WO2024034796A1 - 다중 표적 동시 분석을 통한 변이체 검출용 qpcr 방법 - Google Patents

다중 표적 동시 분석을 통한 변이체 검출용 qpcr 방법 Download PDF

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WO2024034796A1
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qpcr
mutation
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cov
sars
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김재종
임시규
경아영
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(주)제노텍
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    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence

Definitions

  • the present invention provides a method for increasing the specificity and sensitivity of real-time polymerase chain reaction (PCR) for distinguishing and detecting specific genetic variants, and a PCR to which this method can be applied. It's about the kit.
  • PCR real-time polymerase chain reaction
  • the present invention relates to a qPCR method and kit that simultaneously detects multiple mutation regions and increases the positive detection rate and detection specificity of mutant nucleic acids.
  • qPCR quantitative real time PCR
  • SNV single nucleotide variation
  • SNP single nucleotide polymorphisms
  • the qPCR method is known as an analysis method using TaqMan Probe, a hydrolysis probe method, and the basic principle applied is to utilize the 5' ⁇ 3' exonuclease activity possessed by Taq DNA polymerase ( Holland P. M. et al., 1991. Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 7276-7280). In 1991, Holland et al. showed that when using a probe with a base sequence complementary to the template DNA, a specific PCR reaction could be confirmed in real time by the 5' ⁇ 3' exonuclease activity of Taq DNA polymerase. Since then, based on this method, various qPCR techniques using probes modified with fluorescent pigments have been developed and are widely used in various fields (Heid, C. A. et al., 1996. Genome Res. 6. 986-994.; Livak K. J. 1999. Genet. Anal., 14:143-149).
  • the hydrolysis probe method uses a probe with a reporter and a quencher bound to both ends along with a primer during the PCR reaction, and uses the principle of fluorescence resonance energy transfer. That is, when the reporter and the quencher are adjacent, The released energy is transferred to an adjacent quencher and no fluorescence is detected. Then, as the PCR amplification product increases, the probe bound to the target gene is degraded by the 5' ⁇ 3' nuclease activity of Taq DNA polymerase, producing a reporter. This is the principle by which fluorescence is emitted.
  • qPCR is a method that measures and indicates the amount of fluorescence generated from the decomposition of a hydrolysis probe in real time, and is also called real time PCR.
  • the magnitude of the fluorescence value shown by the qPCR method is expressed as RFU (relative fluorescence unit) and ⁇ Rn (difference between the experimental Rn value and the baseline Rn value) depending on the application of reference fluorescence and the device, and the quantitative value of the PCR cycle is Cq (quantification cycle).
  • Cq or Ct is the number of the first cycle that passes the threshold line in qPCR, and represents the number of PCR cycles it takes for the tested sample to show meaningful fluorescence values. This is an important indicator of qPCR, which is used to quantify the amount of a sample through qPCR comparison with a quantified standard. Generally sold qPCR devices appropriately display RFU and Ct through installed and operated programs and charts.
  • SARS-CoV-2 (Covid-19) is an RNA virus, and mutations in its genetic sequence occur during replication in the body of animals such as humans. These sequence mutations cause the emergence of clinically important variants such as Delta variant (B.1.617.2), Omicron variant (BA.1), and Stealth Omicron variant (BA.2).
  • the above mutant strains have changes in infectivity and pathogenicity, so monitoring of mutant strains is very important from a public health epidemiological perspective. In the case of a pandemic or endemic, the emergence of new mutant strains is becoming more frequent, and monitoring of these mutant strains is necessary for health epidemiological studies such as the frequency, timing, and distribution of mutant strains, and also to monitor the fatality rate and transmissibility of each mutant strain. It can provide very important information for understanding.
  • WHO World Health Organization
  • VOC variants of concern
  • VOI variants of interest
  • the mutant strains to be analyzed become more diverse and the number of detection mutation sites increases, resulting in an increase in the number of qPCR reaction tubes.
  • a total of four different wavelength fluorescent probes must be used, including Internal Control (1) and Omicron-specific mutation sites (3). Therefore, if 2-3 mutant strains need to be tested, 2-3 separate reaction tubes must be used, so multiple reaction tubes must be used. Therefore, the inconvenience of having to use multiple reaction tubes for one sample arises, the number of samples that can be analyzed at a clinical analysis institute decreases, and the analysis cost increases.
  • the viral load in clinical specimens is reported to vary from 3 to 10 log copies/ml depending on the progression of the disease (D. Jacot, G. Greub, K Jaton et al., https://doi.org/10.1016/j.micinf.2020.08.004).
  • the fluorescence value of a hydrolysis probe has the advantage of increasing the signal value by making it easier to bind the probe to the target sequence when the sequence is longer, while dissociation is suppressed and decomposition by polymerase is facilitated, but especially at high virus amounts, it is non-specific.
  • the occurrence of non-specific signals due to binding becomes frequent.
  • specificity increases, which lowers the generation of non-specific signals when detecting mutations, thereby lowering the risk of false positive detection.
  • the probe sequence is shortened, the binding ability to the target sequence decreases, and the size of the fluorescence signal generated by hydrolysis decreases, increasing the risk of false negatives.
  • the binding power of the fluorescent hydrolysis probe for wild-type detection commonly used is lowered due to the appearance of unexpected mutations in the target sequence region, and thus the sensitivity of the qPCR test for positive detection is lowered, raising the possibility of false negative detection. It gets higher.
  • the object of the present invention is to provide a kit and method for identifying mutations by qPCR using a fluorescent hydrolysis probe, and an efficient and economical mutation identification qPCR method and kit that can simultaneously analyze multiple mutant strains in one reaction tube. It is intended to provide.
  • the purpose of the present invention is to provide a qPCR method and kit for identifying mutations with high specificity and reducing the possibility of false positives or false negatives in the kit and method for identifying mutations by qPCR using a fluorescent hydrolysis probe.
  • the purpose of the present invention is to provide a qPCR method and kit for detecting SARS-Cov-2 omicron and delta variants as a specific application example.
  • the present inventor sought a method of performing qPCR in one reaction tube by applying each specific fluorescent probe modified (labeled) with the same fluorophore to multiple target detection sequences. .
  • the method of the present invention in the case of conventional qPCR, up to 4 types of fluorophores can be used with current technology, making it possible to detect up to 3 mutant strains.
  • one probe for internal control and a fluorescent hydrolysis probe for detection of each mutant strain are composed by modifying the same fluorophore, so it is possible to implement it in one reaction tube by composing three types of fluorescent hydrolysis probes for each mutant strain.
  • the method of the present invention is not limited to this, and if technology that can simultaneously use four or more types of fluorescent substances becomes possible, simultaneous detection of three or more mutant strains using the present invention is possible.
  • the number of mutation sites to be detected for each mutant strain is preferably 2 to 3, but since the same fluorescent substance is used for each mutant strain, there is no particular limit to the number.
  • the signals generated from each specific fluorescent probe are detected together to increase the fluorescent signal value, overcoming the problem of using fluorescent probes with a short sequence length that have high specificity but low fluorescent signal value, and increasing the fluorescent signal value.
  • the present invention can reduce the possibility of false negatives by simultaneously detecting multiple mutation sites of each mutant strain with a probe that emits the same fluorescence, and can reduce the number of reaction tubes for detecting multiple mutant strains simultaneously, making it an economical and efficient mutant strain detection method. can be provided.
  • the present invention reduces the low positive detection rate that occurs when using a fluorescent hydrolysis probe with high specificity but low fluorescence signal value and low Tm value by detecting multiple mutation sites simultaneously with a probe that emits the same fluorescence, resulting in a high fluorescence signal in qPCR.
  • the positive detection rate and detection specificity can be significantly increased.
  • the present invention can increase the signal value by using probes using the same type of fluorophore for multiple target genes, thereby increasing the sensitivity of qPCR not only for distinguishing mutations but also for detecting general target genes.
  • Figure 1 shows qPCR results as the length (Tm value) of the mutation detection probe increases.
  • FAM-Covid19-Q954H (a), FAM-Covid19-Q954H+2 (b), and AM-Covid19-Q954H+3 (c) were used as probes, and each standard plasmid was used as a template.
  • - ⁇ - is a copy number of 5 x 10 3
  • - ⁇ - is a variant test group of 5 It is a non-mutated wild type test group
  • -X- is a control group without template addition.
  • Figure 2 compares single mutation site detection qPCR and multiple mutation site detection qPCR tests. This is a qPCR plot with multiple detections of T547K (a, d), Q954H (b, e), D796Y (c, f), and these three regions (g). The amount of probe used was 0.5 ⁇ M (a, b, c) and 1.5 ⁇ M (d, e, f), and 0.5 ⁇ M of each of the three probes was used in the multi-site test (g). Probes corresponding to each mutation were used: FAM-Covid19-T547K-1, FAM-Covid19-Q954H, and FAM-Covid19-D796Y-4.
  • Each corresponding standard plasmid was used as a template, - ⁇ - is a copy number of 5 , - ⁇ - is the non-mutated wild type test group with 5 x 10 7 copy number, and -X- is the control group without template addition.
  • Figures 3a and 3b show the results of detection of delta mutant strains (Fig. 3a) and detection of omicron mutant strains (Fig. 3b) using the multiple mutation site detection qPCR test (cloned plasmid DNA) method.
  • cloned standard plasmid DNA was used, and the primer and probe sets in Table 3 were used.
  • - ⁇ - is 5 x 10 3 copy number
  • - ⁇ - is 5 x 10 2 copy number
  • - ⁇ - 5 It is a non-mutated wild type test group
  • -X- is a control group without template addition.
  • RdRp DNA (---) was used as an internal qPCR control.
  • Figures 4a and 4b show the results of detection of delta mutant strains (Fig. 4a) and detection of omicron mutant strains (Fig. 4b) using the multiple mutation site detection qPCR test (SARS-Cov-2 RNA) method.
  • SARS-Cov-2 RNA multiple mutation site detection qPCR test
  • - ⁇ - is 5 x 10 3 copy number
  • - ⁇ - is 5 x 10 2 copy number
  • - ⁇ - 5 It is a non-mutated wild type test group
  • -X- is a control group without template addition
  • --- is an internal qPCR control group.
  • the two or more fluorescent hydrolysis probes are each complementary to two or more target base sequences, bind to the target base sequences, and are modified with the same fluorescence.
  • the present invention relates to a qPCR kit for detection through simultaneous analysis of multiple targets. .
  • the present invention relates to a qPCR kit for detection, wherein the qPCR kit for detection is a kit for detecting mutant strains containing a specific nucleic acid sequence or a kit for detecting wild type specimens.
  • the present invention provides a qPCR method that can increase the signal value by using probes modified with the same type of fluorescence in multiple target base sequences, thereby increasing the sensitivity of not only distinguishing mutations but also detecting genes with common target base sequences; It's about the kit.
  • the present invention provides a variant using multi-target simultaneous analysis in which the fluorescent hydrolysis probe consists of 10 to 30 nucleotides, and the 5' and 3' ends are modified with a reporter and a quencher capable of transferring fluorescence resonance energy, respectively. Or, it relates to a qPCR kit for wild type detection.
  • a template to be tested containing two or more target base sequences from the same taxonomic group; Forward primers and reverse primers for two or more target base sequences of the template; A nucleic acid polymerase that polymerizes nucleic acids from the forward and reverse primers; And two or more fluorescent hydrolysis probes, each complementary to two or more target base sequences, binding to the target base sequence, and modified with the same fluorescence; preparing a mixture for qPCR by mixing;
  • (B) It relates to a qPCR method for simultaneous multi-target analysis, which includes the step of detecting a gene with a target base sequence with high specificity by performing a polymerase chain reaction on the qPCR mixture.
  • the present invention is a qPCR method for detecting genetic variants in which the fluorescent hydrolysis probe consists of 10 to 30 nucleotides, and the 5' and 3' ends are modified with a reporter and a quencher capable of transferring fluorescence resonance energy, respectively. It's about.
  • the present invention relates to a multi-target simultaneous analysis qPCR method, wherein the multi-target simultaneous analysis qPCR method is for detecting mutant strains containing a specific nucleic acid sequence or for detecting wild-type specimens.
  • the present invention provides a forward primer; reverse primer; A nucleic acid polymerase that polymerizes nucleic acids from the forward and reverse primers, respectively, and two or more types of fluorescent hydrolysis that each bind complementary to two or more positions among the T547K, D796Y, and Q954H mutation positions of SARS-Cov-2. It relates to a qPCR kit for determining SARS-Cov-2 omicron mutations, including primers, wherein the two or more types of fluorescent hydrolysis primers are modified with the same fluorescence.
  • the present invention relates to a qPCR kit for determining SARS-Cov-2 omicron mutations, in which the fluorescent hydrolysis primers include primers for each of the three mutation positions of T547K, D796Y, and Q954H.
  • the present invention provides a forward primer; reverse primer; and a nucleic acid polymerase that polymerizes nucleic acids from the forward and reverse primers, respectively, and two or more types of fluorescent singers that each bind complementary to two or more positions among the T19R, L452R, and P681R mutation positions of SARS-Cov-2. It relates to a qPCR kit for determining SARS-Cov-2 delta mutations, which contains decomposition primers, wherein the two or more types of fluorescent hydrolysis primers are modified with the same fluorescence.
  • the present invention relates to a qPCR kit for determining SARS-Cov-2 delta mutation, in which the fluorescent hydrolysis primer includes primers for each of the three mutation positions of T19R, L452R, and P681R.
  • the present invention relates to a qPCR method for detecting SARS-Cov-2 omicron variants, wherein in step (a), the two or more fluorescent hydrolysis probes are three types of probes for each of T547K, D796Y, and Q954H.
  • the present invention relates to a qPCR method for detecting SARS-Cov-2 delta variants, wherein in step (a), the two or more fluorescent hydrolysis probes are three types of probes for each of T19R, L452R, and P681R.
  • the method of the present invention can be applied to PCR methods and kits that detect multiple specific sequences for detecting the same taxon using the same fluorescent hydrolysis probe. It is self-evident to those with ordinary knowledge.
  • RNA samples were performed using three standard pathogen resources (NCCP43326, NCCP43410, NCCP43408) distributed from the National Pathogen Resource Bank.
  • NCCP43326 is a wild-type Covid 19
  • NCCP43410 is a Delta-type mutant strain
  • NCCP43408 is an Omicron-type mutant strain.
  • RNA samples were used while frozen and stored at -70°C.
  • Sequence comparison of variants is performed by comparing the sequence information of the Spike Trimer coding region among the genome sequences of each sample registered with the Global Initiative on Sharing All Influenza Data (GISAID), and the frequency of occurrence of the analyzed sequences (Table 1). As a standard, it was selected as a target region for variant differentiation.
  • Table 1 below shows the mutation frequency of major mutant strains (VOC) of SARS-Cov-2.
  • PCR product containing the T19R, L452R, T547K, P681R, D796Y, and Q954H regions of the S gene of SARS-Cov-2 was prepared and then transferred to the pTOP-TA vector [Engenomics Co., Ltd., Korea] and cloned into 6 wild types (pCov19-S-T19, pCov19-S-L452, pCov19-S-T547, pCov19-S-P681, pCov19-S-D796, pCov19-S-Q954) and 6 mutant types.
  • Table 3 shows primer and probe information used in the examples and test examples of the present invention.
  • sequences shown in Table 3 above are SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 23 in order from the top.
  • Real-time polymerase chain reaction was performed using each DNA sample prepared above as a template and using primers and probes prepared according to the test.
  • the primer and probe sets shown in Table 3 were used to detect each suggested mutation. Depending on the test, each primer and probe were used in the range of 0.3 to 0.75 uM.
  • the polymerase and PCR buffer solution used was Enzynomics (cat no. RT 431M), and the total volume of the reaction solution was set to 20 ⁇ L.
  • qPCR was performed using the CFX9600 Real-Time System at 95°C for 10 minutes, followed by 45 to 50 cycles of 10 to 15 seconds at 95°C and 10 to 15 seconds at 60°C.
  • RT-qPCR quantitative reverse transcription PCR
  • SARS-Cov-2 RNA standards of three types of standard pathogen resources NCCP43326, NCCP43410, NCCP43408, distributed from the National Pathogen Resource Bank was performed at 50°C for 30 minutes and at 95°C for 10 minutes. After the reaction, 45 to 50 cycles of 10 to 15 seconds at 95°C and 10 to 15 seconds at 60°C were performed using the CFX9600 Real-Time System.
  • the fluorescent hydrolysis probe for real-time detection in qPCR was designed to have a base sequence capable of hybridizing to the amplification product, and a fluorescent substance (e.g. FAM) at the 5' end to apply the principle of Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). , JOE, or Cy5, etc.), and a probe with a quencher (e.g., BHQ1 or BHQ3, etc.) bound to the 3' end was used.
  • FAM Fluorescence Resonance Energy Transfer
  • JOE Fluorescence Resonance Energy Transfer
  • a probe with a quencher e.g., BHQ1 or BHQ3, etc.
  • Example 1 the change in qPCR signal and Ct value according to the increase or decrease in Tm through change in the length of the fluorescent probe for mutation detection was tested. For this purpose, a test was conducted to detect Q954H, the mutation region of SARS-Cov-2.
  • Figure 1 shows qPCR results for detecting the Q954H mutation as the length (Tm value) of the mutation detection probe increases.
  • FAM-Covid19-Q954H (a), FAM-Covid19-Q954H+2 (b), and AM-Covid19-Q954H+3 (c) were used as probes, and each standard plasmid was used as a template.
  • - ⁇ - is a copy number of 5 x 10 3
  • - ⁇ - is a variant test group of 5 It is a non-mutated wild type test group
  • -X- is a control group without template addition.
  • Table 4 below shows the Ct value* of qPCR according to the increase in Tm of the mutation detection probe.
  • the threshold value was set to the non-detection value of the FAM-Covid19-Q954H probe test group of the wild-type DNA (5 x 10 7 ) test group.
  • Figure 2 compares the qPCR test results for detection of a single mutation site and simultaneous detection of multiple mutation sites. Illustration of qPCR of T547K (a, d), Q954H (b, e), D796Y (c, f) and three-site mixed (g) detection tests. The amount of probe used was 0.5 ⁇ M (a, b, c) and 1.5 ⁇ M (d, e, f). In the multiple mutation site mixing test (g), three types of probes were used at 0.5 ⁇ M each. As probes, FAM-Covid19-T547K-1, FAM-Covid19-Q954H, and FAM-Covid19-D796Y-4 corresponding to each mutation were used.
  • Each corresponding standard plasmid was used as a template, - ⁇ - is a copy number of 5 , - ⁇ - is the non-mutated wild type test group with 5 x 10 7 copy number, and -X- is the control group without template addition.
  • Table 4 shows the Ct value* of qPCR according to the increase in Tm of the mutation detection probe.
  • Figure 3 shows the results of a mixed detection qPCR test (cloned plasmid DNA) for multiple mutation sites, showing the qPCR test results for detection of delta variants (A) and detection of omicron variants (B).
  • cloned standard plasmid DNA was used, and the primer and probe sets in Table 3 were used.
  • - ⁇ - is 5 x 10 3 copy number
  • - ⁇ - is 5 x 10 2 copy number
  • - ⁇ - 5 It is a non-mutated wild type test group
  • -X- is a control group without template addition.
  • RdRp DNA (---) was used as an internal qPCR control.
  • SARS-Cov-2 RNA was used to detect 3 mutations (T19R, L452R, P681R) for delta mutation and 3 for detection of omicron mutation. Tested for mutations (Q954H, D796Y, T547K) ( Figure 4 and Table 7). As in Example 3, both delta mutants and omicron mutants showed low signal values in the single mutation site detection test, and showed higher signal values and faster Ct values in the case of mixed detection of three mutation sites (Mix). . In particular, at low amounts of viral RNA, the Ct value was detected as less than 40, showing a high positive detection rate (Table 7).
  • FIG. 4 shows multiple mutation site mixed detection qPCR test (SARS-Cov-2 RNA).
  • (A) and (B) are the qPCR test results for detection of Delta mutants and omicron mutants, respectively.
  • SARS-Cov-2 RNA was used, and the primer probe set in Table 3 was used.
  • - ⁇ * - is a copy number of 5 is the unmutated wild-type test group
  • -X- is the template-free control group
  • --- is the internal qPCR control.
  • the present invention is very useful when detecting various types of mutant strains to be detected by distinguishing them from wild type and/or other mutant strains in the fields of health, medicine, pharmacy, veterinary medicine, food, etc.

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Abstract

본 발명은 다수의 변이 부위를 동시에 동일한 형광을 내는 프로브로 검출함으로써 위음성의 가능성을 낮추고, 여러 개의 변이주를 동시에 검출이 용이한 경제적이고 효율적인 변이주 검출방법 및 킷트에 관한 것으로서, 높은 특이도를 가지나 낮은 형광신호값을 가지는 가수분해 형광 프로브 사용 시 나타나는 낮은 양성 검출의 단점을 다수 변이 부위 동시 검출을 통해 qPCR의 높은 형광신호값 및 낮은 Ct 값을 구현하여 검출의 민감도를 높일 수 있다. 또한, 본 발명은 생명체의 같은 분류군 내의 다수의 목적 유전자에 동일한 종류의 형광체를 사용하는 프로브를 사용하여 신호값이 증대되어 검출 민감도가 증대된 qPCR 방법 및 킷트에 관한 것이다.

Description

다중 표적 동시 분석을 통한 변이체 검출용 QPCR 방법
본 발명은 특정 유전자 변이 (variants)의 구분 및 검출을 위한 실시간 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)의 특이도 (specificity)와 민감도 (sensitivity)를 높이는 방법 및 이 방법을 적용할 수 있는 PCR 킷트에 관한 것이다.
좀 더 자세하게는, 본 발명은 다수의 변이 영역을 동시에 검출하여 변이 핵산의 양성 검출도 및 검출 특이도를 높이는 qPCR 방법 및 킷트에 관한 것이다.
In-Del (insertion and deletion), SNV (single nucleotide variation) 또는 SNP (single nucleotide polymorphisms)와 같은 핵산 서열 변이를 구분하는 방법으로는 분자진단 방법을 적용하는 qPCR (quantitative real time PCR)이 일반적이다. qPCR은 빠르며, 민감도와 특이도가 높으며, 분석 비용이 저렴하고, 또한 쉽게 자동화가 가능하다는 장점이 있어 광범위하게 사용되고 있다.
qPCR 방법은 가수분해 프로브 (hydrolysis Probe) 방식인 TaqMan Probe를 사용하는 분석방법으로 알려져 있으며, 이에 적용된 기본 원리는 Taq DNA 폴리머레이즈가 보유하고 있는 5'→3' 엑소뉴클레이즈 활성을 이용하는 것이다 (Holland P. M. et al., 1991. Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 7276-7280). 1991년 Holland 등은 주형 DNA와 상보적 염기서열을 갖는 프로브를 사용할 경우 Taq DNA 폴리머레이즈의 5'→3' 엑소뉴클레이즈 활성에 의해 특정 PCR 반응을 실시간으로 확인할 수 있음을 밝혔다. 이후 이 방법을 기반으로 형광 안료로 수식된 프로브를 활용한 다양한 qPCR 기법들이 개발되어 여러 분야에서 광범위하게 활용되고 있다 (Heid, C. A. et al., 1996. Genome Res. 6. 986-994.; Livak K. J. 1999. Genet. Anal., 14:143-149).
가수분해 프로브 방법은 PCR 반응시 프라이머와 함께 양 말단에 리포터 (reporter)와 퀀처 (quencher)가 결합된 프로브를 사용하며, 형광 공명 에너지 전달 원리를 이용한다 즉, 리포터와 퀀처가 인접되어 있을 경우 리포터로부터 방출된 에너지가 인접한 퀀처로 에너지 전이가 일어나 형광이 검출되지 않다가, PCR 증폭 산물이 증가하면서 표적 유전자에 결합된 프로브가 Taq DNA 폴리머레이즈의 5'→3' 뉴클레이즈 활성에 의해 분해되어 리포터의 형광이 발산되는 원리이다. 이러한 가수분해 프로브 분석 방법 (TaqMan probe assay)은 표적 염기서열에 프로브가 결합하고, 이어지는 뉴클레이즈 활성에 의해 프로브의 분해가 일어날 수 있는 최적의 조건을 찾는 것이 매우 중요하다. qPCR은 가수분해 프로브의 분해에서 발생하는 형광의 양을 실시간으로 측정하여 나타내는 방법으로 실시간 (real time) PCR이라고 불리기도 한다. qPCR 방법으로 나타나는 형광값의 크기는 참조 형광의 적용 및 기기에 따라 RFU (relative fluorescence unit), △Rn (실험 Rn 값으로부터 baseline Rn 값의 차이)로 나타내며, PCR cycle의 정량값은 Cq (quantification cycle) 또는 Ct (threshold cycle), Cp (crossing point), TOP (take-off point) 등으로 표현될 수 있다. qPCR에서 중요한 것은 임계값 (역치, threshold) line을 정하는 것이며, 이는 형광 값이 background 수준을 상회하는 형광강도를 보이는 지점 또는 검출 수준의 형광값 (RFU 또는 △Rn 등)을 기준으로 정하여 사용한다. Cq 또는 Ct는 qPCR에서 threshold line을 지나는 최초의 cycle 수이며, 시험된 시료가 의미있는 형광 값을 나타내는데 걸린 PCR cycle 수를 나타내는 것이다. 이는 정량된 표준물질과의 qPCR 비교를 통해 시료의 양을 정량하는 데 사용되는 qPCR의 중요한 지표이다. 일반적으로 판매되는 qPCR 기기는 설치 운용되는 program 과 chart를 통해 RFU 및 Ct를 적절하게 나타내어준다.
그러므로, qPCR 방법에서 높은 형광신호값 (RFU)과 거기에 비해 상대적으로 낮은 Threhold line, 이를 통해 얻어지는 작은 (빠른) Ct 값을 가지는 것이 qPCR의 효율성 및 감도를 높이는데 매우 중요한 기술 요소가 된다.
SARS-CoV-2 (Covid-19)는 RNA 바이러스로서, 인체와 같은 동물의 체내에서 복제 과정에서 유전자 서열의 변이가 발생한다. 이러한 서열변이는 Delta 변이주 (B.1.617.2), Omicron 변이주 (BA.1), Stealth Omicron 변이주 (BA.2)와 같은 임상적으로 중요한 변이주의 출현을 야기한다. 상기 변이주들은 감염력 및 병원성 변화 등이 발생하여 보건역학적으로 변이주의 모니터링이 매우 중요하다. 펜데믹 혹은 엔데믹의 경우 더욱 더 새로운 변이주의 출현이 빈번해지고 있으며, 이러한 변이주들의 모니터링은 변이주 발생의 빈도, 시기, 분포 등의 보건역학적 연구를 위해 필요하고, 또한 각 변이주의 치명률 및 전파력 등을 파악하는데 매우 중요한 자료를 제공할 수 있다.
이에 따라 세계 보건기구 (WHO) 등과 같이 세계 보건당국은 유사한 유전적 변이 집단을 계통 혹은 계통집단으로 분류하고 우려변이 (VOC) 또는 관심변이 (VOI)와 같이 지정하여 분류하여 관리하고 있다.
변이의 계통에 따라 백신 및 항체 치료제 등의 치료 효과의 감소 등이 발생할 수 있으며, 감염 및 치료의 모니터링을 위한 항원검사 또는 PCR 검사의 민감도 등이 감소될 수도 있을 것이다. 이에 따라 보건당국 및 의료 현장 등에서는 변이주를 구분·검출할 수 있는 효과적이고 경제적 방법이 필요하다.
보건역학적으로 다종의 검출 대상 변이주 (예, Delta, Omicron)를 야생형 및 기타 변이종들과 구분하여 검출하여야 할 필요성이 빈번하게 발생하고 있다. 한 종의 변이주 검사를 위해서는 두 개 이상의 목적 변이부위를 검출하여 검사의 신뢰도를 높이도록 보건 당국에서 권고하고 있다. 모든 동일 변이주로 분류된 그룹이라도 특정 변이부위가 모든 변이주에서 나타나지 않기 때문이다 (예, T19R, 98.3%; T547K 93.9%), 그러므로 별개의 부위를 2개 이상 동시에 검출하여 위음성의 가능성을 낮추도록 권고하고 있다. 이를 만족하기 위해서 현재의 통상의 기술에서는 각각의 목적 검출 변이부위에 해당하는 각기 다른 파장의 형광체가 표지된 프로브를 사용하여 분석하는 방법을 사용하고 있다. 이러한 방법에 따르면, 분석대상 변이주가 다양해지고 검출 변이부위가 많아져 qPCR 반응 튜브의 수가 증가하게 된다. 예컨대 Omicron 변이주 검출을 위하여 Internal Control (1개), Omicron 특이 변이 부위 (3개)를 포함하여 총 4개의 다른 파장 형광 프로브를 사용하여야 한다. 그러므로 만약 2-3개의 변이주를 검사해야 할 경우, 2-3개의 별도 반응 튜브를 사용해야 하므로 다수의 반응 튜브를 사용해야 한다. 따라서 하나의 시료에 대하여 다수의 반응 튜브를 사용해야 하는 번거로움이 생기며, 임상 분석기관에서 분석할 수 있는 시료의 수가 감소하고 분석 비용이 증가하게 된다.
그러므로 하나의 반응 튜브에서 다수의 변이주를 동시에 검출할 수 있는 새로운 방법이 요구된다.
또한 SARS-CoV-2와 같은 바이러스의 경우 임상 검체 내의 바이러스의 양 (viral load)이 질병의 진행 경과에 따라 3 내지 10 log copies/ml로 다양한 것으로 보고된다 (D. Jacot, G. Greub, K. Jaton et al., https://doi.org/10.1016/j.micinf.2020.08.004).
높은 바이러스 양 (viral load는 PCR)을 이용한 감염유무 검출시 낮은 Ct 값을 나타내어 진단에 용이한 반면, 103 복제수 (copies) 이하의 낮은 바이러스 양 (viral load)은 늦은(높은) Ct 값과 낮은 신호값으로 인하여 양성 검출이 불량할 수 있다.
따라서, 바이러스 양이 적은 시료에서의 양성 검출률을 높일 수 있도록 RFU의 증대와 이를 통한 빠른 Ct 값이 구현될 수 있는 경제적 방법이 요구된다.
통상 가수분해 프로브의 형광값은 서열이 길어질 경우 프로브와 타겟 서열과의 결합이 용이해지는 반면, 이탈이 억제되어 중합효소에 의한 분해가 용이해져 신호값이 커지는 장점이 있으나, 특히 높은 바이러스 양에서 비특이적 결합에 의한 비특이 신호의 발생이 빈번해진다. 반면, 프로브의 서열이 짧아질 경우 특이도가 높아지므로 변이 검출시 비특이 신호의 발생이 낮아져 위양성 (false positive) 검출의 위험성이 낮아진다. 그러나 반면 프로브의 서열이 짧아질 경우 표적 서열과의 결합력이 떨어짐에 따라 가수분해에 의해 생성되는 형광신호 값의 크기가 작아지게 되어 위음성 (false negative)의 위험성이 커지게 된다.
또한, 양성 검출용 qPCR일 경우 목적 서열 부위에 예기치 않은 변이의 출현에 의해 상용하는 야생형 검출용 형광 가수분해 프로브의 결합력이 낮아지고 이에 따라 양성 검출을 위한 qPCR 검사 민감도가 낮아져 위음성이 검출될 가능성이 높아진다.
따라서, 본 발명의 목적은 형광 가수분해 프로브를 이용한 qPCR 방법으로 변이를 식별하는 킷트 및 방법에 있어서, 하나의 반응 튜브에서 다수의 변이주 분석을 동시에 할 수 있는 효율적이고 경제적인 변이 식별 qPCR 방법 및 킷트를 제공하려는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 형광 가수분해 프로브를 이용한 qPCR 방법으로 변이를 식별하는 킷트 및 방법에 있어서, 위양성 또는 위음성 가능성을 낮추고 특이성이 높은 변이 식별 qPCR 방법 및 킷트를 제공하려는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 구체적인 적용예로서 SARS-Cov-2 오미크론 및 델타 변이체 검출을 위한 qPCR 방법 및 킷트를 제공하려는 것이다.
위와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해 본 발명자는 여러 곳의 목적 검출 서열에 대해 동일한 형광체로 수식된 (labeled) 각 특이 형광프로브를 적용하여, 하나의 반응 튜브에서 qPCR을 수행하는 방법을 모색하였다.
본 발명의 방법을 이용하면 통상의 qPCR의 경우 현재의 기술로 최대 4종의 형광체를 사용할 수 있으으로 최대 3개의 변이주 검출이 가능하다. 즉, 내부 대조구 (Internal Control) 용 프로브 1종, 변이주별 검출용 형광 가수분해 프로브는 동일 형광체를 수식하여 구성되므로 변이주별 형광 가수분해 프로브 3종으로 구성하여 하나의 반응 튜브에서 구현이 가능하게 된다. 다만, 본 발명의 방법에 이에 한정되는 것은 아니며, 4종 이상의 형광체를 동시에 이용할 수 있는 기술이 가능해지면 본 발명을 이용한 3개 이상의 변이주 동시 검출이 가능하다. 이때 변이주별 검출하고자 하는 변이 부위의 수는 바람직하게는 2 내지 3개로 할 수 있으나, 변이주별로 동일한 형광체를 사용하므로 특별히 그 수에 제한은 없다.
또한, 각 특이 형광프로브에서 발생되는 신호가 함께 검출되어 형광신호 값이 높아지도록 하여, 높은 특이도를 가지나 낮은 형광신호 값을 가지는 서열길이가 짧은 형광 프로브의 사용의 문제점을 극복하고 형광신호 값의 크기를 키워 위음성의 위험성을 낮추어 정확성을 높인 변이체 검출용 qPCR 방법을 발명하기에 이르렀다.
본 발명은 각 변이주의 다수의 변이 부위를 동시에 동일한 형광을 내는 프로브로 검출함으로써 위음성의 가능성을 낮출 수 있고, 여러 개의 변이주를 동시에 검출하기 위한 반응 튜브의 수를 줄일 수 있어 경제적이고 효율적인 변이주 검출방법을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 높은 특이도를 가지나 낮은 형광신호값과 낮은 Tm 값을 가지는 형광 가수분해 프로브 사용시 나타나는 낮은 양성 검출도를 다수의 변이 부위를 동시에 동일한 형광을 내는 프로브로 검출하여 qPCR의 높은 형광신호값 및 낮은 Ct 값을 구현함으로써 양성 검출도 및 검출 특이도를 현저히 높일 수 있다.
또한, 본 발명은 다수의 목적 유전자에 동일한 종류의 형광체를 사용하는 프로브를 사용하여 신호값을 증대함으로써 변이의 구분뿐만 아니라 일반적인 목적 유전자의 검출을 위한 qPCR의 민감도를 높일 수 있다.
도 1은 변이 검출용 프로브의 길이 (Tm 값)의 증가에 따른 qPCR 결과를 나타낸다. Q954H 변이 검출을 위해 프로브는 FAM-Covid19-Q954H (a), FAM-Covid19-Q954H+2 (b), AM-Covid19-Q954H+3 (c)를 사용하였으며, 주형으로는 각 표준 플라스미드를 사용하였다. -△-는 5 x 103 복제수, -○-는 5 x 102 복제수, -□-, 5 x 101복제수의 변이형 시험구이며, -◇-는 5 x 107 복제수의 비변이 야생형 시험구이고, -X-는 주형 무첨가 대조구이다.
도 2는 단일 변이 부위 검출 qPCR 및 다중 변이 부위 검출 qPCR 시험을 비교한 것이다. T547K (a, d), Q954H (b, e), D796Y (c, f) 및 이 세 부위를 다중으로 (g) 검출한 qPCR plot이다. 프로브의 사용량은 0.5 μM (a, b, c) 및 1.5 μM (d, e, f)이고, 다중 부위 시험 (g)에는 세 가지 프로브를 각각 0.5 μM씩 사용하였다. 프로브는 각 변이에 해당하는 FAM-Covid19-T547K-1, FAM-Covid19-Q954H, FAM-Covid19-D796Y-4를 사용하였다. 주형으로는 해당하는 각 표준 플라스미드를 사용하였으며, -○-는 5 x 103 복제수, -□-는 5 x 102 복제수, -◇-, 5 x 101 복제수의 변이형 시험구이며, -△-는 5 x 107 복제수의 비변이 야생형 시험구이고, -X-는 주형 무첨가 대조구이다.
도 3a와 도 3b는 다중 변이 부위 검출 qPCR 시험 (cloned plasmid DNA) 방법으로 Delta 변이주 검출 (도 3a)과 omicron 변이주 검출 (도 3b)을 수행한 결과이다. qPCR을 위해 클론된 각 표준 플라스미드 DNA를 사용하였으며 프라이머, 프로브 set은 표 3의 set를 사용하였다. -○-는 5 x 103 복제수, -□-는 5 x 102 복제수, -◇-, 5 x 101 복제수의 변이형 시험구이며, -△-는 5 x 107 복제수의 비변이 야생형 시험구이고, -X-는 주형 무첨가 대조구이다. 내부 qPCR 대조구 (internal control)는 RdRp DNA (---)를 사용하였다.
도 4a와 도 4b는 다중 변이 부위 검출 qPCR 시험 (SARS-Cov-2 RNA) 방법으로, Delta 변이주 검출 (도 4a)과 omicron 변이주 검출 (도 4b)을 수행한 결과이다. qPCR을 위해 클론된 각 표준 플라스미드 SARS-Cov-2 RNA를 사용하였으며 프라이머, 프로브 set은 표 3의 set를 사용하였다. -○-는 5 x 103 복제수, -□-는 5 x 102 복제수, -◇-, 5 x 101 복제수의 변이형 시험구이며, -△-는 5 x 107 복제수의 비변이 야생형 시험구이고, -X-는 주형 무첨가 대조구이며, --- 는 내부 qPCR 대조구 (internal control)이다.
본 발명은
(가) 동일한 분류군 내의 2개 이상의 표적 염기서열에 대한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머;
(나) 상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로부터 DNA를 중합하는 DNA 중합효소; 및
(다) 상기 2개 이상의 표적 염기서열의 구분을 위한 2개 이상의 형광 가수분해 프로브를 포함하며,
상기 2개 이상의 형광 가수분해 프로브는 각각 2개 이상의 표적 염기서열과 상보적이며 표적 염기서열에 결합하고, 동일한 형광으로 수식된 것임을 특징으로 하는, 다중 표적 동시 분석을 통한 검출용 qPCR 킷트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 검출용 qPCR 킷트가 특정 핵산 서열을 포함하는 변이주 검출용 킷트 또는 야생형 검체 검출용 킷트인, 검출용 qPCR 킷트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 다수의 표적 염기서열에 동일한 종류의 형광으로 수식된 프로브를 사용하여 신호값을 증대함으로써 변이의 구분뿐만 아니라 일반적인 표적 염기서열을 가진 유전자의 검출의 민감도를 높일 수 있는 qPCR 방법 및 킷트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 형광 가수분해 프로브가 10 내지 30 뉴클레오타이드로 이루어지며, 5' 말단과 3' 말단이 각각 형광 공명에너지 전이가 가능한 리포터와 퀀처로 수식된 프로브인, 다중 표적 동시 분석을 이용한 변이체 또는 야생형 검출용 qPCR 킷트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은
(가) 동일한 분류군의 2개 이상의 표적 염기 서열을 포함하는 시험 대상 주형; 상기 주형의 2개 이상의 표적 염기서열에 대한 정방향 프라이머들과 역방향 프라이머들; 상기 정방향 프라이머들 및 역방향 프라이머들로부터 핵산을 중합하는 핵산중합효소; 및 각각 2개 이상의 표적 염기서열과 상보적이며 표적 염기서열에 결합하며 동일한 형광으로 수식된 2개 이상의 형광 가수분해 프로브;를 혼합하여 qPCR용 혼합물을 제조하는 단계 및
(나) 상기 qPCR용 혼합물에 대하여 중합효소 연쇄반응을 수행하여 높은 특이성으로 표적 염기 서열을 가진 유전자를 검출하는 단계를 포함하는 다중 표적 동시 분석 qPCR 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 형광 가수분해 프로브가 10 내지 30 뉴클레오타이드로 이루어지며, 5' 말단과 3' 말단이 각각 형광 공명에너지 전이가 가능한 리포터와 퀀처로 수식된 프로브인, 유전자 변이체를 검출하는 qPCR 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 다중 표적 동시 분석 qPCR 방법이 특정 핵산 서열을 포함하는 변이주 검출용 또는 야생형 검체 검출용인, 다중 표적 동시 분석 qPCR 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 정방향 프라이머; 역방향 프라이머; 상기 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로부터 각각 핵산을 중합하는 핵산 중합효소;를 포함하고, SARS-Cov-2의 T547K, D796Y 및 Q954H 변이 위치 중 2 위치 이상에 각각 상보적으로 결합하는 2종 이상의 형광 가수분해 프라이머를 포함하되, 상기 2종 이상의 형광 가수분해 프라이머는 동일한 형광으로 수식된 것인, SARS-Cov-2 오미크론 변이 판별용 qPCR 킷트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 형광 가수분해 프라이머가 T547K, D796Y 및 Q954H의 3개 변이 위치 각각에 대한 프라이머를 모두 포함하는 것인, SARS-Cov-2 오미크론 변이 판별용 qPCR 킷트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 정방향 프라이머; 역방향 프라이머; 및 상기 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로부터 각각 핵산을 중합하는 핵산 중합효소;를 포함하고, SARS-Cov-2의 T19R, L452R 및 P681R 변이 위치 중 2 위치 이상에 각각 상보적으로 결합하는 2종 이상의 형광 가수분해 프라이머를 함유하되, 상기 2종 이상의 형광 가수분해 프라이머는 동일한 형광으로 수식된 것인, SARS-Cov-2 델타 변이 판별용 qPCR 킷트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 형광 가수분해 프라이머가 T19R, L452R 및 P681R의 3개 변이 위치 각각에 대한 프라이머를 모두 포함하는 것인, SARS-Cov-2 델타 변이 판별용 qPCR 킷트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은
(가) 돌연변이 가능성이 높은 547, 796 및 954의 표적 염기서열 위치를 포함하는 시험 대상 SARS-Cov-2 주형; 상기 표적 염기서열 중 2 위치 이상에 대한 정방향 프라이머들과 역방향 프라이머들; 상기 정방향 프라이머들 및 역방향 프라이머들로부터 핵산을 중합하는 핵산중합효소; 및 T547K, D796Y 및 Q954H 중 2종 이상의 변이 표적 염기서열과 상보적이며 변이 표적 염기서열에 결합하며, 동일한 형광으로 수식된 2종 이상의 형광 가수분해 프로브;를 혼합하여 qPCR용 혼합물을 제조하는 단계; 및
(나) 상기 qPCR용 혼합물에 대하여 중합효소 연쇄반응을 수행하여 높은 특이성으로 SARS-Cov-2 오미크론 변이체를 검출하는 단계;를 포함하는 qPCR 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 (가) 단계에서 2종 이상의 형광 가수분해 프로브는 T547K, D796Y 및 Q954H 각각에 대한 3종의 프로브인, SARS-Cov-2 오미크론 변이체를 검출하는 qPCR 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은
(가) 돌연변이 가능성이 높은 19, 452 및 681의 표적 염기서열 위치를 포함하는 시험 대상 SARS-Cov-2 주형; 상기 표적 염기서열 중 2 위치 이상에 대한 정방향 프라이머들과 역방향 프라이머들; 상기 정방향 프라이머들 및 역방향 프라이머들로부터 핵산을 중합하는 핵산중합효소; 및 T19R, L452R 및 P681R 중 2종 이상의 변이 표적 염기서열과 상보적이며 변이 표적 염기서열에 결합하며, 동일한 형광으로 수식된 2종 이상의 형광 가수분해 프로브;를 혼합하여 qPCR용 혼합물을 제조하는 단계; 및
(나) 상기 qPCR용 혼합물에 대하여 중합효소 연쇄반응을 수행하여 높은 특이성으로 SARS-Cov-2 델타 변이체를 검출하는 단계;를 포함하는 qPCR 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 (가) 단계에서 2종 이상의 형광 가수분해 프로브는 T19R, L452R 및 P681R 각각에 대한 3종의 프로브인, SARS-Cov-2 델타 변이체를 검출하는 qPCR 방법에 관한 것이다.
아래에서는 구체적인 실시예와 시험예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예 및 시험예의 기재 범위 내로 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속한 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
특히 아래의 실시예와 시험예에서는 2 이상의 변이 부위에 대한 형광 가수분해 프로브를 사용하는 예에 관하여 설명하였으나, 이와 반대로 2 이상의 야생형 특이적 부위에 대한 동일 형광 가수분해 프로브를 사용하는 경우에도 위음성 가능성을 낮추어 야생형 검출용 qPCR 방법 및 키트에도 본 발명을 적용할 수 있음은 본 발명이 속한 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
또한, 본 발명의 방법은 통상의 동일한 분류군을 검출하기 위한 다중의 특이 서열을 동일한 형광 가수분해 프로브를 사용하여 검출하는 PCR 방법 및 키트에도 본 발명을 적용할 수 있음은 본 발명이 속한 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
SARS-Cov-2 RNA 시료
SARS-Cov-2 RNA 시료는 국가병원체자원은행에서 분양 받은 표준 병원체자원 3종 (NCCP43326, NCCP43410, NCCP43408)을 이용하여 수행하였다. 분양 RNA 시료 중 NCCP43326은 야생형 Covid 19이며, NCCP43410은 Delta형 변이주, NCCP43408은 Omicron형 변이주이다. RNA는 시료는 -70℃에 냉동보관하면서 사용하였다.
SARS-Cov-2 서열 비교 및 변이 선별
변이체의 서열 비교는 국제인플루엔자 정보공유기구(Global Initiative on Sharing All Influenza Data, GISAID) 에 등록된 각 시료의 게놈 서열 중 Spike Trimer coding 영역의 서열 정보를 비교 분석된 서열의 발생빈도 (표 1)를 기준으로 변이체 구별을 위한 target 부위로 선정하였다.
아래 표 1은 SARS-Cov-2의 주요 변이주 (VOC)의 변이 발생빈도를 나타낸다.
Figure PCTKR2023007259-appb-img-000001
* 2022년 02월 10일 기준 (https://outbreak.info의 자료를 사용함)
이 변이들의 동시 존재 빈도를 확인하여 변이 연관성을 조사하였다. 이를 위해 NCBI에 등록된 omicron 변이주 10,394개와 Delta 변이주 11,354 개의 유전체 정보를 QIAGEN CLC Genomics Workbench로 서열 비교하여 각 변이의 검출도를 확인하였다. 그 결과, omicron 변이주에서는 T547K, D796Y, Q954H가 동시에 존재하는 비율이 99.48% (10,340개)였으며, 또한 delta 변이주에서는 T19R, L452R, P681R이 동시에 존재하는 비율이 99.58% (11,306개)였다. 또한 이들 중에 하나의 변이가 발견되지 아니하는 비율은 0.3% 이하로 매우 적었으며, 하나만 발견되는 경우는 없었다 (표 2). 이로부터 두 군데 이상의 변이 위치를 동시 검출할 경우 하나의 변이만 검출할 때보다 위음성의 빈도를 약 1 내지 5% 정도 낮출 수 있을 것으로 판단되었다.
Figure PCTKR2023007259-appb-img-000002
표준 플라스미드 DNA 시료 준비
표준 병원체자원 RNA 3종을 주형으로 SARS-Cov-2의 S 유전자의 T19R, L452R, T547K, P681R, D796Y, Q954H 부위를 포함하는 PCR 산물을 제조한 후 pTOP-TA 벡터 [(주)엔지노믹스, 한국]에 클로닝하여 야생형 6종 (pCov19-S-T19, pCov19-S-L452, pCov19-S-T547, pCov19-S-P681, pCov19-S-D796, pCov19-S-Q954) 및 변이형 6종 (pCov19-S-R19, pCov19-S-R452, pCov19-S-K547, pCov19-S-R681, pCov19-S-Y796, pCov19-S-H954)을 표준 플라스미드 DNA로 제작하였다. 각 표준 플라스미드 DNA는 제한효소 NotI으로 절단하여 정제한 후 멸균 증류수로 희석하여 1 x 108 copies/μL 를 각각 준비하였다. 이와 같이 준비된 DNA는 실험에 사용하기 전까지 냉동 보관하였다.
프라이머/프로브/콤프로브 및 표준 플라스미드
표 3은 본 발명의 실시예 및 시험예에 사용된 프라이머와 프로브 정보이다.
Figure PCTKR2023007259-appb-img-000003
참고로 위 표 3에 제시된 서열은 위에서부터 차례로 서열번호 1 내지 서열번호 23이다.
위에서 준비한 각 DNA 시료를 주형으로 하여 시험에 따라 준비한 프라이머 및 프로브를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 각 제시된 변이의 검출에는 표 3에서 제시된 프라이머 및 프로브 set을 사용하였다. 시험에 따라 각 프로이머 및 프로브는 0.3 내지 0.75 uM로 범위내에서 사용하였다. 사용한 중합효소 및 PCR 완충용액은 엔지노믹스사 (cat no. RT 431M)을 사용하였으며, 반응용액의 총 부피는 20 μL로 맞추어 수행하였다. qPCR은 95℃에서 10분 반응 후 95℃에서 10 내지 15초, 60℃에서 10 내지 15초간 45 내지 50 cycle로 CFX9600 Real-Time System을 이용하여 수행하였다. 국가병원체 자원은행에서 분양 받은 표준 병원체자원 3종 (NCCP43326, NCCP43410, NCCP43408)의 SARS-Cov-2 RNA 표준품을 사용한 RT-qPCR (quantitative reverse transcription PCR)은 50℃에서 30분, 95℃에서 10분 반응 후, 95℃에서 10 내지 15초, 60℃에서 10 내지 15초간 45 내지 50 cycle로 CFX9600 Real-Time System을 이용하여 수행하였다.
qPCR의 실시
qPCR에 실시간 검출용 형광 가수분해 프로브는 증폭산물에 혼성화 결합이 가능한 염기서열을 갖도록 디자인하였으며, 형광공명 에너지이동(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET) 원리를 적용하기 위해서 5' 말단에 형광물질 (예컨대 FAM, JOE, 또는 Cy5 등), 3' 말단에 퀜처 (예컨대 BHQ1 또는 BHQ3 등)가 결합된 프로브를 사용하였다. 사용된 올리고뉴클레오타이드는 출원인의 올리고뉴클레오타이드 합성 시스템을 이용하여 제작하였다.
실시예 1: 형광 프로브 Tm 증가에 따른 qPCR 비특이 신호의 생성
본 실시예 1에서는 변이 검출용 형광 프로브의 길이의 변화를 통한 Tm의 증감에 따른 qPCR의 시그널 및 Ct 값의 변화를 시험하였다. 이를 위해 SARS-Cov-2의 변이 영역인 Q954H를 검출하는 시험을 실시하였다. 각 Q954H변이 검출용 pCov19-S-Q954 (야생형) 및 pCov19-S-H954 (변이형) 표준 플라스미드 DNA를 주형으로, 형광 가수분해 프로브의 염기수를 증가시켜 시험하였다 [FAM-Covid19-Q954H (Tm = 51.4 ℃), FAM-Covid19-Q954H+2 (Tm = 54.3 ℃), FAM-Covid19-Q954H+3 (Tm = 57.5 ℃)] (도 1 및 표 4).
시험의 결과 도 1 및 표 4와 같이 프로브 길이 증가에 따른 Tm 값의 증가를 살펴보면 비록 신호의 높이는 높아졌지만 높은 야생형 DNA를 사용할 경우 비특이 신호가 높아지는 양태를 보였다. 이러한 프로브의 사용은 위양성 검출 위험이 크다. 그러므로 비특이 신호 검출의 위험성이 낮은 짧은 단편의 프로브를 사용하여야 위양성의 위험성을 낮출 수 있을 것이다. 그러나, 경우에 따라 낮은 복제수의 검체 사용시 위음성의 위험성이 높아질 수 있다. 그러므로 위양성의 위험을 낮추면서 동시에 위음성 검출 위험을 낮출 수 있는 새로운 방법이 요구된다.
도 1은 변이 검출용 프로브의 길이 (Tm 값)의 증가에 따른 Q954H 변이 검출을 위한 qPCR 결과이다. Q954H 변이 검출을 위해 프로브는 FAM-Covid19-Q954H (a), FAM-Covid19-Q954H+2 (b), AM-Covid19-Q954H+3 (c)를 사용하였으며, 주형으로는 각 표준 플라스미드를 사용하였다. -△-는 5 x 103 복제수, -○-는 5 x 102 복제수, -□-, 5 x 101 복제수의 변이형 시험구이며, -◇-는 5 x 107 복제수의 비변이 야생형 시험구이고, -X-는 주형 무첨가 대조구이다.
아래 표 4는 변이 검출용 프로브의 Tm의 증가에 따른 qPCR의 Ct 값*을 나타낸다.
Figure PCTKR2023007259-appb-img-000004
* 도 1 qPCR 시험의 평균 Ct 값을 적시하였다.
** threshold 값은 야생형 DNA (5 x 107)시험구의 FAM-Covid19-Q954H 프로브시험구 미검출 값으로 설정하였다.
실시예 2: 단일 변이 검출 및 다중 변이 부위 동시 검출의 효용성 비교
짧은 프로브의 사용에 의한 낮은 신호값의 발생을 극복하기 위한 방법으로 형광 프로브의 양에 따른 신호값과 Ct를 비교 시험하였다 (도 2 및 표 5). T547K, Q954H, D796Y의 세 변이 위치에 대한 qPCR 시험을 실시하였다. 각 변이 위치에 대하여 각각 1.5 μM의 프로브를 사용한 시험구 (도 2의 d, e, f)가 각각 0.5 μM를 사용한 시험구 (도 2의 a, b, c)에 비교하여 높은 신호값을 보이는 우수한 qPCR 성능을 보였으나, Ct 값의 개선은 크게 나타나지 않았다. 또다른 낮은 신호값을 극복하기 위한 방법으로 T547K, Q954H, D796Y 세 변이 위치를 한 시험구 내에서 동시에 다중 검출하는 방법을 적용하여 보았다 (도 2 및 표 5). 그 결과 높은 신호값이 관찰되었으며 (도 2의 g), 특히 표 5의 시험구 g와 같이 Ct가 2 내지 3 정도 빨라지는 효과가 나타났다. 그러므로 본 발명의 실시예와 같이 다중의 변이 위치에 대한 프로브를 혼합하여 검출할 경우 2 변이 이상의 동시 검출이 가능하며 높은 신호값 및 빠른 Ct 값이 나타나 변이 검출을 위한 우수한 qPCR 특성을 구현할 수 있음을 보여준다.
도 2는 단일 변이 위치 검출 및 다중 변이 위치 동시 검출 qPCR 시험 결과를 비교한 것이다. T547K (a, d), Q954H (b, e), D796Y (c, f) 및 3 부위 혼합 (g) 검출 시험의 qPCR 그림이다. 프로브의 사용량은 0.5 μM (a, b, c) 및 1.5 μM (d, e, f) 몇 다중 변이 위치 혼합시험 (g)에는 3 종류의 프로브를 각 0.5 μM씩 사용하였다. 프로브로는 각 변이에 해당하는 FAM-Covid19-T547K-1, FAM-Covid19-Q954H, FAM-Covid19-D796Y-4 을 사용하였다. 주형으로는 해당하는 각 표준 플라스미드를 사용하였으며, -○-는 5 x 103 복제수, -□-는 5 x 102 복제수, -◇-는 5 x 101 복제수의 변이형 시험구이며, -△-는 5 x 107 복제수의 비변이 야생형 시험구이고, -X-는 주형 무첨가 대조구이다.
표 4는 변이 검출용 프로브의 Tm의 증가에 따른 qPCR의 Ct 값*을 나타낸다.
Figure PCTKR2023007259-appb-img-000005
* 도 2의 qPCR 반복 시험의 평균 Ct 값을 적시하였다. 자세한 내용시험은 내용은 도 1과 같다.
실시예 3: delta 및 omicron 변이주 다중 변이 위치 동시 검출 (cloned plasmid DNA)
실시예 2의 다중 변이 위치 혼합 검출의 효과를 더욱 명확하게 확인하기 위해서 표준 플라스미드 DNA를 사용하여 delta 변이주 검출을 위한 3개의 변이 (T19R, L452R, P681R) 및 omicron 변이주 검출을 위한 3개의 변이 (Q954H, D796Y, T547K)에 대해 시험하였다 (도 3 및 표 6). delta 변이주 및 omicron 변이주 모두 단일 변이위치 검출 시험의 경우 낮은 신호값을 보였으며, 3개의 변이 위치에 대한 동시 검출 (Mix)의 경우 좀 더 높은 신호값을 나타내었다. 특히 다중 변이 위치에 대한 프로브 혼합 시 단일 프로브보다 Ct 값이 2 내지 3 정도 빨라짐을 확인할 수 있었다.
도 3은 다중 변이 부위에 대한 혼합 검출 qPCR 시험 (cloned plasmid DNA)의 결과를 나타내며, Delta 변이주 검출 (A)과 omicron 변이주 검출 (B)을 위한 qPCR 시험 결과이다. qPCR을 위해 클론된 각 표준 플라스미드 DNA를 사용하였으며 프라이머, 프로브 set은 표 3의 set를 사용하였다. -○-는 5 x 103 복제수, -□-는 5 x 102 복제수, -◇-, 5 x 101 복제수의 변이형 시험구이며, -△-는 5 x 107 복제수의 비변이 야생형 시험구이고, -X-는 주형 무첨가 대조구이다. 내부 qPCR 대조구 (internal control)은 RdRp DNA (---)를 사용하였다.
Figure PCTKR2023007259-appb-img-000006
실시예 4: delta 및 omicron 변이주의 다중 변이 위치 혼합 검출 (viral RNA)
실시예 2와 3의 다중 변이 위치 혼합 검출의 효과를 더욱 명확하게 확인하기 위해서 SARS-Cov-2 RNA를 사용하여 delta 변이주 검출을 위한 3 변이 (T19R, L452R, P681R) 및 omicron 변이주 검출을 위한 3 변이 (Q954H, D796Y, T547K)에 대해 시험하였다 (도 4 및 표 7). 실시예 3과 같이 delta 변이주 및 omicron 변이주 모두 단일변이 부위 (single) 검출 시험의 경우 낮은 신호값을 보였으며, 3 변이 위치 혼합 검출 (Mix)일 경우 좀 더 높은 신호값과 빠른 Ct 값을 나타내었다. 특히 낮은 viral RNA 양에서 Ct 값이 40 이하로 검출되어 높은 양성 검출률을 보여주었다 (표 7).
Figure PCTKR2023007259-appb-img-000007
도 4는 다중 변이 위치 혼합검출 qPCR 시험 (SARS-Cov-2 RNA)을 나타낸다. (A)와 (B)는 각각 Delta 변이주 검출과 omicron 변이주 검출 qPCR 시험 결과이다. qPCR을 위해 클론된 각 표준 플라스미드 SARS-Cov-2 RNA를 사용하였으며 프라이머 프로브 set은 표 3의 set를 사용하였다. -○*-는 5 x 103 복제수, -□-는 5 x 102 복제수, -◇-, 5 x 101 복제수의 변이형 시험구이며, -△-는 5 x 107 복제수의 비변이 야생형 시험구이고, -X-는 주형 무첨가 대조구이며, ---는 내부 qPCR 대조구 (internal control)이다.
본 발명은 보건, 의학, 약학, 수의학, 식품 분야 등에서 다종의 검출 대상 변이주를 야생형 및/또는 기타 변이종들과 구분하여 검출할 때 매우 유용하다.
서열목록 전자 파일 첨부함.

Claims (14)

  1. (가) 동일한 분류군 내의 2개 이상의 표적 염기서열에 대한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머;
    (나) 상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로부터 DNA를 중합하는 DNA 중합효소; 및
    (다) 상기 2개 이상의 표적 염기서열의 구분을 위한 2개 이상의 형광 가수분해 프로브를 포함하며,
    상기 2개 이상의 형광 가수분해 프로브는 각각 2개 이상의 표적 염기서열과 상보적이며 표적 염기서열에 결합하고, 동일한 형광으로 수식된 것임을 특징으로 하는, 다중 표적 동시 분석을 통한 검출용 qPCR 킷트.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 형광 가수분해 프로브는 10 내지 30 뉴클레오타이드로 이루어지며, 5' 말단과 3' 말단이 각각 형광 공명에너지 전이가 가능한 리포터와 퀀처로 수식된 프로브인, 검출용 qPCR 킷트.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 검출용 qPCR 킷트는 특정 핵산 서열을 포함하는 변이주 검출용 킷트 또는 야생형 검체 검출용 킷트인, 검출용 qPCR 킷트.
  4. (가) 동일한 분류군의 2개 이상의 표적 염기 서열을 포함하는 시험 대상 주형; 상기 주형의 2개 이상의 표적 염기서열에 대한 정방향 프라이머들과 역방향 프라이머들; 상기 정방향 프라이머들 및 역방향 프라이머들로부터 핵산을 중합하는 핵산중합효소; 및 각각 2개 이상의 표적 염기서열과 상보적이며 표적 염기서열에 결합하며 동일한 형광으로 수식된 2개 이상의 형광 가수분해 프로브;를 혼합하여 qPCR용 혼합물을 제조하는 단계 및
    (나) 상기 qPCR용 혼합물에 대하여 중합효소 연쇄반응을 수행하여 높은 특이성으로 표적 염기 서열을 가진 유전자를 검출하는 단계를 포함하는 다중 표적 동시 분석 qPCR 방법.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 형광 가수분해 프로브는 10 내지 30 뉴클레오타이드로 이루어지며, 5' 말단과 3' 말단이 각각 형광 공명에너지 전이가 가능한 리포터와 퀀처로 수식된 프로브인, 다중 표적 동시 분석 qPCR 방법.
  6. 청구항 4 또는 청구항 5에 있어서,
    상기 다중 표적 동시 분석 qPCR 방법은 특정 핵산 서열을 포함하는 변이주 검출용 또는 야생형 검체 검출용인, 다중 표적 동시 분석 qPCR 방법.
  7. 정방향 프라이머; 역방향 프라이머; 상기 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로부터 각각 핵산을 중합하는 핵산 중합효소;를 포함하고,
    SARS-Cov-2의 T547K, D796Y 및 Q954H 변이 위치 중 2 위치 이상에 각각 상보적으로 결합하는 2종 이상의 형광 가수분해 프라이머를 포함하되, 상기 2종 이상의 형광 가수분해 프라이머는 동일한 형광으로 수식된 것인, SARS-Cov-2 오미크론 변이 판별용 qPCR 킷트.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 형광 가수분해 프라이머는 T547K, D796Y 및 Q954H의 3개 변이 위치 각각에 대한 프라이머를 모두 포함하는 것인, SARS-Cov-2 오미크론 변이 판별용 qPCR 킷트.
  9. 정방향 프라이머; 역방향 프라이머; 상기 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로부터 각각 핵산을 중합하는 핵산 중합효소;를 포함하고,
    SARS-Cov-2의 T19R, L452R 및 P681R 변이 위치 중 2 위치 이상에 각각 상보적으로 결합하는 2종 이상의 형광 가수분해 프라이머를 함유하되, 상기 2종 이상의 형광 가수분해 프라이머는 동일한 형광으로 수식된 것인, SARS-Cov-2 델타 변이 판별용 qPCR 킷트.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 형광 가수분해 프라이머는 T19R, L452R 및 P681R의 3개 변이 위치 각각에 대한 프라이머를 모두 포함하는 것인, SARS-Cov-2 델타 변이 판별용 qPCR 킷트.
  11. (가) 돌연변이 가능성이 높은 547, 796 및 954의 표적 염기서열 위치를 포함하는 시험 대상 SARS-Cov-2 주형; 상기 표적 염기서열 중 2 위치 이상에 대한 정방향 프라이머들과 역방향 프라이머들; 상기 정방향 프라이머들 및 역방향 프라이머들로부터 핵산을 중합하는 핵산중합효소; 및 T547K, D796Y 및 Q954H 중 2종 이상의 변이 표적 염기서열과 상보적이며 변이 표적 염기서열에 결합하며, 동일한 형광으로 수식된 2종 이상의 형광 가수분해 프로브;를 혼합하여 qPCR용 혼합물을 제조하는 단계 및
    (나) 상기 qPCR용 혼합물에 대하여 중합효소 연쇄반응을 수행하여 높은 특이성으로 SARS-Cov-2 오미크론 변이체를 검출하는 단계를 포함하는 qPCR 방법.
  12. 청구항 11에 있어서,
    (가) 단계에서 2종 이상의 형광 가수분해 프로브는 T547K, D796Y 및 Q954H 각각에 대한 3종의 프로브인, SARS-Cov-2 오미크론 변이체를 검출하는 qPCR 방법.
  13. (가) 돌연변이 가능성이 높은 19, 452 및 681의 표적 염기서열 위치를 포함하는 시험 대상 SARS-Cov-2 주형; 상기 표적 염기서열 중 2 위치 이상에 대한 정방향 프라이머들과 역방향 프라이머들; 상기 정방향 프라이머들 및 역방향 프라이머들로부터 핵산을 중합하는 핵산중합효소; 및 T19R, L452R 및 P681R 중 2종 이상의 변이 표적 염기서열과 상보적이며 변이 표적 염기서열에 결합하며, 동일한 형광으로 수식된 2종 이상의 형광 가수분해 프로브;를 혼합하여 qPCR용 혼합물을 제조하는 단계 및
    (나) 상기 qPCR용 혼합물에 대하여 중합효소 연쇄반응을 수행하여 높은 특이성으로 SARS-Cov-2 델타 변이체를 검출하는 단계를 포함하는 qPCR 방법.
  14. 청구항 13에 있어서,
    (가) 단계에서 2종 이상의 형광 가수분해 프로브는 T19R, L452R 및 P681R 각각에 대한 3종의 프로브인, SARS-Cov-2 델타 변이체를 검출하는 qPCR 방법.
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