CN104087679A - 一种甲癣病原菌的分子诊断引物及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供一种甲癣病原菌的分子诊断引物及试剂盒，能够灵敏对甲癣进行分子诊断。在建立了灵敏、特异、稳定的甲癣病原菌检测体系的基础上，本发明针对性地设计了竞争性内参，确保阴性结果的真实可信。本发明的引物和探针，其序列分别为SEQ ID NO:1-9。同时，本发明所提供的试剂盒包含改良过的真菌细胞裂解液，能快速而有效地完成DNA提取过程，使检测更为快捷方便。

Description

一种甲癣病原菌的分子诊断引物及试剂盒

技术领域

本发明属微生物检测技术领域，具体涉及一种基于real time PCR的甲癣病原菌的分子诊断引物及试剂盒。

背景技术

甲癣(俗称灰指甲)，主要由皮肤癣菌(dermatophytes)引起，流行病学调查显示通常在人群中约有5％的个体感染不同程度的甲癣。皮肤癣菌主要包括三个属：小孢子菌属(Microsporum)、毛癣菌属(Trichophyton)和表皮癣菌属(Epidermophyton)；临床上以毛癣菌属的红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)最为常见。

与其他浅表真菌感染相比，甲癣以其低治愈率和高复发率而著称，通常需要较长时间的系统性用药才能彻底治愈。由于系统抗真菌治疗不仅涉及治疗成本的上升，而且抗真菌药物通常会有一定的不良反应，因此精准的甲癣诊断技术就显得非常重要。目前甲癣的真菌学检查主要依赖于镜检和培养。虽然镜检结果较灵敏，但无法有效区分不同物种的真菌，对检测人员的微生物学检测技能要求较高，因此不能满足临床的需要(特别是缺乏有经验的检测人员时)；真菌培养的阳性率极低，有文献指出，大约有15‐50％的镜检阳性标本，会表现出阴性结果。因此，开发快速、灵敏、准确、稳定的甲癣分子诊断试剂盒就显得极有意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种甲癣病原菌的分子诊断引物及试剂盒，能够快速、特异、灵敏、稳定对甲癣进行分子诊断。在建立了可靠的甲癣病原菌检测体系的基础上，本发明针对性地设计了竞争性内参，确保阴性结果的真实可信。同时，本发明所提供的试剂盒包含改良过的真菌细胞裂解液，能快速而有效地完成DNA提取过程。

本发明首先提供用于检测皮肤癣菌属的引物和探针，其序列信息如下：

上游引物Pan‐DF：ATAGTCCCTCTAAGAAGCCAG(SEQ ID NO:1)、

下游引物Pan‐DR：TAGTTGGTGGAGTGATTTGTC(SEQ ID NO:2)、

探针Pan‐DP：AATTGCGATAACGAACGAGACCTT(SEQ ID NO:3)。

探针Pan‐DP的5′用FAM修饰，3′用BHQ1修饰；

本发明还提供用于检测红色毛癣菌的引物和探针，其序列信息如下：

上游引物Tr‐F：TACCTCACCCGGTTGCCTC(SEQ ID NO:4)、

下游引物Tr‐R：CTGATTGTGCTTGCTAAACGC(SEQ ID NO:5)、

探针Tr‐P：CGGCTCGAGGCTCCCAGAAGG(SEQ ID NO:6)。

探针Tr‐P的5′用FAM修饰，3′用BHQ1修饰。

另外，本发明还提供作为竞争性内参的模板和探针，其信息如下：

Pan模板：Pan‐IAC(SEQ ID NO:7)：

ATAGTCCCTCTAAGAAGCCAGagctCTCAGACAGCCTCCAGCCCCGCagatGACAAATCACTCCACCAACTA

Tr模板：Tr‐IAC(SEQ ID NO:8)：

TACCTCACCCGGTTGCCTCagctCTCAGACAGCCTCCAGCCCCGCagatGCGTTTAGCAAGCACAATCAG

内参探针IACP(SEQ ID NO:9)：

CTCAGACAGCCTCCAGCCCCGC，探针5′用TAMRA修饰，3′用BHQ1修饰。

本发明还提供一种包含上述引物、探针的试剂盒。

本发明的引物、探针，以及试剂盒用于非疾病诊断目的的甲癣病菌的检测

本发明还提供一种从标本中提取核酸的方法，具体如下：

1)将待检测的样品加入到真菌细胞裂解液中，以珠磨法对真菌细胞进行裂解。其中真菌细胞裂解液的配方如下：

500mM     Tris‐HCl    pH8.8

100mM     EDTA         pH8.0

100mM     KCl

2)将裂解液离心使样品收集到离心管底部，然后在95℃水浴处理；

3)水浴结束后离心，收集上清作为检测的模板。

本发明提供了一套基于分子方法的甲癣病原体快速诊断体系，能灵敏、特异、快速、稳定、简便地检测甲癣。由于改进了煮沸法，能快速有效地提取临床标本中的皮肤癣菌DNA；而由于采用了竞争性内参，能有效地分辨假阴性结果；由于对引物、探针进行了充分的优化，因此能灵敏、特异而稳定地达到检测效果。

附图说明

图1：皮肤癣菌的18S rDNA序列保守区比对图；

图2：Pan检测引物扩增的标准曲线图；

图3：Tr检测引物扩增的标准曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的引物及探针进行详细的描述。

一、引物和探针的设计

1、Pan检测引物探针的设计

已报道的皮肤癣菌的通用型引物主要针对的几丁质合成酶1(chitinsynthase 1 gene，CHS1)，但由于CHS1为单拷贝基因，因此，本发明选择了在皮肤癣菌内更加保守，且为多拷贝的18S rDNA。

从NCBI下载到皮肤癣菌三个属(含毛癣菌属、小孢子球菌属、表皮癣菌属的11个种)的18S rDNA序列，通过seqman软件比对，从中找出序列相对稳定的区域(如图1)，用于作为检测的目标序列。利用primer select软件进行引物的选择后，选定不存在碱基变异的区域作为扩增引物。

初步选定引物后，通过采用浓度依赖的近似法(nearest‐neighbor)的Tm估算公式，由melitng软件完成。具体公式如下：

$T_m=\frac{\mathrm{\ΔH}}{\mathrm{\ΔS}+R\ln (C/2)}+12.5\log \left[M\right]-273.15$

通过调整引物长度和5′端碱基，使得两者Tm相近。

所得引物信息如下

Pan‐F：ATAGTCCCTCTAAGAAGCCAG(SEQ ID NO:1)，Tm值为55.92度

Pan‐R：TAGTTGGTGGAGTGATTTGTC(SEQ ID NO:2)，Tm值为55.51度

同时，从碱基稳定区域设计探针(要求无明显的二级结构和引物二聚体，且探针的Tm需略高于引物的Tm值)，最终确定的探针的序列如下：

Pan‐P：AATTGCGATAACGAACGAGACCTT(SEQ ID NO:3)，Tm值为60.36。探针5′用FAM修饰，3′用BHQ1修饰。

通过NBCI的primer‐blast，比对设计的引物在人类基因组和其他常见的真菌中的扩增能力，若能扩增，则看Pan‐DP能否有效地屏蔽无关物种，保持引物特异性。比对结果表明所设计的引物探针具有很好的特异性。

2、Tr检测引物探针的设计

从NCBI下载到红色毛癣菌的ITS序列，确定种内序列相对稳定的区域，用于作为检测的目标序列。利用primer select软件进行引物的选择后，选定不存在碱基变异的区域作为扩增引物的设计区域。

设计流程同Pan检测，所得引物的信息如下为：

Tr‐F：TACCTCACCCGGTTGCCTC(SEQ ID NO:4)，Tm值为59.53

Tr‐R：CTGATTGTGCTTGCTAAACGC(SEQ ID NO:5)，Tm值为58.61

Tr‐P：CGGCTCGAGGCTCCCAGAAGG(SEQ ID NO:6)，Tm值为66.83。探针5′用FAM修饰，3′用BHQ1修饰。

3、内参设定：

使竞争性内参(即内参引物与目标基因的引物相同)，以确保阴性结果的可靠性，内参模板信息如下：

Pan‐IAC：

ATAGTCCCTCTAAGAAGCCAGagctCTCAGACAGCCTCCAGCCCCGCagatGACAAATCACTCCACCAACTA(SEQ ID NO:7)

Tr‐IAC：

TACCTCACCCGGTTGCCTCagctCTCAGACAGCCTCCAGCCCCGCagatGCGTTTAGCAAGCACAATCAG(SEQ ID NO:8)

内参探针为：

IACP：CTCAGACAGCCTCCAGCCCCGC(SEQ ID NO:9)，探针5′用TAMRA修饰，3′用BHQ1修饰。

此处所设计的内参体系，为竞争性内参，内参体系和检测体系的引物完全相同，但探针不同。由于内参体系和检测体系使用了相同的引物，所以不存在引物的优势扩增(这就避免了由于内参引物的扩增能力与检测引物存在较大差别，从而抑制其中扩增能力较弱的体系)。同时，检测结果表明即使加入高浓度的内参，本发明所提供的内参模板的加入也不会影响检测体系的检测效果。

二、包含上述引物和探针的试剂盒

试剂盒(20人份)包含：

1、DNA提取管(20个)

提取管为2ml离心管，每管含0.5g玻璃珠(直径710-1180μm，sigma，货号G1152)，400ul真菌DNA提取液。真菌DNA提取液配方如下：

细胞裂解液的配方如下：

500mM Tris‐HCl pH8.8

100mM EDTA      pH8.0

100mM KCl

2、PCR mixture A(2×预混液，300ul)，配方如下：

3、PCR mixture B(260ul)，配方如下：

4、PCR mixture C(260ul)，配方如下：

5、positive control(40ul)，为1ng/ul的红色毛癣菌基因组DNA。

三、试剂盒的使用方法

1、DNA提取

(1)将待检测的样品加入DNA提取管，在TissueLyser II(Qiagen公司)上30hz震荡10min，或涡旋震荡10min。

(2)短暂离心使样品收集到离心管底部，95度水浴10min。

(3)14000rpm离心5min，取上清留用。

2、定量PCR检测

(1)皮肤癣菌检测：

取15ul的PCR mixture A和13ul的PCR mixture B混合，加入2ul上一步所得DNA模板，混匀，上机运行即。

(2)红色毛癣菌检测：

取15ul的PCR mixture A和13ul的PCR mixture C混合，加入2ul上一步所得DNA模板，混匀，上机运行即。

(3)PCR程序为：

95度10min

{95度15sec

54度20sec

72度30sec(采集数据)}40循环

注：本试剂盒适用于ABI7500/7500Fast/Vii7，Stratagene Mx3000P，Mx3005P，Mx4000，MJ Research Chromo4，Opticon(II)，Corbett Rotor Gene3000等仪器。

四、试剂盒效果检测

1、标准曲线制作：

(1)Pan检测

①构建质粒标准品

a、以Pan‐F和Pan‐R扩增出单一片段(以TAKARA的Premix Taq^TM完成，货号：R004A)后，连入pUC18DNA质粒载体(TAKARA，货号：3218)，转入E.coli DH5α(TAKARA，货号：9057)。通过PCR检测筛选出阳性克隆，在摇菌培养后以碱裂解法提取纯化质粒。

b、以分光光度计测到质粒浓度，计算出质粒的拷贝数，计算公式如下：

$\mathrm{Number\; of\; copies}/\mathrm{\μl}=\frac{{6.022\×10}^{23}(\mathrm{molecules}/\mathrm{mole})\×\mathrm{DNA\; concentrations}(g/\mathrm{\μl})}{\mathrm{Number\; of\; bases\; pairs}\×660\mathrm{daltons}}$

c、稀释为每微升含如下拷贝数的不同溶液，拷贝数为：10⁵、10⁴、10³、10²、10、1。

②构建质粒标准品

以质粒构建标准品，进行检测：扩增的标准曲线如图2所示；扩增的具体数值如表1所示。

表1、Pan扩增的质粒标准品Ct数值表

另外，以基因组扩增的情况如表2所示：

表2、Pan扩增的基因组Ct数值表

利用标准曲线对上述结果进行分析，有表3所示：

从上述的数据可以看出，Pan检测下限为2p基因组DNA和10拷贝的质粒数。由于所检测的目标基因为多拷贝基因(每个基因组约有200个拷贝)。所以，当有一个基因组存在时，就可以被本发明的检测体系识别。

(2)Tr检测

以Tr-F和Tr-R扩增出单一片段，构建质粒标准品，过程同Pan检测

检测数据如下：扩增的标准曲线如图3所示；扩增的具体数值如表3所示。

表3、Tr扩增的质粒标准品Ct数值表

另外，以基因组扩增的情况如表4所示：

表4、Tr扩增的基因组Ct数值表

从上述的数据可以看出，Tr检测下限为3p基因组DNA和10拷贝的质粒数。由于所检测的目标基因为多拷贝基因(每个基因组约有200个拷贝)。所以，当有一个基因组存在时，就可以有效被检测体系识别。

2、稳定性检测

以同一个标本进行检测96次，其中：

(1)Pan检测，Ct值的平均值为22.775，最大值为22.957，最小值为22.340，方差为0.102。可知，在这96次检测中，Pan检测表现得非常稳定。

(2)Tr检测，Ct值的平均值为24.790，最大值为24.962，最小值为24.223，方差为0.091。可知，在这96次检测中，Tr检测表现得非常稳定。

3、特异性检测

以高浓度基因组(2-10ng)，对检测体系进行特异性的确认，包括：Trichophyton rubrum(红色毛癣菌)、Trichophyton interdigitaliae(趾间毛癣菌)、Trichophyton tonsurans(断发毛癣菌)、Trichophyton violaceum(紫色毛癣菌)、Trichophyton verrucosum(疣状毛癣菌)、Microsporum canis(犬小孢子菌)、Microsporum gypseum(石膏小孢子菌)、Microsporum nanum(猪小孢子菌)、Microsporum ferrugineum(铁锈色小孢子菌)、Microsporumpersicolor(桃色小孢子菌)、Epidermophyton floccosum(絮状表皮癣菌)、念珠菌属(白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平光滑念珠菌)、曲霉属(烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉、构巢曲霉)、马尔尼菲青霉、新型隐球菌。其中，所用的菌株都事先经过形态学和分子方法的鉴定。

最终确认：Pan检测能有效检测到皮肤癣菌三个属的真菌，而Tr检测能有效检测到红色毛癣菌，而其他无关物种都扩增不出产物，表现出了极佳的特异性。

4、内参体系验证

加入高浓度的内参模板后，检测内参是否对就目标检测有影响。取三份明确已知的阳性临床标本，加入高浓度内参(105拷贝/体系)，结果如下：

(1)Pan检测，如表5所示

表5、内参加入对Pan检测体系的影响

在上表上，内参的Ct值稳定在24左右，证明了内参这一体系中能得较好扩增。在这一前提下，不同浓度的标本在是否加入内参，Ct未呈现出明显的变化。可知，内参对检测影响基本可以忽略。

(2)Tr检测，如表6所示

表6、内参加入对Tr检测体系的影响

在上表上，内参的Ct值稳定在24左右，证明了内参这一体系中能得较好扩增。在这一前提下，不同浓度的标本在是否加入内参，Ct未呈现出明显的变化。可知，内参对检测影响基本可以忽略。

四、临床验证

取得36份已知阳性的甲癣标本(由镜检和培养确认)和40份已知阴性的标本(来源于健康的志愿者)，进行分子检测。使用两套方案：其一为本发明所研制的检测体系；其二为来自文献的检测体系(文献为：Brillowska-A,Saunte DM,Arendrup MC(2007)Five-hourdiagnosis of dermatophyte nail infections with specific detection ofTrichophyton rubrum.Journal of clinical microbiology45,1200-1204，也即是Statens Serum Institut的Dermatophyte PCR Kit的检测体系)，结果如表7所示：

检测结果表明，40份阴性标本的检测结果，本发明的方法与文献报道的一致。但在36份阳性标本，本发明检测结果均为阳性；而DermatophytePCR Kit检测则存在4份阴性(如表7所示)。

表7、本发明与Dermatophyte PCR Kit检测体系结果对比

本发明的灵敏度为100％，而Dermatophyte PCR Kit的灵敏度为88.89％；两者的特异度增均为100％。本发明的阳性预测值和阴性预测值均为100％，而Dermatophyte PCR Kit的阳性预测值和阴性预测值分别为100％和90.91％。综上可知，本发明在在特异性方面与Dermatophyte PCR Kit检测相同，但灵敏度则要高于Dermatophyte PCR Kit。

Claims (9)

1.一种用于检测皮肤癣菌属的引物和探针，其特征在于，所述的引物和探针的序列信息如下：

上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:1、

下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:2、

探针的核苷酸序列为SEQ ID NO:3。

2.一种用于检测红色毛癣菌的引物和探针，特征在于，所述的引物和探针的序列信息如下：

上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:4、

下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:5、

探针的核苷酸序列为SEQ ID NO:6。

3.如权利要求1或2所述的引物和探针，其特征在于，所述的探针的5′端用FAM修饰，3′端用BHQ1修饰。

4.一种模板和探针，其特征在于，所述的模板和探针为权利要求1或2所述的引物和探针的竞争性内参，其序列信息如下：

Pan模板，其核苷酸序列为SEQ ID NO:7：

Tr模板，其核苷酸序列为SEQ ID NO:8：

内参探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:9。

5.如权利要求4所述的模板和探针，其特征在于所述的内参探针的5′端用TAMRA修饰，3′端用BHQ1修饰。

6.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有权利要求1和/或2所述的引物和探针。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包含有权利要求4所述的模板和探针。

8.权利要求7或8所述的试剂盒用于非疾病诊断目的的甲癣病菌的检测。

9.一种检测甲癣病菌的方法，其特征在于，所述的方法是采用权利要求1和/或2所述的引物和探针，其中扩增样品核酸模板的提取方法如下：

1)将待检测的样品加入到真菌细胞裂解液中，以珠磨法对真菌细胞进行裂解，其中真菌细胞裂解液的配方如下：

500mM     Tris-HCl   pH 8.8

100mM     EDTA       pH8.0

100mM     KCl；

2)将裂解液离心使样品收集到离心管底部，然后在95℃水浴处理；

3)水浴结束后离心，收集上清作为检测的模板。