WO2021066464A2 - 핵산 검출 시스템 - Google Patents

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엄숭호
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김정훈
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Definitions

  • the present invention relates to detection and amplification by converting a target nucleic acid into a unified universal code.
  • a method of detecting a specific nucleic acid (DNA or RNA) or protein is a fundamentally important technology in the field of scientific research. By being able to detect and identify specific nucleic acids or proteins, researchers can determine which genetic and biological markers are indicative of a person's health status. By using such a method of detecting nucleic acids and proteins, it is possible to detect modifications of pathogen genes present in a sample or expression of specific genes.
  • Such molecular diagnosis is used to diagnose the root of diseases such as DNA or RNA, and is used in various fields such as infectious diseases, cancer diagnosis, genetic diseases and customized diagnosis.
  • As a representative molecular diagnostic technology there is a PCR technology that amplifies DNA within a short time (Saiki, R., et. al.
  • Cepheid's GeneXprt system and reagents which are PCR products with a field diagnosis concept, have been developed and sold, but it is difficult to use them in general tests because equipment and reagents are very expensive (Helb, D., et. al., Rapid Detection). of Mycobacterium tuberculosis and Rifampin Resistance by Use of On-Demand, Near-Patient Technology. J. Clin. Microbiol. 48, 229-237, 2010).
  • there is a Nucleic Acid Lateral Flow Assay which is confirmed using membranes instead of gel electrophoresis after PCR (Aveyard, J., et. al., One step visual detection of PCR products).
  • nucleic acid lateral flow (NALF) device with gold nanoparticles and a nucleic acid lateral flow (NALF) device.Chem. Commun., 41, 4251-4253, 2007).
  • NALF nucleic acid lateral flow
  • the sequence of the probe attached to the membrane is generally used due to the limitation of the technology that must be used to specifically bind according to the PCR amplification product. There are limitations to use.
  • the tumor tissue may be directly collected and tested through biopsy, but in this case, only a portion of the suspected cancer tissue is examined, so the overall pattern and type of cancer cannot be grasped. .
  • the use of needles or surgical therapies to collect tumors can also give patients a great sense of rejection, and there are cases in which tissue biopsy itself is not possible depending on the patient's condition.
  • the existing methods used to confirm cancer are expensive and inconvenient to patients, so they are not suitable for periodic and frequent examinations.
  • attempts are being made to diagnose cancer by detecting biomarkers in the patient's blood, urine, and saliva through a liquid biopsy.
  • sncRNAs short non-coding RNAs
  • miRNAs RNA and DNA interacting with each other
  • studies on the correlation between sncRNA profiling and genetic mutations of genes are being conducted, but there has been a problem in designing each probe according to various short sequences that are noted in sequencing analysis.
  • human diseases are much more often caused by problems with multiple genes than by an abnormality in one gene, diagnosis accuracy and usefulness can be improved if multiple genes can be identified in a single test.
  • an object of the present invention is to provide a nucleic acid detection signal amplification system.
  • an object of the present invention is to provide a biosensor for detecting nucleic acids.
  • the present invention provides a nucleic acid detection system including a first nucleic acid S1, a second nucleic acid O, a third nucleic acid F1, a fourth nucleic acid S2, a fifth nucleic acid U, and a sixth nucleic acid F2.
  • the present invention provides a nucleic acid detection signal amplification system comprising a first nucleic acid S1, a second nucleic acid O, a third nucleic acid F1, a fourth nucleic acid S2, a fifth nucleic acid U, and a sixth nucleic acid F2.
  • the present invention provides a universal code conversion system comprising a first nucleic acid S1, a second nucleic acid O, a third nucleic acid F1, a fourth nucleic acid S2, a fifth nucleic acid U, and a sixth nucleic acid F2.
  • the present invention provides a method of detecting a nucleic acid or amplifying a detection signal through a threshold-mediated strand displacement reaction.
  • the present invention provides a nucleic acid detection biosensor comprising a hybrid product of the third nucleic acid F1 and the sixth nucleic acid F2, S10 and S2U.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a sequence conversion process through a threshold-mediated strand displacement reaction of the system of the present invention:
  • Substrate 1 first nucleic acid S1;
  • T target nucleic acid
  • Fuel 1 third nucleic acid F1;
  • Substrate 2 fourth nucleic acid S2; And
  • Fuel 2 sixth nucleic acid F2.
  • thermodynamic energy of core constituent materials in each step of constructing the system of the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram confirming the sequence optimization of nucleic acids constituting the system of the present invention by electrophoresis.
  • 7 is a diagram confirming the amplification and detection results of the system of the present invention according to the presence or absence of 12 miRNAs through fluorescence kinetics analysis.
  • 7A is a diagram illustrating fluorescence detection results for 12 types of miRNAs with a universal code for a specific target miRNA (miR-21).
  • Figure 7b is a diagram showing the conversion of each target miRNA to a universal code using the system of the present invention, and confirming the fluorescence detection results for each target miRNA.
  • FIG. 8 is a diagram showing the electrophoresis result of the reaction progress of the cycle 1 part in the system of the present invention for 12 kinds of miRNAs.
  • FIG. 9 is a diagram showing the electrophoresis results for the reaction progress of the cycle 2 part in the system of the present invention for 12 miRNAs.
  • FIG. 10 shows the application of the nucleic acid detection system of the present invention to a graphene biosensor.
  • the left side shows the outline of the experiment of Example 5, and the right side shows the measured fluorescence values.
  • FIG. 11 is a schematic diagram showing the sequence complementarity of the first nucleic acid S1, the second nucleic acid O, the third nucleic acid F1, the fourth nucleic acid S2, the fifth nucleic acid U, and the sixth nucleic acid F2 constituting the system of the present invention:
  • nucleic acids are written in a 5' ⁇ 3' orientation from left to right.
  • Numerical ranges recited within the specification include the numbers defining the range, and include each integer or any non-integer fraction within the defined range.
  • the present invention comprises 1) a nucleic acid sequence A1, a nucleic acid sequence A2, a first threshold sequence A3, a nucleic acid sequence A4, and a second threshold sequence A5 in sequence, wherein the nucleic acid sequence A4 and the first threshold sequence A5 Is a complementary sequence capable of binding to all or part of the target nucleic acid as a whole, and the nucleic acid sequence A1 and the nucleic acid sequence A2 are complementary to each other to form a hairpin structure, the first nucleic acid S1 (Substrat 1); 2) a second nucleic acid O (Output) sequentially comprising a sequence complementary to the nucleic acid sequence A4 and a sequence complementary to the first threshold sequence A3; 3) a third nucleic acid F1 (Fuel 1) which sequentially comprises a sequence complementary to a part of nucleic acid sequence A4, a sequence complementary to a first threshold sequence A3, and a sequence complementary to all or part of the sequence of nucleic acid sequence A2;
  • a fourth nucleic acid S2 (Substrate 2) which is a complementary sequence capable of binding to all or part of the sequence of, and the nucleic acid sequence B1 and the nucleic acid sequence B2 complementarily bind to each other to form a hairpin structure; 5) a fifth nucleic acid U (Universal code) sequentially comprising a sequence complementary to the nucleic acid sequence B4 and a sequence complementary to the third threshold sequence B3; And 6) a sequence complementary to a part of the nucleic acid sequence B4, a sequence complementary to a third threshold sequence A3, and a sequence complementary to all or part of the nucleic acid sequence B2. It relates to a nucleic acid detection system comprising.
  • the system of the present invention changes the fourth threshold sequence B5 of S1, F1, O and S2 according to the sequence of T (target nucleic acid), such as the sequence complementarity of each nucleic acid sequence shown in FIG. , U and F2 sequences can be fixed as constructed by a technician and used without alteration, so that the sequence of the target nucleic acid can be unified with the U sequence, without changing the sequence of a nucleic acid detection construct with a complex structure (e.g., fluorescent nanonucleic acid structure). It has the advantage of being able to detect a variety of target nucleic acids.
  • T target nucleic acid
  • U and F2 sequences can be fixed as constructed by a technician and used without alteration, so that the sequence of the target nucleic acid can be unified with the U sequence, without changing the sequence of a nucleic acid detection construct with a complex structure (e.g., fluorescent nanonucleic acid structure). It has the advantage of being able to detect a variety of target nucleic acids.
  • the present invention comprises 1) a nucleic acid sequence A1, a nucleic acid sequence A2, a first threshold sequence A3, a nucleic acid sequence A4, and a second threshold sequence A5 in sequence, wherein the nucleic acid sequence A4 and the first threshold sequence A5 Is a complementary sequence capable of binding to all or part of the target nucleic acid as a whole, and the nucleic acid sequence A1 and the nucleic acid sequence A2 are complementarily bound to each other to form a hairpin structure; 2) a second nucleic acid O sequentially comprising a sequence complementary to the nucleic acid sequence A4 and a sequence complementary to the first threshold sequence A3; 3) a third nucleic acid F1 sequentially comprising a sequence complementary to a part of nucleic acid sequence A4, a sequence complementary to a first threshold sequence A3, and a sequence complementary to all or part of the nucleic acid sequence A2; 4) A nucleic acid sequence B1, a nucleic acid sequence B2, a third threshold sequence
  • a fourth nucleic acid S2 that is a complementary sequence capable of binding to all or part of the sequence of, and the nucleic acid sequence B1 and the nucleic acid sequence B2 are complementary to each other to form a hairpin structure; 5) a fifth nucleic acid U sequentially comprising a sequence complementary to the nucleic acid sequence B4 and a sequence complementary to the third threshold sequence B3; And 6) a sequence complementary to a part of nucleic acid sequence B4, a sequence complementary to a third threshold sequence A3, and a sixth nucleic acid F2 sequentially comprising a sequence complementary to all or part of the sequence of nucleic acid sequence B2. It relates to a detection signal amplification system.
  • the nucleic acid detection system of the present invention can detect by amplifying a detection signal of a target nucleic acid.
  • the target nucleic acid (T) is complementarily bound to S1O through a Toehold mediated strand displacement reaction (S1T), and then S1 and S1 through a toehold mediated strand displacement reaction with the third nucleic acid F1. Since the target sequence is released and reused as F1 binds complementarily, its signal is primarily amplified, and the second nucleic acid O released by binding of the target nucleic acid and S1 is complementarily bound to S2U through a threshold-mediated strand displacement reaction. After (S2O), the second nucleic acid O is released and reused by complementary binding of S2 and F2 through a threshold-mediated strand displacement reaction with the sixth nucleic acid F2, so that its signal is secondarily amplified.
  • S1T Toehold mediated strand displacement reaction
  • F1T Toehold mediated strand displacement reaction
  • F1T Toehold mediated strand displacement reaction
  • F1T Toehold mediated strand displacement reaction
  • F1T Toehold
  • the present invention comprises 1) a nucleic acid sequence A1, a nucleic acid sequence A2, a first threshold sequence A3, a nucleic acid sequence A4, and a second threshold sequence A5 in sequence, wherein the nucleic acid sequence A4 and the first threshold sequence A5 Is a complementary sequence capable of binding to all or part of the target nucleic acid as a whole, and the nucleic acid sequence A1 and the nucleic acid sequence A2 are complementarily bound to each other to form a hairpin structure; 2) a second nucleic acid O sequentially comprising a sequence complementary to the nucleic acid sequence A4 and a sequence complementary to the first threshold sequence A3; 3) a third nucleic acid F1 sequentially comprising a sequence complementary to a part of nucleic acid sequence A4, a sequence complementary to a first threshold sequence A3, and a sequence complementary to all or part of the nucleic acid sequence A2; 4) A nucleic acid sequence B1, a nucleic acid sequence B2, a third threshold sequence
  • a fourth nucleic acid S2 that is a complementary sequence capable of binding to all or part of the sequence of, and the nucleic acid sequence B1 and the nucleic acid sequence B2 are complementary to each other to form a hairpin structure; 5) a fifth nucleic acid U sequentially comprising a sequence complementary to the nucleic acid sequence B4 and a sequence complementary to the third threshold sequence B3; And 6) a sequence complementary to a part of nucleic acid sequence B4, a sequence complementary to a third threshold sequence A3, and a sixth nucleic acid F2 sequentially comprising a sequence complementary to all or part of the sequence of nucleic acid sequence B2. It relates to a unified system.
  • the target sequence may be converted to a second nucleic acid O in the first cycle and a fifth nucleic acid U (ie, a universal code having a predetermined sequence) in the second cycle (see FIG. 1 ).
  • a fifth nucleic acid U ie, a universal code having a predetermined sequence
  • the present invention converts various base sequences depending on the target into a universal code (U) having a unified sequence completely independent of the target sequence (T), and uses a detection system for the universal code to provide various base sequences. There is an advantage of being able to detect.
  • the present invention comprises 1) a nucleic acid sequence A1, a nucleic acid sequence A2, a first threshold sequence A3, a nucleic acid sequence A4, and a second threshold sequence A5 in sequence, wherein the nucleic acid sequence A4 and the first threshold sequence A5 Is a complementary sequence capable of binding to all or part of the target nucleic acid as a whole, and the nucleic acid sequence A1 and the nucleic acid sequence A2 are complementarily bound to each other to form a hairpin structure; 2) a second nucleic acid O sequentially comprising a sequence complementary to the nucleic acid sequence A4 and a sequence complementary to the first threshold sequence A3; 3) a third nucleic acid F1 sequentially comprising a sequence complementary to a part of nucleic acid sequence A4, a sequence complementary to a first threshold sequence A3, and a sequence complementary to all or part of the nucleic acid sequence A2; 4) A nucleic acid sequence B1, a nucleic acid sequence B2, a third threshold sequence
  • a fourth nucleic acid S2 that is a complementary sequence capable of binding to all or part of the sequence of, and the nucleic acid sequence B1 and the nucleic acid sequence B2 are complementary to each other to form a hairpin structure; 5) a fifth nucleic acid U sequentially comprising a sequence complementary to the nucleic acid sequence B4 and a sequence complementary to the third threshold sequence B3; And 6) a sequence complementary to a part of nucleic acid sequence B4, a sequence complementary to a third threshold sequence A3, and a sixth nucleic acid F2 sequentially comprising a sequence complementary to all or part of the sequence of nucleic acid sequence B2. It relates to a composition for detection.
  • the target nucleic acid may be a biomarker such as a short miRNA in vivo, a gene biomarker in a liquid biopsy, or a short non-coding RNA (sncRNA) such as miRNA.
  • a biomarker such as a short miRNA in vivo, a gene biomarker in a liquid biopsy, or a short non-coding RNA (sncRNA) such as miRNA.
  • the second nucleic acid O and the first nucleic acid S1 are complementarily bound to form a double strand (S10), and the fifth nucleic acid U and the fourth nucleic acid S2 are complementarily bound to the double stranded (S2U) May be forming.
  • the second threshold sequence A5 in S10 and the fourth threshold sequence B5 in S2U may be exposed as a single strand.
  • the second threshold sequence A5 or the fourth threshold sequence B5 may comprise 4 to 8 nucleotides.
  • the third nucleic acid F1 or the sixth nucleic acid F2 may have a hairpin structure.
  • the stem portion of the third nucleic acid F1 or the sixth nucleic acid F2 (the double bond portion of the hairpin structure may include 6 to 12 nucleotides.
  • the first threshold sequence B3 or the third threshold sequence B3 may comprise 4 to 12 nucleotides.
  • the first nucleic acid S1 may further include a quencher.
  • the quenching material is Dabcyl, TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, Blackberry Quencher, Black Hole Quencher, Qxl, Iowa black FQ, Iowa Black RQ , It may be one or more selected from the group IRDye QC-1.
  • the second nucleic acid O and the fifth nucleic acid U may contain a fluorescent material.
  • the fluorescent material is fluorescein, fluorescein chlorotriazinyl, rhodamine green, rhodamine red, tetramethylrhodamine, FITC, Oregon green, Alexa Fluor, FAM, JOE, ROX, HEX, Texas Red, TET, TRITC, TAMRA, Cyanine series dyes and siadicarbocyanin (thiadicarbocyanine) may be one or more selected from the group consisting of.
  • a signal for the presence of a target nucleic acid may be amplified as the fifth nucleic acid U released through a threshold-mediated strand displacement reaction characterized by ineffectiveness and self-assembly.
  • it may further include a composition for detecting the fifth nucleic acid U.
  • a fluorescent nucleic acid nanostructure including a single-stranded probe including a nucleic acid complementary to the fifth nucleic acid U and a fluorescent material, and graphene oxide may be further included.
  • the composition for detection of the fifth nucleic acid U comprises a nucleic acid sequence complementary to the fifth nucleic acid U, a primer pair that specifically recognizes the nucleic acid sequence and a fragment of the complementary sequence, or a probe, or a primer pair, and It may include a probe.
  • detection of the fifth nucleic acid U is polymerase chain reaction, real-time RT-PCR, reverse transcription polymerase chain reaction, competitive polymerase chain reaction (Competitive RT-PCR), and Nuclease protection.
  • Analysis RNase, S1 nuclease assay
  • in situ hybridization nucleic acid microarray, Northern blot
  • a fluorescent nucleic acid nanostructure including a probe and a fluorescent nucleic acid nanostructure for nucleic acid detection including graphene oxide-graphene oxide complex.
  • the fluorescent nucleic acid nanostructure for nucleic acid detection-graphene oxide complex may detect fluorescence through a fluorescence resonance energy transfer phenomenon.
  • fluorescent nanonucleic acid structure includes a single-stranded probe comprising a nucleic acid complementary to a target nucleic acid and a fluorescent material, a structure consisting of the probes, or the probes bound to the target nucleic acid.
  • fluorescent nucleic acid nanostructure/graphene oxide complex or “graphene fluorescent nucleic acid nanostructure” refers to a structure or complex in which the fluorescent nucleic acid nanostructure is attached on graphene oxide.
  • the term "probe” refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA corresponding to a few bases or hundreds of bases that can achieve specific binding to mRNA, and is labeled to confirm the presence or absence of a specific nucleic acid.
  • the probe may be manufactured in the form of an oligonucleotide probe, a single stranded DNA (DNA) probe, a double stranded DNA (double stranded DNA) probe, or an RNA probe, but in the present invention, it means a single-stranded nucleic acid.
  • the fluorescent nucleic acid nanostructure for nucleic acid detection-graphene oxide complex comprises: a first single-stranded probe comprising a nucleic acid and a fluorescent material complementary to the universal code A converted and released with respect to the target a; A second single-stranded probe containing a nucleic acid and a fluorescent substance complementary to the universal code B released by being converted to the target b; A third single-stranded probe comprising a nucleic acid and a fluorescent material complementary to the universal code C converted and released with respect to the target c; And a fourth single-stranded probe comprising a sequence complementary to the first single-stranded probe, a sequence complementary to the second single-stranded probe, and a sequence complementary to the third single-stranded probe.
  • the fluorescent materials included in the single-stranded probes may be fluorescent materials of different wavelength bands.
  • the fluorescent nucleic acid nanostructure for nucleic acid detection-graphene oxide complex fluorescent nucleic acid nanostructure is any one of the first single-stranded probe, the second single-stranded probe, and the third single-stranded probe attached to graphene oxide, It may have an inverse hexahedral structure on graphene oxide.
  • the fluorescent nucleic acid nanostructure for nucleic acid detection-graphene oxide complex fluorescent nucleic acid nanostructure is the first single-stranded probe, the second single-stranded probe, and the third single-stranded probe of the fluorescent nucleic acid nanostructure are attached to graphene oxide.
  • the fluorescent nucleic acid nanostructure may have a triangular columnar structure on graphene oxide.
  • the fluorescent nucleic acid nanostructure for nucleic acid detection-graphene oxide complex fluorescent nucleic acid nanostructure is a graphene oxide in which the first single-stranded probe, the second single-stranded probe, and the third single-stranded probe are attached to graphene oxide. It may have a triangular columnar structure on the top.
  • graphene oxide is a fluorescence-limiting chemical (Universal Quencher: UQ) and can selectively block fluorescence due to fluorescence resonance energy transfer, and the target nucleic acid and the single-stranded probe of the present invention are When combined to form a double bond, the probe (or fluorescent nanonucleic acid structure) is farther away from the graphene oxide, so that light emission of the fluorescent material can be detected.
  • UQ Universal Quencher
  • graphene oxide blocks fluorescence when the distance between the graphene oxide and the fluorescent substance of the fluorescent nanonucleic acid structure is close according to the unique property of being more easily attached to the single-stranded nucleotide sequence and the fluorescence resonance energy transfer than the double-stranded nucleotide sequence.
  • the distance increases, using the property that fluorescence can be detected again, when multiple target base sequences are combined with a sequence complementary to each of the probes to form a double bond in the probes containing a fluorescent substance, the graphene oxide is released from the graphene oxide.
  • the target nucleic acid when the target nucleic acid binds complementarily with the second threshold sequence A5 of the first nucleic acid S1, the second nucleic acid O is released through a branch migration reaction, and the third threshold sequence A3 is exposed.
  • the first threshold sequence A3 of the first nucleic acid S1 bound to the target nucleic acid and the third nucleic acid F1 are bound to release the target nucleic acid through a branch point transfer reaction;
  • the released second nucleic acid O binds complementarily with the fourth threshold sequence B5 of the fourth nucleic acid S2 to release the fifth nucleic acid U through a branch point transfer reaction;
  • the third threshold sequence B3 of the fourth nucleic acid S2 bound to the second nucleic acid O and the sixth nucleic acid F2 are bound to release the second nucleic acid O through a branch point transfer reaction.
  • the target nucleic acid released in the above is re-reacted with the second threshold sequence A5 of the second nucleic acid O and the first nucleic acid S1 (S10) forming a double strand by complementary binding, and released from the above.
  • the resulting second nucleic acid O may be re-reacted with the fourth threshold sequence B5 of the fourth nucleic acid S2 and the fifth nucleic acid U (S2U) forming a double strand by complementary binding.
  • the present invention comprises 1) a nucleic acid sequence A1, a nucleic acid sequence A2, a first threshold sequence A3, a nucleic acid sequence A4, and a second threshold sequence A5 in sequence, wherein the nucleic acid sequence A4 and the first threshold sequence A5 Is a complementary sequence capable of binding to all or part of the target nucleic acid as a whole, and the nucleic acid sequence A1 and the nucleic acid sequence A2 are complementarily bound to each other to form a hairpin structure; 2) a second nucleic acid O sequentially comprising a sequence complementary to the nucleic acid sequence A4 and a sequence complementary to the first threshold sequence A3; 3) a third nucleic acid F1 sequentially comprising a sequence complementary to a part of nucleic acid sequence A4, a sequence complementary to a first threshold sequence A3, and a sequence complementary to all or part of the nucleic acid sequence A2; 4) A nucleic acid sequence B1, a nucleic acid sequence B2, a third threshold sequence
  • a fourth nucleic acid S2 that is a complementary sequence capable of binding to all or part of the sequence of, and the nucleic acid sequence B1 and the nucleic acid sequence B2 are complementary to each other to form a hairpin structure; 5) a fifth nucleic acid U sequentially comprising a sequence complementary to the nucleic acid sequence B4 and a sequence complementary to the third threshold sequence B3; And 6) a sixth nucleic acid F2 sequentially comprising a sequence complementary to a part of the nucleic acid sequence B4, a sequence complementary to a third threshold sequence A3, and a sequence complementary to all or part of the nucleic acid sequence B2. It relates to a kit for detecting nucleic acids.
  • the present invention comprises 1) a nucleic acid sequence A1, a nucleic acid sequence A2, a first threshold sequence A3, a nucleic acid sequence A4, and a second threshold sequence A5 in sequence, wherein the nucleic acid sequence A4 and the first threshold sequence A5 Is a complementary sequence capable of binding to all or part of the target nucleic acid as a whole, and the nucleic acid sequence A1 and the nucleic acid sequence A2 are complementarily bound to each other to form a hairpin structure; 2) a second nucleic acid O sequentially comprising a sequence complementary to the nucleic acid sequence A4 and a sequence complementary to the first threshold sequence A3; 3) a third nucleic acid F1 sequentially comprising a sequence complementary to a part of nucleic acid sequence A4, a sequence complementary to a first threshold sequence A3, and a sequence complementary to all or part of the nucleic acid sequence A2; 4) A nucleic acid sequence B1, a nucleic acid sequence B2, a third threshold sequence
  • a fourth nucleic acid S2 that is a complementary sequence capable of binding to all or part of the sequence of, and the nucleic acid sequence B1 and the nucleic acid sequence B2 are complementary to each other to form a hairpin structure; 5) a fifth nucleic acid U sequentially comprising a sequence complementary to the nucleic acid sequence B4 and a sequence complementary to the third threshold sequence B3; And 6) a sequence complementary to a part of nucleic acid sequence B4, a sequence complementary to a third threshold sequence A3, and a sixth nucleic acid F2 sequentially comprising a sequence complementary to all or part of the sequence of nucleic acid sequence B2. It relates to a composition or kit for amplifying a detection signal.
  • the present invention comprises 1) a nucleic acid sequence A1, a nucleic acid sequence A2, a first threshold sequence A3, a nucleic acid sequence A4, and a second threshold sequence A5 in sequence, wherein the nucleic acid sequence A4 and the first threshold sequence A5 Is a complementary sequence capable of binding to all or part of the target nucleic acid as a whole, and the nucleic acid sequence A1 and the nucleic acid sequence A2 are complementarily bound to each other to form a hairpin structure; 2) a second nucleic acid O sequentially comprising a sequence complementary to the nucleic acid sequence A4 and a sequence complementary to the first threshold sequence A3; 3) a third nucleic acid F1 sequentially comprising a sequence complementary to a part of nucleic acid sequence A4, a sequence complementary to a first threshold sequence A3, and a sequence complementary to all or part of the nucleic acid sequence A2; 4) A nucleic acid sequence B1, a nucleic acid sequence B2, a third threshold sequence
  • a fourth nucleic acid S2 that is a complementary sequence capable of binding to all or part of the sequence of, and the nucleic acid sequence B1 and the nucleic acid sequence B2 are complementary to each other to form a hairpin structure; 5) a fifth nucleic acid U sequentially comprising a sequence complementary to the nucleic acid sequence B4 and a sequence complementary to the third threshold sequence B3; And 6) a sequence complementary to a part of nucleic acid sequence B4, a sequence complementary to a third threshold sequence A3, and a sixth nucleic acid F2 sequentially comprising a sequence complementary to all or part of the sequence of nucleic acid sequence B2, and It relates to a composition for converting a universal code, which converts a target nucleic acid into a fifth nucleic acid U, which is a predetermined universal code, through a hold-mediated strand displacement reaction.
  • the fourth threshold sequence B5 of the first nucleic acid S1, the second nucleic acid O, the third nucleic acid F1 and the fourth nucleic acid S2 may be changed according to the target nucleic acid, and the sixth nucleic acid F2 and the fifth nucleic acid U May be immobilized to a predetermined sequence irrespective of the target nucleic acid.
  • the present invention comprises 1) a nucleic acid sequence A1, a nucleic acid sequence A2, a first threshold sequence A3, a nucleic acid sequence A4, and a second threshold sequence A5 in sequence, wherein the nucleic acid sequence A4 and the first threshold sequence A5 Is a complementary sequence capable of binding to all or part of the target nucleic acid as a whole, and the nucleic acid sequence A1 and the nucleic acid sequence A2 are complementarily bound to each other to form a hairpin structure; 2) a second nucleic acid O sequentially comprising a sequence complementary to the nucleic acid sequence A4 and a sequence complementary to the first threshold sequence A3; 3) a third nucleic acid F1 sequentially comprising a sequence complementary to a part of nucleic acid sequence A4, a sequence complementary to a first threshold sequence A3, and a sequence complementary to all or part of the nucleic acid sequence A2; 4) A nucleic acid sequence B1, a nucleic acid sequence B2, a third threshold sequence
  • a fourth nucleic acid S2 that is a complementary sequence capable of binding to all or part of the sequence of, and the nucleic acid sequence B1 and the nucleic acid sequence B2 are complementary to each other to form a hairpin structure; 5) a fifth nucleic acid U sequentially comprising a sequence complementary to the nucleic acid sequence B4 and a sequence complementary to the third threshold sequence B3; And 6) a sequence complementary to a part of nucleic acid sequence B4, a sequence complementary to a third threshold sequence A3, and a sixth nucleic acid F2 sequentially comprising a sequence complementary to all or part of the sequence of nucleic acid sequence B2, and It relates to a universal code conversion kit, which converts a target nucleic acid into a predetermined universal code, a fifth nucleic acid U, through a hold-mediated strand displacement reaction.
  • the present invention 1) in the nucleic acid detection system of the present invention, the nucleic acid sequence A4 and the second threshold sequence A5 of the first nucleic acid S1 are changed to a complementary sequence capable of binding to all or part of the target nucleic acid, and accordingly, Altering the fourth threshold sequence B5 of the second nucleic acid O, the third nucleic acid F1 and the fourth nucleic acid S2; And 2) detecting a fifth nucleic acid U released through a threshold mediated strand displacement reaction.
  • the sixth nucleic acid F2 and the fifth nucleic acid U which is a universal code, may be a sequence-fixed predetermined nucleic acid.
  • the released fifth nucleic acid U may be detected using a fluorescent nucleic acid nanostructure specific to the released fifth nucleic acid U and graphene oxide.
  • the present invention relates to a method for unifying sequences using the universal code conversion system of the present invention.
  • the present invention provides a hybrid product of a third nucleic acid F1 and a sixth nucleic acid F2; A double strand (S10) to which the second nucleic acid O and the first nucleic acid S1 are complementarily bound; And it relates to a biosensor for detection of a target nucleic acid comprising a double strand (S2U) complementarily bound to the fifth nucleic acid U and the fourth nucleic acid S2.
  • a fluorescent nucleic acid nanostructure including a single-stranded probe including a nucleic acid complementary to the fifth nucleic acid U and a fluorescent material, and graphene oxide may be further included.
  • the present invention relates to a system for amplifying a nucleic acid detection or detection signal for each of the miRNAs in Table 1.
  • the first nucleic acid S1, the second nucleic acid O, the third nucleic acid F1, the fourth nucleic acid S2, the fifth nucleic acid U, and the sixth nucleic acid F2 for each of the miRNAs may be as shown in Table 3. .
  • the nucleic acid detection or detection signal amplification system of the sequence shown in Table 3 may be cancer specific.
  • Example 1 Fabrication and optimization of a universal code conversion system
  • the target sequence miR-21 is invading into the complementarily bound S1 (Substrate 1) and the toehold part of the output sequence (original strand) (the 3'part of S1 where the output sequence is not bound, miRNA toehold). input as a strand and the output sequence is passed to cycle 2;
  • the target sequence bound to S1 is separated from S1 by inputting the Fuel 1 sequence (F1) as an invading strand to the Fuel 1 toehold part (the part where the 3'and S1 sequence of the target sequence is not bound to the S1 sequence, Fuel toehold); And it is again input as an invading strand in the structure in which the S1 and the output sequence are combined and recycled (Cycle 1 of FIG. 1).
  • the output sequence from Cycle 1 is input as an invading strand in the toehold part of the Universal code complementarily bound to the S2 sequence (Substrate 2) (the 3'part of the S2 sequence where the universal code is not bound). code comes out of S2; And the Fuel 2 sequence (F2) is input as an invading strand to the Fuel 2 toehold part of the Output sequence linked to S2 (the part where the 3'and S2 sequences of the Output sequence are not combined), so that the Output sequence is separated from S2 and reconnects with S2. In the complementary combined universal code, it is input again to the toehold part and recycled (Cycle 2 in FIG. 1).
  • a sample was loaded on a 15% poly acryl amide gel, followed by Bio Rad PowerPac basic (Bio Rad, Hercules, CA, USA) and Bio Rad CRITERION Cell (Bio Rad, Hercules, California, USA). Using 110V, it was carried out under TBE buffer conditions for 1 hour, and the temperature was maintained at 4°C during electrophoresis. Each sample was reacted at 200 nM based on the molar concentration, and the reaction time and temperature were set to 6 hours and 25°C. During electrophoresis, each sample was loaded in a volume of 10 ⁇ , and by weight, 30 to 50 ng per sample were loaded.
  • the polyacrylamide gel after electrophoresis was dyed for 30 minutes using Gel Red, and images were obtained using FluoroBox (NEO Science, Seoul, Korea), and the quantitative analysis of the reaction progress was performed by electrophoresis using the Imagej tool.
  • the intensity of the band was analyzed.
  • the reaction progress of cycle 1 was confirmed under the reaction temperature condition.
  • the S1F1 band was clearly displayed even in the first row.
  • the reaction progression was likely to increase as the temperature increased, but there was no significant difference, and the experiment was conducted at 25°C (FIG. 3A).
  • Example 5 Graphene sensor for detecting nucleic acid of universal code
  • the sample was prepared with a 200 mM salt concentration of TE buffer, and the sample was prepared so that the concentration of the nucleic acid detection system was 100 nM, and the target nucleic acid (EGFR del 19 mutant) was added, followed by incubation for 30 minutes. After the TNT system (graphene biosensor) was injected at the same concentration, graphene oxide was added. Thereafter, fluorescence values were measured with FAM (Fluorescein phosphoramide, excitation wavelength 485 nm, emission wavelength 525 nm) using a SpectraMax M5 microplate. The target nucleic acid used (EGFR del 19 mutant) and each probe sequence of the TNT system are shown in Table 4.
  • FAM Fluorescein phosphoramide, excitation wavelength 485 nm, emission wavelength 525 nm
  • a target nucleic acid can be detected by an ineffective reaction or a detection signal can be amplified, and various target nucleic acids can be converted/unified into a pre-designated universal code, so that a probe for each target nucleic acid can be newly designed each time. Since there is no need, it can be usefully applied to a detection system with a complex structure.

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Abstract

본 발명은 표적 핵산을 단일화된 특정 서열을 갖는 유니버셜 코드로 변환하여 검출 및 증폭하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 무효소 반응으로 표적 핵산을 검출하거나 검출 신호를 증폭할 수 있으며, 다양한 표적 핵산을 미리 지정해둔 유니버셜 코드로 전환/단일화할 수 있으므로, 표적 핵산 각각에 대한 프로브를 매번 새로 디자인할 필요가 없어, 복잡한 구조의 검출 시스템에 유용하게 적용할 수 있다.

Description

핵산 검출 시스템
본 발명은 표적 핵산을 단일화된 유니버셜 코드로 변환하여 검출 및 증폭하는 것에 관한 것이다.
특정한 핵산(DNA 또는 RNA) 또는 단백질을 검출하는 방법은 과학연구 분야에서 기본적으로 중요한 기술이다. 특정한 핵산 또는 단백질을 검출하고 동정할 수 있게 됨으로써, 연구자들은 어떤 유전적, 생물학적 표지가 사람의 건강상태를 나타내는 지표가 되는지를 판정할 수 있게 되었다. 이러한 핵산과 단백질을 검출하는 방법을 이용하면 시료에 존재하는 병원체 유전자의 변형, 또는 특정 유전자의 발현 등을 발견할 수 있다. 이와 같은 분자 진단은 DNA 또는 RNA 등 질병의 근본을 진단하는 것으로 감염질환, 암진단, 유전질환 및 맞춤 진단 등 다양한 분야에서 사용되고 있다. 대표적인 분자진단 기술로는 단시간 내에 DNA를 증폭시키는 PCR 기술이 있다 (Saiki, R., et. al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239, 487-91. 1998). 그러나, 일반적인 PCR 기술은 증폭된 DNA를 확 인하기 위해서 전기 영동 방법을 사용하여야 한다. 이러한 전기 영동을 수행하기 위해서는 아가로즈 젤 (Agarose gel)을 만들고 DNA를 EtBr 등으로 염색하여 확인해야 하는 번거로움이 있어왔다. 또한, 최근에 사용되고 있는 real-time PCR 방법은 형광을 사용하기 때문에 전기 영동이 불필요하나, 고가의 사용 기기와 고가의 형광시약을 사용해야 한다 (Higuchi, R., et. al., Kinetic PCR Analysis: Real-time Monitoring of DNA Amplification Reactions. Nature Biotechnology 11, 1026 - 1030, 1993)는 문제점이 있다. 최근에 현장 진단 개념의 PCR 제품인 Cepheid사의 GeneXprt system과 시약이 개발되어 판매되고 있으나, 장비와 시약이 매우 고가이므로 일반적인 검사에서 사용하는 데는 어려움이 있다 (Helb, D., et. al., Rapid Detection of Mycobacterium tuberculosis and Rifampin Resistance by Use of On-Demand, Near-Patient Technology. J. Clin. Microbiol. 48, 229-237, 2010). 다른 방법으로, PCR 후에 젤 전기 영동 대신에 멤브 레인을 사용하여 확인하는 핵산 측면 흐름 어세이 (Nucleic Acid Lateral Flow Assay)가 있다 (Aveyard, J., et. al., One step visual detection of PCR products with gold nanoparticles and a nucleic acid lateral flow (NALF) device. Chem. Commun., 41, 4251-4253, 2007). 그러나, 젤 전기 영동 기술에 비해 복잡하여 실험실에서 제조하여 사용하기는 불가능하며, 멤브 레인에 부착된 프로브의 시퀀스는 PCR 증폭 산물에 따라서 특이적으로 결합할 수 있도록 사용하여야 하는 기술의 한계 때문에 범용으로 사용하는 데는 한계점이 있다. 특히, 이와 같은 PCR 기반의 연기서열분석법은 특정 오류에 극히 취약하고 데이터 해석과정에서 문제가 생겨 자주 심각한 오진이 있어, 혈액 속 특정 핵산 바이오마커를 이와 상보적인 서열을 만났을 때 변화를 형광, 전위차, 색변화 등으로 표현하고자 하는 연구들이 진행되고 있으나, 하지만 이 연구들의 경우는 대부분 한 번에 하나의 바이오마커를 검출해 내기 때문에 다중의 바이오마커들이 관여하는 대부분의 질병들을 효과적으로 진단하는데 어려움이 있다.
한편, 대중적인 암 진단 기법으로는 분자 생물학적 진단, 초음파 진단, X-Ray, MRI, CT, PET, 뼈 스캔 등 다양한 방법이 존재한다. 대부분의 암 진단 기법은 최종적으로 육안을 통해 판단하므로 방사선 필름 또는 조직 판독 과정에 큰 오류가 생길 수 있다. 즉, 암의 크기에 따라 발견되지 못하거나 단순한 염증 등을 암으로 오인하여 진단할 수 있다. MRI나 PET 등의 몇몇 방법들은 긴 측정시간이 있어야 하는데 이때 환자의 움직임과 긴장이 진단의 정확성에 영향을 미친다는 단점이 존재한다. 또한, 환자에 대한 방사선 피폭의 위험성은 피해갈 수 없는 문제이다. 따라서 더욱 확실한 암 진단을 위하여 생체검사(biopsy)를 통해 종양 조직을 직접 채취해 검사를 진행하기도 하나, 이 경우에는 일부분의 암으로 의심되는 조직만을 검사하게 되므로 전체적인 암의 양상 및 유형을 파악할 수 없다. 종양을 채취하기 위해 바늘이나 수술 요법이 사용되는 것 또한 환자에게 큰 거부감을 줄 수 있고 환자의 상태에 따라 조직 생체검사 자체가 불가능한 경우도 존재한다. 전반적으로 암을 확진하기 위해 사용되는 기존의 방법들은 비싼 비용과 환자에게 불편을 주어 주기적으로 자주 검사하기에 적합한 방법이 아닌 실정이다. 현재는 액체 생체검사를 통해 환자의 혈액, 대소변, 침 등의 체액을 통해 그 안에 있는 바이오마커를 검출하여 암을 진단하고자 하는 시도들이 점차 이루어지고 있다. 이미 암 환자의 혈액 속에는 특정한 염기서열들이 환자가 아닌 자에 비교해 굉장히 많이 존재한다는 것이 다양한 연구들을 통해 밝혀지고 있으며 이는 바이오 빅데이터의 형태로 모든 자료가 저장되고 있다. 현재 연구되고 있는 유전자 바이오마커들은 miRNA와 같은 짧은 비특이적 코딩 RNA (Small non-coding RNA: sncRNA)들이 주목받고 있다. 최근 들어 RNA, DNA 들이 서로 작용하면서 세포의 분열, 성장, 사멸, 그리고 종양 진행에 큰 영향을 주는 것으로 알려졌다. 또한, sncRNA의 프로파일링이 유전자의 유전적 변이와의 상관관계에 관한 연구들도 진행되고 있으나, 서열분석에서 주목되는 다양한 짧은 서열들에 따른 각각의 프로브를 디자인해야 하는 문제점이 있어왔다. 아울러, 인체질환은 하나의 유전자 이상이라기보다 여러 유전자의 문제로 인해 발병되는 경우가 훨씬 많기 때문에 일회 검사에 여러 개의 유전자를 확인할 수 있다면 진단의 정확성과 유용성을 향상시킬 수 있다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 핵산 검출 시스템을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 핵산 검출 신호 증폭 시스템을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 유니버셜 코드 전환 시스템을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 핵산을 검출하거나 검출 신호를 증폭하는 방법을 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 목적은 핵산 검출용 바이오센서를 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 제 1 핵산 S1, 제 2 핵산 O, 제 3 핵산 F1, 제 4 핵산 S2, 제 5 핵산 U 및 제 6 핵산 F2을 포함하는 핵산 검출 시스템을 제공한다.
또한, 본 발명은 제 1 핵산 S1, 제 2 핵산 O, 제 3 핵산 F1, 제 4 핵산 S2, 제 5 핵산 U 및 제 6 핵산 F2을 포함하는 핵산 검출 신호 증폭 시스템을 제공한다.
또한, 본 발명은 제 1 핵산 S1, 제 2 핵산 O, 제 3 핵산 F1, 제 4 핵산 S2, 제 5 핵산 U 및 제 6 핵산 F2을 포함하는 유니버셜 코드 전환 시스템을 제공한다.
또한, 본 발명은 토홀드 매개 가닥 변위 반응을 통해 핵산을 검출하거나 검출 신호를 증폭하는 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 제 3 핵산 F1 및 제 6 핵산 F2의 혼성화물, S1O 및 S2U을 포함하는 핵산 검출용 바이오센서를 제공한다.
도 1은 본 발명의 시스템의 토홀드 매개 가닥 변위 반응을 통한 서열 변환 과정을 나타낸 모식도다:
Universal code: 제 5 핵산 U;
Substrate 1: 제 1 핵산 S1;
Output: 제 2 핵산 O;
miRNA: 표적 핵산 (T);
Fuel 1: 제 3 핵산 F1;
Substrate 2: 제 4 핵산 S2; 및
Fuel 2: 제 6 핵산 F2.
도 2는 본 발명의 시스템을 구성하는 각 단계에서 핵심 구성 물질의 열역학 에너지를 비교한 도이다.
도 3은 실험 조건에서 반응 온도와 반응 시간의 변화에 따른 본 발명의 시스템의 사이클 1에서의 반응 진행정도를 확인한 전기영동 결과이다.
도 4는 본 발명의 시스템을 구성하는 핵산들의 서열 최적화를 전기영동으로 확인한 도이다.
도 5는 본 발명의 시스템에서 표적 핵산의 유니버셜 코드 (U)로의 전환 과정에서 사이클 1 및 사이클 2의 각 단계 반응 진행을 전기 영동 방법으로 확인한 결과이다.
도 6은 표적 핵산의 농도에 따른 유니버셜 코드의 반응 진행을 확인한 결과이다.
도 7은 12 종의 miRNA의 유무에 따른 본 발명의 시스템의 증폭 및 검출 결과를 형광 동역학 분석을 통해 확인한 도이다. 도 7a는 특정 표적 miRNA(miR-21)에 대한 유니버셜 코드를 가지고 12종의 miRNA에 대한 형광 검출 결과를 확인한 도이다. 도 7b는 각각의 표적 miRNA를 본 발명의 시스템을 사용하여 유니버셜 코드로 전환하고, 각각의 표적 miRNA에 대한 형광 검출 결과를 확인한 도이다.
도 8은 12 종의 miRNA에 대한 본 발명의 시스템에서 사이클 1 부분의 반응 진행도에 관한 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 12 종의 miRNA에 대한 본 발명의 시스템에서 사이클 2 부분의 반응 진행도에 대한 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명의 핵산 검출 시스템을 그래핀 바이오 센서에 응용한 것을 나타낸다. 좌측은 실시예 5의 실험 개요를 나타낸 것이며, 우측은 측정한 형광 값을 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명의 시스템을 구성하는 제 1 핵산 S1, 제 2 핵산 O, 제 3 핵산 F1, 제 4 핵산 S2, 제 5 핵산 U 및 제 6 핵산 F2의 서열 상보 관계를 나타낸 모식도이다:
*: 서열 상보적.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
이하, 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
달리 지시되지 않는 한, 핵산은 좌측에서 우측으로 5'→3' 배향으로 기록된다. 명세서 내에서 열거된 수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함하고, 정의된 범위 내의 각각의 정수 또는 임의의 비-정수 분획을 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 테스트하기 위한 실행에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에서 기술된다.
일 측면에서, 본 발명은 1) 핵산 서열 A1, 핵산 서열 A2, 제 1 토홀드 서열 A3, 핵산 서열 A4 및 제 2 토홀드 서열 A5를 순차적으로 포함하되, 핵산 서열 A4 및 제 1 토홀드 서열 A5는 전체로서 표적 핵산의 전부 또는 일부 서열과 결합 가능한 상보 서열이며, 핵산 서열 A1 및 핵산 서열 A2는 서로 상보적으로 결합하여 헤어핀 구조를 형성하는 제 1 핵산 S1(Substrat 1); 2) 핵산 서열 A4에 상보적인 서열 및 제 1 토홀드 서열 A3과 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 2 핵산 O(Output); 3) 핵산 서열 A4의 일부와 상보적인 서열, 제 1 토홀드 서열 A3에 상보적인 서열 및 핵산 서열 A2의 전부 또는 일부 서열과 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 3 핵산 F1(Fuel 1); 4) 핵산 서열 B1, 핵산 서열 B2, 제 3 토홀드 서열 B3, 핵산서열 B4 및 제 4 토홀드 서열 B5를 순차적으로 포함하되, 핵산 서열 B4 및 제 4 토홀드 서열 B5는 전체로서 제 2 핵산 O의 전부 또는 일부 서열과 결합 가능한 상보 서열이며, 핵산 서열 B1 및 핵산 서열 B2는 서로 상보적으로 결합하여 헤어핀 구조를 형성하는 제 4 핵산 S2(Substrate 2); 5) 핵산 서열 B4에 상보적인 서열 및 제 3 토홀드 서열 B3에 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 5 핵산 U(Universal code); 및 6) 핵산 서열 B4의 일부와 상보적인 서열, 제 3 토홀드 서열 A3에 상보적인 서열 및 핵산 서열 B2의 전부 또는 일부 서열과 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 6 핵산 F2(Fuel 2)를 포함하는, 핵산 검출 시스템에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 시스템은 도 11에 나타낸 각 핵산 서열들의 서열 상보 관계와 같이, T(표적 핵산)의 서열에 따라 S1, F1, O 및 S2의 제 4 토홀드 서열 B5이 변경되나, U 및 F2의 서열은 기술자가 구성한대로 고정하여 변경없이 이용할 수 있어, 표적 핵산의 서열을 U 서열로 단일화할 수 있으므로, 복잡한 구조의 핵산 검출 구조체 (예컨대, 형광나노핵산구조체)의 서열 변경없이 다양한 표적 핵산을 검출할 수 있는 장점이 있다.
일 측면에서, 본 발명은 1) 핵산 서열 A1, 핵산 서열 A2, 제 1 토홀드 서열 A3, 핵산 서열 A4 및 제 2 토홀드 서열 A5를 순차적으로 포함하되, 핵산 서열 A4 및 제 1 토홀드 서열 A5는 전체로서 표적 핵산의 전부 또는 일부 서열과 결합 가능한 상보 서열이며, 핵산 서열 A1 및 핵산 서열 A2는 서로 상보적으로 결합하여 헤어핀 구조를 형성하는 제 1 핵산 S1; 2) 핵산 서열 A4에 상보적인 서열 및 제 1 토홀드 서열 A3과 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 2 핵산 O; 3) 핵산 서열 A4의 일부와 상보적인 서열, 제 1 토홀드 서열 A3에 상보적인 서열 및 핵산 서열 A2의 전부 또는 일부 서열과 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 3 핵산 F1; 4) 핵산 서열 B1, 핵산 서열 B2, 제 3 토홀드 서열 B3, 핵산서열 B4 및 제 4 토홀드 서열 B5를 순차적으로 포함하되, 핵산 서열 B4 및 제 4 토홀드 서열 B5는 전체로서 제 2 핵산 O의 전부 또는 일부 서열과 결합 가능한 상보 서열이며, 핵산 서열 B1 및 핵산 서열 B2는 서로 상보적으로 결합하여 헤어핀 구조를 형성하는 제 4 핵산 S2; 5) 핵산 서열 B4에 상보적인 서열 및 제 3 토홀드 서열 B3에 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 5 핵산 U; 및 6) 핵산 서열 B4의 일부와 상보적인 서열, 제 3 토홀드 서열 A3에 상보적인 서열 및 핵산 서열 B2의 전부 또는 일부 서열과 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 6 핵산 F2를 포함하는, 핵산 검출 신호 증폭 시스템에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 핵산 검출 시스템은 표적 핵산의 검출 신호를 증폭하여 검출할 수 있다.
본 발명은 표적 핵산 (T)은 S1O와 토홀드 매개 가닥 변위 반응 (Toehold mediated strand displacement reaction)을 통해 상보적으로 결합한 뒤 (S1T), 제 3 핵산 F1와의 토홀드 매개 가닥 변위 반응을 통해 S1과 F1이 상보적으로 결합함으로써 표적 서열이 방출되어 재사용되므로 이의 신호가 1차 증폭되며, 표적 핵산과 S1의 결합함으로써 방출된 제 2 핵산 O이 S2U와 토홀드 매개 가닥 변위 반응을 통해 상보적으로 결합한 뒤 (S2O), 제 6 핵산 F2와의 토홀드 매개 가닥 변위 반응을 통해 S2와 F2가 상보적으로 결합함으로써 제 2 핵산 O가 방출되어 재사용되므로 이의 신호가 2차로 증폭되는 장점이 있다.
일 측면에서, 본 발명은 1) 핵산 서열 A1, 핵산 서열 A2, 제 1 토홀드 서열 A3, 핵산 서열 A4 및 제 2 토홀드 서열 A5를 순차적으로 포함하되, 핵산 서열 A4 및 제 1 토홀드 서열 A5는 전체로서 표적 핵산의 전부 또는 일부 서열과 결합 가능한 상보 서열이며, 핵산 서열 A1 및 핵산 서열 A2는 서로 상보적으로 결합하여 헤어핀 구조를 형성하는 제 1 핵산 S1; 2) 핵산 서열 A4에 상보적인 서열 및 제 1 토홀드 서열 A3과 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 2 핵산 O; 3) 핵산 서열 A4의 일부와 상보적인 서열, 제 1 토홀드 서열 A3에 상보적인 서열 및 핵산 서열 A2의 전부 또는 일부 서열과 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 3 핵산 F1; 4) 핵산 서열 B1, 핵산 서열 B2, 제 3 토홀드 서열 B3, 핵산서열 B4 및 제 4 토홀드 서열 B5를 순차적으로 포함하되, 핵산 서열 B4 및 제 4 토홀드 서열 B5는 전체로서 제 2 핵산 O의 전부 또는 일부 서열과 결합 가능한 상보 서열이며, 핵산 서열 B1 및 핵산 서열 B2는 서로 상보적으로 결합하여 헤어핀 구조를 형성하는 제 4 핵산 S2; 5) 핵산 서열 B4에 상보적인 서열 및 제 3 토홀드 서열 B3에 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 5 핵산 U; 및 6) 핵산 서열 B4의 일부와 상보적인 서열, 제 3 토홀드 서열 A3에 상보적인 서열 및 핵산 서열 B2의 전부 또는 일부 서열과 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 6 핵산 F2를 포함하는, 서열 단일화 시스템에 관한 것이다.
일 구현예에서, 표적 서열은 첫 번째 사이클에서 제 2 핵산 O로 전환되고, 두 번째 순환에서 제 5 핵산 U (즉, 소정의 서열을 갖는 유니버셜 코드)로 전환될 수 있다 (도 1 참조).
본 발명은 표적에 따라 다양하게 서로 상이한 염기서열을 표적 서열 (T)과는 완전히 무관하게 단일화된 서열을 갖는 유니버셜 코드(U)로 변환하여, 상기 유니버셜 코드에 대한 검출 시스템을 사용하여 다양한 염기서열을 검출할 수 있는 장점이 있다.
일 측면에서, 본 발명은 1) 핵산 서열 A1, 핵산 서열 A2, 제 1 토홀드 서열 A3, 핵산 서열 A4 및 제 2 토홀드 서열 A5를 순차적으로 포함하되, 핵산 서열 A4 및 제 1 토홀드 서열 A5는 전체로서 표적 핵산의 전부 또는 일부 서열과 결합 가능한 상보 서열이며, 핵산 서열 A1 및 핵산 서열 A2는 서로 상보적으로 결합하여 헤어핀 구조를 형성하는 제 1 핵산 S1; 2) 핵산 서열 A4에 상보적인 서열 및 제 1 토홀드 서열 A3과 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 2 핵산 O; 3) 핵산 서열 A4의 일부와 상보적인 서열, 제 1 토홀드 서열 A3에 상보적인 서열 및 핵산 서열 A2의 전부 또는 일부 서열과 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 3 핵산 F1; 4) 핵산 서열 B1, 핵산 서열 B2, 제 3 토홀드 서열 B3, 핵산서열 B4 및 제 4 토홀드 서열 B5를 순차적으로 포함하되, 핵산 서열 B4 및 제 4 토홀드 서열 B5는 전체로서 제 2 핵산 O의 전부 또는 일부 서열과 결합 가능한 상보 서열이며, 핵산 서열 B1 및 핵산 서열 B2는 서로 상보적으로 결합하여 헤어핀 구조를 형성하는 제 4 핵산 S2; 5) 핵산 서열 B4에 상보적인 서열 및 제 3 토홀드 서열 B3에 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 5 핵산 U; 및 6) 핵산 서열 B4의 일부와 상보적인 서열, 제 3 토홀드 서열 A3에 상보적인 서열 및 핵산 서열 B2의 전부 또는 일부 서열과 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 6 핵산 F2를 포함하는, 핵산 검출용 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 표적 핵산은 생체 내 짧은 miRNA와 같은 바이오마커일 수 있으며, 액체 생검 내의 유전자 바이오마커일 수 있고, miRNA와 같은 짧은 비특이적 코딩 RNA (Small non-coding RNA: sncRNA)일 수 있다.
일 구현예에서, 제 2 핵산 O 및 제 1 핵산 S1가 상보적으로 결합하여 이중 가닥 (S1O)을 형성하고, 및 제 5 핵산 U 및 제 4 핵산 S2와 상보적으로 결합하여 이중 가닥 (S2U)을 형성하고 있을 수 있다.
일 구현예에서, S1O에서 제 2 토홀드 서열 A5이, 및 S2U에서 제 4 토홀드 서열 B5는 단일가닥으로 노출되어 있을 수 있다.
일 구현예에서, 제 2 토홀드 서열 A5 또는 제 4 토홀드 서열 B5는 4 내지 8개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 제 3 핵산 F1 또는 제 6 핵산 F2가 헤어핀 구조를 가질 수 있다.
일 구현예에서, 제 3 핵산 F1 또는 제 6 핵산 F2의 줄기(stem) 부분(헤어핀 구조의 이중결합 부분이 6 내지 12개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 제 1 토홀드 서열 B3 또는 제 3 토홀드 서열 B3는 4 내지 12 개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 제 1 핵산 S1이 소광물질(quencher)을 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 소광물질은 답실(Dabcyl), TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 블랙홀 퀸처(Black Hole Quencher), Qxl, 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ, IRDye QC-1 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
일 구현예에서, 제 2 핵산 O 및 제 5 핵산 U이 형광물질을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 형광물질은 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
일 구현예에서, 무효소 및 자가조립을 특징으로 하는 토홀드 매개 가닥 변위 반응을 통해 방출된 제 5 핵산 U로서 표적 핵산의 존재 신호를 증폭할 수 있다.
일 구현예에서, 제 5 핵산 U 검출용 조성물을 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 제 5 핵산 U에 상보적인 핵산 및 형광물질을 포함하는 단일가닥 프로브를 포함하는 형광핵산나노구조체, 및 그래핀 옥사이드를 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 제 5 핵산 U의 검출용 조성물은 제 5 핵산 U에 상보적인 핵산서열, 상기 핵산서열 및 상보적인 서열의 단편을 특이적으로 인식하는 프라미어 쌍, 또는 프로브, 또는 프라이머쌍 및 프로브를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 제 5 핵산 U의 검출은 중합효소연쇄반응, 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응(Competitive RT-PCR), Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, 핵산 마이크로어레이, 노던블랏, DNA 칩을 포함하는 분석 방법으로 검출될 수 있으나, 제 5 핵산 U에 상보적인 핵산 및 형광물질을 포함하는 단일가닥 프로브를 포함하는 형광핵산나노구조체, 및 그래핀 옥사이드를 포함하는 핵산 검출용 형광핵산나노구조체-그래핀 옥사이드 복합체로 검출하는 것이 더욱 바람직하다.
일 구현예에서, 핵산 검출용 형광핵산나노구조체-그래핀 옥사이드 복합체는 형광공명에너지전이(fluorescence resonance energy transfer) 현상으로 형광을 검출할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "형광나노핵산구조체"는 타겟 핵산에 상보적인 핵산 및 형광물질을 포함하는 단일가닥 프로브, 상기 프로브들로 이루어진 구조체 또는 타겟 핵산과 결합된 상기 프로브들을 포함한다.
본 발명에서 용어, "형광핵산나노구조체/그래핀 옥사이드 복합체" 또는 "그래핀 형광핵산나노구조체"는 상기 형광핵산나노구조체가 그래핀 옥사이드 상에 부착된 구조체 또는 복합체를 말한다.
본 발명에서 용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 핵산의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있으나, 본 발명에서는 단일가닥 핵산을 의미한다.
일 구현예에서, 핵산 검출용 형광핵산나노구조체-그래핀 옥사이드 복합체는 표적 a에 대해 전환되어 방출된 유니버셜 코드 A에 상보적인 핵산 및 형광물질을 포함하는 제 1 단일가닥 프로브; 표적 b에 대해 전환되어 방출된 유니버셜 코드 B에 상보적인 핵산 및 형광물질을 포함하는 제 2 단일가닥 프로브; 표적 c에 대해 전환되어 방출된 유니버셜 코드 C에 상보적인 핵산 및 형광물질을 포함하는 제 3 단일가닥 프로브; 및 상기 제 1 단일가닥 프로브와 상보적인 서열, 제 2 단일가닥 프로브와 상보적인 서열 및 제 3 단일가닥 프로브와 상보적인 서열로 이루어진 제 4 단일가닥 프로브를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 단일가닥 프로브들에 포함된 형광물질들은 서로 다른 파장대의 형광물질일 수 있다.
일 구현예에서, 핵산 검출용 형광핵산나노구조체-그래핀 옥사이드 복합체 형광핵산나노구조체는 제 1 단일가닥 프로브, 제 2 단일가닥 프로브 및 제 3 단일가닥 프로브 중 어느 하나가 그래핀 옥사이드에 부착된, 그래핀 옥사이드 상에서 역사면체형 구조일 수 있다.
일 구현예에서, 핵산 검출용 형광핵산나노구조체-그래핀 옥사이드 복합체 형광핵산나노구조체는 형광핵산나노구조체의 제 1 단일가닥 프로브, 제 2 단일가닥 프로브 및 제 3 단일가닥 프로브가 그래핀 옥사이드에 부착된, 형광핵산나노구조체는 그래핀 옥사이드 상에서 삼각기둥형 구조일 수 있다.
일 구현예에서, 핵산 검출용 형광핵산나노구조체-그래핀 옥사이드 복합체 형광핵산나노구조체는 제 1 단일가닥 프로브, 제 2 단일가닥 프로브 및 제 3 단일가닥 프로브가 그래핀 옥사이드에 부착된, 그래핀 옥사이드 상에서 삼각기둥형 구조일 수 있다.
일 구현예에서, 그래핀 옥사이드(Graphene Oxide: GO)는 형광제한화학물질(Universal Quencher: UQ)로서 형광공명에너지 전이에 의한 형광을 선택적으로 차단할 수 있으며, 타겟 핵산과 본 발명의 단일가닥 프로브가 결합하여 이중결합을 형성하면 프로브 (또는 형광나노핵산구조체)가 그래핀 옥사이드로부터 거리가 멀어져 형광물질의 발광이 검출될 수 있다. 즉, 그래핀 옥사이드는 이중가닥 염기서열보다 단일가닥 염기서열과 더 쉽게 부착되는 고유한 특성과 형광공명에너지전이에 따라 그래핀 옥사이드와 형광나노핵산구조체의 형광물질의 거리가 가까워지면 형광이 차단되며, 거리가 멀어지면 다시 형광이 검출될 수 있는 특성을 이용하여, 형광 물질이 포함된 프로브들에 다중의 타겟 염기서열들이 프로브들의 각각에 상보적인 서열과 결합해 이중결합을 형성하면 그래핀 옥사이드로부터 거리가 멀어지게 되어 형광을 발광함으로써, 다중 타겟을 한 번에 인식하고 정량할 수 있다.
일 구현예에서, 표적 핵산이 제 1 핵산 S1의 제 2 토홀드 서열 A5와 상보적으로 결합하면 분지점 이동(branch migration) 반응을 통해 제 2 핵산 O를 방출시키고 제 3 토홀드 서열 A3가 노출되며; 표적 핵산과 결합한 제 1 핵산 S1의 제 1 토홀드 서열 A3과 제 3 핵산 F1이 결합하여 분지점 이동 반응을 통해 표적 핵산을 방출시키고; 방출된 제 2 핵산 O가 제 4 핵산 S2의 제 4 토홀드 서열 B5와 상보적으로 결합하여 분지점 이동 반응을 통해 제 5 핵산 U를 방출시키며; 제 2 핵산 O와 결합한 제 4 핵산 S2의 제 3 토홀드 서열 B3와 제 6 핵산 F2가 결합하여 분지점 이동 반응을 통해 제 2 핵산 O를 방출시킬 수 있다.
일 구현예에서, 상기에서 방출된 표적 핵산이 상보적으로 결합하여 이중 가닥을 형성하고 있는 제 2 핵산 O 및 제 1 핵산 S1 (S1O)의 제 2 토홀드 서열 A5와 재반응되고, 상기에서 방출된 제 2 핵산 O가 상보적으로 결합하여 이중 가닥을 형성하고 있는 제 4 핵산 S2 및 제 5 핵산 U (S2U)의 제 4 토홀드 서열 B5와 재반응될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 1) 핵산 서열 A1, 핵산 서열 A2, 제 1 토홀드 서열 A3, 핵산 서열 A4 및 제 2 토홀드 서열 A5를 순차적으로 포함하되, 핵산 서열 A4 및 제 1 토홀드 서열 A5는 전체로서 표적 핵산의 전부 또는 일부 서열과 결합 가능한 상보 서열이며, 핵산 서열 A1 및 핵산 서열 A2는 서로 상보적으로 결합하여 헤어핀 구조를 형성하는 제 1 핵산 S1; 2) 핵산 서열 A4에 상보적인 서열 및 제 1 토홀드 서열 A3과 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 2 핵산 O; 3) 핵산 서열 A4의 일부와 상보적인 서열, 제 1 토홀드 서열 A3에 상보적인 서열 및 핵산 서열 A2의 전부 또는 일부 서열과 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 3 핵산 F1; 4) 핵산 서열 B1, 핵산 서열 B2, 제 3 토홀드 서열 B3, 핵산서열 B4 및 제 4 토홀드 서열 B5를 순차적으로 포함하되, 핵산 서열 B4 및 제 4 토홀드 서열 B5는 전체로서 제 2 핵산 O의 전부 또는 일부 서열과 결합 가능한 상보 서열이며, 핵산 서열 B1 및 핵산 서열 B2는 서로 상보적으로 결합하여 헤어핀 구조를 형성하는 제 4 핵산 S2; 5) 핵산 서열 B4에 상보적인 서열 및 제 3 토홀드 서열 B3에 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 5 핵산 U; 및 6) 핵산 서열 B4의 일부와 상보적인 서열, 제 3 토홀드 서열 A3에 상보적인 서열 및 핵산 서열 B2의 전부 또는 일부 서열과 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 6 핵산 F2를 포함하는, 표적 핵산 검출용 키트에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 1) 핵산 서열 A1, 핵산 서열 A2, 제 1 토홀드 서열 A3, 핵산 서열 A4 및 제 2 토홀드 서열 A5를 순차적으로 포함하되, 핵산 서열 A4 및 제 1 토홀드 서열 A5는 전체로서 표적 핵산의 전부 또는 일부 서열과 결합 가능한 상보 서열이며, 핵산 서열 A1 및 핵산 서열 A2는 서로 상보적으로 결합하여 헤어핀 구조를 형성하는 제 1 핵산 S1; 2) 핵산 서열 A4에 상보적인 서열 및 제 1 토홀드 서열 A3과 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 2 핵산 O; 3) 핵산 서열 A4의 일부와 상보적인 서열, 제 1 토홀드 서열 A3에 상보적인 서열 및 핵산 서열 A2의 전부 또는 일부 서열과 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 3 핵산 F1; 4) 핵산 서열 B1, 핵산 서열 B2, 제 3 토홀드 서열 B3, 핵산서열 B4 및 제 4 토홀드 서열 B5를 순차적으로 포함하되, 핵산 서열 B4 및 제 4 토홀드 서열 B5는 전체로서 제 2 핵산 O의 전부 또는 일부 서열과 결합 가능한 상보 서열이며, 핵산 서열 B1 및 핵산 서열 B2는 서로 상보적으로 결합하여 헤어핀 구조를 형성하는 제 4 핵산 S2; 5) 핵산 서열 B4에 상보적인 서열 및 제 3 토홀드 서열 B3에 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 5 핵산 U; 및 6) 핵산 서열 B4의 일부와 상보적인 서열, 제 3 토홀드 서열 A3에 상보적인 서열 및 핵산 서열 B2의 전부 또는 일부 서열과 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 6 핵산 F2를 포함하는, 핵산 검출 신호 증폭용 조성물 또는 키트에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 1) 핵산 서열 A1, 핵산 서열 A2, 제 1 토홀드 서열 A3, 핵산 서열 A4 및 제 2 토홀드 서열 A5를 순차적으로 포함하되, 핵산 서열 A4 및 제 1 토홀드 서열 A5는 전체로서 표적 핵산의 전부 또는 일부 서열과 결합 가능한 상보 서열이며, 핵산 서열 A1 및 핵산 서열 A2는 서로 상보적으로 결합하여 헤어핀 구조를 형성하는 제 1 핵산 S1; 2) 핵산 서열 A4에 상보적인 서열 및 제 1 토홀드 서열 A3과 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 2 핵산 O; 3) 핵산 서열 A4의 일부와 상보적인 서열, 제 1 토홀드 서열 A3에 상보적인 서열 및 핵산 서열 A2의 전부 또는 일부 서열과 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 3 핵산 F1; 4) 핵산 서열 B1, 핵산 서열 B2, 제 3 토홀드 서열 B3, 핵산서열 B4 및 제 4 토홀드 서열 B5를 순차적으로 포함하되, 핵산 서열 B4 및 제 4 토홀드 서열 B5는 전체로서 제 2 핵산 O의 전부 또는 일부 서열과 결합 가능한 상보 서열이며, 핵산 서열 B1 및 핵산 서열 B2는 서로 상보적으로 결합하여 헤어핀 구조를 형성하는 제 4 핵산 S2; 5) 핵산 서열 B4에 상보적인 서열 및 제 3 토홀드 서열 B3에 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 5 핵산 U; 및 6) 핵산 서열 B4의 일부와 상보적인 서열, 제 3 토홀드 서열 A3에 상보적인 서열 및 핵산 서열 B2의 전부 또는 일부 서열과 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 6 핵산 F2를 포함하고, 토홀드 매개 가닥 변위 반응을 통해 표적 핵산을 소정의 유니버셜 코드(universal code)인 제 5 핵산 U로 전환하는, 유니버셜 코드 전환용 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 제 1 핵산 S1, 제 2 핵산 O, 제 3 핵산 F1 및 제 4 핵산 S2의 제 4 토홀드 서열 B5를 표적 핵산에 따라 변경될 수 있으며, 제 6 핵산 F2 및 제 5 핵산 U는 표적 핵산과 상관없이 소정의 서열로 고정될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 1) 핵산 서열 A1, 핵산 서열 A2, 제 1 토홀드 서열 A3, 핵산 서열 A4 및 제 2 토홀드 서열 A5를 순차적으로 포함하되, 핵산 서열 A4 및 제 1 토홀드 서열 A5는 전체로서 표적 핵산의 전부 또는 일부 서열과 결합 가능한 상보 서열이며, 핵산 서열 A1 및 핵산 서열 A2는 서로 상보적으로 결합하여 헤어핀 구조를 형성하는 제 1 핵산 S1; 2) 핵산 서열 A4에 상보적인 서열 및 제 1 토홀드 서열 A3과 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 2 핵산 O; 3) 핵산 서열 A4의 일부와 상보적인 서열, 제 1 토홀드 서열 A3에 상보적인 서열 및 핵산 서열 A2의 전부 또는 일부 서열과 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 3 핵산 F1; 4) 핵산 서열 B1, 핵산 서열 B2, 제 3 토홀드 서열 B3, 핵산서열 B4 및 제 4 토홀드 서열 B5를 순차적으로 포함하되, 핵산 서열 B4 및 제 4 토홀드 서열 B5는 전체로서 제 2 핵산 O의 전부 또는 일부 서열과 결합 가능한 상보 서열이며, 핵산 서열 B1 및 핵산 서열 B2는 서로 상보적으로 결합하여 헤어핀 구조를 형성하는 제 4 핵산 S2; 5) 핵산 서열 B4에 상보적인 서열 및 제 3 토홀드 서열 B3에 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 5 핵산 U; 및 6) 핵산 서열 B4의 일부와 상보적인 서열, 제 3 토홀드 서열 A3에 상보적인 서열 및 핵산 서열 B2의 전부 또는 일부 서열과 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 6 핵산 F2를 포함하고, 토홀드 매개 가닥 변위 반응을 통해 표적 핵산을 소정의 유니버셜 코드인 제 5 핵산 U로 전환하는, 유니버셜 코드 전환 키트에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 1) 본 발명의 핵산 검출 시스템에서 제 1 핵산 S1의 핵산 서열 A4 및 제 2 토홀드 서열 A5를 표적 핵산의 전부 또는 일부 서열과 결합 가능한 상보 서열로 변경하고, 이에 따라 제 2 핵산 O, 제 3 핵산 F1 및 제 4 핵산 S2의 제 4 토홀드 서열 B5를 변경하고; 및 2) 토홀드 매개 가닥 변위 반응을 통해 방출된 제 5 핵산 U를 검출하는 것을 포함하는, 핵산의 검출을 증폭하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 제 6 핵산 F2 및 유니버셜 코드인 제 5 핵산 U는 서열 고정된 소정의 핵산일 수 있다.
일 구현예에서, 방출된 제 5 핵산 U에 특이적인 형광핵산나노구조체 및 그래핀 옥사이드를 이용하여 방출된 제 5 핵산 U를 검출할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 유니버셜 코드 전환 시스템을 이용한 서열 단일화 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 제 3 핵산 F1 및 제 6 핵산 F2의 혼성화물; 제 2 핵산 O 및 제 1 핵산 S1가 상보적으로 결합한 이중 가닥 (S1O); 및 제 5 핵산 U 및 제 4 핵산 S2와 상보적으로 결합한 이중 가닥 (S2U)을 포함하는 표적 핵산 검출용 바이오센서에 관한 것이다.
일 구현예에서, 제 5 핵산 U에 상보적인 핵산 및 형광물질을 포함하는 단일가닥 프로브를 포함하는 형광핵산나노구조체, 및 그래핀 옥사이드를 추가로 포함할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 표 1의 miRNA들 각각에 대한 핵산 검출 또는 검출 신호를 증폭하는 시스템에 관한 것이다.
일 구현예에서, 각 miRNA들 각각에 대한 제 1 핵산 S1, 제 2 핵산 O, 제 3 핵산 F1, 제 4 핵산 S2, 제 5 핵산 U 및 제 6 핵산 F2는 표 3에 표시한 것과 같을 수 있다.
일 구현예에서, 표 3에 표시된 서열의 핵산 검출 또는 검출 신호 증폭 시스템은 암 특이적일 수 있다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 유니버셜 코드 변환 시스템 제작 및 최적화
1-1. 유니버셜 코드 변환 시스템 구성
miR-21을 표적으로 하여 이를 특정 서열을 갖는 유니버셜 코드(universal code)로의 변환을 통해 표적서열의 증폭 및 검출을 위하여, 발판 매개 가닥 변위 반응 (Toehold mediated strand displacement reaction) (Yurke, Bernard (2000). "A DNA-fuelled molecular machine made of DNA". Nature. 406 (6796): 605-8. 참조)을 기반으로 2 사이클로 이루어진 유니버셜 코드 변환 시스템을 제작하였다. 구체적으로, 유니버셜 코드 변환 시스템은 두 개의 사이클 시스템에 의해 진행되는데, 타겟인 miRNA는 우선 첫 번째 사이클 시스템을 통해 Substrate 1(S1) 에 붙어있던 Output 서열로 전환되고, 두 번째 사이클 시스템으로 이동해 Substrate 2(S2) 에 붙어있는 유니버셜 코드 (U)의 형태로 전환되며, 각각의 순환에서 타겟 (Target)은 Fuel 서열에 의해 재사용될 수 있게 되는 시스템이다. 즉, 사이클 1에서는 상보적으로 결합된 S1(Substrate 1)과 Output 서열 (original strand)의 toehold 부분 (output 서열이 결합되지 않은 S1의 3' 부분, miRNA toehold)에 표적 서열인 miR-21가 invading strand로서 input되어 Output 서열이 사이클 2로 넘어가고; S1과 결합된 표적 서열은 Fuel 1 toehold 부분 (표적 서열인 miRNA의 3'과 S1 서열이 결합하지 않은 부분, Fuel toehold)에 Fuel 1 서열 (F1)이 invading strand로서 input됨으로써 S1로부터 떨어져 나오며; 및 다시 S1과 Output 서열이 결합된 구조에 다시 invading strand로서 input되어 재활용된다 (도 1의 Cycle 1). 또한, 사이클 2에서는 S2 서열 (Substrate 2)와 상보적으로 결합된 Universal code의 toehold 부분 (Universal code가 결합되지 않은 S2 서열의 3' 부분)에 사이클 1에서 넘어온 Output 서열이 invading strand로서 input되어 Universal code가 S2에서 떨어져 나오고; 및 S2와 결합된 Output 서열의 Fuel 2 toehold 부분 (Output 서열의 3'과 S2 서열이 결합하지 않은 부분)에 Fuel 2 서열 (F2)이 invading strand로서 input됨으로써 Output 서열이 S2에서 떨어져 나와 다시 S2와 상보적으로 결합된 Universal code에서 toehold 부분에 다시 input되어 재활용된다 (도 1의 Cycle 2). 이를 위해, 표 1에 기재된 서열의 miR-21에 대한 S1 및 S2, Output (O), Fuel 1 및 2 (F1 및 F2), 및 유니버셜 코드 (universal code, U)를 누펙 (Nupack) 프로그램을 통해 열역학적 반응 관계를 고려하여 디자인하였으며 (도 2), 서열의 최적화 실험을 위해 여러 조건의 서열들을 디자인하였다 (표 2). 디자인하여 제작된 서열들은 TE 버퍼 상에서 보관하였고, S1 및 Output, S2 및 유니버셜 코드를 Bio Rad MyCycler Thermal Cycler PCR (Bio Rad, Hercules, California, USA)을 이용해 염 농도 200 mM의 TE 버퍼 상에서 이중 가닥 형태로 결합시켰다.
Figure PCTKR2020013234-appb-T000001
Figure PCTKR2020013234-appb-T000002
실시예 2. 유니버셜 코드 서열 최적화
유니버셜 코드 서열의 최적화를 위해, 상기에서 제작한 miR-21에 대한 S1 및 S2, Output, Fuel 1 및 2, 및 유니버셜 코드 (universal code, U)들 (표 2)에서 Output의 toehold 서열 (Output이 결합하지 않은 S1의 단일가닥 부분으로서 miRNA가 들어오는 부분, 도 3a의 하단에 표시)의 갯수 (4, 6 또는 8개), Fuel 서열의 고리 유무, stem의 수, 및 S1의 Fuel toehold 서열 (타겟 서열과 S1이 결합되지 않아 단일 서열이 드러나 있어 Fuel 1이 들어오는 부분, 도 3c 하단에 표시)의 갯수에 따른 반응 차이를 전기영동으로 확인하였다. 전기 영동은 15% 폴리 아크릴 아마이드 겔 (poly acryl amide gel)에 시료를 로딩하고 Bio Rad PowerPac basic (Bio Rad, Hercules, CA, USA)과 Bio Rad CRITERION Cell (Bio Rad, Hercules, California, USA)을 이용해 110V, 1시간 동안 TBE 버퍼 조건 하에서 시행하였으며, 전기 영동 시 온도는 4℃를 유지하였다. 각각의 시료는 몰 농도를 기준으로 200 nM 상태에서 반응이 이루어졌고 반응 시간 및 온도는 6 시간, 25℃로 설정하였다. 전기영동시 각 시료는 10 μ의 부피로 로딩되었으며 무게로는 시료당 30 ~ 50 ng씩 로딩되었다. 전기 영동을 마친 폴리 아크릴 아마이드 겔은 겔레드를 이용해 30분간 염색하였으며 FluoroBox (NEO Science, Seoul, Korea)를 이용해 이미지를 얻었고, 반응 진행의 정량적인 분석은 이미지제이(Imagej) 툴을 사용하여 전기 영동 밴드의 세기를 분석하였다. 실험 조건 부분에서 반응 온도나 시간 유니버셜 코드 시스템의 구성물들 간의 비율에 대한 최적화를 실행한 결과, 반응 온도 조건에서 cycle 1의 반응 진행이 확인되었는데, 37.5℃ 이상에서는 1번 열에서도 S1F1 밴드가 선명히 나타났고, 2번 열 및 3번 열의 경우 온도가 높아질수록 반응 진행도가 높아질 수는 있는 것으로 보였으나 큰 차이가 없는 것으로 나타나 25℃에서 실험을 진행하였다 (도 3a). 또한, 반응 시간에 대해서는 시간 이후부터 3번 열에서 거의 대부분이 S1F1 밴드로 전환되었음이 확인되어, 이후의 실험에서도 6시간 반응 진행 이후 측정하였다 (도 3b). 아울러, 전기 영동 이미지를 통한 반응 진행도는 이미지 제이 프로그램을 이용해 얻은 밴드의 강도를 하기의 수학식 1을 이용해 분석하였다.
[수학식 1]
Figure PCTKR2020013234-appb-I000001
A = (반응 진행시킨 시료의 결과물 밴드 강도) / (결과물 밴드 대조군의 밴드 강도); 및
B = (반응 진행시킨 시료의 반응 전 밴드 강도) / (반응 전 밴드 대조군의 밴드 강도).
그 결과, toehold 서열의 개수가 4개일 때는 S1O-S1m 반응이 거의 일어나지 않았으나, 6개에서 S1O-S1F1가 약 19% 및 S1m-S1F1가 약 47%로 나타났고, 8개에서 S1O-S1F1가 42% 및 S1m-S1F1가 58%로 나타났다 (도 4a). 또한, Fuel 서열에 고리가 없을 때 S1O-S1F1 반응 진행이 매우 잘 일어났고 stem의 갯수가 8개 일 때 (S1O-S1F1 14% 및 S1m-S1F1 22%)보다 10개일 때 (S1O-S1F1 13% 및 S1m-S1F1 37%)가 반응이 좀 더 안정적으로 진행되는 것으로 나타났다 (도 4b). 아울러, S1O-S1F1 및 S1m-S1F1의 반응 진행이 S1의 Fuel toehold 갯수가 4개일 때 각각 9% 및 37%이고, 6개일 때 10% 및 41%, 8개일 때 14% 및 42%로 나타났다 (도 4c). 이에, Fuel 서열은 고리 구조에 stem 서열 10개, toehold 서열 부분은 6개로 선정하였다.
실시예 3. 유니버셜 코드 전환 확인
본 발명의 유니버셜 코드 전환 과정에서 Cycle 1 및 Cycle 2의 각 단계에서 농도별 반응 진행을 전기 영동 방법으로 확인하고, 검출 한계를 하기의 수학식 2로 계산하였으며, 검출 신호 증폭률을 하기 수학식 3으로 계산하였다.
[수학식 2]
Figure PCTKR2020013234-appb-I000002
s = standard deviation of the response; 및
S = slope of the calibration curve (linear).
[수학식 3]
Figure PCTKR2020013234-appb-I000003
그 결과, 단계별로 농도에 대한 반응 진행은 정비례 관계에 있는 것으로 나타났으며, 반응 속도에 따른 차이가 있으나 시간이 지남에 따라 반응 진행이 전체적으로 S 자형을 그림이 확인되었다 (도 5). 구체적으로, 도 5의 전기 영동 이미지 1 및 2번 열은 다음 단계 타겟으로의 전환을 나타내고, 3 및 4번 열은 타겟 유무에 따른 반응 차이를 나타내며, 이미지 제이 툴로 밴드 강도를 측정하고 상기 수학식 1으로 계산했을 때 도 5a의 1번 열에서 반응 진행은 약 73%, 2번 열에서는 약 94%가 진행된 것으로 나타났으며, 5b의 1번 열에서 약 93%, 2번 열의 경우 69% 가 진행된 것으로 나타났다. 또한, 도 5a의 3 및 4번 열에서 타겟에 의한 반응 차이는 82%로, 도 5b의 3 및 4번 열에서는 64%의 반응 진행 차이가 확인되었다. 아울러, miRNA 농도에 따른 유니버셜 코드의 반응 진행을 확인한 결과, Cycle 1에서 6시간 기준 평균적으로 약 3.95 배, Cycle 2에서 약 1.24 배 증폭되는 것으로 확인되었으며, 전체 순환 에서는 6시간 기준 평균 2.13 배 증폭되나, 12시간까지 반응을 진행하면 4.13 배까지 증폭률이 증가하는 것으로 나타났다 (도 6). 이를 통해, 두 개의 Cycle이 모두 돌아가면서 전체 반응 시간이 증가하게 된 것으로 보이며, 시스템의 검출 한계는 18.5 nM로 계산되었다.
실시예 4. 다양한 표적 RNA에 대한 적용
유니버셜 코드 시스템의 특이성을 확인하기 위하여, 상기 표 1의 miRNA들에 대한 S1 및 S2, Output, Fuel 1 및 2, 및 유니버셜 코드 (universal code, U)들을 상기 실시예들에서와 같이 제작하였다 (표 3). 이 후, miR-21의 유니버셜 코드에 대해 총 12종의 miRNA를 주입하였을 때의 반응 진행을 형광으로 분석하였다. 구체적으로, 형광 샘플은 200 mM 염 농도의 TE 버퍼 상에서 반응을 진행시켰고, 형광 동역학측정을 위해 SpectraMax M5 microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, California, USA)를 사용해 12시간 동안 FAM (Fluorescein phosphoramidite, 여기 파장 485nm, 방출 파장 525nm), Cy 3 (Cyanine-3, 여기 파장 540nm, 방출 파장 570nm) 및 Cy 5 (Cyanine-5, 여기 파장 640nm, 방출 파장 670nm) 조건에서 각 형광의 변화를 확인하였다. 시료 당 100 nM 농도, 100 μ의 부피로 실험되었으며 모든 실험은 같은 조건에서 같은 실험자에 의해 3회 실험되었다. 각 사이클 시스템의 반응은 각각 S1O 서열 (S1 서열과 O 서열이 결합된 상태)에 타겟 miRNA인 miR-21 및 F1을 주입하거나, S2U 서열 (S1 서열과 U 서열이 결합된 상태)에 O 및 F2를 주입하는 형태로 이루어졌다. 전체 사이클 시스템의 경우 S1O 및 S2U를 동시에 포함하고 있는 시료에 F1, F2 및 농도별 miRNA를 주입하는 방식으로 이루어졌다. 최종적으로 12종에 대한 유니버셜 코드 전환 확인에서는 S1O, S2U, F1 및 F2가 모두 있는 상황에서 miRNA를 넣었을 때와 넣지 않았을 때, 소광체가 달린 S2를 다시 넣어준 상태에서 차광 되는 양을 통해 유니버셜 코드의 전환이 확인되었다. 아울러, 상기 12종의 각 miRNA들에 대한 유니버셜 코드 변환 시스템의 Cycle 1 부분의 반응 진행도와 Cycle 2 부분의 반응 진행도를 전기영동으로 상기 실시예 2 및 3에서와 같이 확인하였다.
Figure PCTKR2020013234-appb-T000003
Figure PCTKR2020013234-appb-I000004
Figure PCTKR2020013234-appb-I000005
그 결과, miR-21의 유니버셜 코드에 다른 miRNA를 주입했을 때와 비교하여 miR-21을 주입하였을 때가 평균 약 7배 이상의 반응 진행 차이가 발생하였다 (도 7a). 이는 특정 표적에 대한 유니버셜 코드가 해당 표적에 특이적인 검출능을 갖는다는 것을 의미한다. 이에 따른 유의성 분석을 위해 T검정을 진행했으며, 모든 miRNA에 대해 p-값 0.01 이하로 유의성이 있음을 확인하였다.
또한, 최종적으로 12종 각각의 표적 miRNA에 대한 유니버셜 코드 시스템에 의한 유니버셜 코드로의 전환 및 검출능을 확인한 결과, 각각의 코드 시스템에 맞추어 miRNA를 주입한 시료와 주입하지 않은 시료의 형광 데이터가 확연히 구분 가능한 결과 차이를 나타냈으며 T 검정을 통한 유의성 검사에서도 모두 유의미한 차이를 보여주었다 (도 7b). 추가로 각각의 표적 miRNA에 대한 유니버셜 코드 시스템의 전기영동 결과에서도 12종의 표적 miRNA 각각이 단일화된 서열을 갖는 유니버셜 코드로 잘 전환되는 것으로 나타났다 (도 8 및 9).
실시예 5. 유니버셜 코드의 핵산 검출용 그래핀 센서
다음으로, 상기 유니버셜 코드를 사용한 본 발명의 핵산 검출용 그래핀 센서를 사용하여 농도에 따른 형광 값을 확인하였다. 샘플은 200 mM 염 농도의 TE 완충액으로, 핵산 검출 시스템의 농도가 각각 100 nM이 되도록 샘플을 준비하고, 표적 핵산(EGFR del 19 돌연변이체)을 첨가한 후, 30분간 인큐베이션하였다. TNT 시스템 (그래핀 바이오센서)을 동일 농도로 주입 후 산화 그래핀 첨가하였다. 그 후, SpectraMax M5 마이크로 플레이트를 사용하여 FAM (Fluorescein phosphoramide, 여기 파장 485nm, 방출 파장 525nm)으로 형광 값을 측정하였다. 사용된 표적 핵산(EGFR del 19 돌연변이체) 및 TNT 시스템의 각각의 프로브 서열은 표 4와 같다.
도 10에 도시된 것과 같이, 타겟 농도를 5, 10, 20, 50, 100, 150 및 200 nM으로 변경함에 따라 형광 값이 sigmoidal 형으로 증가하는 것을 확인하였으며, 이는 표적의 형태가 성공적으로 변환되고 일부 증폭되었음을 의미한다.
Figure PCTKR2020013234-appb-T000004
본 발명에 따르면, 무효소 반응으로 표적 핵산을 검출하거나 검출 신호를 증폭할 수 있으며, 다양한 표적 핵산을 미리 지정해둔 유니버셜 코드로 전환/단일화할 수 있으므로, 표적 핵산 각각에 대한 프로브를 매번 새로 디자인할 필요가 없어, 복잡한 구조의 검출 시스템에 유용하게 적용할 수 있다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (29)

1) 핵산 서열 A1, 핵산 서열 A2, 제 1 토홀드 서열 A3, 핵산 서열 A4 및 제 2 토홀드 서열 A5를 순차적으로 포함하되, 핵산 서열 A4 및 제 1 토홀드 서열 A5는 전체로서 표적 핵산의 전부 또는 일부 서열과 결합 가능한 상보 서열이며, 핵산 서열 A1 및 핵산 서열 A2는 서로 상보적으로 결합하여 헤어핀 구조를 형성하는 제 1 핵산 S1(Substrat 1);
2) 핵산 서열 A4에 상보적인 서열 및 제 1 토홀드 서열 A3과 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 2 핵산 O(Output);
3) 핵산 서열 A4의 일부와 상보적인 서열, 제 1 토홀드 서열 A3에 상보적인 서열 및 핵산 서열 A2의 전부 또는 일부 서열과 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 3 핵산 F1(Fuel 1);
4) 핵산 서열 B1, 핵산 서열 B2, 제 3 토홀드 서열 B3, 핵산서열 B4 및 제 4 토홀드 서열 B5를 순차적으로 포함하되, 핵산 서열 B4 및 제 4 토홀드 서열 B5는 전체로서 제 2 핵산 O의 전부 또는 일부 서열과 결합 가능한 상보 서열이며, 핵산 서열 B1 및 핵산 서열 B2는 서로 상보적으로 결합하여 헤어핀 구조를 형성하는 제 4 핵산 S2(Substrate 2);
5) 핵산 서열 B4에 상보적인 서열 및 제 3 토홀드 서열 B3에 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 5 핵산 U(Universal code); 및
6) 핵산 서열 B4의 일부와 상보적인 서열, 제 3 토홀드 서열 A3에 상보적인 서열 및 핵산 서열 B2의 전부 또는 일부 서열과 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 6 핵산 F2(Fuel 2)를 포함하는, 핵산 검출용 조성물.
제 1항에 있어서, 제 2 핵산 O 및 제 1 핵산 S1가 상보적으로 결합하여 이중 가닥 (S1O)을 형성하고, 및 제 5 핵산 U 및 제 4 핵산 S2와 상보적으로 결합하여 이중 가닥 (S2U)을 형성하고 있는, 핵산 검출용 조성물.
제 1항에 있어서, 제 2 토홀드 서열 A5 및 제 4 토홀드 서열 B5는 단일가닥으로 노출되어 있는, 핵산 검출용 조성물.
제 1항에 있어서, 제 2 토홀드 서열 A5 또는 제 4 토홀드 서열 B5는 4 내지 8개의 뉴클레오티드를 포함하는, 핵산 검출용 조성물.
제 1항에 있어서, 제 3 핵산 F1 또는 제 6 핵산 F2가 헤어핀 구조를 가지는, 핵산 검출용 조성물.
제 5항에 있어서, 제 3 핵산 F1 또는 제 6 핵산 F2의 줄기(stem) 부분이 6 내지 12개의 뉴클레오티드를 포함하는, 핵산 검출용 조성물.
제 1항에 있어서, 제 1 토홀드 서열 B3 또는 제 3 토홀드 서열 B3는 4 내지 12 개의 뉴클레오티드를 포함하는, 핵산 검출용 조성물.
제 1항에 있어서, 표적 핵산이 제 1 핵산 S1의 제 2 토홀드 서열 A5와 상보적으로 결합하면 분지점 이동(branch migration) 반응을 통해 제 2 핵산 O를 방출시키고 제 3 토홀드 서열 A3가 노출되는, 핵산 검출용 조성물.
제 8항에 있어서, 표적 핵산과 결합한 제 1 핵산 S1의 제 1 토홀드 서열 A3과 제 3 핵산 F1이 결합하여 분지점 이동 반응을 통해 표적 핵산을 방출시키는, 핵산 검출용 조성물.
제 9항에 있어서, 방출된 표적 핵산이 상보적으로 결합하여 이중 가닥을 형성하고 있는 제 2 핵산 O 및 제 1 핵산 S1 (S1O)의 제 2 토홀드 서열 A5와 재반응되는, 핵산 검출용 조성물.
제 8항에 있어서, 방출된 제 2 핵산 O가 제 4 핵산 S2의 제 4 토홀드 서열 B5와 상보적으로 결합하여 분지점 이동 반응을 통해 제 5 핵산 U를 방출시키는, 핵산 검출용 조성물.
제 11항에 있어서, 제 2 핵산 O와 결합한 제 4 핵산 S2의 제 3 토홀드 서열 B3와 제 6 핵산 F2가 결합하여 분지점 이동 반응을 통해 제 2 핵산 O를 방출시키는, 핵산 검출용 조성물.
제 12항에 있어서, 방출된 제 2 핵산 O가 상보적으로 결합하여 이중 가닥을 형성하고 있는 제 4 핵산 S2 및 제 5 핵산 U (S2U)의 제 4 토홀드 서열 B5와 재반응되는, 핵산 검출용 조성물.
제 1항에 있어서, 토홀드 매개 가닥 변위 반응 (Toehold mediated strand displacement reaction)을 통해 방출된 제 5 핵산 U로서 표적 핵산의 검출 신호를 증폭하는, 핵산 검출용 조성물.
제 14항에 있어서, 무효소 자가조립으로 표적 핵산의 검출 신호를 증폭하는, 핵산 검출용 조성물.
제 1항에 있어서, 제 1 핵산 S1이 소광물질(quencher)을 추가로 포함하는, 핵산 검출용 조성물.
제 16항에 있어서, 소광물질은 답실(Dabcyl), TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 블랙홀 퀸처(Black Hole Quencher), Qxl, 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ, IRDye QC-1 군으로부터 선택된 하나 이상인, 핵산 검출용 조성물.
제 1항에 있어서, 제 2 핵산 O 및 제 5 핵산 U이 형광물질을 포함하는, 핵산 검출용 조성물.
제 18항에 있어서, 형광물질은 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 핵산 검출용 조성물.
제 1항에 있어서, 제 5 핵산 U에 상보적인 핵산 및 형광물질을 포함하는 단일가닥 프로브를 포함하는 형광핵산나노구조체, 및 그래핀 옥사이드를 추가로 포함하는, 핵산 검출용 조성물.
1) 핵산 서열 A1, 핵산 서열 A2, 제 1 토홀드 서열 A3, 핵산 서열 A4 및 제 2 토홀드 서열 A5를 순차적으로 포함하되, 핵산 서열 A4 및 제 1 토홀드 서열 A5는 전체로서 표적 핵산의 전부 또는 일부 서열과 결합 가능한 상보 서열이며, 핵산 서열 A1 및 핵산 서열 A2는 서로 상보적으로 결합하여 헤어핀 구조를 형성하는 제 1 핵산 S1;
2) 핵산 서열 A4에 상보적인 서열 및 제 1 토홀드 서열 A3과 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 2 핵산 O;
3) 핵산 서열 A4의 일부와 상보적인 서열, 제 1 토홀드 서열 A3에 상보적인 서열 및 핵산 서열 A2의 전부 또는 일부 서열과 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 3 핵산 F1;
4) 핵산 서열 B1, 핵산 서열 B2, 제 3 토홀드 서열 B3, 핵산서열 B4 및 제 4 토홀드 서열 B5를 순차적으로 포함하되, 핵산 서열 B4 및 제 4 토홀드 서열 B5는 전체로서 제 2 핵산 O의 전부 또는 일부 서열과 결합 가능한 상보 서열이며, 핵산 서열 B1 및 핵산 서열 B2는 서로 상보적으로 결합하여 헤어핀 구조를 형성하는 제 4 핵산 S2;
5) 핵산 서열 B4에 상보적인 서열 및 제 3 토홀드 서열 B3에 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 5 핵산 U; 및
6) 핵산 서열 B4의 일부와 상보적인 서열, 제 3 토홀드 서열 A3에 상보적인 서열 및 핵산 서열 B2의 전부 또는 일부 서열과 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 6 핵산 F2를 포함하는, 표적 핵산 검출용 키트.
1) 핵산 서열 A1, 핵산 서열 A2, 제 1 토홀드 서열 A3, 핵산 서열 A4 및 제 2 토홀드 서열 A5를 순차적으로 포함하되, 핵산 서열 A4 및 제 1 토홀드 서열 A5는 전체로서 표적 핵산의 전부 또는 일부 서열과 결합 가능한 상보 서열이며, 핵산 서열 A1 및 핵산 서열 A2는 서로 상보적으로 결합하여 헤어핀 구조를 형성하는 제 1 핵산 S1;
2) 핵산 서열 A4에 상보적인 서열 및 제 1 토홀드 서열 A3과 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 2 핵산 O;
3) 핵산 서열 A4의 일부와 상보적인 서열, 제 1 토홀드 서열 A3에 상보적인 서열 및 핵산 서열 A2의 전부 또는 일부 서열과 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 3 핵산 F1;
4) 핵산 서열 B1, 핵산 서열 B2, 제 3 토홀드 서열 B3, 핵산서열 B4 및 제 4 토홀드 서열 B5를 순차적으로 포함하되, 핵산 서열 B4 및 제 4 토홀드 서열 B5는 전체로서 제 2 핵산 O의 전부 또는 일부 서열과 결합 가능한 상보 서열이며, 핵산 서열 B1 및 핵산 서열 B2는 서로 상보적으로 결합하여 헤어핀 구조를 형성하는 제 4 핵산 S2;
5) 핵산 서열 B4에 상보적인 서열 및 제 3 토홀드 서열 B3에 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 5 핵산 U; 및
6) 핵산 서열 B4의 일부와 상보적인 서열, 제 3 토홀드 서열 A3에 상보적인 서열 및 핵산 서열 B2의 전부 또는 일부 서열과 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 6 핵산 F2를 포함하고, 토홀드 매개 가닥 변위 반응을 통해 표적 핵산을 소정의 유니버셜(universal) 코드인 제 5 핵산 U로 전환하는, 유니버셜 코드 전환용 조성물.
제 22항에 있어서, 제 1 핵산 S1, 제 2 핵산 O, 제 3 핵산 F1 및 제 4 핵산 S2의 제 4 토홀드 서열 B5를 표적 핵산에 따라 변경되는, 유니버셜 코드 전환용 조성물.
제 22항에 있어서, 제 6 핵산 F2 및 제 5 핵산 U는 표적 핵산과 상관없이 소정의 서열로 고정되는, 유니버셜 코드 전환용 조성물.
1) 핵산 서열 A1, 핵산 서열 A2, 제 1 토홀드 서열 A3, 핵산 서열 A4 및 제 2 토홀드 서열 A5를 순차적으로 포함하되, 핵산 서열 A4 및 제 1 토홀드 서열 A5는 전체로서 표적 핵산의 전부 또는 일부 서열과 결합 가능한 상보 서열이며, 핵산 서열 A1 및 핵산 서열 A2는 서로 상보적으로 결합하여 헤어핀 구조를 형성하는 제 1 핵산 S1;
2) 핵산 서열 A4에 상보적인 서열 및 제 1 토홀드 서열 A3과 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 2 핵산 O;
3) 핵산 서열 A4의 일부와 상보적인 서열, 제 1 토홀드 서열 A3에 상보적인 서열 및 핵산 서열 A2의 전부 또는 일부 서열과 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 3 핵산 F1;
4) 핵산 서열 B1, 핵산 서열 B2, 제 3 토홀드 서열 B3, 핵산서열 B4 및 제 4 토홀드 서열 B5를 순차적으로 포함하되, 핵산 서열 B4 및 제 4 토홀드 서열 B5는 전체로서 제 2 핵산 O의 전부 또는 일부 서열과 결합 가능한 상보 서열이며, 핵산 서열 B1 및 핵산 서열 B2는 서로 상보적으로 결합하여 헤어핀 구조를 형성하는 제 4 핵산 S2;
5) 핵산 서열 B4에 상보적인 서열 및 제 3 토홀드 서열 B3에 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 5 핵산 U; 및
6) 핵산 서열 B4의 일부와 상보적인 서열, 제 3 토홀드 서열 A3에 상보적인 서열 및 핵산 서열 B2의 전부 또는 일부 서열과 상보적인 서열을 순차적으로 포함하는 제 6 핵산 F2를 포함하고,
토홀드 매개 가닥 변위 반응을 통해 표적 핵산을 소정의 유니버셜 코드인 제 5 핵산 U로 전환하는, 유니버셜 코드 전환 키트.
1) 제 21항의 표적 핵산 검출용 키트에서 제 1 핵산 S1의 핵산 서열 A4 및 제 2 토홀드 서열 A5를 표적 핵산의 전부 또는 일부 서열과 결합 가능한 상보 서열로 변경하고, 이에 따라 제 2 핵산 O, 제 3 핵산 F1 및 제 4 핵산 S2의 제 4 토홀드 서열 B5를 변경하며; 및
2) 토홀드 매개 가닥 변위 반응을 통해 방출된 제 5 핵산 U를 검출하는 것을 포함하는, 핵산을 검출하는 방법.
제 26항에 있어서, 방출된 제 5 핵산 U에 특이적인 형광핵산나노구조체 및 그래핀 옥사이드를 이용하여 방출된 제 5 핵산 U를 검출하는, 핵산을 검출하는 방법.
제 3 핵산 F1 및 제 6 핵산 F2의 혼성화물;
제 2 핵산 O 및 제 1 핵산 S1가 상보적으로 결합한 이중 가닥 (S1O); 및
제 5 핵산 U 및 제 4 핵산 S2와 상보적으로 결합한 이중 가닥 (S2U)을 포함하는 핵산 검출용 바이오센서.
제 28항에 있어서, 제 5 핵산 U에 상보적인 핵산 및 형광물질을 포함하는 단일가닥 프로브를 포함하는 형광핵산나노구조체, 및 그래핀 옥사이드를 추가로 포함하는 핵산 검출용 바이오센서.
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