CN102031314A

CN102031314A - 一种用于检测人偏肺病毒核酸的引物和探针序列

Info

Publication number: CN102031314A
Application number: CN2010102623193A
Authority: CN
Inventors: 崔丽瑾; 谭文杰; 陆柔剑; 张陵林; 周为民; 阮力
Original assignee: National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2010-08-25
Filing date: 2010-08-25
Publication date: 2011-04-27

Abstract

一种检测用于人偏肺病毒核酸的引物和探针序列技术领域：1.生物技术2.病毒检测技术。本发明提供一种用于人偏肺病毒核酸real-time RT-PCR检测的引物和MGB探针序列，该序列是通过对已知的hMPV的N基因和L基因进行序列测定与分析而设计合成的、以L基因为靶的引物与探针序列，该序列经real-time RT-PCR方法检测200份临床样本进行研究验证，其简并碱基涵盖了hMPV 4种基因亚型的变异规律，可用于hMPV感染的核酸检测技术的研究与开发。

Description

一种用于检测人偏肺病毒核酸的引物和探针序列

技术领域

本发明涉及人偏肺病毒核酸real-time RT-PCR检测的引物和探针序列。

背景技术

人偏肺病毒(hMPV)为单股负链RNA病毒，属副粘病毒科肺病毒亚科，是荷兰学者Vanden Hoogen等人于2001年发现的一种新的人类呼吸道病毒，基于基因组测序和系统进化分析，hMPV有A、B两个基因型，引起的临床症状和体征主要包括流涕，咳嗽，咽痛，发热，支气管炎，肺炎，结膜炎，中耳炎等，婴幼儿、老人和免疫缺陷者为易感人群。hMPV发现后，在欧洲、澳大利亚、美洲、亚洲等国相继有报道hMPV感染的情况，提示该病毒是世界范围普遍存在的人类致病原。同时，荷兰1958年的血清标本检测表明，hMPV至少在人群中传播至少有50年的历史。hMPV作为一种“新出现的传染病病原体”，从目前关于临床表现较少且不完整的资料来看，hMPV是人类急性呼吸道感染重要的致病原，也是社区获得性急性呼吸道感染的致病原，其在婴幼儿下呼吸道感染中占5.5％-43.0％，特别是1岁以下儿童常发生急性重症下呼吸道感染，成为仅次于RSV的导致儿童住院的重要病原，已经引起世界各国微生物学家和临床工作者的重视，其流行病学特点，进化，传播，临床表现及致病机理等成为呼吸道病毒中的研究焦点之一。

由于hMPV在培养呼吸道病毒的大部分细胞中不增殖，其敏感细胞较少，且复制缓慢，不出现典型的CPE，所以要求hMPV的分子生物学检测技术不断完善和提高。Van den Hoogen最先利用了RT-PCR技术对hMPV进行检测，该技术快速、灵敏并能在感染早期对病毒进行检测，且不依赖于病毒和细胞的状态，已以成为研究和诊断hMPV感染的主要手段，但由于具有定量不准确，假阳性高，重复性差，劳动强度大等不足，使其应用受到限制。1996年，美国Applied Biosystem公司推出实时荧光定量PCR技术，实现了PCR从定性到定量的飞越。所谓实时荧光定量PCR就是在反应体系中引入荧光集团，对每一个循环扩增产物的累积情况进行实时监测，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。其特点为全封闭(污染少)，高精确，高灵敏，重复性好，结果可定量，有宽泛的动力学范围(10-10¹⁰拷贝)【39】，因而越来越成为呼吸道病毒检测的主流方法。

然而，无论是普通RT-PCR，还是荧光定量PCR，都面临针对不同基因扩增的检出率差异的问题。目前针对hMPV研究中N、L、M和F基因都被作为扩增靶基因，但由于hMPV有2个基因型，，如果引物设计不合理，可能导致hMPV的检出率不准确。有研究认为，建立在L基因的保守序列的RT-PCR，比细胞分离鉴定敏感10-100倍，也可以区分hMPV的不同基因型。另外，也有人认为，建立在N基因上的RT-PCR可能更敏感。所以Cotes等认为建立在N基因和L基因上的RT-PCR最适合hMPV的检测，Maertzdorf等则证明建立在N基因上的引物由于错配可能对于B型的病毒的敏感度较低。

发明内容

综上所述，目前还没有一种既快速，又能全面准确地检测hMPV的方法。因此，本发明的目的是：寻找可以在临床样本中全面准确地获得hMPV阳性结果的real-timeRT-PCR检测方法。

本发明可以通过以下方法和原则实现：①以目前已经公开发表的针对hMPV保守基因N基因和L基因的real-time RT-PCR检测的引物探针为基础；②分别以经选择和优化的针对N基因和L基因的引物和探针，对临床样本同时进行检测，将检测结果进行对比；③将两种方法检测不相符的阳性样本，针对荧光定量PCR扩增区域进行覆盖扩增，获得测序后进行序列比对；④应用生物信息学手段将代表性差异结果的荧光定量PCR扩增区序列与GenBank数据库中hMPV的A1、A2、B1、B2各型的相应区域进行比对，寻找差异结果与各型毒株在相应序列的差别特征，寻找其中核苷酸的变异规律；⑤最终通过核苷酸简并，确定能够检出A、B两种基因型的引物和探针序列。

具体实施方式

1.引物探针的选择与优化：

针对N基因的引物探针序列选择了与应用最多的由荷兰学者Van den Hoogen首次报道的001株(其GenBank登录号为af371337)同源的序列，其中探针使用MGB探针技术，缩短了寡核苷酸数量，增加了探针特异型并提高了Tm值，适合于hMPV基因组T/A丰富、G/C含量较低的特征(图1)。其组合如下：

上游引物：CATCAGGTAATATCCCACAAAATCAG

下游引物：GTGAATATTAAGGCACCTACACATAATAA

MGB探针：TCAGCACCAGACACAC

针对L基因的引物探针序列选择了与在北京发现的BJ1887株(其GenBank登录号为DQ843659)同源的序列，原探针为普通TaqMan探针，在建立方法的时候发现该探针没有扩增信号，因此重新设计了与原引物对相匹配的MGB探针，其组合如下：

上游引物：TGCTCATGCCCACTATAAAGGGT

下游引物：TCTGTTAATATCCCACACCAATGAC

MGB探针：TATCAGCAGCATTAGCA

2.两种real-time RT-PCR检测方法的建立与优化

2.1将人工合成的hMPV N基因克隆至pET-9a载体构建标准质粒，经体外转录，将获得的N基因相应的RNA片段按照10⁸-10¹个/3μL拷贝进行系列稀释作为模板，应用the

RNA-to-C_T ^TM 1-Step Kit(Applied Biosystems，USA)，加入相应的引物探针建立20μL反应体系，各组份及相应浓度见表1。

表1 real-time RT-PCR反应体系各组份及相应浓度

2.2将来自hMPV检测阳性样本扩增得到的L基因片段克隆至pGEM-T Easy载体构建标准质粒，经体外转录，将获得的L基因相应的RNA片段按照108-101个/3μL拷贝进行系列稀释作为模板，应用the

RNA-to-CT^TM 1-Step Kit(Applied Biosystems，USA)，加入相应的引物探针建立20μL反应体系，各组份及相应浓度同表1。

2.3两种real-time RT-PCR反应的扩增条件：根据表1加样，使用ABI Prism 7000TaqManmachine(Applied Biosystems，USA)，按照MGB探针要求设置荧光收集条件和扩增条件，反应程序如下：

48℃15min进行RNA反转录，95℃10min灭活反转录酶；

94℃15sec变性，60℃1min退火和延伸，如此重复45个循环，实时检测荧光信号。

2.4两种real-time RT-PCR检测方法标准曲线的建立及敏感性和稳定性试验：

经反复测试，针对两种基因的检测方法在10⁴个拷贝/反应的批内和批间变异系数均小于2％，标准曲线相关系数可以达到R²＝99.4(N基因)和R²＝99.5(L基因)，针对N基因的real-timeRT-PCR方法敏感性可以达到10个拷贝/20μL，针对L基因的可以达到100个拷贝/20μL(图2)，表明本发明使用的针对hMPV N基因和L基因的real-time RT-PCR方法具有很好的稳定性和敏感性，可以检测到样本中微量存在的hMPV感染。

2.5两种real-time RT-PCR检测方法的特异性实验：

在20μL反应体系中，以非hMPV的呼吸道病毒基因，及将N基因和L基因进行互换作为模板，分别应用两种引物和探针进行扩增，结果没有得到扩增曲线，证实本发明使用的两种real-time RT-PCR方法具有很好的特异性(图3)。

3.应用两种real-time RT-PCR方法对住院儿童鼻咽抽吸物样本进行检测：

以200份样本实施对比检测，取各待测样本200μL提取RNA，按表1加样，同时应用两种real-time RT-PCR方法进行检测，分别获得阳性结果(图4)。

4.将检测结果对比分析，对两种方法检测差异的阳性样本，将其L基因引物探针(与BJ1887株同源)区域进行覆盖扩增，将测序结果应用DNAStar软件进行比对，发现在N基因方法检测阳性和L基因检测阳性的结果差异样本中，引物和探针序列的核苷酸变异呈规律性，并与型别有关(图5)。

5.选取GenBank中hMPV A1、A2、B1、B2所有4个基因型的参考序列(见图7)，与差异阳性样本的相应序列进行比对，进一步发现针对L基因的real-time RT-PCR方法中引物和探针在不同基因型hMPV毒株序列中核苷酸呈现规律性变异，并且在4个型别中的主要变异情况已经被涵盖(图6)，提示可以通过碱基简并，设计出可以同时扩增hMPV 4个基因型的引物和探针。

本发明的优点在于：

1.本发明提供的引物和探针序列是以稳定、敏感、特异的real-time RT-PCR方法为基础，经过了批量的样本检测比较，和针对性PCR扩增和序列对比分析得来的，其结果真实可靠。

2.本发明提供的引物和探针序列涵盖了hMPV 2个基因型及其4个基因亚型的主要变异规律，能够作为hMPV临床快速检测确诊的诊断试剂进行后续研究。

3.由于本发明采用荧光定量PCR技术作为检测方法，整个反应均在封闭的反应管内进行，避免了其他核酸检测方法，如PCR-电泳等易于形成气溶胶污染而造成假阳性结果，由于可以对PCR产物进行实时监测，所以可以大大节省了检测时间，节约人力物力。

4.本发明采用MGB探针技术，适用于G/C含量较低的hMPV基因组特征，缩短了探针长度，提高了探针本身的Tm值和特异性，使检测结果更为真实可靠。

附图说明

图1.MGB探针原理图。

图2.图中A图为针对N基因的real-time RT-PCR方法的标准曲线，其相关系数可以达到R²＝99.4，检测下限可达到10个拷贝/20μL；B图为针对L基因的real-time RT-PCR方法的标准曲线，其相关系数可以达到R²＝99.5，检测下线可以达到100个拷贝/20μL，说明两种方法皆成功建立，并具有良好的稳定性和敏感性。

图3.两种real-time RT-PCR检测方法的特异性实验，非特异性模板不能获得扩增曲线。

图4.两种real-time RT-PCR方法同时检测，分别获得阳性样本

图5.两种方法检测各获得32份阳性样本，其中26份为两种方法均为阳性，各有6份为单一方法获得的阳性样本。将差异阳性样本针对L基因的引物探针区域进行覆盖扩增，获得的PCR产物测序后进行序列比较，发现引物探针序列的核苷酸变异呈现规律性。上游引物的变异为：第5位为C/T交替，第11位为C/T交替，第20位为G/A交替；下游引物反映在反向互补序列的变异为：第2位为C/T交替，第5位为C/T交替，第14位为G/A交替；探针的变异为：第5位为A/T交替，第12位为C/T交替，第14位为A/T交替。

图6.选取GenBank中hMPV首次分离的001株、NCBI参考序列、中国分离株BJ1887、BJ1816等包括A1、A2、B1、B2共4个基因型的毒株，将其相应序列与差异阳性样本的序列共同比较，发现引物探针部位的变异与差异样本具有相同的规律性，临床样本中出现的变异规律涵盖了全部4个基因型的变异规律，即：上游引物第5位为C/T交替，第11位为C/T交替，第20位为G/A交替；下游引物反映在反向互补序列的变异为：第2位为C/T交替，第5位为C/T交替，第14位为G/A交替；探针的变异为：第5位为A/T交替，第12位为C/T交替，第14位为A/T交替。

图7.与针对L基因real-time RT-PCR检测引物和探针进行序列比对的参考序列来源

本发明提供针对hMPV L基因的real-time RT-PCR检测的引物探针序列，该序列经临床样本检测验证，其简并碱基涵盖hMPV 4个基因亚型的变异规律，可用于hMPV更为准确全面的检测技术的研究与开发。

Claims

1.一种用于人偏肺病毒(A型)核酸real-time RT-PCR检测的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括：由上游引物MLF-1序列为T GCTCATGCCCACTATAAAGGGT和下游引物MLR-1序列为TCT GTTAATATCCCACACCAATGAC组成的引物对，以及上游引物的互补序列ACGAGTACGGGTGATATTTCCCA和下游引物的互补序列AGACAATTATAGGGTGTGGTTACTG。

2.根据权利要求1所述的用于人偏肺病毒(A型)核酸real-time RT-PCR检测的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物MLF-1位置向5’端方向延伸10个碱基，向3’端方向延伸10个碱基，下游引物MLR-1位置想3’端方向延伸10个碱基，向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的引物序列。

3.一种用于人偏肺病毒核酸real-time RT-PCR检测的MGB探针序列，其特征在于所述的探针MLP-1序列为TATCAGCAGCATTAGCA，以及其互补序列为ATAGTCGTCGTAATCGT。

4.根据权利要求3所述的用于人偏肺病毒核酸real-time RT-PCR检测的探针序列，其特征在于所述的探针序列包括由探针MLP-1向3’端方向延伸10个碱基和想5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的探针序列及互补序列。

5.一种用于人偏肺病毒(B型)核酸real-time RT-PCR检测的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括：由上游引物MLF-2序列为T GCTTATGCCTACTATAAAAGGT和下游引物MLR-2序列为TCT GTTAATATTCCACACCAGTGGC组成的引物对，以及上游引物的互补序列ACGAATACGGATGATATTTTCCA和下游引物的互补序列AGACAATTATAAGGTGTGGTCACCG。

6.根据权利要求5所述的用于人偏肺病毒(B型)核酸real-time RT-PCR检测的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物MLF-2位置向5’端方向延伸10个碱基，向3’端方向延伸10个碱基，下游引物MLR-2位置想3’端方向延伸10个碱基，向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的引物序列。

7.一种用于人偏肺病毒(B型)核酸real-time RT-PCR检测的MGB探针序列，其特征在于所述的探针MLP-2序列为TATCTGCAGCACTTGCA，以及其互补序列为ATAGACGTCGTGAACGT。

8.根据权利要求7所述的用于人偏肺病毒(B)核酸real-time RT-PCR检测的探针序列，其特征在于所述的探针序列包括由探针MLP-2向3’端方向延伸10个碱基和想5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的探针序列及互补序列。

9.一种用于人偏肺病毒(A、B两个基因型4个亚型)核酸real-time RT-PCR检测的简并引物序列，其特征在于所述的简并引物序列：上游引物MLF-J序列为TGCTYATGCCYACTATAAARGGT(Y＝T/C；R＝A/G)和下游引物MLR-J序列TCTGTTAATATYCCACACCARTGRC(Y＝T/C；R＝A/G)以及上游引物的互补序列ACGARTACGGRTGATATTTYCCA(R＝A/G；Y＝T/C)和下游引物的互补序列AGACAATTATARGGTGTGGTYACYG(R＝A/G；Y＝T/C)。

10.根据权利要求9所述的用于人偏肺病毒(A、B两个基因型4个亚型)核酸real-timeRT-PCR检测的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物MLF-J位置向5’端方向延伸10个碱基，向3’端方向延伸10个碱基，下游引物MLR-J位置想3’端方向延伸10个碱基，向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的引物序列。

11.一种用于人偏肺病毒(A、B两个基因型4个亚型)核酸real-time RT-PCR检测的MGB探针序列，其特征在于所述的探针MLP-J序列为TATCWGCAGCAYTWGCA(Y＝T/C；W＝A/T)，以及其互补序列为ATAGWCGTCGTRAWCGT(W＝A/T；R＝A/G)。

12.根据权利要求12所述的用于人偏肺病毒核酸real-time RT-PCR检测的探针序列，其特征在于所述的探针序列包括由探针MLP-J向3’端方向延伸10个碱基和想5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的探针序列及互补序列。