CN112725513A - 一种定量检测西红花的微滴式数字pcr引物、探针、试剂盒及方法 - Google Patents

一种定量检测西红花的微滴式数字pcr引物、探针、试剂盒及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112725513A
CN112725513A CN202110195786.7A CN202110195786A CN112725513A CN 112725513 A CN112725513 A CN 112725513A CN 202110195786 A CN202110195786 A CN 202110195786A CN 112725513 A CN112725513 A CN 112725513A
Authority
CN
China
Prior art keywords
probe
primer
saffron
digital pcr
xhh
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110195786.7A
Other languages
English (en)
Inventor
张卫东
权永兵
水克娟
廖力
徐淼锋
林伟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gongbei Customs Technology Center
Original Assignee
Gongbei Customs Technology Center
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gongbei Customs Technology Center filed Critical Gongbei Customs Technology Center
Priority to CN202110195786.7A priority Critical patent/CN112725513A/zh
Publication of CN112725513A publication Critical patent/CN112725513A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于分子生物学检测领域，公开了一种定量检测西红花的微滴式数字PCR引物、探针、试剂盒及方法。所述定量检测西红花的微滴式数字PCR引物的核苷酸序列为：XHH‑ITS‑F：5’‑ATAAGCGCGCCCGAGAGATGAT‑3’(SEQ ID No.1)，XHH‑ITS‑R：5’‑CATCCTGGGGTCGCATTCGAT‑3’(SEQ ID No.2)。所述定量检测西红花的微滴式数字PCR探针的核苷酸序列为：XHH‑ITS‑P：5’‑CGCCATCCATGGATTAGCGCATGGA‑3’(SEQ ID No.3)。采用上述引物和探针能够对西红花进行定量检测，并具有良好的特异性和灵敏性。

Description

一种定量检测西红花的微滴式数字PCR引物、探针、试剂盒及 方法
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，特别涉及一种定量检测西红花的微滴式数字PCR引物、探针、试剂盒及方法。
背景技术
西红花为著名的珍贵中药材，为鸢尾科植物番红花CrocussativusL.的干燥柱头，具有活血祛瘀，散郁开结，凉血解毒的功效，主治痛经，经闭，月经不调，产后恶露不净，腹中包块疼痛，跌扑损伤，忧郁痞闷，惊悸，温病发斑和麻疹。
由于西红花中药材价值珍贵，常常被不法分子假借其他原料来冒充，或者在西红花中掺杂其它原料。为满足检验监管工作和相关部门打假执法的需要，希望提供一种可靠的西红花检测方法。
当前所用于西红花的分子生物学检测方法较少，主要为常规PCR或荧光定量PCR，常规PCR检测繁琐不便，而荧光定量PCR所用的标准曲线又会对测量结果产生影响，因此上述方法均不能满足实际的检测需要。
而数字PCR作为核酸定量的新技术，本质上将一个传统的PCR反应分成了数万个PCR反应，在这数万个反应单元中分别独立扩增和检测目的序列，减少了背景序列及抑制物对PCR反应的干扰，从而大大提高了检测的灵敏度。其中ddPCR(微滴式数字PCR)更是无需依赖于Ct值和标准曲线就可以进行精确的定量检测，解决了荧光定量PCR所用的标准曲线对测量结果产生影响等问题。
因此，研发出一种可更好用于检测西红花的试剂盒及方法成为亟需解决的问题。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种定量检测西红花的微滴式数字PCR引物、探针、试剂盒及方法，能够对西红花进行定量检测，并具有良好的特异性和灵敏性。
一种定量检测西红花的微滴式数字PCR引物，所述引物的核苷酸序列为：
XHH-ITS-F：5’-ATAAGCGCGCCCGAGAGATGAT-3’(SEQ ID No.1)，
XHH-ITS-R：5’-CATCCTGGGGTCGCATTCGAT-3’(SEQ ID No.2)。
一种定量检测西红花的微滴式数字PCR探针，所述探针的核苷酸序列为：
XHH-ITS-P：5’-CGCCATCCATGGATTAGCGCATGGA-3’(SEQ ID No.3)。
本发明基于ITS(内转录间隔区)序列进行特异性引物和探针的设计，经所述引物扩增得到的片段长度为92bp。
优选的，所述探针的5’端标记有荧光基团，所述探针的3’端标记有淬灭基团。
所述荧光基团选自FAM、TET、HEX、CY3或JOE，所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL、MGB或Eclipse。
一种定量检测西红花的试剂盒，包括上述检测西红花的微滴式数字PCR引物和检测西红花的微滴式数字PCR探针。
优选的，所述试剂盒还包括检测内参基因的引物和探针，
所述检测内参基因的引物的核苷酸序列为：
ZW-5.8S-F：5’-TCGGCTCTCGCATCGATGAAG-3’(SEQ ID No.4)，
ZW-5.8S-R：5’-GCGCAACTTGCGTTCAAAGAC-3’(SEQ ID No.5)；
所述检测内参基因的探针的核苷酸序列为：
ZW-5.8S-P：5’-ATGGTTCGCGGGATTCTGCAATTC-3’(SEQ ID No.6)。
由于5.8S基因具有较高的保守性，因此本发明将5.8S基因作为内参基因，并设计得到上述检测内参基因的引物和探针。
更优选的，所述检测内参基因的探针的5’端标记有荧光基团，所述检测内参基因的探针的3’端标记有淬灭基团。为实际检测需要，检测特异性基因的探针与检测内参基因的探针在5’端所标记的荧光基团不相同。
一种定量检测西红花的微滴式数字PCR方法，包括以下步骤：
(1)提取样品DNA；
(2)以所述样品DNA为模板，加入上述试剂盒中的引物和探针、ddPCR Super Mix和蒸馏水，得到反应体系；
(3)将步骤(2)配制的反应体系和微滴生成油加入微滴生成卡中，置于微滴发生器中生成微滴；
(4)进行扩增反应，反应结束后进行微滴荧光数据分析。
优选的，步骤(2)的反应体系包括以下组分：2×ddPCR Super Mix 10μL、10μmol/L的上下游引物(XHH-ITS-F和XHH-ITS-R)各1.8μL、10μmol/L探针(XHH-ITS-P)0.5μL、样品DNA 2μL、采用灭菌蒸馏水补足至20μL。
优选的，步骤(2)中上游引物的终浓度为600-1200nmol/L，下游引物的终浓度为600-1200nmol/L，探针的终浓度为150-400nmol/L。
优选的，步骤(4)中扩增反应的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火延伸1min，40个扩增；98℃保持10min使酶失活。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
本研究采用双通道法，即对检测西红花内源基因ZW-5.8S和特异性基因XHH-ITS的探针进行不同的荧光标记，在同一个PCR反应体系中同时测定内源基因和特异性基因的分子数，建立基于微滴式数字PCR技术的定量检测方法，应用于西红花及其产品的快速鉴定和分析，具有高效、准确、快速的特点，为检验监管工作和相关部门打假执法提供的更有力的依据，对提升中药材成分定量检测能力，规范相关企业的生产行为，保障中药材市场安全具有重大的意义。
附图说明
图1为实施例4中特异性检测的结果；
图2为实施例5中检测西红花的线性范围拟合标准曲线，其中A为内参基因ZW-5.8S的拟合标准曲线，B为特异性基因XHH-ITS的拟合标准曲线；
图3为实施例7中90％含量的西红花数字PCR检测结果，其中通道1用于检测XHH-ITS，通道2用于检测ZW-5.8S。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
实验材料：西红花XHH-01购自中国食品药品检定研究院，西红花HH-01采自新疆，西红花HH-02采自河南，菊花花冠JHHG-01购自淘宝，玉米花柱YMHZ-01购自淘宝，白番红花BFHH-01采自新疆，莲花雄蕊LHXR购自淘宝。
主要试剂及仪器：恒温孵育仪(德国Eppendorf公司)；高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；KingFisher mL核酸自动提取仪(美国赛默飞世尔公司)；NanoDrop1000微量紫外分光光度计(美国赛默飞世尔公司)；Bio-Rad QX200TM Droplet Digital PCR系统(包括微滴生成卡、微滴发生器、封膜仪、梯度PCR仪和微滴荧光检测仪)(美国伯乐公司)；移液枪(德国艾本德公司)。CTAB裂解液(20g/L CTAB，1.4mol/L NaCl)；磁珠吸附缓冲液(5g/LCTAB，40mmol/L NaCl)；磁珠悬浮液(洛阳爱森生物科技有限公司)；TE缓冲液(10mmol/LTris-HCl，EDTA二钠1mmol/L，pH为8.0)；75％酒精；2×ddPCR supermix for probes、微滴生成油(droplet generation oil for probes)、微滴分析油(ddPCR droplet readeroil)(美国伯乐公司)。
实施例1
本实施例提供一种定量检测西红花的微滴式数字PCR引物、探针，发明人基于ITS(内转录间隔区)序列，通过分析西红花区别于其他相近植物种类的特异性保守区域，使用分子生物学软件进行特异性引物和探针的设计。
其中设计得到的引物核苷酸序列为：
XHH-ITS-F：5’-ATAAGCGCGCCCGAGAGATGAT-3’(SEQ ID No.1)，
XHH-ITS-R：5’-CATCCTGGGGTCGCATTCGAT-3’(SEQ ID No.2)；
其中设计得到的探针核苷酸序列为：
XHH-ITS-P：5’-CGCCATCCATGGATTAGCGCATGGA-3’(SEQ ID No.3)。
该探针的5’端标记有荧光基团FAM，探针的3’端标记有淬灭基团BHQ1。
使用上述引物扩增得到的片段长度为92bp。
实施例2
本实施例提供一种定量检测西红花的试剂盒，包括实施例1中的引物和引物，还包括检测内参基因的引物和探针，检测内参基因的引物核苷酸序列为：
ZW-5.8S-F：5’-TCGGCTCTCGCATCGATGAAG-3’(SEQ ID No.4)，
ZW-5.8S-R：5’-GCGCAACTTGCGTTCAAAGAC-3’(SEQ ID No.5)；
检测内参基因的探针核苷酸序列为：
ZW-5.8S-P：5’-ATGGTTCGCGGGATTCTGCAATTC-3’(SEQ ID No.6)。
使用上述引物扩增得到的片段长度为96bp。
该检测内参基因的探针的5’端标记有荧光基团HEX，3’端标记有淬灭基团BHQ1。由于5.8S基因具有较高的保守性，因此本发明将5.8S基因作为内参基因，并设计得到上述检测内参基因的引物和探针。
实施例3
本实施例提供一种定量检测西红花的微滴式数字PCR方法，包括以下步骤：
(1)提取样品DNA；
(2)以样品DNA为模板，加入实施例2中试剂盒的引物和探针、ddPCR Super Mix和蒸馏水，得到反应体系；
(3)将步骤(2)配制的反应体系和微滴生成油加入微滴生成卡中，置于微滴发生器中生成微滴；
(4)进行扩增反应，反应结束后进行微滴荧光数据分析，计算得出样本的核酸浓度。
其中样品DNA提取方法不作限制，可选用CTAB法、玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法、异硫氰酸胍法或碱裂解法。
其中步骤(2)的反应体系包括以下组分：2×ddPCR Super Mix 10μL、每种上下游引物各1.8μL，浓度为10μmol(在反应体系中的终浓度为900nmol/L)、每种探针0.5μL，浓度为10μmol/L(在反应体系中的终浓度为250nmol/L)、样品DNA 2μL、采用灭菌蒸馏水补足至20μL。
步骤(3)的具体操作为：将上述20μL反应体系和70μL矿物油一同加入到微滴发生卡的相应孔中，在微滴发生器上自动生成微滴，然后将产生的40μL油包水微滴小心地转移到96孔反应板中，再将96孔反应板在封膜仪上封膜，最后在梯度PCR仪上进行扩增反应。
步骤(4)中扩增反应的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火延伸1min，40个扩增；98℃保持10min使酶失活。扩增完成后通过微滴式数字PCR荧光分析系统中进行荧光分析，在连接仪器的软件中进行设置：选择绝对定量方法，将特异性基因通道设置为FAM荧光通道，内参基因通道设置为HEX荧光通道，进行荧光数据分析。
实施例4
特异性检测
选取经实时荧光PCR方法特异性验证过的样品，按实施例3中的检测方法进行ddPCR(微滴式数字PCR)特异性扩增，从而验证该检测方法的特异性。
检测结果如图1所示，实施例1中的特异性引物和探针可对西红花样品XHH-01(对应B11)进行有效的扩增，而被测样品HH-01、HH-02、JHHG-01、YMHZ-01、BFHH-01、LHXR(以上样品分别对应F10、G10、F11、G11、A12、B12)等对照组和空白对照组CK(对应C12)均未有信号扩增，表明该方法能够特异性的扩增西红花。
实施例5
灵敏性检测
为了确定数字PCR检测体系的灵敏度，将5ng/μL阳性样品DNA，分别稀释至1ng/μL、200pg/μL、40pg/μL、8pg/μL和1.6pg/μL等5个浓度梯度，采用实施例3的方法进行灵敏度检测(由于样品DNA占反应体系体积的十分之一，因而反应体系中模板量浓度为样品DNA的十分之一)，每个浓度梯度做3次重复试验。统计每个反应的拷贝数，测试该方法体系的灵敏度。灵敏度检测结果如表1所示，线性范围内的数据拟合标准曲线如图2所示。
表1检测西红花的微滴式数字PCR方法的线性范围
Figure BDA0002946398820000061
Figure BDA0002946398820000071
通过表1中实际拷贝数的检测结果，绘制得到图2的数据拟合标准曲线。由图2中A可以看出，在内参基因ZW-5.8S的拷贝数位于0.63-946.93个/μL的区间内可以呈现出良好的线性，R2为0.9999，所有浓度组的RSD值(相对标准偏差)位于4.06％到24.12％之间，均小于25％；由图2中B可以看出，XHH-ITS基因的拷贝数位于2.10-950.80个/μL的区间内可以呈现出良好的线性，R2为0.9999，所有浓度组的RSD值位于2.30％到19.05％之间，均小于25％。结果表明本方法在模板量浓度为0.8-500pg/μL时具有良好的定量检测能力。
实施例6
定量检测限
取在线性范围验证中可以稳定扩增的最低DNA浓度组进行定量检测限(Limit OfQuantitation，LOQ)的验证，本方法研究中的定量检测限是指在方法线性范围内可以进行稳定定量检测最低拷贝数。因此取线性范围验证结果的最低模板量(即0.8pg/μL)进行LOQ值验证。将模板量为0.8pg/μL的样品DNA进行8个平行的微滴式数字PCR扩增，计算每个平行的内参基因和特异性基因的拷贝数，计算平均值和RSD值，试验结果见表2。
表2检测西红花的微滴式数字PCR方法的LOQ验证结果
Figure BDA0002946398820000072
由表2可以得出，内参基因ZW-5.8S的8个平行扩增的拷贝数平均值为2.18个/μL，RSD为18.06％，低于所限定的25％，符合方法要求，说明本方法对单位体系内的内参基因可进行稳定的定量检测的最低拷贝数为43.6个(由于反应体系为20μL，因此最低拷贝数为20×2.18＝43.6个)。XHH-ITS基因的8个平行扩增拷贝数平均值为2.13个/μL，RSD为20.40％，低于所限定的25％，符合方法要求，说明本方法对单位体系内的XHH-ITS基因可进行稳定定量检测的最低拷贝数为42.6个(由于反应体系为20μL，因此最低拷贝数为20×2.13＝42.6个)。
实施例7
准确度验证
将西红花和白番红花完全干燥后混合，分别得到西红花含量为90％、50％、10％和1％的样品，并分别进行核酸提取，将核酸样品稀释到1ng/μL，进行微滴式数字PCR准确度验证，每组8个重复，计算特异性基因和内参基因拷贝数及其百分比，求百分比的平均值，得出实际检测含量，计算RSD，验证方法的准确度。西红花数字PCR定量检测方法的准确度验证结果见表3所示。
表3检测西红花的微滴式数字PCR方法的准确度验证
Figure BDA0002946398820000081
通过表3可知，西红花理论含量值为90％、50％、10％和1％时所测得的含量分别为88.45％、47.95％、9.01％和0.92％，对应检测的RSD值分别为4.27％、2.26％、9.61％和14.55％，三组检测结果的相对标准偏差均小于25％，符合试验方法的要求，而图3表示90％含量的西红花数字PCR准确度检测结果。由上可知，本方法可针对西红花样品进行准确的绝对定量检测。
SEQUENCE LISTING
<110> 拱北海关技术中心
<120> 一种定量检测西红花的微滴式数字PCR引物、探针、试剂盒及方法
<130> 1
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ataagcgcgc ccgagagatg at 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
catcctgggg tcgcattcga t 21
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgccatccat ggattagcgc atgga 25
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tcggctctcg catcgatgaa g 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcgcaacttg cgttcaaaga c 21
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atggttcgcg ggattctgca attc 24

Claims (9)

1.一种定量检测西红花的微滴式数字PCR引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为：
XHH-ITS-F：5’-ATAAGCGCGCCCGAGAGATGAT-3’(SEQ ID No.1)，
XHH-ITS-R：5’-CATCCTGGGGTCGCATTCGAT-3’(SEQ ID No.2)。
2.一种定量检测西红花的微滴式数字PCR探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列为：XHH-ITS-P：5’-CGCCATCCATGGATTAGCGCATGGA-3’(SEQ ID No.3)。
3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述探针的5’端标记有荧光基团，所述探针的3’端标记有淬灭基团。
4.一种定量检测西红花的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物、权利要求2或3所述的探针。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测内参基因的引物和探针，所述检测内参基因的引物的核苷酸序列为：
ZW-5.8S-F：5’-TCGGCTCTCGCATCGATGAAG-3’(SEQ ID No.4)，
ZW-5.8S-R：5’-GCGCAACTTGCGTTCAAAGAC-3’(SEQ ID No.5)；
所述检测内参基因的探针的核苷酸序列为：
ZW-5.8S-P：5’-ATGGTTCGCGGGATTCTGCAATTC-3’(SEQ ID No.6)。
6.一种定量检测西红花的微滴式数字PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取样品DNA；
(2)以所述样品DNA为模板，加入权利要求4或5中所述试剂盒中的引物和探针、ddPCRSuper Mix和蒸馏水，配置得到反应体系；
(3)将步骤(2)配制的反应体系和微滴生成油加入微滴生成卡中，置于微滴发生器中生成微滴；
(4)进行扩增反应，反应结束后进行微滴荧光数据分析。
7.根据权利要求6所述的微滴式数字PCR方法，其特征在于，步骤(2)的反应体系包括以下组分：2×ddPCR Super Mix 10μL、10μmol/L的上下游引物(XHH-ITS-F和XHH-ITS-R)各1.8μL、10μmol/L探针(XHH-ITS-P)0.5μL、样品DNA 2μL、采用灭菌蒸馏水补足至20μL。
8.根据权利要求6所述的微滴式数字PCR方法，其特征在于，步骤(2)中上游引物的终浓度为600-1200nmol/L，下游引物的终浓度为600-1200nmol/L，探针的终浓度为150-400nmol/L。
9.根据权利要求6所述的微滴式数字PCR方法，其特征在于，步骤(4)中扩增反应的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火延伸1min，40个扩增；98℃保持10min使酶失活。
CN202110195786.7A 2021-02-22 2021-02-22 一种定量检测西红花的微滴式数字pcr引物、探针、试剂盒及方法 Pending CN112725513A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110195786.7A CN112725513A (zh) 2021-02-22 2021-02-22 一种定量检测西红花的微滴式数字pcr引物、探针、试剂盒及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110195786.7A CN112725513A (zh) 2021-02-22 2021-02-22 一种定量检测西红花的微滴式数字pcr引物、探针、试剂盒及方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112725513A true CN112725513A (zh) 2021-04-30

Family

ID=75596873

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110195786.7A Pending CN112725513A (zh) 2021-02-22 2021-02-22 一种定量检测西红花的微滴式数字pcr引物、探针、试剂盒及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112725513A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113832238A (zh) * 2021-10-13 2021-12-24 中国科学院水生生物研究所 拉萨裸裂尻鱼环境dna检测的引物和探针及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104630327A (zh) * 2013-11-08 2015-05-20 中国中医科学院中药研究所 西红花特异性鉴别引物及pcr方法
CN107142333A (zh) * 2017-07-20 2017-09-08 山东省农业科学院生物技术研究中心 一种用于鉴别西红花的荧光pcr检测引物组、试剂盒及检测方法和应用
CN107586865A (zh) * 2017-05-06 2018-01-16 宝童（固安）生物医药有限公司 一种用于快速检测中药材西红花的lamp引物及包含该引物的检测试剂盒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104630327A (zh) * 2013-11-08 2015-05-20 中国中医科学院中药研究所 西红花特异性鉴别引物及pcr方法
CN107586865A (zh) * 2017-05-06 2018-01-16 宝童（固安）生物医药有限公司 一种用于快速检测中药材西红花的lamp引物及包含该引物的检测试剂盒
CN107142333A (zh) * 2017-07-20 2017-09-08 山东省农业科学院生物技术研究中心 一种用于鉴别西红花的荧光pcr检测引物组、试剂盒及检测方法和应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YU等: "A Novel Analytical Droplet Digital PCR Method for Identification and Quantification of Raw Health Food Material Powder from Panax notoginseng", 《FOOD ANALYTICAL METHODS》, 24 October 2020 (2020-10-24), pages 554 *
张全芳等: "一种鉴定西红花和红花源性成分的实时荧光PCR方法", 《中国中药杂志》, no. 23, 26 October 2018 (2018-10-26), pages 29 - 35 *
李春平等: "番红花与红花及其掺伪品的鉴别", 《海峡药学》, no. 03, pages 117 - 118 *
龙浩等: "《现代肺癌诊断与治疗》", 31 July 2020, pages: 76 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113832238A (zh) * 2021-10-13 2021-12-24 中国科学院水生生物研究所 拉萨裸裂尻鱼环境dna检测的引物和探针及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109576352B (zh) 单管检测多个待测目标核酸序列的方法、探针及其试剂盒
CN111270013A (zh) 一种检测2019新型冠状病毒的多重实时荧光定量pcr试剂盒、方法及引物探针组合物
CN111074007A (zh) 一种检测sars-cov-2病毒的恒温扩增试剂盒及引物探针组
CN111733295B (zh) 用于检测新型冠状病毒的引物组及试剂盒
CN106399517B (zh) 一种多交叉恒温扩增结合金纳米生物传感的核酸检测技术
CN113201594A (zh) 一种食源性唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的快速检测方法
CN112725475A (zh) 一种结核分枝杆菌检测引物和探针组合物、试剂盒及应用
CN112322766A (zh) 一种基于微滴式数字pcr技术的三七粉精准定量方法
CN113025734A (zh) 鉴别布鲁氏菌疫苗株a19与野毒株的引物、探针及应用
CN113755558A (zh) 一种基于液态芯片技术的核酸检测方法
CN112813195B (zh) 基于微液滴数字分析的新型冠状病毒核酸定量检测试剂盒
CN112725514A (zh) 一种定量检测冬虫夏草的微滴式数字pcr引物、探针、试剂盒及方法
CN112725513A (zh) 一种定量检测西红花的微滴式数字pcr引物、探针、试剂盒及方法
KR102334343B1 (ko) 결핵균 및 비결핵항산균을 동시에 감별하여 검출할 수 있는 고감도 다중 등온증폭반응용 프라이머 세트
CN112725511A (zh) 一种定量检测铁皮石斛的微滴式数字pcr引物、探针、试剂盒及方法
CN102031314A (zh) 一种用于检测人偏肺病毒核酸的引物和探针序列
CN113046463A (zh) 念珠菌的引物探针组合及应用、pcr反应液、试剂盒和方法
CN112899385A (zh) 鉴别布鲁氏菌s2疫苗株与野毒株的引物组、探针及其应用
CN111575403A (zh) 一种检测rna病毒核酸的高通量数字pcr试剂盒及检测方法
CN106755392B (zh) 藻类培养中腔轮虫的快速定量检测qPCR方法
EP3252167A1 (en) Visually determinable genetic testing
Jyothy et al. REAL-TIME PCR OR QUANTITATIVE PCR (QPCR)–A REVOLUTION IN MODERN SCIENCE
CN112725512A (zh) 一种定量检测人参的微滴式数字pcr引物、探针、试剂盒及方法
CN113444839B (zh) 制备检测ep病原和er病原试剂的试剂盒及其应用
CN112410445B (zh) 一种TaqMan探针荧光定量PCR检测巴通体的方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20210430