WO2013165038A1 - 엡스타인-바 바이러스 검출용 키트 및 이를 이용한 엡스타인-바 바이러스의 검출방법 - Google Patents

엡스타인-바 바이러스 검출용 키트 및 이를 이용한 엡스타인-바 바이러스의 검출방법 Download PDF

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WO2013165038A1
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WO
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epstein
kit
barr virus
ebv
detection
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PCT/KR2012/003506
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문지혜
변상진
임관훈
윤현규
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(주)바이오니아
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    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/705—Specific hybridization probes for herpetoviridae, e.g. herpes simplex, varicella zoster
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
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    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the present invention relates to a kit for detecting Epstein-Barr virus, and to a method for identifying and quantitatively detecting the presence or absence of Epstein-Barr virus in a biological sample using the kit.
  • Epstein-Bar virus (EBV), first discovered in Burkitt's lymphoma patients, is an infectious B lymphotropic virus belonging to the human herpes viridae. It causes mononucleosis and causes various clinical symptoms such as Buckyrim lymphoma, nasopharyngeal cancer, Hodgkin's disease, central nervous system B-cell lymphoma, and lymphocytic hyperplasia (Jeong-Rim Jung, Hyun-Sook Kim. Korean J Lab Med, 2000 Jun; 20 (03) 320-329)
  • Infectious mononucleosis is a typical clinical symptom of EBV.
  • the characteristic characteristics of infectious mononucleosis are systemic body complications such as fatigue, helplessness, fever, sore throat, and systemic lymphadenopathy.
  • Analyzing the origin of B lymphocytes involved in the development of EBV-related lymphocyte proliferative diseases is useful for analyzing the causes of infection after transplantation and clinical symptoms of transplantation.
  • the quantitative distribution of donor EBV is associated with It may also be an important data in analyzing the relationship between the propagation potential to transplant patients (Seungwon Jung et al. Korean J Lab Med 2010; 30: 554-8).
  • the incidence of infection varies according to economic conditions, hygiene and geographic location.
  • the epidemiologic relationship of infectious mononucleosis is known to be related to the age of EBV-infected patients.
  • the age of EBV infection varies depending on the hygiene environment, but it shows an antibody positive rate in about 80% at 3 years of age, 90% before and after 20 years of age, and almost 100% in late 20s.
  • IM infectious mononucleosis
  • EBV opportunistic B cell lymphoma
  • Burkitt's lymphoma opportunistic B cell lymphoma
  • Korean Patent No. 10-0378942 discloses a diagnostic agent capable of detecting antibodies and a method of detecting EBV antibodies in a sample as a patent for EBV diagnosis, but diagnostic methods based on these immunological assays can be quickly tested. It has the advantage that it is difficult to quantitatively detect low sensitivity and degree of infection.
  • the present invention provides an Epstein-Barr virus detection kit capable of quickly and quantitatively detecting very low concentrations of Epstein-Barr virus in the diagnosis of EBV infection.
  • the oligonucleotides represented by SEQ ID NO: 1 and oligonucleotides represented by SEQ ID NO: 2 and oligonucleotides represented by SEQ ID NO: 2 may be used to detect Epstein-Barr virus using real-time polymerase chain reaction.
  • an Epstein-Bar virus detection kit comprising a probe configured, and provides a quantitative detection method for EBV infection using the same.
  • an oligonucleotide refers to a molecule composed of two or more deoxyribonucleotides or ribonucleotides such as primers and probes, and primers are oligonucleotides that are naturally occurring (eg, as restriction fragments) or synthetically prepared, Nucleic acid amplification agents, such as DNA dependent or RNA dependent polymerases, and nucleic acid strands, when placed under suitable conditions in the presence of nucleotides, which can act as a starting point for the synthesis of primer extension products complementary to the template or target sequence. .
  • Template DNA for EBV detection was selected as a high homology sequence as the target sequence. (GenBank Accession Number; HM366190) (SEQ ID NO: 4, see FIG. 1) Based on this, a gene of 81bp, the 1100th to 1250th sequence, was synthesized. The solution was cloned into pGEM-T-Easy vector (see Example 1).
  • primers and probes were designed to select SEQ ID NOs: 1 to 3, which are excellent candidates for amplification efficiency.
  • Detection of the real-time polymerase chain reaction is made through fluorescence coloring, characterized in that it comprises a fluorescent dye (reporter dye) and a quencher dye (quencher dye), which is a dyeing reagent labeled on the sock end of the probe.
  • fluorescent dye reporter dye
  • quencher dye quencher dye
  • FAM or TAMRA which is a reporter dye
  • BHQ1 a quencher dye
  • the kit of the present invention further comprises at least one composition selected from the reaction buffer, DNA polymerase, dNTP, heat-resistant pyrophosphatase, PPi, and stabilizers used in real time polymerase chain reaction in addition to the primers and probes.
  • the composition to be used in the kit of the present invention described above can be used both as a reagent that is commercially available for medicinal or research use or directly prepared.
  • the composition included in the kit can be all room temperature, high temperature or lyophilization.
  • the form of the kit can be produced by loading the well-plate form or the tube in the market.
  • the well-plate may be manufactured without limitation, such as 96 wells, 384 wells.
  • the storage temperature of the kit can be stored at room temperature, refrigerated or frozen (below -20 °C or -70 °C), but preferably when stored at -20 °C shelf life is one year, may vary depending on the storage conditions .
  • kits of the present invention can be carried out by the real-time polymerase chain reaction method, the use of the kit is characterized by having a rapid, convenient and high sensitivity of the results obtained in the EBV detection.
  • Epstein-Barr virus detection method comprises the steps of (a) extracting and quantifying DNA from the sample; (b) amplifying the DNA by real-time polymerase chain reaction using the DNA obtained in step (a) and the Epstein-Barr virus detection kit according to the present invention; And (c) analyzing the expression level of the amplified viral DNA and determining the degree of EBV infection.
  • Extracting DNA from the sample in step (a) can be used without limitation the conventional method, can be quantified by UV measurement or can be used without limitation by conventional known methods.
  • Samples that can be used in the EBV detection method of the present invention include whole blood, plasma, serum, red blood cells, white blood cells, platelets, feces, urine, tears, saliva, skin, respiratory tract, intestine, external secretions of the digestive tract, spinal fluid, It is preferable to use any one selected from lymph fluid, body fluid, tissue, and the like. Most preferably using plasma or serum.
  • the present invention relates to a kit for detecting EBV, and to a method for detecting EBV using the kit. More specifically, the present invention provides a kit comprising a novel primer and a probe having EBV specificity in an EBV detection kit. In the method of detecting EBV using the kit according to the present invention, the degree of infection as well as whether EBV is infected or not Can be presented quantitatively.
  • EBV detection kit of the present invention is characterized by being manufactured by drying the reactants used in the real-time polymerase chain reaction. Compared to the case where the reactants are stored in solution, the dry reactants have a longer shelf life, can simplify the experiment process, maximize user convenience, and significantly reduce the possibility of error by the experimenter. There is an advantage.
  • EBV detection using the EBV detection kit according to the present invention by solving the low sensitivity in the conventional EBV diagnosis can obtain quantitative results with high sensitivity, thus providing more accurate results in diagnosis of EBV infection. Enable to provide
  • the red area shows the location of the selected primers and probes.
  • FIG. 2 is a view showing the results of real-time polymerase chain reaction according to the concentration of the template DNA (10 1 to 10 10 (copies / rxn)) to confirm the detection range of the present invention.
  • Figure 3 is a graph showing the change in the Ct value obtained in the real-time polymerase chain reaction according to the concentration of the template DNA (10 1 to 10 10 (copies / rxn)) in order to confirm the detection range of the present invention.
  • Figure 4 shows a graph of real-time polymerase chain reaction for three batches and the standard deviation (STDEV) and coefficient of variation (CV) of the obtained Ct values for three batches in the reproducibility evaluation for the kit of the present invention.
  • FIG. 5 is a graph showing the detection limits of the kit for detecting EBV of the present invention.
  • Figure 6 is a graph comparing the results of real-time polymerase chain reaction of the primers and probes of the kit for detecting EBV of the present invention with the comparative group which is not selected candidate group.
  • Template DNA for testing quantitative detection of EBV was prepared by real time PCR using the Epstein-Barr virus detection kit according to the present invention.
  • Template DNA for the detection of EBV was selected with a highly homologous sequence (see Fig. 1), through the homology analysis for this, select a region with no mutation as the target sequence, and standard base sequence information using a combination of the selected primers Based on (Ginbank Accession Number; HM366190), a gene of 81 bp, which is the 1100th to 1250th sequences, was synthesized (Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998, 248, 200-203), which was used as a pGEM-T-Easy vector ( Cat: A1360, manufactured by Promega, USA).
  • the prepared pluripotent cells were plated on LB plate medium coated with ampicillin, IPTG, and X-Gal, and then cultured at 37 ° C. for 16 hours. Take the white colonies on the plate after completion of the culture, incubate for 16 hours in LB liquid medium, centrifuge and discard the supernatant, and pellet using a plasmid DNA extraction kit (Bionia, Korea). Plasmid DNA was extracted from the. Plasmid DNA was measured for concentration and purity by UV spectrometer (Shimazu, Japan). It was confirmed that the purity is between 1.8 and 2.0, and the DNA copy number was calculated by the following formula based on the concentration measurement result.
  • the template DNA copy number was calculated and then diluted 10-fold with 1 ⁇ TE buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) and stored at ⁇ 70 ° C. until use.
  • the EBV specific primers and probes were selected from the gene sequences selected in Example 1, using the highest homology, the highest amplification efficiency, and the sequence in which the amplification products were selected closest to around 100 bp.
  • the forward primer (SEQ ID NO: 1) adopts a base range of 1145 bp to 1168 bp of standard base sequence information (GeneBank accession number; HM366190), and the reverse primer (SEQ ID NO: 2) has a base of 1207 bp to 1235 bp Sequence ranges were adopted. Adopted criteria is that the Tm value ranges from 55 ° C. to 60 ° C., and the length includes a base sequence range comprised from 80 bp to 85 bp.
  • Probe selection was based on the nucleotide sequence range of 1185 bp to 1206 bp of standard base sequence information (GeneBank accession number; HM366190), which can be minimized based on the homology results of FIG. It was included in the 55 °C to 60 °C range, based on whether the length is in the range of 80 bp to 150 bp. (See Table 1)
  • the kit for EBV detection consists of 10 ⁇ TE buffer (10mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1mM EDTA), 2.5U Taq DNA polymerase, 20mM dNTP, thermally resistant pyrophosphatase, PPi and stable
  • the mixture was prepared by mixing a composition consisting of an agent ( ⁇ -MG, trehalose, Tween 20) and adding a primer (SEQ ID NOs: 1 and 2) and a probe (SEQ ID NO: 3) employed in Example 2.
  • the mixture was loaded into a 96 well plate and dried to complete the kit for EBV detection.
  • the concentration of EBV template DNA prepared in Example 1 was administered to the kit, and the total dose was 50 ⁇ l. Based on the total volume of 50 ⁇ l mixture, the concentrations of the forward primer, the reverse primer, and the probe included in the kit were 15 pmole, respectively.
  • the detection range of the kit thus prepared was confirmed by real-time polymerase chain reaction method. Specifically, the EBV template DNA according to Example 1 was prepared in 10 sections by diluting step by step from high concentration to low concentration (1 ⁇ 10 1 to 1 ⁇ 10 10 copies / rxn). The real time polymerase chain reaction was performed using an ExiCycler TM Real-Time PCR System (Bioner, Korea).
  • Intra-assay analysis was performed three times, three times when the same experimenter was tested once using the kit produced in the same batch (inter-assay), the inter-assay was the test Three different experimenters were analyzed by the same method as my analysis, and the inter-batch was analyzed by the same experimenter using different production batches of the kit.
  • Table 3 Standards of Ct obtained through intra-assay, inter-assay, inter-batch, and 8-day repeated tests to assess the precision of EBV detection kits The table shows deviation (STDEV) and coefficient of variation (CV,%).
  • the panel was prepared by step dilution from high concentration to low concentration using the panel 'The 1st WHO international standard for Epstein-Barr virus (EBV)'.
  • EBV Epstein-Barr virus
  • an amplification component was prepared, and a panel of each concentration was injected to measure fluorescence values, and 32 repeat tests were performed for each concentration for statistical analysis.
  • Statistical results were performed through Probit analysis, and the detectable concentration was determined as the detection limit. (See Figure 5)
  • the template DNA concentration was selected as 10 3 , 10 5 , 10 7 copies / reaction in the same manner as in Example 5 and stored at 40 ° C. for 7 days. Then, the performance was evaluated by real-time polymerase chain reaction in the same manner as in Example 3 at 1 day intervals. The results obtained in this experiment confirmed the predicted storage stability based on the Arrhenius equation for accelerated stability for storage temperature conditions of the product.
  • the kit of the present invention has a shelf life of 1 year when stored below -20 ° C.
  • Comparative Example 1 Real time polymerase chain reaction using primers and probes that are not selected as primers and probes for detecting EBV according to the present invention
  • the primer and probe sequences used in the comparative examples are as follows. In this comparison, a sequence designed to satisfy the conditions as a primer and a probe was used as a comparative example. Comparing the primers and probes adopted in the present invention, the Ct value and the intensity of the curves of the comparative example were confirmed to be inferior. (See Table 5 and Figure 6)
  • Table 5 shows the Ct values obtained in the real time polymerase chain reaction of Example 4, Comparative Example (1) and Comparative Example (2).
  • SEQ ID NO: 1 is a synthetic primer and is a forward primer, and the base sequence information (GeneBank accession number; HM366190) of EBV template DNA is nucleotide sequence of 1145 bp to 1168 bp
  • SEQ ID NO: 2 is a reverse primer as synthetic DNA, and the base sequence information of the EBV template DNA (GeneBank Accession No .; HM366190) is shown in the base sequence of 1207 bp to 1235 bp.
  • SEQ ID NO: 3 is a probe as synthetic DNA, and the base sequence information of the EBV template DNA (GeneBank Accession Number; HM366190) is from 1185 bp to 1206.

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Abstract

본 발명은 실시간 중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction; PCR)을 이용하여 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Bar virus; EBV)를 검출하는데 사용될 수 있는 프라이머 및 프로브를 포함하는 EBV 검출용 키트 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것으로서, 엡스타인-바 바이러스를 매우 낮은 농도까지 신속하게 정량적으로 검출할 수 있어, EBV에 의한 질병을 차단하는 효과가 기대된다.

Description

엡스타인-바 바이러스 검출용 키트 및 이를 이용한 엡스타인-바 바이러스의 검출방법
본 발명은 엡스타인-바 바이러스 검출용 키트에 관한 것이며, 상기 키트를 이용하여 생물학적 시료에 존재하는 엡스타인-바 바이러스의 유무를 확인 및 정량적 검출방법에 관한 것이다.
버키트림프종(Burkitt's lymphoma) 환자에게서 처음 발견된 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Bar virus; 이하 ‘EBV’라고 함)는 인간 허피스 바이러스(human herpes viridae)에 속하는 B 림프종 바이러스(B lymphotropic virus)로 전염성 단핵구증을 일으키며, 버키트림프종, 비인강암, 호즈킨병, 중추신경계 B세포 림프종, 림프세포증식성 등 다양한 임상적 증상을 유발하는 원인체로 그 중요성은 점점 더 커지고 있다.(정재림, 김현숙. Korean J Lab Med, 2000 Jun; 20(03) 320-329)
전염성단핵구증이 EBV의 대표적인 임상적 증상으로 전염성단핵구증의 특징은 전신적 신체 합병증으로 피로감, 무력감, 발열, 인후통 및 전신 림프절 병증으로 나타난다. 또한, 고형장기 또는 조혈모 세포의 이식 이후에 림프구 증식성 질환에 대한 병인과 높은 연관 관계가 있어 혈액 종양환자에게서도 감염의 상태를 확인하는 것이 중요하다고 알려져 있다.(Seungwon Jung et al. Korean J Lab Med 2010; 30: 554-8)
EBV와 관련된 림프구 증식성 질환의 발생에 관여하는 B 림프구의 기원을 분석하는 것은 장기이식 후의 감염여부 및 이식 시 발생하는 임상적 증상원인을 분석하는데 유용하며, 공여자 EBV의 정량적 분포는 혈중 EBV 부하량과 이식환자로의 전파가능성의 관계를 분석하는데 있어서도 중요한 데이터가 될 수 있다.(Seungwon Jung et al. Korean J Lab Med 2010; 30: 554-8)
감염 발생은 경제적인 여건, 위생 상태, 지리적 위치에 따라 차이를 보이는데 전염성 단핵구증의 역학적 관계는 EBV 감염된 환자의 연령과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. EBV 초감염 연령은 위생적 환경에 따라 다르지만 3세에 약 80%, 20세 전후에 90%, 20대 후반에는 거의 100%에서 항체 양성율을 나타낸다, 유아기에 초감염 되면 무증상이나 경미한 증상에 그치는 경우가 많지만, 청년기에 초감염 되면 일부 전연염성 단색구증(infectious mononucleosis, IM)을 일으키고, 때로는 만성 EBV 감염증(chronic EBV infection)이나 일단 감염이 잠재되는 EBV가 재활성화 과정에서 opportunistic B cell lymphoma, 버키트림프종(Burkitt's lymphoma)을 일으킨다. 일차감염 시기에는 말초 B 림프구의 10%가 감염되고, 숙주의 변역 반응 결과 림프구 백만 개 당 감염된 림프구는 몇 개 수준으로 떨어져, 잠복상태(latent state)의 EBV 유전체로 평생 지속된다.
EBV 감염의 진단은 임상적 증상과 동반하는 말초혈액을 이용한 혈청 검사로 이루어지며, 최근 분자생물학적 진단법에 도입되고 있는 실정이다. 대한민국 특허 제 10-0378942호는 EBV 진단에 대한 특허로 항체를 검출할 수 있는 진단제와 시료 내 EBV 항체를 검출하는 방법을 제시하고 있지만, 이러한 면역학적 분석법을 기반으로 하는 진단법들은 빠른 검사가 가능하다는 장점이 있으나, 낮은 민감도와 감염 정도에 대한 정량검출이 어렵다는 한계점이 있다.
EBV 감염에 대한 진단에 있어서, 상기한 바와 같은 문제점인 EBV 검출에서의 낮은 민감도를 극복하고자 하며, 정량적 검출을 수행 할 수 있도록 하는 것이다.
본 발명은 EBV 감염의 진단에 있어서, 높은 민감도를 가지고 있어 매우 낮은 농도의 엡스타인-바 바이러스를 신속하게 정량적 검출이 가능한 엡스타인-바 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
보다 상세하게는 실시간 중합효소연쇄반응을 이용하여 엡스타인-바 바이러스를 검출하는데 사용될 수 있는, 서열번호 1로 기재된 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2로 기재된 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머와 서열번호 3으로 기재된 올리고뉴클레오티드로 구성된 프로브를 포함하는 엡스타인-바 바이러스 검출용 키트를 제공하고, 이를 이용한 EBV 감염여부에 대한 정량적 검출방법을 제공한다.
본 발명에서 사용된 올리고뉴클레오티드는 프라이머 및 프로브와 같은 2개 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드로 구성된 분자를 말하며, 프라이머는 자연 발생적(예컨테, 제한 단편으로서) 또는 합성으로 제조된 올리고뉴클레오티드로서, DNA 의존성 또는 RNA 의존성 폴리머라아제와 같은 핵산 증폭제 및 뉴클에오티드의 존재하의 적합한 조건하에 놓일 때 핵산 가닥(주형 또는 표적 서열에 상보적인 프라이머 연장 생성물의 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 것을 말한다.
EBV 검출을 위한 주형 DNA는 상동성이 높은 서열을 표적 서열로 선정하였다.(진뱅크 접근번호; HM366190)(서열번호 4, 도 1 참조) 이를 근거로 1100 내지 1250번째 서열인 81bp의 유전자를 합성해 pGEM-T-Easy 벡터에 클로닝 하였다.(실시예 1 참조)
표적서열을 실시간 중합효소연쇄 반응으로 증폭하기 위하여 프라이머 및 프로브를 디자인하여 증폭효율이 우수한 후보인 서열번호 1 내지 3을 선정하였다. 비특이적 인 증폭을 야기할 수 있는 GC 함량은 낮추고, 3´ 말단에 티민(thymidine)이 오지 않도록 하며, 적절한 Tm 값을 나타내며, 프라이머가 2차 구조를 형성하지 않도록 디자인 된 것들 중에서 증폭효율이 가장 우수한 것을 선정한 것이다.
본 발명에 따른 실시간 중합효소연쇄 반응의 감지는 형광 발색을 통해 이루어지며, 프로브의 양말단에 표지된 염색시약인 형광물질(reporter dye)와 켄쳐물질(quencher dye)을 포함하는 것이 특징이다. 바람직하게는 FAM, TAMRA, Cy3, Cy5, HEX, JOE, VIC, TET, Alexa Fluor647, Alexa Fluor660, Texas Red, Bodipy630/650, ROX, 또는 BHQ1 중에서 2종이 선택되며, 프로브의 5´ 말단 및 3´ 말단에 표지되며, 더욱 바람직하게는 상기 프로브의 5´ 말단은 형광시약(reporter dye)인 FAM 또는 TAMRA로 표지되고, 3´ 말단은 켄쳐시약(quencher dye)인 BHQ1로 표지되는 것이다.
또한 본 발명 키트는 상기 프라이머 및 프로브 이외에 실시간 중합효소연쇄반응법에 이용되는 반응 완충용액, DNA 중합효소, dNTP, 내열성 피로포스파타아제, PPi, 및 안정화제 중에서 선택된 하나이상의 조성물을 더 포함하는 것이 바람직하다. 상기한 본 발명의 키트에 사용되는 조성물은 의약용 또는 연구용으로 시판되는 시약 또는 직접 제조하여 사용하는 것이 모두 사용가능하다. 상기 키트에 포함되는 조성물은 상온, 고온 또는 동결건조가 모두 가능하다. 또한 키트의 형태는 시판되고 있는 웰-플레이드 형태나 튜브에 로딩하여 제작되는 것이 가능하다. 상기 웰-플레이트는 96웰, 384웰 등 제한없이 제작될 수 있는 것이 특징이다. 상기 키트의 보관온도는 상온, 냉장 또는 냉동(-20℃ 또는 -70℃이하) 보관이 가능하지만, 바람직하게는 -20℃에서 보관하는 경우 유효기간이 1년이며, 보관조건에 따라 달라 질수 있다.
본 발명의 키트의 특징은 실시간 중합효소연쇄 반응법에 의해 실시 될 수 있으며, 상기의 키트를 사용하는 것은 EBV 검출을 하는데 있어서, 결과 획득의 신속성, 편리성 및 높은 민감도를 갖는 것이 특징이다.
본 발명에 따른 엡스타인-바 바이러스 검출방법은 (a) 검체로부터 DNA를 추출하고 정량하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 획득된 DNA 및 본 발명에 따른 엡스타인-바 바이러스 검출용 키트를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응법으로 상기 DNA를 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭된 바이러스 DNA의 발현량을 분석하고 EBV 감염정도를 판별하는 단계;를 포함하는 엡스타인-바 바이러스를 검출하는 방법이다.
상기 단계(a)에서 검체로부터 DNA를 추출하는 것은 종래의 방법은 제한없이 사용할 수있으며, UV 측정을 통한 정량을 하거나 또는 종래의 알려진 방법으로 제한없이 사용할 수 있다.
본 발명의 EBV 검출방법에서 사용될수 있는 검체는 전혈(whole blood), 혈장, 혈청, 적혈구, 백혈구, 혈소판, 분변, 소변, 눈물, 타액, 피부, 호흡관, 장관, 소화관들의 외부 분비물, 척수액, 림프액, 체액, 또는 조직 등에서 선택된 어느 하나를 이용하는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는 혈장 또는 혈청을 이용하는 것이다.
본 발명은 EBV 검출용 키트에 관한 것이고, 상기 키트를 이용한 EBV의 검출방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 EBV 검출용 키트에 있어서 EBV 특이성을 갖는 신규한 프라이머와 프로브를 포함하는 키트를 제공하는 것이며, 본 발명에 따른 키트를 이용한 EBV의 검출방법에 있어서도, EBV 감염여부 뿐만 아니라 감염의 정도를 정량적으로 제시할 수 있는 것이다.
본 발명의 EBV 검출용 키트는 실시간중합효소연쇄 반응에 사용되는 반응물을 건조하여 제조된 것이 특징이다. 상기 키트는 반응물이 용액상태로 보관 하였을 때와 비교하면, 건조상태의 반응물은 유효기간이 길며, 실험과정을 간소화하여 사용자 편의성을 극대화할 수 있고, 실험자 실수에 의한 오차의 가능성을 현저히 감소 시킬수 있다는 장점이 있다. 무엇보다도, 종래의 EBV 진단에서 있어서 낮은 민감도를 해결하여 본 발명에 따른 EBV 검출용 키트를 활용한 EBV 검출은 높은 민감도를 갖는 정량적 결과를 획득할 수 있으므로 EBV 감염에 대한 진단에 있어서 보다 정확한 결과를 제공할 수 있게 한다.
도 1은 주형 DNA의 상동성을 나타낸 도면이다. 빨간색으로 표시된 부분은 선택된 프라이머 및 프로브가 포함된 위치를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 검출범위를 확인하기 위하여, 주형 DNA의 농도(101 내지 1010 (copies/rxn))별 실시간 중합효소연쇄반응 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 검출범위를 확인하기 위하여, 주형 DNA의 농도(101 내지 1010 (copies/rxn))별 실시간 중합효소연쇄반응에서 얻어진 Ct값의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4은 본 발명의 키트에 대한 재현성 평가로 3번의 배치에 대한 실시간 중합효소 연쇄반응의 그래프와 획득된 Ct 값의 표준편차(STDEV) 및 변동계수(CV)를 나타낸 것이다.
도 5는 본발명 EBV 검출용 키트의 검출한계를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 EBV 검출용 키트의 프라이머 및 프로브인 실시예와 선정되지 않은 후보군인 비교군에 대한 실시간 중합효소연쇄반응 결과를 비교한 그래프이다.
이하, 실시예 및 비교예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예 1. EBV 바이러스 주형 DNA의 제조
본 발명에 따른 엡스타인-바 바이러스 검출용 키트를 이용한 실시간 중합효소연쇄반응법(real time PCR)으로 EBV의 정량적 검출을 시험하기 위한 주형 DNA를 제조하였다.
EBV 검출을 위한 주형 DNA는 상동성이 높은 서열을 선택하였으며(도 1 참조), 이에 대한 상동성 분석을 통하여 변이가 없는 부분을 표적 서열로 선택하고, 선택된 프라이머의 조합을 이용하여 표준염기 서열정보(진뱅크 접근번호; HM366190)를 근거로 1100 내지 1250번째 서열인 81 bp의 유전자를 합성하였고(Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998, 248, 200-203), 이를 pGEM-T-Easy 벡터(Cat: A1360, Promega사제, 미국)에 클로닝하였다.
클로닝 방법은 프로메가(Promega)사에서 제공된 실험법에 따라 진행하였으며, E. coli 만능세포(competent cell)는 HIT-DH5a(Real Biotech Corporation, 대만) 제품을 사용하였으며, 준비된 벡터(vector)를 리얼바이오텍사(Real Biotech Corporation)에서 제공하는 실험방법에 따라 형질전환을 진행하였다.
준비된 만능세포는 앰피실린, IPTG, X-Gal이 도포된 LB 평판배지 상에 도말한 후 37℃에서 16시간 배양하였다. 배양이 완료된 평판배지 상의 흰 콜로니를 취하여 다시 LB 액체 배지에서 16시간 정도 증균 배양한 후 원심 분리하여 상층액은 버리고, 플라스미드 DNA 추출 키트(Accuprep　plasmid DNA prep kit, 바이오니아사, 한국)를 사용하여 펠렛으로부터 플라스미드 DNA를 추출하였다. 플라스미드 DNA는 UV 분광계(Shimazu사, 일본)로 농도와 순도를 측정하였다. 순도가 1.8∼2.0 사이인 것을 확인하였고, 농도 측정 결과를 바탕으로 DNA 복제 개수(copy number)를 아래의 공식에 의하여 계산하였다.
DNA 복제 개수(copy number) = {6.02× 1023 × 농도}/{(3015bp+80)× 660} [식 1]
(상기 농도는 UV 분광계로 측정된 농도(g/㎖)이며; 3015 bp는 T-easy vector의 크기이고; 80 bp는 EBV 주형 DNA의 크기이고; 1bp=660Da이다. )
주형 DNA 복제 개수를 계산한 다음, 1X TE 완충용액(10mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1mM EDTA)으로 10배 희석하여 사용 시까지 -70℃에 보관하였다.
실시예 2. EBV 검출을 위한 프라이머 및 프로브의 선정
EBV 특이 프라이머 및 프로브의 선정은 실시예 1에서 선택한 유전자 서열 중, 상동성이 가장 높고, 증폭효율이 가장 우수하며, 증폭 산물이 100 bp 전후에 가장 가깝게 선택되어 질 수 있는 서열을 이용하였다. 정방향의 프라이머(서열번호 1)는 표준염기서열정보(GeneBank 접근번호; HM366190)의 1145 bp 내지 1168 bp의 염기서열 범위를 채택하였으며, 역방향의 프라이머(서열번호 2)는 1207 bp 내지 1235 bp 의 염기서열 범위를 채택하였다. 채택 기준은 Tm 값이 55℃ 내지 60℃ 범위에 포함되고, 길이는 80 bp 내지 85 bp에 포함되는 염기서열 범위를 포함하는 것이다.
프로브의 선정은 표준염기서열정보(GeneBank 접근번호; HM366190)의 1185 bp내지 1206 bp의 염기서열 범위를 채택하였으며, 이는 도 1의 상동성 결과를 근거로 하여 염기변이가 최소화 될 수 있으며, Tm 값이 55℃내지 60℃범위에 포함되고, 길이가 80 bp내지 150 bp 범위에 포함되는지 여부를 기준으로 하였다. (표 1 참조)
표 1. EBV 감염여부를 검출하기 위한 프라이머와 프로브로 채택된 올리고뉴클레오티스 서열
Figure PCTKR2012003506-appb-I000001
실시예 3. EBV 검출용 키트의 제작.
EBV 검출용 키트를 제작은 10× TE 완충용액(10mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1mM EDTA), 2.5U Taq DNA 폴리머라아제(polymerase) , 20mM dNTP, 내열성 피로포스파타제(thermostable pyrophosphatase), PPi 및 안정화제(α-MG, trehalose, Tween 20)로 구성된 조성물을 혼합하고, 상기 실시예 2에서 채택된 프라이머(서열번호 1 및 2)와 프로브(서열번호 3)를 첨가하여 혼합물을 제조하였다. 상기 혼합물은 96웰 플레이트에 로딩하고 건조하여 EBV 검출용 키트 제작를 완성하였다.
실시예 4. EBV 검출용 키트 검출범위의 평가
상기 실시예 3에서 제작된 EBV 검출용 키트를 이용한 EBV 검출범위를 평가하기 위해, 상기 실시예 1에서 준비된 각 농도의 EBV 주형 DNA를 키트에 투여하고, 총 용량이 50㎕가 되도록 하였다. 총 용량 50㎕ 혼합액을 기준으로 하였을대 키트에 포함된 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브의 농도는 각각 15 pmole이 되도록 하는 것이 특징이다. 이와같이 준비된 키트의 검출범위는 실시간 중합효소연쇄반응법으로 확인하였다. 구체적으로는 상기 실시예 1에 따른 EBV 주형 DNA는 높은 농도에서 낮은 농도로 단계적으로 희석하여 10개 구간으로 준비하였다(1× 101~ 1× 1010 copies/rxn). 실시간 중합효소연쇄반응은 엑시사이클러 실시간중합효소연쇄반응 시스템(ExiCyclerTM Real-Time PCR System, Bioneer사, 한국)을 이용하였다. 구체적으로, 실시간 중합효소연쇄반응 조건은 95℃에서 5분간 변성시킨 후, 95℃에서 5초, 55℃에서 5초씩 45 사이클 반응시켰다. 증폭된 형광값은 각 사이클(cycle)이 진행됨에 따라 55℃ 30초 반응 후에 1회씩 지속적으로 측정되었다. (도 2 및 도 3 참조) 이때, 내부기준(internal control)유전자는 담배 모자이크 바이러스(tobacco mosaic virus; TMV) DNA 서열을 사용하였다.
실시예 5. EBV 검출용 키트의 재현성 평가
재현성 평가는 실시예 3과 동일한 방법으로 3번 반복 실험하였다. 반복실험 결과는 하기 표2와 도 4에 나타내었다. 제시된 바와 같이 표준편차(STDEV) 및 변동계수(CV)가 유효한 값으로 나타났다.
표 2. EBV 검출용 키트의 재현성을 평가하기 위해, 농도별로 3번 반복 실험하여 획득한 Ct값을 나타낸 것이다.
Figure PCTKR2012003506-appb-I000002
실시예 6. EBV 검출용 키트의 정밀도 평가
본 발명에 따른 EBV 검출용 키트의 정밀도를 평가하기 위해서 3단계의 주형 DNA 농도를 103, 105, 107 copies/reaction으로 선택하고 시험내분석(intra-assay), 시험간분석(inter-assay), 제품간분석(inter-batch) 및 8일 반복 검사를 통하여 Ct의 표준편차(STDEV) 및 변동계수(CV)를 계산하여 정밀도를 평가하였다.(표 3 참조)
시험내 분석(intra-assay)은 동일 실험자가 동일 배치(batch)로 생산된 키트를 이용하여 1회 실험할 때 4번 반복하여, 3회 분석하였으며, 시험간 분석(inter-assay)는 상기 시험내 분석과 동일한 방법으로 서로 다른 3인의 실험자가 분석하였고, 제품간 분석(inter-batch)은 키트의 생산 배치 서로 다른 것을 이용하여 동일 실험자가 분석하였다.
표 3. EBV 검출용 키트의 정밀도 평가를 위한 시험내 분석(intra-assay), 시험간 분석(inter-assay), 제품간 분석(inter-batch) 및 8일 반복 검사를 통하여 획득된 Ct의 표준편차(STDEV)와 변동계수(CV, %)를 나타낸 표이다.
Figure PCTKR2012003506-appb-I000003
실시예 7. EBV 검출용 키트의 검출한도 평가
본 발명 EBV 검출용 키트의 ‘검출한도’를 평가하기 위해서 ‘The 1st WHO international Standard for Epstein-Barr virus (EBV)’ 패널을 이용하여 높은 농도에서 낮은 농도로 단계 희석하여 준비하였다. 실시 예 3의 과정과 동일하게 증폭 구성물을 준비하고 각 농도의 패널을 주입하여 형광값을 측정하였으며, 통계 분석을 위하여 각 농도별로 32 반복 검사를 수행하였다. 실험을 통하여 얻어진 결과값을 프로빗(Probit) 분석을 통하여 통계 분석을 수행하였고, 95% 이상 측정 검출 가능한 농도를 검출 한도로 정하였다. (도 5 참조)
실시예 8. EBV 검출용 키트의 보관 안정성 평가
본 발명에서 제공하는 EBV 검출용 키트의 보관 안정성을 평가하기 위해서 상기 실시예 5와 동일하게 주형 DNA 농도를 103, 105, 107 copies/reaction으로 선택하고 7일간 40℃의 온도에서 보관한 후 1일 간격으로 실시예 3과 동일한 방법으로 실시간 중합효소연쇄반응을 진행하여 성능을 평가하였다. 본 실험과정에서 얻은 결과는 제품의 보관 온도조건을 위한 가속 안정성을 위해서는 아레니우스 식(Arrhenius equation)에 기반하여 예측되는 보관 안정성을 확인하였다. 본 발명 키트는 -20℃ 이하 보관 시 유효기간이 1년으로 채택되었다.
비교예 1. 본 발명에 따른 EBV 검출을 위한 프라이머 및 프로브로 선정되지 않은 비교예 프라이머 및 프로브를 이용한 실시간 중합효소연쇄 반응
본 발명에 따른 EBV 검출을 위한 프라이머 및 프로브로 선정되지 않은 비교예 프라이머 및 프로브(비교예(1) 및 비교예(2), 표 4 참조)를 이용한 실시간 중합효소연쇄 반응은 실시예 4와 동일한 구성 및 방법으로 실시하여 결과를 비교하였다.
비교예에서 사용된 프라이머 및 프로브 서열은 하기와 같다. 본 비교에서는 프라이머와 프로브로서의 조건을 만족하여 디자인된 서열을 비교예로서 사용하였다. 본 발명에서 채택된 프라이머와 프로브와 비교하면 비교예의 Ct 값과 curve의 강도(intensity)가 떨어지는 것을 확인 할 수 있었다. (표5 및 도 6 참조)
표 4. 비교예로 사용된 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다.
Figure PCTKR2012003506-appb-I000004
표 5. 실시예 4, 비교예(1) 및 비교예(2)의 실시간중합효소 연쇄반응에서 획득된 Ct값을 나타낸 것이다.
Figure PCTKR2012003506-appb-I000005
서열번호 1: 합성 DNA로서 정방향 프라이머이며, EBV 주형 DNA의 표준염기서열정보(GeneBank 접근번호; HM366190)1145 bp 내지 1168 bp의 염기서열
GCG AGC AAT CGG ACA TTT G
서열번호 2: 합성 DNA로서 역방향 프라이머이며, EBV 주형 DNA의 표준염기서열정보(GeneBank 접근번호; HM366190)1207 bp 내지 1235 bp의 염기서열
GGT AGC CGT TCG TGT GAT AAT GA
서열번호 3: 합성 DNA로서 프로브이며, EBV 주형 DNA의 표준염기서열정보(GeneBank 접근번호; HM366190)1185 bp내지 1206의 염기서열
TTG GCA CGG CCC CCA AGA CA

Claims (7)

  1. 서열번호 1로 기재된 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2로 기재된 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 세트와 서열번호 3으로 기재된 올리고뉴클레오티드로 구성된 프로브를 포함하는 엡스타인-바 바이러스 검출용 키트.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 키트는 실시간 중합효소연쇄반응법에 이용되는 반응 완충용액, DNA 중합효소, dNTP, 내열성 피로포스파타아제, PPi 및 안정화제 중에서 선택된 하나 이상을 더 포함하는 엡스타인-바 바이러스 검출용 키트.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 프로브의 양 말단은 염색시약으로 표지된 것을 특징으로 하는 엡스타인-바 바이러스 검출용 키트.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 염색시약은 FAM, TAMRA, Cy3, Cy5, HEX, JOE, VIC, TET, Alexa Fluor647, Alexa Fluor660, Texas Red, Bodipy630/650, ROX 또는 BHQ1 중에서 2종이 선택되며, 각각은 프로브의 5´ 말단 및 3´ 말단에 표지되는 것을 특징으로 하는 엡스타인-바 바이러스 검출용 키트.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 프로브의 5´ 말단은 형광시약(reporter dye)인 FAM 또는 TAMRA으로 표지되고, 3´ 말단은 켄쳐시약(quencher dye)인 BHQ1로 표지되는 것을 특징으로 하는 엡스타인-바 바이러스 검출용 키트.
  6. (a) 검체로부터 DNA를 추출하고 정량하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 획득된 DNA 및 제 1항 내지 제 5항의 어느 한 항에 따른 엡스타인-바 바이러스 검출용 키트를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응으로 DNA를 증폭하는 단계; 및
    (c) 상기 증폭된 바이러스 DNA의 발현량을 분석하여 EBV 감염정도를 판별하는 단계;를 포함하는 엡스타인-바 바이러스의 검출방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 검체는 혈장 또는 혈청인 것을 특징으로 하는 엡스타인-바 바이러스의 검출방법.
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