CN102115794A - 含内参的hcmv荧光定量pcr检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及含内参的HCMV荧光定量PCR检测试剂盒。本发明针对人巨细胞病毒(HCMV)基因组的UL122基因设计了检测引物和探针，通过设计内参探针和内参阳模，引入竞争性内参扩增体系，与HCMV DNA检测体系存在于同一反应管中，通过引入内参扩增体系，能有效降低因试剂盒实效或实验操作失误等原因导致的假阴性的发生。本发明技术能快速、简便的对HCMV DNA进行定性和定量检测，具有较高的特异性和灵敏性。

Description

含内参的HCMV荧光定量PCR检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种含内参的HCMV荧光定量PCR检测试剂盒，对内参DNA和HCMV DNA同时进行检测，能有效防止在对人巨细胞病毒进行实时荧光PCR检测的过程中出现假阴性，属于分子生物学领域。

背景技术

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)也称人疱疹病毒5型(Humanherpesvirus 5)，属a疱疹病毒亚科，HCMV是人类先人性病毒感染的最常见病原之一，可致感染患儿中枢神经系统受累、多器官损害、智力降低、耳聋等；在正常健康人中可引起单核细胞增多症；在免疫缺陷者一如器官移植受者一、获得性免疫缺陷综合征患者一及癌症患者一中可引起严重的感染，甚至致死。它和弓形体、风疹病毒、单纯疱疹病毒、梅毒螺旋体合称为人类五大生物致畸因子。鉴于HCMV在临床疾病中的重要作用，已经引起医学界的广泛重视。

在疱疹病毒科中，HCMV基因组最大，约235～240kb，分子为150～160×103KDa。HCMV基因的转录及翻译受其自身及宿主细胞的调控，并具有时相性，分为IE(即刻早期)，E(早期)和L(晚期)。

HCMV病原学检测

(一)血清学诊断方法

HCMV感染的血清学诊断方法通常有补体结合试验(CF)，酶免疫试验(EIA)等，CF法敏感性低，而EIA则在高效价血清标本检测时分辩率低下。

1.CF法：

用于CF法的抗原大多数从感染CMV实验株如AD169的成纤维细胞中提取，抗原提取方法往往会影响检测效果，几年前的重要改进是用甘氨酸提取CMV的CF抗原，增加了实验的敏感性.尽管如此，CF法敏感性很低，因而目前不再应用。

2.EIA法：

(1)EIA法检测CMV抗体：

有好几种CMV抗体检测ELISA试剂盒供应，一般几小时可出结果，许多比较性研究证实ELISA抗体效价高，操作容易，无需虑及血清的抗补体作用，但在ELISA检测中，某些血清与正常细胞抗原有非特异性反应而产生假阳性，若提高起始稀释度以排除假阳性又会降低实验的敏感性，故需做重复试验并设定正常细胞抗原对照.CMV特异性的IgM-ELISA试剂盒已有供应，但如同所有的IgM检测一样，可能受类风湿因子等干扰，因而血清标本需预处理.CMV的血清检测也包括中和病毒感染的抗体测定，血清的中和抗效价常不变，很少超过1∶2000，试验需要活性良好的补体，有一定技术难度。

(2)EIA法检测CMV抗原：

用单克隆抗体进行EIA，检测CMV抗原是近几年研究的重点，现已可测定CMV的中和抗原(至少3种蛋白质)，及各种结构蛋白，调节蛋白.单克隆抗体能在感染后的几个小时内检测到成纤维细胞核内的CMV抗株，离心可帮助CMV吸附于单层细胞，效果可提高4倍，尿与气管肺泡洗液的培养结果尤佳.但由于血液白细胞层常有细胞毒性，经离心会使单层细胞受损，反而降低了检测阳性率。

3.乳胶凝集法：

乳胶凝集法测定CMV抗体是筛选血、器官供体的重要方法，几分钟内可出结果，误差5％(包括假阴性)，判定结果的主观性是误差的明显因素。

4.免疫吸印法：

将高分辨率的凝胶电泳和高灵敏度的免疫固相检出法相结合，凝胶电泳使混合在一起的病毒成分和细胞成份分开，再通过敏感的生物分子亲和技术检测，克服了CF试验敏感性差，EIA分辨率低的缺陷.同时，整个反应只需16h左右即可作出明确的诊断，快速且简便.HCMV主要结构蛋白150和38KDa出现于大部分病人血清中，并与HCMV-IgG、HCMV-IgM均起反应，极具代表性，可作为感染HCMV感染的指标。

(二)核酸杂交：

目前HCMV感染的诊断技术已从生物学病毒分离防和免疫学检测抗原抗体，进入到对基因组进行诊断的分子生物学水平阶段，通过标记的核酸探针用分子杂交方法检测标本微量的病毒DNA，具有特异性强，灵敏度高的优点，同时此法，不仅能诊断HCMV的活动性感染，而且还能确证潜伏感染.用高比活性放射性同位素检测HCMV，DNA克隆片段及放射自显影检测方法.灵敏度可达0.5pg，特异性可达100％.如用光敏生物素标记探针检测HCMV DNA，灵敏度达10～50pg，由随机引物延伸法和缺口平移法标记的生物素探针灵敏度分别为10～50pg和10pg。

(三)病毒的分离(细胞培养)：

基本原理：细胞培养是以组织活细胞为母体，使活病毒得到扩增，引起宿主细胞病变(CPE).通过CPE出现的时间，特征等进行病毒检测。从临床标本中分离CMV是一种确切的诊断，但HCMV感染宿主范围窄，只在人成纤维母细胞中增殖，增殖非常缓慢，初次分离需1个月才出现细胞毒，细胞肿大形成巨细胞性细胞，肿大的细胞核内和胞浆内可查见嗜酸性包涵体，在不利条件下CMV的感染性迅速减弱，且一些生长迅速的疱疹病毒或真菌会使单层细胞受损而影响CMV的分离。

(四)DNA/RNA扩增：

已有较多文献报道通过DNA扩增的方法检测HCMV DNA或RNA，但有报道通过一对PCR引物可引起假阴性，主要原因可能是临床标本中HCMV毒株的不同或病毒基因组中极微小变异(及病毒拷贝数太低)所致。此外，即使引物设计所选的序列针对HCMV同一基因的不同部位，其PCR扩增结果也有明显差异.。因此，巢式PCR常被用于HCMV的检测。但与此同时，操作步骤和检测时间均较长，而且实验容易造成污染，很难在临床上进行广泛的推广。

发明内容

本发明的目的是提供一种含内参的HCMV荧光定量PCR检测试剂盒，用于检测标本中HCMVDNA的含量，同时通过内参体系的设置，对检测过程中的假阴性进行有效防控。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

1、使用一对特异性引物和一条特异性探针，与人巨细胞病毒(HCMV)基因组的UL122基因保守序列完全匹配，扩增一段长度为96bp的靶序列。引物探针序列如下：

引物1：5`-GACTTCTTCACCCTGTTCTTCC-3`    (Seq No.1)

引物2：5`-GAGCCCGACTTTACCATCCA-3`      (Seq No.2)

探针1：5`-CTATCAGAGATCACGATACAGCCGG-3` (Seq No.3)

2、设计一条内参探针，该探针与HCMV基因组DNA无同源性，并且能与引物1和引物2组合成扩增效率高、非特异性扩增低的荧光PCR检测体系，即内参检测体系。内参探针序列如下：

探针2：5`-CACTCAACCTACACGTCAACGCTA-3`  (Seq No.4)

3、根据靶序列以及引物1、引物2和内参探针的序列，将靶序列中探针1的结合部位更换成内参探针的相同或互补序列，人工合成DNA片段，作为内参阳模。内参阳模及扩增靶序列片段的核苷酸序列如下：

内参阳模：5`-GACTTCTTCA CCCTGTTCTT CCTCGCACTC AACCTACACG TCAACGCTAC GGTATCGATA

ATCTTGTTGC GGTACTGGAT GGTAAAGTCG GGCTC-3`(Seq No.5)

靶基因序列：5`-GACTTCTTCA CCCTGTTCTT CCTCGCTATC AGAGATCACG ATACAGCCGG CGGTATCGAT

AATCTTGTTG CGGTACTGGA TGGTAAAGTC GGGCTC-3`(Seq No.6)

4、根据不同的荧光定量PCR仪器，从以下荧光基团中选择两个分布于不同的仪器检测通道的两种荧光进行组合，荧光种类为FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Fluorescein、Rhodamine、Rhodamine Red、Rhodamine Green、Rhodamine 6G、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine orange和ROX；荧光淬灭基团根据选择的荧光发光基团的种类和组合从DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3中的选择一种或两种淬灭基团。优选的方案为：两条探针分别用FAM-BHQ1和TET-BHQ1进行标记。

5、上述试剂盒，其特征在于采用多重荧光PCR检测技术，内参阳模DNA片段预先加入到含探针1和探针2的组成成分“探针”中，试剂盒的组成成分包括：PCR反应缓冲液、探针、Taq酶、核酸提取液、校准品1、校准品2、校准品3、阳性对照品和阴性对照品。

6、上述试剂盒，其特征在于PCR反应体系包含Tris-HCl(PH 8.3)、KCl、d(AGC)TP、dUTP、MgCl2、引物1和引物2、探针1和探针2、Taq酶、UNG酶以及适当浓度的内参阳模，试剂盒校准品为已知核酸DNA浓度并包含引物1和引物2扩增片段的人工合成DNA片段，阳性对照品为适当浓度的AD169标准病毒株，阴性对照品为超纯水。

7、上述的检测方法和试剂盒，可以按如下程序进行实时荧光PCR检测：反应管先在50℃反应2分钟，然后95℃保温5分钟，再按94℃20秒→60℃45秒循环40次(60℃退火条件下采集相应探针标记通道的荧光)。

本发明与现有HCMV核酸PCR检测方法相比，具有以下有益的技术效果：

(1)检测HCMV基因组即刻早期基因(immediate-early transcriptional regulator；IE2)中的U122基因，预测性较强。

(2)在检测HCMV靶基因U122的同一管PCR反应液中，同时对内参阳模进行扩增与检测，能有效监控PCR反应体系的有效性，较好的降低假阴性率。

附图说明

图1为2倍梯度稀释的人巨细胞病毒临床分离标本使用本发明试剂盒在ABI公司ABI7500荧光扩增仪上检测的FAM通道(检测HCMV靶基因的反应体系)的扩增曲线；

图2为2倍梯度稀释的人巨细胞病毒临床分离标本使用本发明试剂盒在ABI公司ABI7500荧光扩增仪上检测的JOE通道(内参检测反应体系)的扩增曲线；

具体实施方式

设计和制备引物、探针序列(针对HCMV标准株-Human herpesvirus 5 strain AD169基因<GeneBank序列号为BK000394>序列设计)：

引物1：5`-GACTTCTTCACCCTGTTCTTCC-3`        (Seq No.1)

引物2：5`-GAGCCCGACTTTACCATCCA-3`          (Seq No.2)

探针1：5`-CTATCAGAGATCACGATACAGCCGG-3`     (Seq No.3)

探针2：5`-CACTCAACCTACACGTCAACGCTA-3`      (Seq No.4)

上述引物和探针均在宝生物工程(大连)有限公司合成。

内参阳模：5`-GACTTCTTCA CCCTGTTCTT CCTCGCACTC AACCTACACG TCAACGCTAC GGTATCGATA

ATCTTGTTGC GGTACTGGAT GGTAAAGTCG GGCTC-3`(Seq No.5)

校准品：5`-GACTTCTTCA CCCTGTTCTT CCTCGCTATC AGAGATCACG ATACAGCCGG CGGTATCGAT

AATCTTGTTG CGGTACTGGA TGGTAAAGTC GGGCTC-3`    (Seq No.6)

含内参的HCMV荧光定量PCR检测试剂盒的组成为(20人份)：

组成成份名称                                体积

核酸提取液                                  1ml

PCR反应缓冲液                               400μl

探针                                        60μl

Taq酶                                       40μl

校准品1                                     20μl

校准品2                                     20μl

校准品3                                     20μl

阳性对照品                                  50μl

阴性对照品                                  50μl

其中，PCR反应缓冲液(使用终浓度)包括：10mM Tris-HCl(PH 8.3)、50mM KCl、300μMd(AGC)TP、300μMdUTP、5mM MgCl2、200nM引物1和200nM引物2；荧光探针(终浓度)包括200nM探针1和200nM探针2以及1E+4copies/ml浓度的内参阳模；Taq酶(终浓度)包括：1U Taq酶、0.05U UNG酶；3个校准品均为靶序列片段Seq No.6，其浓度分别依次为1E+7copies/ml、1E+6copies/ml和1E+5copies/ml；阳性对照品为HCMV DNA阳性临床血清，阴性对照品为HCMV DNA阴性的血清。

试剂盒的操作步骤如下：

(1)病毒核酸提取

取待测血清样本200μl(或尿液、乳汁1ml)3,000rpm离心5min，取上清，4℃13,000rpm离心10min，弃上清，加入核酸提取液50μl(阳性和阴性对照品直接加入核酸提取液50μl)，振荡混匀15s，100℃保温10min，取出至4℃或室温冷却，13,000rpm离心3min。取上清供PCR扩增用。

(2)荧光PCR反应液的配制：

按每人份PCR反应缓冲液20ul、探针3ul、Taq酶2ul的配方配制PCR反应液，并按25ul/管分装到0.2ml PCR管中，然后加入5ul待检的核酸提取产物，按如下程序进行实时荧光PGR检测：反应管先在50℃反应2分钟，然后94℃保温3分钟，再按94℃20秒→60℃45秒循环40次(60℃退火条件下采集FAM和JOE通道荧光)。

(3)质量监控与结果分析：

FAM通道的Ct值	JOE通道的Ct值	判断
			＜40	≤40	HCMV 阳性
40	＞40	HCMV 阴性
			40	40	实验失败，建议重做

根据仪器分析的结果，在如下情况视实验有效：阳性对照品的25＜Ct值＜30，阴性对照品Ct值为40(ABI7500等仪器上显示为“Undet.”)。

试剂盒性能指标：

最低检测量

取HCMV标准细胞毒株-AD169细胞培养液，使用中山大学达安基因股份有限公司生产的“人巨细胞病毒核酸扩增荧光定量检测试剂盒”(批准文号：国药准字S20060056)对其进行HCMV核酸定量，用TE缓冲液分别稀释至1×10⁴copies/ml、1×10³copies/ml和1×10²copies/ml，重复检测各稀释产物10次，结果表明，试剂盒能稳定检测出1×10³copies/ml浓度的标准细胞毒株(10/10)，试剂盒最低检测量为1×10³copies/ml；

特异性

使用试剂盒对HSV-1、HSV-2、EB、RV和HPV临床标本各1例(酶免检测抗体为阳性，达安基因股份有限公司生产的“人巨细胞病毒核酸扩增荧光定量检测试剂盒”检测为HCMV阴性)进行检测，结果全部为阴性，特异性为100％。

精密性

使用试剂盒对1例经达安基因股份有限公司生产的“人巨细胞病毒核酸扩增荧光定量检测试剂盒”定量结果为5.2×10⁵copies/ml的临床标本(尿液)重复10次检测，统计检测Ct值CV＜3％。

临床研究：

使用试剂盒对沈阳盛京医院297例HCMV临床标本(其中，尿液195例，乳汁62例，血清40例)分别在Roche公司的LightCycler和ABI公司的ABI7500荧光PCR仪上进行检测，阳性率分别为32.3％(96/297)和31.3％(93/297)，其中，乳汁标本的检测阳性检出率最高，为93.5％(58/62)。

上述实验结果表明，本发明试剂盒不仅操作简单，而且，在保证了高灵敏度的同时，保证了特异性和精密性，可用于分析标本中的HCMV病毒核酸的情况。

SEQUENCE LISTING

<110>上海复星医学科技发展有限公司

     上海复星医药(集团)股份有限公司

     剑军，何

     懿，夏

     大治，吴

     倩，韩

     维祥，沈

<120>含内参的HCMV荧光定量PCR检测试剂盒

<130>XQ00325617211

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gacttcttca ccctgttctt cc                    22

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gagcccgact ttaccatcca                       20

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ctatcagaga tcacgataca gccgg                 25

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

cactcaacct acacgtcaac gcta                  24

<210>5

<211>95

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gacttcttca ccctgttctt cctcgcactc aacctacacg tcaacgctac ggtatcgata    60

atcttgttgc ggtactggat ggtaaagtcg ggctc                               95

<210>6

<211>96

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gacttcttca ccctgttctt cctcgctatc agagatcacg atacagccgg cggtatcgat    60

aatcttgttg cggtactgga tggtaaagtc gggctc                              96

Claims (6)

1.含内参的HCMV荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于包含一对特异性引物、一条HCMV特异性检测探针和内参探针，分别用于检测HCMV病毒核酸DNA和人工合成的内参DNA片段，

其中，用于检测HCMV病毒DNA的扩增片段长度为96bp，引物和探针序列如下：

引物1：5`-GACTTCTTCACCCTGTTCTTCC-3`      (Seq No.1)

引物2：5`-GAGCCCGACTTTACCATCCA-3`        (Seq No.2)

探针1：5`-CTATCAGAGATCACGATACAGCCGG-3`   (Seq No.3)

探针2：5`-CACTCAACCTACACGTCAACGCTA-3`    (Seq No.4)

或者上述引物序列的互补序列，或者上述序列同源性大于75％的序列。

2.含内参的HCMV荧光定量PCR检测试剂盒其特征在于使用人工合成的内参DNA片段，内参DNA片段除探针1的结合区域更换成探针2的结合区域外，其余部分与HCMV DNA的扩增序列最好完全相同，但亦可完全不同。内参DNA片段序列如下：

内参阳模：

5`- GACTTCTTCA CCCTGTTCTT CCTCGCACTC AACCTACACG TCAACGCTAC GGTATCGATA ATCTTGTTGCGGTACTGGAT GGTAAAGTCG GG

3.含内参的HCMV荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于内参DNA片段预先加入到含探针1和探针2的组成成分“探针”中，试剂盒的组成成分包括：PCR反应缓冲液、探针、Taq酶、核酸提取液、校准品1、校准品2、校准品3、阳性对照品和阴性对照品。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于两条标记探针的荧光发光基团不同，根据不同的荧光定量PCR仪器，从以下荧光基团中选择两个分布于不同的仪器检测通道的两种荧光进行组合，荧光种类为FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Fluorescein、Rhodamine、Rhodamine Red、Rhodamine Green、Rhodamine 6G、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine orange和ROX；荧光淬灭基团根据选择的荧光发光基团的种类和组合从DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3中的选择一种或两种淬灭基团。优选的方案为：两条探针分别用FAM-BHQ1和TET-BHQ1进行标记。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于PCR反应体系包含Tris-HCl(PH 8.3)、KCl、d(AGC)TP、dUTP、MgCl₂、引物1和引物2、探针1和探针2、Taq酶、UNG酶以及适当浓度的内参阳模，试剂盒校准品为已知核酸DNA浓度并包含引物1和引物2扩增片段的人工合成DNA片段，阳性对照品为适当浓度的AD169标准病毒株，阴性对照品为超纯水。校准品序列如下：

5-GACTTCTTCA CCCTGTTCTT CCTCGCTATC AGAGATCACG ATACAGCCGG CGGTATCGAT AATCTTGTTGCGGTACTGGA TGGTAAAGTC GGGCTC-3`(Seq No.6)

6.根据权利要求3所述的试剂盒其特征在于，按如下程序进行实时荧光PCR检测：反应管先在50℃反应2分钟，然后95℃保温5分钟，再按94℃20秒→60℃45秒循环40次(60℃退火条件下采集相应探针标记通道的荧光)。

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