생된 PDCoV와 전체 유전자의 상동성이 98.9-99.2%로 유사하였고, 한국에서도 2014년 4월 및 6월에 PDCoV가 최초로 검색되었으며, 미국 및 중국 발생 PDCoV와 전체 유전자의 상동성이 98.8-99.8%로 유사하였다.
돼지의 코로나바이러스는 조류 및 박쥐에서 다양한 동물로 감염력을 나타내고, 돌연변이 및 재조합 등의 변이율이 높아 다양한 종, 세포, 경로로 감염 가능하며, 특히 조류 PDCoV가 중국의 Asian leopard cat와 Chinese ferret-badger에 감염(중간 숙주)되어 돼지에 감염된 것으로 추정된다. PDCoV는 PEDV 및 TGEV와 항원성 차이가 크고, 교차 반응성도 미약하며, 일반적으로 치사율과 소장의 위축 병변이 PEDV 보다 약한 것으로 알려져 있으나, 돼지 품종(사육 환경) 및 접종 바이러스 형태(유제액, 세포 계대 바이러스) 등에 따라 PDCoV의 병변, 설사 유무, 체중 감소 차이가 많아 정확한 PDCoV의 병원성 조사가 부족한 실정이다. 국내에서는 PDCoV에 대한 표준화된 진단법이 개발 및 보급되지 않아, 일선 질병진단기관에서는 검사하지 않거나 자체 진단법을 적용하고 있으며, 미국과 같이 전국적인 PDCoV에 대한 모니터링 체계가 구축되어 있지 않아, 국내 PDCoV의 발생현황 자료가 부재한 실정이다.
종래기술로는 PEDV, TGEV，돼지호흡기코로나바이러스(porcine respiratory coronavirus, PRCV) 동시 감별 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 동시감별방법(등록특허공보 제10-0617951호), 돼지 호흡기 질환에 대한 예방약 생산을 위한 약독화 PRCV주(등록특허공보 제10-0173441호), PRCV 감염증의 감별진단과 항체분포 조사(Korean J. Vet. Serv. 32(4):293-298 (2009)) 등이 개시되어 있으나, PDCoV 유래의 돼지 바이러스성 설사병의 진단에 대해서는 전혀 개시하고 있지 않은 실정이다.
또한, PDCoV 등과 같은 돼지의 코로나바이러스에 관한 비특허 문헌으로서, Wang et al.(Emerg. Infect. Dis. 2014, 20:1227-1230; Emerg. Infect. Dis. 2014, 20:1594-1595; Genome Announc. 2014. 2) 등이 개시되어 있으나, 상기 비특허 문헌에 의한 방법은 검출 한계(민감도) 및 특이도 등이 낮아서 돼지 바이러스성 설사병의 진단에 한계를 가지고 있는 문제점이 있다. 따라서 돼지에서 문제가 되는 주요 바이러스성 설사병을 진단하기 위해서는 신규 질병인 PDCoV뿐만 아니라 지속적으로 발생되고 있는 PEDV와 TGEV을 포함하는 3종 바이러스를 동시에 검사할 수 있는 유전자검사법이 필요하다.
본 발명자들은 돼지에서 확인된 신종 코로나바이러스인 돼지 델타코로나바이러스 뿐만 아니라 돼지 유행성설사바이러스 및 돼지 전염성위장염바이러스를 동시에 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브 세트를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 멀티플렉스 RT-PCR 방법을 통해 한번의 PCR 반응으로 상기 3종 바이러스를 높은 민감도와 특이도로 동시에 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브 세트를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 돼지 델타코로나바이러스, 돼지 유행성설사바이러스 및 돼지 전염성위장염바이러스 각각에 특이적으로 결합하는 프라이머 및 프로브를 포함하는 돼지 장염 코로나바이러스 동시 검출용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 돼지 장염 코로나바이러스 동시 검출용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 사용하여 돼지 장염 코로나바이러스를 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 사용하여 돼지 장염 코로나바이러스 감염 여부에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 돼지 장염 코로나바이러스(swine enteric coronavirus: SECoV) 동시 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명자들은 돼지에서 확인된 신종 코로나바이러스인 돼지 델타코로나바이러스 뿐만 아니라 돼지 유행성설사바이러스 및 돼지 전염성위장염바이러스를 동시에 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브 세트를 개발하고자 노력하였고 그 결과, 멀티플렉스 RT-PCR 방법을 통해 한번의 PCR 반응으로 상기 3종 바이러스를 높은 민감도와 특이도로 동시에 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브 세트를 개발하였다.
돼지 델타코로나바이러스는 2012년 중국 홍콩에서 돼지 분변 시료로부터 최초로 발견되었으며, 이후 2014년 미국과 국내에서도 그 존재가 확인되었다. 국내의 경우 돼지 설사병을 유발하는 코로나바이러스 중 돼지 유행성설사바이러스가 지난 20여년 동안 국내 양돈산업에 막대한 피해를 입혀 오고 있으며, 이로 인해 진단, 예방접종, 방역 등 질병 근절 방안에 대해서 꾸준히 연구되고 있는 상태이다. 하지만 신종 출현한 돼지 델타코로나바이러스의 경우 현재까지 국내에서 돼지 설사병을 유발하는 원인체로서 검출은 되고 있지만, 실제 현장에서 자돈 폐사로 이어지는 피해를 경험하지 못하고 있는 실정이기 때문에 실질적인 예방 및 방제 대책이 수립되지 않고 있다.
최근 미국의 경우 농가에서 높은 폐사율을 동반한 돼지 델타코로나바이러스 감염 사례가 보고되었으며, 중국에서도 신생 자돈에서 심각한 설사병에 의한 폐사를 유발한다고 보고된 바 있다. 하지만 국내의 경우에는 미국, 중국과는 달리 전반적으로 낮은 감염률을 보였고, 현장에서 심각한 수준의 임상증상이나 폐사를 동반한 돼지 델타코로나바이러스 사례는 현재까지 확인되고 있지 않다. 이러한 이유로는 야외에서 바이러스의 병원성이 실제로 낮거나 아니면 설사병이 발생했을 경우 정확한 실험실 진단이 제대로 이루어지지 않은 채 돼지 유행성설사바이러스로 오인해서 그에 따른 사후 처리로 인해 질병의 정도가 평가 절하될 수 있다고 추측할 수 있다.
국내 유입이 증가되고 있는 돼지 델타코로나바이러스는 유사한 임상증상(돼지 설사병)을 나타내는 돼지 유행성설사바이러스 및 돼지 전염성위장염바이러스와는 병원성 정도 및 전파능력에 있어 확연한 차이를 나타내기 때문에 이들 3종 바이러스에 대한 정확한 감별 진단이 필요하다.
본 발명의 돼지 장염 코로나바이러스 동시 검출용 조성물은 신종 코로나바이러스인 돼지 델타코로나바이러스 뿐만 아니라 돼지 유행성설사바이러스 및 돼지 전염성위장염바이러스를 동시에 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브 세트를 포함한다.
본 발명의 돼지 장염 코로나바이러스 동시 검출용 조성물은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 1로 표시되는 프라이머; 서열번호 2 로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 3으로 표시되는 프로브;
서열번호 4로 표시되는 프라이머; 서열번호 5로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 6으로 표시되는 프로브; 및
서열번호 7로 표시되는 프라이머; 서열번호 8로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 9로 표시되는 프로브로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 돼지 델타코로나바이러스(porcine deltacorona virus: PDCoV) 검출용 프라이머 및 프로브 세트;
(b) 서열번호 10으로 표시되는 프라이머; 서열번호 11 로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 12로 표시되는 프로브;
서열번호 13으로 표시되는 프라이머; 서열번호 14로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 15로 표시되는 프로브;
서열번호 16으로 표시되는 프라이머; 서열번호 17로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 18로 표시되는 프로브; 및
서열번호 19로 표시되는 프라이머; 서열번호 20으로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 21로 표시되는 프로브로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 돼지 유행성설사바이러스(porcine epidemic diarrhea virus: PEDV) 검출용 프라이머 및 프로브 세트;
(c) 서열번호 22로 표시되는 프라이머; 서열번호 23으로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 24로 표시되는 프로브;
서열번호 25로 표시되는 프라이머; 서열번호 26으로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 27로 표시되는 프로브; 및
서열번호 28로 표시되는 프라이머; 서열번호 29로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 30으로 표시되는 프로브로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 돼지 전염성위장염바이러스(transmissible gastroenteritis virus: TGEV) 검출용 프라이머 및 프로브 세트.
본 발명의 돼지 장염 코로나바이러스 동시 검출용 조성물은 돼지 델타코로나바이러스 검출용 프라이머 및 프로브 세트; 돼지 유행성설사바이러스 검출용 프라이머 및 프로브 세트; 및 돼지 전염성위장염바이러스 검출용 프라이머 및 프로브 세트의 조합을 포함한다.
본 발명에 따르면, 돼지 델타코로나바이러스 검출용 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 1로 표시되는 프라이머; 서열번호 2 로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 3으로 표시되는 프로브로 이루어진 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 4로 표시되는 프라이머; 서열번호 5로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 6으로 표시되는 프로브로 이루어진 프라이머 및 프로브 세트; 및 서열번호 7로 표시되는 프라이머; 서열번호 8로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 9로 표시되는 프로브로 이루어진 프라이머 및 프로브 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 프라이머 및 프로브 세트일 수 있고,
돼지 유행성설사바이러스 검출용 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 10으로 표시되는 프라이머; 서열번호 11 로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 12로 표시되는 프로브로 이루어진 프라이머 및 프로브 세트;
서열번호 13으로 표시되는 프라이머; 서열번호 14로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 15로 표시되는 프로브로 이루어진 프라이머 및 프로브 세트;
서열번호 16으로 표시되는 프라이머; 서열번호 17로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 18로 표시되는 프로브로 이루어진 프라이머 및 프로브 세트; 및
서열번호 19로 표시되는 프라이머; 서열번호 20으로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 21로 표시되는 프로브로 이루어진 프라이머 및 프로브 세트로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 및 프로브 세트일 수 있으며,
돼지 전염성위장염바이러스 검출용 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 22로 표시되는 프라이머; 서열번호 23으로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 24로 표시되는 프로브로 이루어진 프라이머 및 프로브 세트;
서열번호 25로 표시되는 프라이머; 서열번호 26으로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 27로 표시되는 프로브로 이루어진 프라이머 및 프로브 세트; 및
서열번호 28로 표시되는 프라이머; 서열번호 29로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 30으로 표시되는 프로브로 이루어진 프라이머 및 프로브 세트로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 및 프로브 세트일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 돼지 장염 코로나바이러스 동시 검출용 조성물은 다음의 프라이머 및 프로브 세트를 포함할 수 있다:
(a) 서열번호 4로 표시되는 프라이머; 서열번호 5로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 6으로 표시되는 프로브; 및
서열번호 7로 표시되는 프라이머; 서열번호 8로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 9로 표시되는 프로브로 이루어진 돼지 델타코로나바이러스 검출용 프라이머 및 프로브 세트;
(b) 서열번호 13으로 표시되는 프라이머; 서열번호 14로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 15로 표시되는 프로브로 이루어진 돼지 유행성설사바이러스 검출용 프라이머 및 프로브 세트; 및
(c) 서열번호 25로 표시되는 프라이머; 서열번호 26으로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 27로 표시되는 프로브로 이루어진 돼지 전염성위장염바이러스 검출용 프라이머 및 프로브 세트.
본 발명에서 사용되는 용어, "돼지 장염 코로나바이러스(swine enteric coronavirus: SECoV)"는 돼지 유행성설사바이러스(porcine epidemic diarrhea virus: PEDV) 및 돼지 전염성위장염바이러스(transmissible gastroenteritis virus: TGEV)와 신종 돼지 델타코로나바이러스(porcine deltacorona virus: PDCoV)를 의미한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 돼지 장염 코로나바이러스 동시 검출용 조성물을 포함하는 돼지 장염 코로나바이러스 동시 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 돼지 장염 코로나바이러스 동시 검출용 키트는 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 유전자증폭방식을 통해 돼지 장염 코로나바이러스를 검출한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머(primer)"는 주형 (template) 핵산에 상보적으로 결합하여 합성을 위한 시발점으로 기능하는 자유 3'-수산화기 (free 3'-hydroxyl group)를 가지는 짧은 핵산 단편을 의미한다. 프라이머는 적절한 반응 완충 용액 (buffer) 및 온도에서 중합 반응을 위한 효소 [DNA 중합 효소 (DNA polymerase), 역전사 효소 (reverse transcriptase) 등] 및 상이한 4가지 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트 (deoxynucleoside triphosphates; dNTPs)의 존재 하에서 주형에 상보적인 가닥의 합성을 개시할 수 있는데, 프라이머 길이 및 반응 조건 등은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. 프라이머는 필요할 경우 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있으며, 표지의 예로는 효소, 방사선 동위원소, 형광성 분자, 화학 그룹 등이 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프로브(probe)"는 혼성화(hybridization)에 의해 상보적인 목적 핵산 서열의 존재를 검출하는데 사용되어지는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 DNA 또는 RNA 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드 프로브, 단일 가닥 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.
프로브는 해당 염기서열의 5'과 3'말단에 각각 검출에 이용되는 표지자를 포함할 수 있으며, 이러한 표지자로는 형광단(fluorophore)과 소광체(quencher)가 각각 5' 과 3' 말단에 표지될 수 있다. 이에 따라, 프로브에 형광단과 소광체가 서로 결합한 형태로 존재할 때에는 상호 간섭에 의해 발광이 억제되고, PCR 반응 등을 통해 프로브의 분해가 이루어지면 프로브에 표지된 형광단과 소광체 간의 간섭이 사라져 발광을 하게 된다.
상기 5' 말단에 표지될 수 있는 형광단은 당업계에서 통상적으로 사용되는 형광 물질이 제한 없이 사용될 수 있는데, 예를 들면 플루오레세인(Fluorescein), 6-카르복시플루오레세인(6-Carboxyfluorescein; FAM), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(Hexachloro-6-carboxyfluorescein; HEX), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(Tetrachloro-6-carboxyfluorescein), VIC, JOE, 5-(2'-아미노에틸)아미노 나프탈렌-1-술폰산(5-(2'-Aminoethyl)amino naphthalene-1-sulfonic acid), 쿠마린(Coumarin) 및 이의 유도체, 시아닌-5(Cyanine-5; Cy5), 텍사스 레드(Texas Red), 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine), 칼 플루오르 레드 610(CAL Fluor Red 610), 엘씨 레드 610 (LC Red 610) 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 프로브의 5'-말단은 Texas-Red, FAM 및 Cy5로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광물질(fluorophore)로 표지된다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명에서 서열번호 3, 서열번호 6 및 서열번호 9로 표시되는 프로브의 5'-말단은 Texas-Red로 표지되고, 서열번호 12, 서열번호 15, 서열번호 18 및 서열번호 21로 표시되는 프로브의 5'-말단은 FAM으로 표지되며, 서열번호 24, 서열번호 27 및 서열번호 30으로 표시되는 프로브의 5' 말단은 Cy5로 표지된다.
상기 3' 말단에 표지될 수 있는 소광체 또한 당업계에서 통상적으로 사용되는 소광제가 제한 없이 사용될 수 있는데, 예를 들면 테트라메틸로다민, 6-카르복시테트라메틸로다민(6-Carboxytetramethylrhodamine), BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, 4-다이메틸아미노페닐아조페닐-4'-말레이미드(4-Dimethylaminophenylazophenyl-4'-maleimide) 등이 사용될 수 있다. 이처럼 형광 물질이 표지된 프로브를 사용하여 실시간(RT-)PCR을 수행하면, 증폭된 산물을 실시간으로 모니터링할 수 있고, DNA 및 RNA의 정량이 가능하며, 전기영동이 필요 없어 빠르고 간편하게 정확한 진단이 가능하다는 장점을 갖는다.
상기 프라이머 및 프로브는 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입하는 것이 가능하다. 즉, 본 발명에서 목적으로 하는 돼지 장염 코로나바이러스를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당업계에 공지된 통상적인 수단을 이용하여 프라이머 및 프로브가 변형될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "혼성화(hybridization)"는 상보적인 단일 가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 완전히 일치하거나 일부 미스매치로 실질적으로 일치하는 2개의 핵산 가닥 사이에서 일어날 수 있다. 혼성화를 위한 상보성은 혼성화 조건, 특히 온도에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 키트는 상기 프라이머 및 프로브를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction: PCR) 방식을 통해 돼지 델타코로나바이러스, 돼지 유행성설사바이러스 및 돼지 전염성위장염바이러스를 동시에 검출한다.
상기 실시간 PCR은 PCR 증폭 산물의 증가를 실시간으로 모니터링하여 분석하는 기술이다(Levak KJ, et al., PCR Methods Appl., 4(6): 357-62(1995)). PCR 생산물의 증가가 타겟 템플레이트의 초기 양과 비례하는 지수기(exponential phase) 동안 각 사이클에서 형광 방출량을 기록하여 PCR 반응을 모니터링 할 수 있다. 핵산 타겟의 출발 카피 수가 높을수록, 형광 증가가 더 빨리 관찰되고 더 낮은 Ct 값(cycle threshold)을 가지게 된다. 3-15 사이클 사이에서 측정된 기준값보다 높은 형광의 뚜렷한 증가는 축적된 PCR 생산물의 검출을 의미한다.
종래의 PCR 방법에 비해, 실시간 PCR은 다음과 같은 장점을 가진다: (a) 종래의 PCR은 정체 상태(plateau)에서 측정되는 반면에, 실시간 PCR은 지수성장기(exponential growth phase) 동안 데이터를 얻을 수 있다; (b) 리포터 형광 시그널의 증가는 발생된 앰플리콘(amplicons)의 수와 직접적으로 비례한다; (c) 분해된 프로브는 앰플리콘의 영구적인 기록 증폭(record amplification)을 제공한다; (d) 검출 범위의 증가; (e) 종래 PCR 방법에 비해 1,000배 이상 적은 핵산을 필요로 한다; (f) 전기영동을 통한 분리 없이 증폭된 DNA의 검출이 가능하다; (g) 작은 앰플리콘 크기를 이용하여 증가된 증폭 효율을 획득할 수 있다; 및 (h) 오염 위험성이 적다.
PCR 증폭 산물량은 형광으로 검출 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 시그널이 상승하다가 정체 상태에 도달한다. 초기 DNA량이 많을수록 증폭 산물량이 검출 가능한 양에 달하는 사이클 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서, 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 실시간 PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭 곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 역치(threshold)를 설정하면 역치와 증폭 곡선이 교차하는 지점 Ct 값이 산출된다.
Ct(cycle threshold) 값은 반응에서 발생된 형광이 역치(threshold)를 넘어서는 사이클 수를 의미하며, 이는 초기 카피 수의 대수에 반비례한다. 그러므로, 특정 웰에 할당된 Ct 값은 반응에서 앰플리콘의 충분한 수가 축적된 사이클의 수를 반영한다. Ct 값은 △Rn의 증가가 처음으로 검출된 사이클이다. Rn은 각 시점에서 PCR 동안 발생된 형광 시그널의 크기를 의미하며, △Rn은 레퍼런스 다이의 형광 방출 강도로 나뉘어진 리포터 다이의 형광방출 강도(표준화된 리포터 시그널)를 의미한다. Ct 값은 LightCycler에서는 Cp(crossing point)로도 명명된다. Ct 값은 시스템이 로그-선형 단계(log-linear phase)에서 PCR 생산물의 지수성장과 관련된 형광 시그널의 증가를 검출하기 시작하는 시점을 나타낸다. 이 시기는 반응에 대한 가장 유용한 정보를 제공한다. 로그-선형단계의 기울기는 증폭 효율(amplification efficiency, Eff)을 나타낸다.
실시간 PCR에서는 PCR 증폭 산물을 형광을 통해 검출한다. 검출 방법은 크게 interchelating 방법(SYBR 그린 I 방법), 형광 표지 프로브를 이용하는 방법(TaqMan 프로브 방법) 등이 있다. interchelating 방법은 이중 가닥 DNA를 모두 검출하기 때문에 유전자별 프로브를 준비할 필요가 없어 저렴한 비용으로 반응계를 구축할 수 있다. 형광 표지 프로브를 이용하는 방법은 고비용이 드는 반면에 검출 특이성이 높아 유사 서열까지도 구별해서 검출할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 형광 표지 프로브를 이용하는 방법을 이용한다.
상기 실시간 중합효소연쇄반응은 바람직하게는 "멀티플렉스 실시간 PCR(Multiplex real time polymerase chain reaction)"을 의미하며, 더욱 바람직하게는 "멀티플렉스 정량적 실시간 PCR(Multiplex quantitative real time polymerase chain reaction)"을 의미한다.
본 발명의 돼지 장염 코로나바이러스 동시 검출용 키트는 돼지 델타코로나바이러스, 돼지 유행성설사바이러스 및 돼지 전염성위장염바이러스의 감염 여부를 경제적이며, 빠르고 간편하게 수행하기 위한 멀티플렉스 정량적 실시간 PCR 키트로서, 상기 조성물에 포함되는 돼지 델타코로나바이러스 검출용 프라이머 및 프로브 세트, 돼지 유행성설사바이러스 검출용 프라이머 및 프로브 세트 및 돼지 전염성위장염바이러스 검출용 프라이머 및 프로브 세트 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다.
구체적인 일례로서, 본 발명의 키트는 역전사 반응 및 PCR 분석을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. 상기 진단 키트는 각 검출 부위에 대한 특이적인 각각의 프라이머 및 프로브 세트 외에도 돼지 장염 코로나바이러스 RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사 효소, cDNA의 특정 영역을 대량으로 증폭하기 위한 DNA 중합 효소, 반응 완충 용액, dNTPs, RNA 분해 효소 억제제 (RNase inhibitor), 멸균수, 테스트 튜브 또는 다른 적절한 용기 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 각 테스트 튜브에 포함되는 성분들로는, 이에 국한되지 않지만, 돼지 장염 코로나바이러스 동시 검사를 위한 다중 올리고 혼합 조성물, DNA 중합 효소, 역전사 효소, RNA 분해 효소 억제제, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, Tris-HCl, MgCl2, KCl, BSA, 핵산 분해 효소 제거수(nuclease-free water) 등이 있으며, 특정 반응을 위해 사용되는 성분 또는 반응물의 최적량은 당업자에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 본 발명의 조성물을 사용하여 멀티플렉스 실시간 PCR을 수행함으로써 시료 내 돼지 장염 코로나바이러스를 동시에 검출하는 방법을 제공한다.
구체적으로 본 발명의 돼지 장염 코로나바이러스를 동시에 검출하는 방법은 (a) 검체에서 RNA를 분리하는 단계; 및 (b) 상기 분리된 RNA를 대상으로 상기 조성물을 이용하여 멀티플렉스 정량적 실시간 PCR을 수행하여 표적 서열을 특이적으로 증폭하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 검체는 돼지로부터 분리된 혈액, 혈청, 혈장, 분변, 조직 등을 포함하고, 보다 구체적으로는 분변 및 장조직이며, 가장 구체적으로는 장조직이다.
본 발명에 따르면, 당업계에서의 공지의 방법에 따라 검체에서 RNA를 추출한 다음, 추출된 RNA를 함유한 추출액에 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트들로 이루어진 조성물을 이용하여 단일 튜브에서 멀티플렉스 정량적 실시간 PCR을 실시한다. 증폭 및 검출의 결과는 실시간으로 확인되는데, 예를 들어 서열번호 3, 서열번호 6 또는 서열번호 9의 프로브에 표지된 형광 물질의 발광이 확인되면, 이는 검체 내에 돼지 델타코로나바이러스가 존재함을 의미하고, 서열번호 12, 서열번호 15, 서열번호 18 또는 서열번호 21의 프로브에 표지된 형광 물질의 발광이 확인되면, 이는 검체 내에 돼지 유행성설사바이러스가 존재함을 의미하며, 마찬가지 방식으로 서열번호 24, 서열번호 27 또는 서열번호 30의 프로브에 표지된 형광 물질의 발광이 확인되면, 이는 검체 내에 돼지 전염성위장염바이러스가 존재함을 의미한다. 즉, 검체 내의 돼지 장염 코로나바이러스 검출 여부와 함께 돼지 델타코로나바이러스, 돼지 유행성설사바이러스 또는 돼지 전염성위장염바이러스에 대한 감별이 가능하다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 본 발명의 조성물을 사용하여 멀티플렉스 RT-PCR을 수행함으로써 돼지 장염 코로나바이러스 감염 여부에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 (i) 내지 (iii) 중 선택되는 1종 이상의 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 돼지 델타코로나바이러스(porcine deltacorona virus: PDCoV) 검출용 조성물을 제공한다:
(i) 서열번호 1로 표시되는 프라이머, 서열번호 2 로 표시되는 프라이머, 및 서열번호 3으로 표시되는 프로브로 이루어진 프라이머 및 프로브 세트;
(ii) 서열번호 4로 표시되는 프라이머, 서열번호 5로 표시되는 프라이머, 및 서열번호 6으로 표시되는 프로브로 이루어진 프라이머 및 프로브 세트; 및
(iii) 서열번호 7로 표시되는 프라이머, 서열번호 8로 표시되는 프라이머, 및 서열번호 9로 표시되는 프로브로 이루어진 프라이머 및 프로브 세트.
본 발명은 돼지에서 확인된 신종 코로나바이러스인 돼지 델타코로나바이러스 뿐만 아니라 돼지 유행성설사바이러스 및 돼지 전염성위장염바이러스를 동시에 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 돼지 장염 코로나바이러스 동시 검출용 조성물에 관한 것으로 상기 조성물을 이용하여 멀티플렉스 RT-PCR 방법을 통해 한번의 PCR 반응으로 상기 3종 바이러스를 동시에 검출 및 감별할 수 있다. 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용할 경우, 높은 민감도 및 특이도로 돼지 장염 코로나바이러스를 검출할 수 있을 뿐 아니라 검출에 소모되는 시간과 비용을 절감하고 검사의 정확성과 용이성을 확보할 수 있으므로 돼지 장염 코로나바이러스 검출 및 감시체계(surveillance)에 유용한 기법으로 활용가능하다.
도 1a는 표 1에 표시된 PDCoV P2 및 P3 프라이머/프로브 세트, PEDV P2 프라이머/프로브 세트 및 TGEV P2 프라이머/프로브 세트를 이용하여 PDCoV에 대한 qRT-PCR의 검출 한계를 조사한 결과이다.
도 1b는 표 1에 표시된 PDCoV P2 및 P3 프라이머/프로브 세트, PEDV P2 프라이머/프로브 세트 및 TGEV P2 프라이머/프로브 세트를 이용하여 PEDV에 대한 qRT-PCR의 검출 한계를 조사한 결과이다.
도 1c는 표 1에 표시된 PDCoV P2 및 P3 프라이머/프로브 세트, PEDV P2 프라이머/프로브 세트 및 TGEV P2 프라이머/프로브 세트를 이용하여 TGEV에 대한 qRT-PCR의 검출 한계를 조사한 결과이다.
도 2는 표 1에 표시된 PDCoV P2 및 P3 프라이머/프로브 세트, PEDV P2 프라이머/프로브 세트 및 TGEV P2 프라이머/프로브 세트를 이용한 qRT-PCR 반응 결과를 나타낸 도면이다.
도 3a-3b는 표 5 및 표 6에 기재된 프라이머/프로브 세트를 이용한 qRT-PCR 반응 결과를 나타낸 도면이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명할 것이다.
실시예 1: PDCoV 단일 및 SECoV (swine enteric coronavirus ) 동시 감별 실시간 RT- PCR 조건 설정
PDCoV 단일 실시간 RT-PCR과 PDCoV, PEDV 및 TGEV를 동시에 감별할 수 있는 다중 실시간 RT-PCR을 개발하기 위하여, 하기 표 1과 같이 각 바이러스별로 3-4종의 프라이머 및 프로브 세트를 제작하였다.
바이러스 프라이머 & 프로브 서열 유전자 리포터
PDCoV P1 PDCoV_S1 　CAGTACCATCAAAAGATGCTGAAATC (서열 1) ORF1 Texas
-Red
PDCoV_AS1 　ACCATAGAATTTGGTTGTTCCAATC (서열 2)
PDCoV_P1 　TTCACTTGCACGCAATCAGACCATCG (서열 3)
P2 PDCoV_S2 　ATCTGCGCACTGATACCTGTAGTT (서열 4) S
PDCoV_AS2 　TCATCTCACAAGCACCAGATTCA (서열 5)
PDCoV_P2 　CCTGTCAGCAGTAAACAATGGCATGTCATT (서열 6)
P3 PDCoV_S3 　ATCGACCACATGGCTCCAA (서열 7) M
PDCoV_AS3 　CAGCTCTTGCCCATGTAGCTT (서열 8)
PDCoV_P3 　CACACCAGTCGTTAAGCATGGCAAGCT (서열 9)
PEDV P1 PEDV_S1 　ACGTCCCTTTACTTTCAATTCACA (서열 10) S FAM
PEDV_AS1 　TATACTTGGTACACACATCCAGAGTCA (서열 11)
PEDV_P1 　TGAGTTGATTACTGGCACGCCTAAACCAC (서열 12)
P2 PEDV_S2 　GAATTCCCAAGGGCGAAAAT (서열 13) N
PEDV_AS2 　TTTTCGACAAATTCCGCATCT (서열 14)
PEDV_P2 　CGTAGCAGCTTGCTTCGGACCCA (서열 15)
P3 PEDV_S3 　TTTGTCAA(T/C)AGCATTC(G/A)GTTGT (서열 16) M
PEDV_AS3 CAGA(A/C)GTAGTGAGAAGCGCGT (서열 17)
PEDV_P3 　GCGCAGGACACATTCTTGGTGGTCT (서열 18)
P4 PEDV_S4 　CGCAAAGACTGAACCCACTAATTT (서열 19) N
PEDV_AS4 　TTGCCTCTGTTGTTACTTGGAGAT (서열 20)
PEDV_P4 　TGTTGCCATTGCCACGACTCCTGC (서열 21)
TGEV P1 TGEV_S1 　TGGGGAGATGAATCCACCAAAAC (서열 22) N Cy5
TGEV_AS1 　AGGGTTATGGGGTTGAAGAATGAA (서열 23)
TGEV_P1 　CGTGGTCGCTCCAATTCCCGTGGT (서열 24)
P2 TGEV_S2 　TAATGTAAGGCAACCCGATGTCT (서열 25) N
TGEV_AS2 　AGCATTGCCAAATCAAATCTAAACT (서열 26)
TGEV_P2 　CATCGCGCTGTCTACTCTTGTACAGAATGG (서열 27)
P3 TGEV_S3 　GCAGGTAAAGGTGATGTGACAA (서열 28) N
TGEV_AS3 　ACATTCAGCCAGTTGTGGGTAA (서열 29)
TGEV_P3 　TGGCACTGCTGGGATTGGCAACGA (서열 30)
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, PDCoV는 ORF1, spike 및 membrane 단백질을 코딩하는 유전자 각각에 대하여 3종의 프라이머 및 프로브를 설계하였고, PEDV는 spike, nucleocapsid, membrane 단백질을 코딩하는 유전자에 대한 4종의 프라이머 및 프로브를 설계하였으며, TGEV는 nucleocapsid 단백질을 코딩하는 유전자에 대한 3종의 프라이머 및 프로브를 설계하였다. PDCoV, PEDV 및 TGEV의 동시 감별을 위하여 리포터는 Texas-Red, FAM 및 Cy5 순으로 프로브에 결합시켰다.
증폭 반응 조건은 55℃에서 역전사(reverse transcription) 반응을 30분간 수행한 후, 95℃에서 30초간 변성(denaturation) 반응을 실시하였으며, 이후 95℃에서 15초, 60℃에서 30초(annealing 및 extension) 로 45회 반복 증폭하였다. RT-PCR이 종료된 반응액 5 μl를 이용하여 nested PCR용 프라이머로 95℃ 5분간 변성 반응 후, 95℃에서 15초, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분으로 30회 이차 반복 증폭하였다.
기존에 많이 알려지지 않은 PDCoV의 단일 실시간 RT-PCR의 성능을 향상시키기 위해 기존에 판매되고 있는 RT-PCR용 master mix 3종(master mix A: Qiagen QuuantiTect Probe RT-PCR kit, master mix B: Bioneer AccuPower Hotstart RT-qPCR kit, master mix C: Toyobo Probe One-step qRT-PCR kit)과 PDCoV 프라이머 및 프로브 1-3 세트를 혼합하여 PDCoV의 검출 감도를 조사하였다. 그 결과, 하기 표 2에서 보는 바와 같이, Master mix C를 이용할 경우 가장 검출 감도가 우수함을 알 수 있다.
Figure 112020010714661-pat00001
또한, SECoV 동시 감별 qRT-PCR의 검출 감도를 향상시키기 위하여, PDCoV의 프라이머 및 프로브를 1-3 세트 혼합하여 시험한 결과를 하기 표 3에 나타냈다.
- RNA dilution single
(PDCoV)
 Multiplex
(PDCoV)
 Multiplex
(PDCoV/PEDV/TGEV)
 Multiplex
(PEDV/TGEV)
P1 P2 P3 P1+P2 P1+P3 P2+P3 P1+P2+P3 P1+P2 P1+P3 P2+P3 P1+P2+P3 -
PDCoV 10-5 28.39 30.11 29.99 28.51 28.55 29.51 28.92 30.33 30.54 30.99 30.31 -
10-6 31.68 33.56 33.49 32.26 31.94 33.25 32.99 33.72 33.03 34.49 33.42 -
10-7 34.91 37.67 37.51 35.05 36.00 35.95 36.02 34.98 ND 36.25 36.24 -
10-8 36.75 ND ND 38.35 37.84 38.90 39.42 ND ND 40.01 42.47 -
PEDV 10-2 - - - - - - - 30.63 30.71 30.29 30.30 30.06
10-3 - - - - - - - 33.42 34.94 33.35 33.92 33.42
10-4 - - - - - - - 39.44 37.66 38.17 39.68 37.38
10-5 - - - - - - - ND ND ND ND ND
TGEV 10-3 - - - - - - - 35.58 38.07 34.67 36.08 34.43
10-4 - - - - - - - ND ND 38.17 47.64 37.96
10-5 - - - - - - - ND ND ND ND ND
10-6 - - - - - - - ND ND ND ND ND
상세하게는 Single(PDCoV)에서는 PDCoV 프라이머 및 프로브 세트 하나, Multiplex(PDCoV/PEDV/TGEV)에서는 PDCoV 프라이머 및 프로브 세트 P2 내지 P3에서 선택되는 조합; PEDV 프라이머 및 프로브 세트 P2; 및 TGEV 프라이머 및 프로브 세트 P2의 조합을 이용하여 qRT-PCR의 검출 감도를 측정하였다.
실험 결과, 상기 표 3에서 보는 바와 같이 PDCoV 프라이머 및 프로브 세트 P2 및 P3와 PEDV 프라이머 및 프로브 세트 P2 및 TGEV 프라이머 및 프로브 세트 P2를 함께 혼합할 경우, 검출 감도가 가장 우수함을 알 수 있다.
실시예 2: SECoV 동시 감별 qRT - PCR의 검출 한계
2-1. 검출 한계(정밀도) 테스트
상기 실시예 2에서 최종 확립된 SECoV(PDCoV, PEDV, TGEV) 동시 감별 프라이머 및 프로브 세트의 qRT-PCR 검출 한계(정밀도)를 조사하기 위하여, 각 병원체 DNA의 복제수를 10배 단위로 단계적으로 감소시킨 후(104 copies/Rx ~ 101 copies/Rx), 검출 한계(정밀도)를 테스트하였다.
표 4 및 도 1a-도 1c에서 보는 바와 같이, PDCoV, PEDV, TGEV 모두 10 copy까지 검출이 가능하였으며, 3종의 병원체 모두 102 copies/Rx의 낮은 복제수에서도 Ct 값이 35 이하로서 양성을 나타내어 우수한 민감도를 가짐을 알 수 있다.
바이러스 Copies/Rx Ct value
PDCoV 104 25.66
103 28.10
102 31.73
10 35.91
PEDV 104 28.08
103 31.73
102 35.35
10 39.01　
TGEV 104 26.93
103 29.33
102 33.12
10 37.16　
2-2. 기존에 알려진 프라이머 / 프로브 세트와의 qRT - PCR 검출 감도 비교
상기 실시예 2에서 최종 확립된 SECoV(PDCoV, PEDV, TGEV) 동시 감별 프라이머 및 프로브 세트와 기존에 알려진 PEDV 및 PDCoV 검출용 프라이머 및 프로브(표 5, J. Zhang et al./Journal of Virological Methods 234 (2016) 34-42 참조)에 대한 qRT-PCR 검출 감도를 비교하였다. PCR 반응의 조건은 Zhang et al.에 따라 수행하였다.
어세이 프라이머&프로브 서열(5'-3') 서열번호
PDCoV RT-iiPCR PDCoV iiF GAGAGTAGACTCCTTGCAGGGATTAT 31
PDCoV iiR GCTTGCCATGCTTAACGACTG 32
PDCoV iiP FAM-AATGCACCTCCATGTACC-MGB 33
dilution　 Auto(480)
PDCoV IPC *
10-1 16.36 16.29
10-2 19.42 19.7
10-3 23.07 23.15
10-4 25.08 26.35
10-5 26.06 29.76
10-6 29.66 30.92
10-7 30.67 32.56
10 -8 32.48 33.42
10-9 - -
(-) - -
*IPC: internal positive control
dilution PDCoV
10-1 19.23
10-2 22.72
10-3 25.76
10-4 29.39
10-5 32.52
10-6 36.11
10 -7 38.22
10-8 -
10-9 -
(-) -
실험 결과, 본 발명의 SECoV(PDCoV, PEDV, TGEV) 동시 감별 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 경우(표 6), J. Zhang et al.에 기재된 프라이머 및 프로브 세트(표 7)와 비교하여 PDCoV에 대한 qRT-PCR에서 동등 이상의 민감도를 나타내었으며, 더 낮은 Ct 값에서 PDCoV를 검출할 수 있음을 확인하였다.
실시예 3: 수집 시료에 대한 PDCoV 검사 및 유병율 조사(능동적 검색)
양돈 수의사가 의뢰한 PDCoV 의심 농장 시료에 대하여 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 적용한 결과, 총 61농가(294두) 중 16농가(24두)에서 PDCoV가 검출되었다. 폐사체의 장조직 시료(19.7%)가 분변시료(4.1%)보다 양성률이 높았다.
농장별 개체별 시료별
검사
농장수		 양성
농장수(%)		 검사
두수		 양성
두수(%)		 시료 검사
시료수		 양성
시료수(%)
61 16(26.2) 294 24(8.2) 장조직 76 15(19.7)
분변 218 9(4.1)
PDCoV 양성으로 판정된 시료는 대부분 포유자돈(21두) 시료였으며, 낮은 역가의 PDCoV가 검출되었고, 양성농장에서 의뢰된 개체(80두)중 일부 개체(24두)에서만 PDCoV가 검출되었으며, 타 설사병 병원체 혼·복합 감염에서는 상재균인 Clostridium perfringens A가 가장 많이 검출되었고, Clostridium difficile , PEDV, E.coli 가 일부 확인되었다.
번호 의뢰일 지역 연령 검사
시료		 검사
두수		 양성두수 검사 결과
PDCoV PEDV TGEV RotaV CpA* E.coli Cd*
R14-0 ‘16.3. 경남 이자* 장 3 2 + + - - - - -
+ + - - - - -
R14-1 ‘16.3. 경북 포자* 장 2 2 + - - - + - -
+ - - - + - -
R14-2 ‘16.3. 충북 포자 장 2 2 + - - - + - -
+ - - - + - -
R14-9 ‘16.6. 제주 포자 장 3 1 + - - - + - -
R14-11 ‘16.6. 경북 포자 분변 10 1 + - - - - - +
R14-14 ‘16.7. 제주 포자 장 4 1 + - - - - - -
R14-18 ‘16.7. 경북 포자 분변 10 1 + - - - + - +
R14-22 ‘16.8. 경기 포자
이자		 장
분변		 8 3 + - - - - - -
+ - - - - - -
+ - - - - - -
R14-23 ‘16.8. 경북 포자 분변 7 1 + - - - - - -
R14-24 ‘16.9. 제주 포자 장 2 2 + - - - - - -
+ - - - - - +
R14-29 ‘16.11. 경북 포자 분변 20 1 + - - - - - -
R14-30 ‘16.11. 경북 포자 장 1 1 + - - - - + -
R14-38 ‘17.2. 경기 포자 장 2 2 + - - - + - -
+ - - - + - -
R14-39 ‘17.2. 경기 포자 분변 2 2 + - - - - - -
+ - - - - - -
R14-41 ‘17.2. 경기 포자 장 2 1 + - - - - + -
R14-45 ‘17.5. 전남 포자 장 2 1 + - - - - - -
16건합계 - - - - 80 24 24 2 0 0 8 2 3
실시예 4: 수집 시료에 대한 PDCoV 검사 및 유병율 조사(수동적 검색)
본 발명의 PDCoV 프라이머/프로브 셋트를 이용하여 검역본부 병성감정 및 돼지소모성질환 지도지원사업 관련 시료에 대한 PDCoV 양성률을 조사한 결과, 설사 증상이 있는 돼지에서는 8.0%, 설사 증상이 없는 돼지에서는 1.2%의 양성률을 보였다.
설사증상 유무 검사 농장수 검사 두수 양성 농장수(%) 양성 두수(%)
유 120 225 12(10.0) 18(8.0)
무 195 494 6(3.1) 6(1.2)
<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Composition for simultaneous detection of swine enteric coronavirus and use thereof <130> PN190359 <160> 33 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCoV_S1 <400> 1 cagtaccatc aaaagatgct gaaatc 26 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCoV_AS1 <400> 2 accatagaat ttggttgttc caatc 25 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCoV_P1 <400> 3 ttcacttgca cgcaatcaga ccatcg 26 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCoV_S2 <400> 4 atctgcgcac tgatacctgt agtt 24 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCoV_AS2 <400> 5 tcatctcaca agcaccagat tca 23 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCoV_P2 <400> 6 cctgtcagca gtaaacaatg gcatgtcatt 30 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCoV_S3 <400> 7 atcgaccaca tggctccaa 19 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCoV_AS3 <400> 8 cagctcttgc ccatgtagct t 21 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCoV_P3 <400> 9 cacaccagtc gttaagcatg gcaagct 27 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEDV_S1 <400> 10 acgtcccttt actttcaatt caca 24 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEDV_AS1 <400> 11 tatacttggt acacacatcc agagtca 27 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEDV_P1 <400> 12 tgagttgatt actggcacgc ctaaaccac 29 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEDV_S2 <400> 13 gaattcccaa gggcgaaaat 20 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEDV_AS2 <400> 14 ttttcgacaa attccgcatc t 21 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEDV_P2 <400> 15 cgtagcagct tgcttcggac cca 23 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEDV_S3 <220> <221> variation <222> (17) <223> G OR A <220> <221> variation <222> (9) <223> T OR C <400> 16 tttgtcaata gcattcggtt gt 22 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEDV_AS3 <220> <221> variation <222> (5) <223> A OR C <400> 17 cagaagtagt gagaagcgcg t 21 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEDV_P3 <400> 18 gcgcaggaca cattcttggt ggtct 25 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEDV_S4 <400> 19 cgcaaagact gaacccacta attt 24 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEDV_AS4 <400> 20 ttgcctctgt tgttacttgg agat 24 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEDV_P4 <400> 21 tgttgccatt gccacgactc ctgc 24 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGEV_S1 <400> 22 tggggagatg aatccaccaa aac 23 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGEV_AS1 <400> 23 agggttatgg ggttgaagaa tgaa 24 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGEV_P1 <400> 24 cgtggtcgct ccaattcccg tggt 24 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGEV_S2 <400> 25 taatgtaagg caacccgatg tct 23 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGEV_AS2 <400> 26 agcattgcca aatcaaatct aaact 25 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGEV_P2 <400> 27 catcgcgctg tctactcttg tacagaatgg 30 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGEV_S3 <400> 28 gcaggtaaag gtgatgtgac aa 22 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGEV_AS3 <400> 29 acattcagcc agttgtgggt aa 22 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGEV_P3 <400> 30 tggcactgct gggattggca acga 24 <210> 31 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCoV iiF <400> 31 gagagtagac tccttgcagg gattat 26 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCoV iiB <400> 32 gcttgccatg cttaacgact g 21 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCoV iiP <400> 33 aatgcacctc catgtacc 18

Claims (8)

  1. 다음을 포함하는 돼지 장염 코로나바이러스(swine enteric coronavirus: SECoV) 동시 검출용 조성물:
    (a) 서열번호 4로 표시되는 프라이머; 서열번호 5로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 6으로 표시되는 프로브; 및
    서열번호 7로 표시되는 프라이머; 서열번호 8로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 9로 표시되는 프로브를 포함하는 돼지 델타코로나바이러스(porcine deltacorona virus: PDCoV) 검출용 프라이머 및 프로브 세트;
    (b) 서열번호 10으로 표시되는 프라이머; 서열번호 11 로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 12으로 표시되는 프로브;
    서열번호 13으로 표시되는 프라이머; 서열번호 14로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 15로 표시되는 프로브;
    서열번호 16으로 표시되는 프라이머; 서열번호 17로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 18로 표시되는 프로브; 및
    서열번호 19로 표시되는 프라이머; 서열번호 20으로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 21로 표시되는 프로브로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 돼지 유행성설사바이러스(porcine epidemic diarrhea virus: PEDV) 검출용 프라이머 및 프로브 세트; 및
    (c) 서열번호 22로 표시되는 프라이머; 서열번호 23으로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 24로 표시되는 프로브;
    서열번호 25로 표시되는 프라이머; 서열번호 26으로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 27로 표시되는 프로브; 및
    서열번호 28로 표시되는 프라이머; 서열번호 29로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 30으로 표시되는 프로브로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 돼지 전염성위장염바이러스(transmissible gastroenteritis virus: TGEV) 검출용 프라이머 및 프로브 세트.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 다음을 포함하는 것인, 돼지 장염 코로나바이러스 동시 검출용 조성물:
    (a) 서열번호 4로 표시되는 프라이머; 서열번호 5로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 6으로 표시되는 프로브; 및
    서열번호 7로 표시되는 프라이머; 서열번호 8로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 9로 표시되는 프로브로 이루어진 돼지 델타코로나바이러스 검출용 프라이머 및 프로브 세트;
    (b) 서열번호 13으로 표시되는 프라이머; 서열번호 14로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 15로 표시되는 프로브로 이루어진 돼지 유행성설사바이러스 검출용 프라이머 및 프로브 세트; 및
    (c) 서열번호 25로 표시되는 프라이머; 서열번호 26으로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 27로 표시되는 프로브로 이루어진 돼지 전염성위장염바이러스 검출용 프라이머 및 프로브 세트.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 돼지 장염 코로나바이러스는 돼지 델타코로나바이러스(porcine deltacorona virus: PDCoV); 돼지 유행성설사바이러스(porcine epidemic diarrhea virus: PEDV); 및 돼지 전염성위장염바이러스(transmissible gastroenteritis virus: TGEV)로부터 선택되는 것인, 돼지 장염 코로나바이러스 동시 검출용 조성물.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 돼지 장염 코로나바이러스 동시 검출용 키트.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 키트는 돼지 델타코로나바이러스; 돼지 유행성설사바이러스; 및 돼지 전염성위장염바이러스를 단일 튜브 내에서 동시 검출하는 것인, 키트.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 조성물을 사용하여 멀티플렉스 RT-PCR을 수행함으로써 돼지 장염 코로나바이러스를 검출하는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 조성물을 사용하여 멀티플렉스 RT-PCR을 수행하여 돼지 장염 코로나바이러스 감염 여부에 대한 정보를 제공하는 방법.
  8. 하기의 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 돼지 델타코로나바이러스(porcine deltacorona virus: PDCoV) 검출용 조성물:
    (i) 서열번호 4로 표시되는 프라이머, 서열번호 5로 표시되는 프라이머, 및 서열번호 6으로 표시되는 프로브로 이루어진 프라이머 및 프로브 세트; 및
    (ii) 서열번호 7로 표시되는 프라이머, 서열번호 8로 표시되는 프라이머, 및 서열번호 9로 표시되는 프로브로 이루어진 프라이머 및 프로브 세트.
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