CN115873849B - 同步检测16种女性生殖道病原体的引物探针组合物 - Google Patents

同步检测16种女性生殖道病原体的引物探针组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN115873849B
CN115873849B CN202310023152.2A CN202310023152A CN115873849B CN 115873849 B CN115873849 B CN 115873849B CN 202310023152 A CN202310023152 A CN 202310023152A CN 115873849 B CN115873849 B CN 115873849B
Authority
CN
China
Prior art keywords
probe
specific primers
herpes simplex
simplex virus
hemolytic streptococcus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202310023152.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115873849A (zh
Inventor
夏雪山
梁江楠
冯悦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kunming University of Science and Technology
Original Assignee
Kunming University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kunming University of Science and Technology filed Critical Kunming University of Science and Technology
Priority to CN202310023152.2A priority Critical patent/CN115873849B/zh
Publication of CN115873849A publication Critical patent/CN115873849A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115873849B publication Critical patent/CN115873849B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种同步检测16种女性生殖道病原体的引物探针组合物，包括检测细菌：结核分枝杆菌、α型溶血性链球菌、β型溶血性链球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、加德纳菌；真菌：白色念珠菌；支原体：生殖支原体、微小脲原体、解脲脲原体；衣原体：沙眼衣原体；病毒：单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、EB病毒、巨细胞病毒；寄生虫：阴道毛滴虫的特异性引物和探针；是目前较为全面的女性生殖道病原体感染检测方法，灵敏度高、特异性强且耗时较少，可快速准确针对常见病原体感染引起疾病的致病原因作出判断，为临床诊断提供依据。

Description

同步检测16种女性生殖道病原体的引物探针组合物
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一组检测引起女性生殖道疾病病原体的多重qPCR引物探针组合物，利用多重qPCR检测16种引起女性生殖道疾病的病原体。
背景技术
妇科疾病是女性生殖系统病变的总称，多数女性一生中存在不同程度或不同种类的妇科疾病，常见的妇科感染疾病有阴道炎、宫颈炎、子宫内膜炎、输卵管炎、卵巢炎和卵巢脓肿、盆腔炎、生殖器结核、炎性盆腔包块与盆腔疼痛，以及性传播疾病(sexuallytransmitteddisease，STD)。目前，列入重点防治的性传播疾病为梅毒、淋病、沙眼衣原体、尖锐湿疣、生殖器疱疹和艾滋病等。
引起这些妇科疾病的原因多为外源性致病菌入侵生殖道，常见的女性生殖道感染病原体包括：细菌：结核分枝杆菌(MTB)、α型溶血性链球菌(GAS)、β型溶血性链球菌(GBS)、大肠杆菌(EC)、金黄色葡萄球菌(SA)、加德纳菌(GV)；真菌：白色念珠菌(CA)；支原体：生殖支原体(Mg)、微小脲原体(UP)、解脲脲原体(UU)；衣原体：沙眼衣原体(CT)；病毒：单纯疱疹病毒1型(HSV-1)、单纯疱疹病毒2型(HSV-2)、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)；寄生虫：阴道毛滴虫(Tv)。
临床常用女性生殖道病原体检测方法有培养法、血清学检测、分子生物学检测等。较为原始的培养法耗时长且准确率低，只适用于判断少部分病原体；血清学检测较为灵敏但易出现假阳性，且操作有一定难度；因此，临床需要能快速准确判定病原体的方法。
普通PCR虽能准确区分病原体，但检测多种病原体时操作繁琐且耗材；基因芯片技术和二代测序技术具有高通量等优点，适用于癌症等复杂性疾病的遗传学筛查，若应用于多种病原体检出则成本太高；普通实时荧光定量PCR具有较好的灵敏度和特异性等优点，能在避免污染的同时对病原体定性且定量，但该技术只能针对一种或几种病原体，同步检测多种病原体则成本较高。根据临床性病防治管理需求，针对女性生殖道感染病原体的特点，建立灵敏度高、特异性强且快速的检测方法，对实现病原体多重联检及女性性传播疾病研究具有重要意义。
多重荧光定量PCR(MμLtiplefluorescencequantitativePCR)技术是在普通PCR的基础上，于同一PCR反应管内，同时对多个目标基因序列进行扩增，从而实现多重联检。多重荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性强、成本低等优点，应用于临床诊断，可及时判断病情，实现疾病的早期、快速、精准治疗。
目前国内外已有基于实时荧光定量PCR技术检测女性生殖道感染病原体的试剂盒，但这些试剂盒检测的病原体种类少且物种涵盖范围小，不能满足临床需求。
发明内容
针对现有技术不足，本发明提供了一组同步检测16种女性生殖道病原体的引物探针组合物，其包含细菌、真菌、支原体、衣原体、病毒和寄生虫检测，不仅选取了常见病原体，还选取了部分无症状感染类病原体，在控制成本的同时做到较为全面的女性生殖道病原体筛查。
上述引物探针组合物包括检测细菌：结核分枝杆菌(MTB)、α型溶血性链球菌(GAS)、β型溶血性链球菌(GBS)、大肠杆菌(EC)、金黄色葡萄球菌(SA)、加德纳菌(GV)；真菌：白色念珠菌(CA)；支原体：生殖支原体(Mg)、微小脲原体(UP)、解脲脲原体(UU)；衣原体：沙眼衣原体(CT)；病毒：单纯疱疹病毒1型(HSV-1)、单纯疱疹病毒2型(HSV-2)、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)；寄生虫：阴道毛滴虫(Tv)的特异性引物和探针，本发明检测试剂中还包括用于多重qPCR的其他常规试剂，本发明对建立的方法进行特异性、灵敏度、重复性和准确性评价，发现多重qPCR方法具有检测灵敏度高、特异性强、重复性良好，对仪器设备要求不高、操作简便、所需时间短等优点，因此具有较大的应用价值，为妇科病原体的快速检测提供了便捷方法，对流行病学研究及临床早期分子诊断等具有重要意义。
针对解脲脲原体的特异性引物为UU-F：TATGTCAGGATCATCAAATCAATTC和UU-R：TTTGCYTCTCTACCTTCGTTCATC；针对解脲脲原体的探针为UU-P：CCAGGAGCAATTAACTTCGCTGAAGGC；
针对沙眼衣原体的特异性引物为CT-F：AACCAAGGTCGATGTGATAG和CT-R：TCAGATAATTGGCGATTCTT；针对沙眼衣原体的探针为CT-P：CGAACTCATCGGCGATAAGG；
针对α型溶血性链球菌的特异性引物为GAS-F：TGGATGTGGTTGCAGGTTTAGAC和GAS-R：CGGGCAAGTAGTTCTTCAATGG；针对α型溶血性链球菌的探针为GAS-P：CGGTGCAGACGACTATATTGTTAAACC；
针对β型溶血性链球菌的特异性引物为GBS-F：ATCCTGAGACAACACTGACA和GBS-R：TTGCTGGTGTTTCTATTTTCA；针对β型溶血性链球菌的探针为GBS-P：ATCAGAAGAGTCATACTGCYACTTC；
针对阴道毛滴虫的特异性引物为Tv-F：AAGTCTCTAAGCAATGGATGTCT和Tv-R：CAAAGATTAACCTGTCATGATGT；针对阴道毛滴虫的探针为Tv-P：TCTTGGCTCCTCACACGATGA；
针对单纯疱疹病毒2型的特异性引物为HSV-2-F：AGATATCCTCTTTATCATCAGCACCA和HSV-2-R：TTGTGCTGCCAAGGCGA；针对单纯疱疹病毒2型的探针为HSV-2-P：CAGACAAACGAACGCCGCCG；
针对结核分枝杆菌的特异性引物为MTB-F：AGACGTTATCCACCATAC和MTB-R：AGTGCATTGTCATAGGAG；针对结核分枝杆菌的探针为MTB-P：TCTCAGTACACATCGATCCGGT；
针对巨细胞病毒的特异性引物为CMV-F：TCATCCACACTAGGAGAGCAGACT和CMV-R：GCCAAGCGGCCTCTGAT；针对巨细胞病毒的探针为CMV-P：ACTGGGCAAAGACCTTCATGCAGATCTC；
针对EB病毒的特异性引物为EBV-F：AGGATGCGATTAAGGACCTTGTT和EBV-R：GGAAACCAGGGAGGCAAATCT；针对EB病毒的探针为EBV-P：TGACAAAGCCCGCTCCTACCTGCA；
针对生殖支原体的特异性引物为Mg-F：CCCAAACTGTCTTTCAACCC和Mg-R：ATTCCAATCGTTAATCCCAAA；针对生殖支原体的探针为Mg-P：AGTGGGCAGACTATGTCTTACCTTTG；
针对微小脲原体的特异性引物为F：GCAAGAAGACGTTTAGCTAGAGGTTT和R：CGAGCAGATTGCATTAGGTCAG；针对微小脲原体的探针为UP-P：TTTAATTACTGATCATGTAATGGA；
针对单纯疱疹病毒1型的特异性引物为F：GGCCTGGCTATCCGGAGA和R：GCGCAGAGACATCGCGA；针对单纯疱疹病毒1型的探针为HSV-1-P：CAGCACACGACTTGGCGTTCTGTGT；
针对金黄色葡萄球菌的特异性引物为SA-F：GTTGTTTAGTGTTAACTTTAGTTGTA和SA-R：AATGTCGCAGGTTCTTTATGTAATTT；针对金黄色葡萄球菌的探针为SA-P：AAGTCTAAGTAGCTCAGCAAATGCA；
针对大肠杆菌的特异性引物为EC-F：GAACAAAACCATGTGCAATATGC和EC-R：CTTCATCTCCTTCCGATATACCTAACG；针对大肠杆菌的探针为EC-P：AGCAACCGTTCCATTACTTACAG；
针对白色念珠菌的特异性引物为CA-F：CCTGTTTGAGCGTCRTTT和CA-R：TCCTCCGCTTATTGATAT；针对白色念珠菌的探针为CA-P：CATTGCTTGCGGCGGTA；针对加德纳菌的特异性引物为GV-F：TCCCAACCCCAACTCACGATCTT和GV-R：RCGCAAACCAACRATCTCAACTGG；针对加德纳菌的探针为GV-P：CCATCTCCGGTCGTGGTACCGTTG。
本发明采用以下技术方案实现本发明目的：
1、样品核酸(DNA)提取，样品为阴道拭子；
2、以步骤(1)核酸为模版，采用靶向16种病原体的特异性引物和探针，经过多重实时荧光定量PCR进行检测，以GAPDH为内参，根据Ct值进行结果判定；
在检测中检测解脲脲原体(UU)、沙眼衣原体(CT)、α型溶血性链球菌(GAS)和β型溶血性链球菌(GBS)的特异性引物和探针同时使用；检测阴道毛滴虫(Tv)、单纯疱疹病毒2型(HSV-2)、结核分枝杆菌(MTB)和巨细胞病毒(CMV)的特异性引物和探针同时使用；检测EB病毒(EBV)、生殖支原体(Mg)和微小脲原体(UP)的特异性引物和探针同时使用；检测单纯疱疹病毒1型(HSV-1)和金黄色葡萄球菌(SA)的特异性引物和探针同时使用；检测大肠杆菌(EC)、白色念珠菌(CA)和加德纳菌(GV)的特异性引物和探针同时使用；以GAPDH为内参，GAPDH-F：GAAGGTGAAGGTCGGAGTC、GAPDH-R：GAAGATGGTGATGGGATTTC；GAPDH-P：ACGGATTTGGTCGTATTGGGC。
采用本发明多重荧光定量PCR检测试剂检测病原体的扩增反应体系如下：2×ProTaqHSProbePremix20μL、每种病原体上下游引物探针各1μL、DNA模版5μL、ddH2O补足至40μL；反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，58℃退火并延伸30s，45个循环，在每个循环的退火延伸阶段收集荧光信号。
检测阳性结果判读包括：(1)内参(GAPDH基因)Ct值≤36.0，阴性对照组、无模版对照组无Ct值；如不符合须再次进行多重实时荧光定量PCR检测，或重新提取核酸进行多重实时荧光定量PCR检测；(2)病原体Ct值≤36.0，若Ct值>36.0，需要针对该病原体进行单重实时荧光定量PCR验证；(3)扩增曲线呈标准“S”型且无异常波动。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和技术效果：
1、本发明提供的用于检测16种妇科疾病病原体的引物、探针组合，检测效率高，检测结果准确，可以低成本快速完成病原体诊断，对mqPCR方法进行特异性评价发现每组病原体与其他组外病原体之间均无交叉反应，各组病原体特异性良好；灵敏度评价发现除沙眼衣原体的灵敏度达到100copies/μL量级外，有8种病原体灵敏度均达到10copies/μL量级，剩余7种病原体灵敏度均达到1copies/μL量级，灵敏度很高；对该方法进行重复性评价发现各组病原体在批间和批内的变异系数(CV)均小于6，重复性良好；通过检测15例阴道拭子样本进行mqPCR准确性评价，结果发现mqPCR方法准确性良好；
本发明是在实时荧光定量PCR技术平台的基础上，对病原特异性靶标基因进行定性检测，一次可检测多个样本，具有快速、特异、经济等特点，极大降低了每个样品的检测成本。
附图说明
图1为解脲脲原体、沙眼衣原体、α型溶血性链球菌、β型溶血性链球菌和GAPDH的多重qPCR特异性试验结果；
图2为阴道毛滴虫、单纯疱疹病毒2型、结核分枝杆菌、巨细胞病毒和GAPDH的多重qPCR特异性试验结果；
图3为EB病毒、生殖支原体、微小脲原体和GAPDH的多重qPCR特异性试验结果；
图4为单纯疱疹病毒1型、金黄色葡萄球菌和GAPDH的多重qPCR特异性试验结果；
图5为大肠杆菌、白色念珠菌、加德纳菌和GAPDH的多重qPCR特异性试验结果；
图6为解脲脲原体(上图)和沙眼衣原体(下图)的多重qPCR灵敏度试验结果；
图7为α型溶血性链球菌(上图)和β型溶血性链球菌(下图)的多重qPCR灵敏度试验结果；
图8为阴道毛滴虫(上图)和单纯疱疹病毒2型(下图)的多重qPCR灵敏度试验结果；
图9为结核分枝杆菌(上图)和巨细胞病毒(下图)的多重qPCR灵敏度试验结果；
图10为EB病毒(上图)和生殖支原体(下图)的多重qPCR灵敏度试验结果；
图11为微小脲原体(上图)和单纯疱疹病毒1型(下图)的多重qPCR灵敏度试验结果；
图12为金黄色葡萄球菌(上图)和大肠杆菌(下图)的多重qPCR灵敏度试验结果；
图13为白色念珠菌(上图)和加德纳菌(下图)的多重qPCR灵敏度试验结果；
图14为内参GAPDH基因的多重qPCR灵敏度试验结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。
实施例1：引物和探针的设计
1、在NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation，美国国家生物技术信息中心)网站中下载病原体基因参考序列如下：解脲脲原体urease complex componentUreB(ureB)and UreC(ureC)编码基因，α型溶血性链球菌CsrRS编码基因，沙眼衣原体Plasmid编码基因，β型溶血性链球菌surface immunogenic protein(sip)gene编码基因，阴道毛滴虫ribosomal RNA编码基因，单纯疱疹病毒2型US3 and US4编码基因，结核分枝杆菌IS6110 gene编码基因，巨细胞病毒UL122和UL123编码基因，EB病毒BKRF1编码基因，生殖支原体MgpB adhesin(mgpB)and MgpA adhesin(mgpA)gene编码基因，微小脲原体ureasecomplex component UreA(ureA)编码基因，单纯疱疹病毒1型envelope glycoprotein编码基因，金黄色葡萄球菌Staphylococcal protein A(SPA)编码基因，大肠杆菌RfbE编码基因，白色念珠菌ribosomal RNA编码基因，加德纳菌Tuf编码基因；使用Mega7软件对核苷酸序列进行对齐，使用PrimerSelect软件设计引物与探针，并需要满足以下条件：
(1)Tm值：一般探针Tm值较引物Tm高8-10℃，其中探针Tm值一般为60℃以上；
(2)GC含量：一般不低于40％；
(3)不产生引物二聚体，发夹结构软件评估结果为OK；
(4)扩增片段大小一般小于200bp。
2、引物与探针BLAST评估：初步设计完成的引物探针核苷酸序列，再次使用NCBI网站中的BLAST检索功能，进行比对，选择特异性高的引物、探针序列；
3、靶向16种中枢神经系统感染性疾病病原体及内参GAPDH基因的特异性引物和探针的核苷酸序列见下表；
4、质粒的构建
将16种病原体的特异性序列、内参基因GAPDH的序列与pUC57载体连接，合成质粒标准品，GAS、CA、Tv、MTB、GAPDH单独合成一个质粒；EBV和CMV，UU和EC，Mg和HSV-2每两个合成到一个质粒上；SA、GBS和HSV-1，UP、GV和CT每三个合成到一个质粒上，质粒构建由中美泰和生物技术北京有限公司完成；通过紫外分光光度计进行浓度测定，根据各个质粒长度和浓度计算出质粒的拷贝数，结果见下表：
将这些质粒按照10倍稀释法梯度稀释，共设置七个梯度分别为106、105、104、103、102、101、100copies/μL量级。
实施例2：qPCR扩增及特异性、灵敏度、重复性试验
1、多重荧光定量PCR
由于多重荧光定量PCR需要在一个体系中检测3或4种病原体及1种内参基因，所以多重荧光定量PCR反应体系为40μL，其中3或4种病原体及1种内参基因的引物探针均加入1μL，模板为4μL：
扩增反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，58℃退火并延伸30s，45个循环，在每个循环的退火延伸阶段收集荧光信号。
检测分组为：(1)解脲脲原体、沙眼衣原体、α型溶血性链球菌、β型溶血性链球菌；(2)阴道毛滴虫、单纯疱疹病毒2型、结核分枝杆菌、巨细胞病毒；(3)EB病毒、生殖支原体、微小脲原体；(4)单纯疱疹病毒1型、金黄色葡萄球菌；(5)大肠杆菌、白色念珠菌、加德纳菌；
分别将含有病原体特异序列的浓度103copies/μL质粒标准品10μL按上述分组混合为模板，使用艾科瑞生物公司ProTaqHS预混型探针法qPCR试剂盒进行多重荧光定量PCR检测，并在每组中添加对应的病原体的引物和探针，检测结果见图1-5；结果显示各组病原体之间均无交叉反应，说明检测引物在多重荧光定量PCR中特异性良好。
2、多重qPCR灵敏性试验
用qPCR的方法对梯度106、105、104、103、102、101、100copies/μL的质粒模板进行检测，确定MqPCR检测方法能检测到的最低质粒浓度，结果如图6-14所示，从图6-7中可以看出解脲脲原体(UU)、沙眼衣原体(CT)、α型溶血性链球菌(GAS)和β型溶血性链球菌(GBS)的灵敏度的检测下限分别为：6.45×101、5.09×102、1.31×101、2.58×101copies/μL；从图8-9中可以看出阴道毛滴虫(Tv)、单纯疱疹病毒2型(HSV-2)、结核分枝杆菌(MTB)和巨细胞病毒(CMV)的灵敏度的检测下限分别为：6.06×100、1.17×100、3.92×101、5.44×101copies/μL；从图10-11中可以看出EB病毒(EBV)、生殖支原体(Mg)和微小脲原体(UP)的灵敏度的检测下限分别为：5.44×101、1.17×100、5.09×100copies/μL；从图11-12中可以看出单纯疱疹病毒1型(HSV-1)和金黄色葡萄球菌(SA)，其灵敏度的检测下限分别为：2.58×101、2.58×101copies/μL；从图12-13中可以看出大肠杆菌(EC)、白色念珠菌(CA)和加德纳菌(GV)的灵敏度的检测下限分别为：6.45×100、3.99×101、5.09×100copies/μL；从图14中可以看出GAPDH基因的多重qPCR灵敏性试验结果，发现内参GADPH基因的检测限达到1copies/μL量级。
3、多重qPCR重复性试验
为了验证MqPCR检测方法的重复性，用103copies/μL量级质粒作为模板进行实验，分别进行组内和组间重复性实验；以每组病原体的特异性引物和探针对质粒模板进行检测，同一时间重复进行三次，观察记录其Ct值，每周一进行重复性检测，连续进行三周，观察记录其Ct值，重复性结果下表：
实施例3：阴道拭子的检测
1、样本的采集采样时用拭子将宫颈口过多的分泌物擦去，然后将一次性采样拭子伸入宫颈口处，轻轻转动拭子试用期顺时针旋转3～5圈，慢慢抽出一次性采样拭子，将其放入装有细胞保存液的采样管中，在管口处将多余的拭子尾部折断，将拭子头留在采样管中，将植绒的尖端充分浸入小瓶中，并紧紧地拧紧瓶盖，在标签上记录病人的姓名和身份证号码，将采样管运输到实验室，在运输过程中储存在大约4℃，然后保存在-80℃直至分析。
2、基因组DNA提取
基因组DNA提取，样品为阴道拭子；将阴道拭子放入2mL装有生理盐水的离心管中，充分震荡，使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取核酸，具体步骤如下：
(1)用移液器将20μL ProteinaseK加入到一个干净的1.5mL离心管中；
(2)向离心管中加入200μL样品样本；
(3)加入200μL CarrierRNA工作液(为缓冲液GB与CarrierRNA溶液的混合液，配制方法按照公式计算：n×0.22mL＝ymL；ymL×28μL/mL＝zμL；其中n＝同时提取的样品个数，y＝需要加入缓冲液GB的体积，z＝需要加入CarrierRNA溶液的体积)，盖上管盖，涡旋振荡15s混匀，使样品和CarrierRNA工作液需要彻底混匀，保证其裂解充分；
(4)在56℃孵育15min，简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体；
(5)加入250μL无水乙醇，此时可能会出现絮状沉淀，盖上管盖并涡旋振荡15s，彻底混匀，在室温(15-25℃)放置5min；
(6)简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体；
(7)仔细将离心管中的溶液和絮状沉淀全部转移至RNase-Free吸附柱CR2(吸附柱放在收集管中)，盖上管盖，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
(8)小心打开吸附柱盖子，加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，盖上管盖，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管，
(9)小心打开吸附柱盖子，加入600μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，盖上管盖，静置2min，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管；
(10)重复步骤9；
(11)小心打开吸附柱盖子，加入500μL无水乙醇，盖上管盖，8000rpm离心1min，弃废液；
(12)将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心3min，使吸附膜完全变干，弃废液；
(13)将吸附柱放入一个RNase-Free离心管(1.5mL)中，小心打开吸附柱的盖子，室温放置3min，使吸附膜完全变干，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μLRNase-FreeddH2O，盖上盖子，室温放置5min，12000rpm离心1min；
(14)核酸收集于离心管，标记好信息，放于-80℃保存。
3、从医院收集15例阳性阴道拭子样本，在核酸提取后进行一代测序检测(sanger测序)，测序结果进行NCBIBlast比对，确定病原体种类，同时用本发明qPCR的方法检测这15例样本，记录检测结果，结果如下：
/>
由上表可知，通过本发明设计的妇科疾病主要的16种外源病原体的多重qPCR检测的引物、探针组，较一代测序的检测方法更加的快速与便捷。

Claims (2)

1.一种同步检测16种女性生殖道病原体的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物包括针对解脲脲原体、沙眼衣原体、α型溶血性链球菌、β型溶血性链球菌、阴道毛滴虫、单纯疱疹病毒2型、结核分枝杆菌、巨细胞病毒、EB病毒、生殖支原体、微小脲原体、单纯疱疹病毒1型、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌和加德纳菌的特异性引物和探针：
针对解脲脲原体的特异性引物为UU-F：TATGTCAGGATCATCAAATCAATTC和UU-R：TTTGCYTCTCTACCTTCGTTCATC；针对解脲脲原体的探针为UU-P：CCAGGAGCAATTAACTTCGCTGAAGGC；
针对沙眼衣原体的特异性引物为CT-F：AACCAAGGTCGATGTGATAG和CT-R：TCAGATAATTGGCGATTCTT；针对沙眼衣原体的探针为CT-P：CGAACTCATCGGCGATAAGG；
针对α型溶血性链球菌的特异性引物为GAS-F：TGGATGTGGTTGCAGGTTTAGAC和GAS-R：CGGGCAAGTAGTTCTTCAATGG；针对α型溶血性链球菌的探针为GAS-P：CGGTGCAGACGACTATATTGTTAAACC；
针对β型溶血性链球菌的特异性引物为GBS-F：ATCCTGAGACAACACTGACA和GBS-R：TTGCTGGTGTTTCTATTTTCA；针对β型溶血性链球菌的探针为GBS-P：ATCAGAAGAGTCATACTGCYACTTC；
针对阴道毛滴虫的特异性引物为Tv-F：AAGTCTCTAAGCAATGGATGTCT和Tv-R：CAAAGATTAACCTGTCATGATGT；针对阴道毛滴虫的探针为Tv-P：TCTTGGCTCCTCACACGATGA；
针对单纯疱疹病毒2型的特异性引物为HSV-2-F：AGATATCCTCTTTATCATCAGCACCA和HSV-2-R：TTGTGCTGCCAAGGCGA；针对单纯疱疹病毒2型的探针为HSV-2-P：CAGACAAACGAACGCCGCCG；
针对结核分枝杆菌的特异性引物为MTB-F：AGACGTTATCCACCATAC和MTB-R：AGTGCATTGTCATAGGAG；针对结核分枝杆菌的探针为MTB-P：TCTCAGTACACATCGATCCGGT；
针对巨细胞病毒的特异性引物为CMV-F：TCATCCACACTAGGAGAGCAGACT和CMV-R：GCCAAGCGGCCTCTGAT；针对巨细胞病毒的探针为CMV-P：ACTGGGCAAAGACCTTCATGCAGATCTC；
针对EB病毒的特异性引物为EBV-F：AGGATGCGATTAAGGACCTTGTT和EBV-R：GGAAACCAGGGAGGCAAATCT；针对EB病毒的探针为EBV-P：TGACAAAGCCCGCTCCTACCTGCA；
针对生殖支原体的特异性引物为Mg-F：CCCAAACTGTCTTTCAACCC和Mg-R：ATTCCAATCGTTAATCCCAAA；针对生殖支原体的探针为Mg-P：AGTGGGCAGACTATGTCTTACCTTTG；
针对微小脲原体的特异性引物为F：GCAAGAAGACGTTTAGCTAGAGGTTT和R：CGAGCAGATTGCATTAGGTCAG；针对微小脲原体的探针为UP-P：TTTAATTACTGATCATGTAATGGA；
针对单纯疱疹病毒1型的特异性引物为F：GGCCTGGCTATCCGGAGA和R：GCGCAGAGACATCGCGA；针对单纯疱疹病毒1型的探针为HSV-1-P：CAGCACACGACTTGGCGTTCTGTGT；
针对金黄色葡萄球菌的特异性引物为SA-F：GTTGTTTAGTGTTAACTTTAGTTGTA和SA-R：AATGTCGCAGGTTCTTTATGTAATTT；针对金黄色葡萄球菌的探针为SA-P：AAGTCTAAGTAGCTCAGCAAATGCA；
针对大肠杆菌的特异性引物为EC-F：GAACAAAACCATGTGCAATATGC和EC-R：CTTCATCTCCTTCCGATATACCTAACG；针对大肠杆菌的探针为EC-P：AGCAACCGTTCCATTACTTACAG；
针对白色念珠菌的特异性引物为CA-F：CCTGTTTGAGCGTCRTTT和CA-R：TCCTCCGCTTATTGATAT；针对白色念珠菌的探针为CA-P：CATTGCTTGCGGCGGTA；
针对加德纳菌的特异性引物为GV-F：TCCCAACCCCAACTCACGATCTT和GV-R：RCGCAAACCAACRATCTCAACTGG；针对加德纳菌的探针为GV-P：CCATCTCCGGTCGTGGTACCGTTG。
2.含有权利要求1所述同步检测16种女性生殖道病原体的引物探针组合物的检测试剂盒。
CN202310023152.2A 2023-01-09 2023-01-09 同步检测16种女性生殖道病原体的引物探针组合物 Active CN115873849B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310023152.2A CN115873849B (zh) 2023-01-09 2023-01-09 同步检测16种女性生殖道病原体的引物探针组合物

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310023152.2A CN115873849B (zh) 2023-01-09 2023-01-09 同步检测16种女性生殖道病原体的引物探针组合物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115873849A CN115873849A (zh) 2023-03-31
CN115873849B true CN115873849B (zh) 2024-04-05

Family

ID=85758245

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310023152.2A Active CN115873849B (zh) 2023-01-09 2023-01-09 同步检测16种女性生殖道病原体的引物探针组合物

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115873849B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117106938B (zh) * 2023-08-31 2024-05-28 苏州创澜生物科技有限公司 一种用于检测阴道炎病原体的试剂、试剂盒及应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014060604A2 (en) * 2012-10-20 2014-04-24 Selfdiagnostics OÜ Method and its compositions for detection of nucleic acid target from biological samples and body fluids
CN110229916A (zh) * 2019-06-06 2019-09-13 昆明理工大学 一种大肠杆菌特异基因的引物及检测大肠杆菌的方法
CN113652493A (zh) * 2021-08-17 2021-11-16 厦门市妇幼保健院（厦门市计划生育服务中心） 一种能减少三种荧光通道pcr竞争的生殖道pcr体系
CN114990240A (zh) * 2022-06-01 2022-09-02 昆明理工大学 用于检测妇科疾病外源病原体的多重qPCR检测试剂
CN114990260A (zh) * 2022-06-01 2022-09-02 昆明理工大学 用于检测中枢神经系统感染性病原体的多重荧光定量pcr检测试剂
CN116732203A (zh) * 2023-04-28 2023-09-12 天津威高分子诊断科技有限公司 一种用于生殖道三项病原体核酸检测的pcr试剂体系、试剂盒及制备方法
CN117106938A (zh) * 2023-08-31 2023-11-24 苏州创澜生物科技有限公司 一种用于检测阴道炎病原体的试剂、试剂盒及应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140114215A1 (en) * 2012-10-20 2014-04-24 Medtronic Ardian Luxembourg S.A.R.L. Methods for Renal Neuromodulation and Associated Systems and Devices

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014060604A2 (en) * 2012-10-20 2014-04-24 Selfdiagnostics OÜ Method and its compositions for detection of nucleic acid target from biological samples and body fluids
CN110229916A (zh) * 2019-06-06 2019-09-13 昆明理工大学 一种大肠杆菌特异基因的引物及检测大肠杆菌的方法
CN113652493A (zh) * 2021-08-17 2021-11-16 厦门市妇幼保健院（厦门市计划生育服务中心） 一种能减少三种荧光通道pcr竞争的生殖道pcr体系
CN114990240A (zh) * 2022-06-01 2022-09-02 昆明理工大学 用于检测妇科疾病外源病原体的多重qPCR检测试剂
CN114990260A (zh) * 2022-06-01 2022-09-02 昆明理工大学 用于检测中枢神经系统感染性病原体的多重荧光定量pcr检测试剂
CN116732203A (zh) * 2023-04-28 2023-09-12 天津威高分子诊断科技有限公司 一种用于生殖道三项病原体核酸检测的pcr试剂体系、试剂盒及制备方法
CN117106938A (zh) * 2023-08-31 2023-11-24 苏州创澜生物科技有限公司 一种用于检测阴道炎病原体的试剂、试剂盒及应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Comparison between Culture and a Multiplex Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction Assay Detecting Ureaplasma urealyticum and U. parvum;Maria Frølund等;PLOS ONE;20140721;摘要 *
Density Interactions between Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae and Staphylococcus aureus in the Nasopharynx of Young Peruvian Children;Yu-Wen Chien等;Pediatr Infect Dis J;20140101;第32卷(第1期);72–77 *
Herpes Simplex Virus Type 1 in Saliva of Patients With Vestibular Neuronitis;Pollak, Lea MD等;The Neurologist;20111130;第17卷(第6期);330-332 *
Real time polymerase chain reaction for identification of Candida species isolated from blood stream infections in non-neutropenic cancer patients;Rasha A等;African Journal of Microbiology Research;20130927;第 7卷(第39期);4730-4734 *
女性生殖系统感染性疾病主要致病病原体多重qPCR方法建立及应用;梁江楠;中国硕士学位论文全文数据库;20230501;摘要 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN115873849A (zh) 2023-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110408726B (zh) 利用Taqman低密度微流体芯片技术检测29种呼吸道病原体的方法
CN109487013B (zh) 单纯疱疹病毒i型和ii型检测标志物、引物探针对、试剂盒及检测方法
CN115873849B (zh) 同步检测16种女性生殖道病原体的引物探针组合物
CN110846438A (zh) 犬腺病毒ii型、犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬副流感病毒的四重实时荧光定量pcr检测
CN111286559B (zh) 检测非洲猪瘟病毒的引物、探针及试剂盒
CN111705163A (zh) 基于热对流pcr的新型冠状病毒快速检测试剂盒
CN111763752A (zh) 一种基于rpa对泌尿生殖道支原体的快速检测方法
WO2021179469A1 (zh) 检测病原体的组合物、试剂盒及方法
CN111500788B (zh) 用于人类疱疹病毒感染检测的试剂盒及其检测方法
CN114990260B (zh) 用于检测中枢神经系统感染性病原体的多重荧光定量pcr检测试剂
CN111910021A (zh) 一种用于呼吸道病原体核酸检测的微流控芯片及检测方法
Jannes et al. A review of current and future molecular diagnostic tests for use in the microbiology laboratory
CN114990240B (zh) 用于检测妇科疾病外源病原体的多重qPCR检测试剂
CN113444773A (zh) 一种基于液相芯片检测蜱虫病原体核酸的方法及试剂盒
WO2011115465A2 (ko) 멀티플렉스 리퀴드 어레이 시스템을 이용한 여성 생식기 병원체 검출 방법 및 키트
CN109487014B (zh) 单纯疱疹病毒ii型检测标志物、引物探针对、试剂盒及检测方法
Ossewaarde et al. Detection of amplified Chlamydia trachomatis DNA using a microtiter plate-based enzyme immunoassay
KR101678553B1 (ko) 엡스타인-바 바이러스 검출용 키트 및 이를 이용한 엡스타인-바 바이러스의 검출방법
CN113801963B (zh) 一种检测冠状病毒的引物探针组合、试剂盒及方法
CN112553379B (zh) 基于液相芯片检测呼吸道传染病病毒的方法及试剂盒
KR101915211B1 (ko) 멜팅 피크 분석을 이용한 하부요로 생식기 감염균 검출 방법
CN112725513A (zh) 一种定量检测西红花的微滴式数字pcr引物、探针、试剂盒及方法
CN113373263A (zh) 用于检测lsdv的引物和试剂盒
CN112458195B (zh) 基于高通量测序检测性传播病原体的多重pcr引物组、试剂盒及其方法
CN114836579B (zh) 中枢神经系统感染性病原体的多重荧光定量pcr检测引物组合

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant