CN109022422A - 一种提取真菌基因组dna的方法 - Google Patents

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邢鹏杰
高婷婷
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李长田
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李冠霖
李玉
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
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Abstract

本发明公开一种提取真菌基因组DNA的方法。其中，包括步骤：将真菌的菌丝或菌根加入备有提取液的PCR管中；将PCR管放入PCR仪中，在90‑100°C下处理5‑15min；取出PCR管后加入稀释液；提取完成，冻存，备用。本发明所述的提取真菌基因组DNA的方法，具有以下优点：（1）提取过程简单，省时省力，提取过程不到1小时；（2）提取的基因组DNA相对含量较高，足够为后续的研究奠定基础；（3）成本低。

Description

一种提取真菌基因组DNA的方法
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，尤其涉及一种提取真菌基因组DNA的方法。
背景技术
DNA的提取是真菌基因工程研究中一项重要的前提工作。目前真菌基因组提取广泛采用的CTAB法是针对丝状真菌细胞结构成分与植物细胞的相似性借鉴提取物基因组的方法改进而来的。但是传统的CTAB法仍存在较多的不足之处，主要包括：(1) 液氮研磨所需菌体量多，需大量培养，对于生长较慢的种类，费时费力；(2) 研磨的充分与否严重影响提取基因组的质量，研磨不充分或研磨后没有及时加入裂解液， 就可能造成提取DNA量太少或基因组降解。
对于一些微量的材料而言，细胞壁的破碎程度直接影响DNA的提取质量，量少且韧度大的材料机械破碎较难，如某些真菌培养物，生长缓慢，菌丝量少，且菌丝韧度大，提取基因组DNA需要在技术上进行改进；对于新鲜菌根样品，在菌根合成数量有限的情况下，进行菌根内真菌基因组提取，不但有植物根系组织的阻隔，而且存在真菌细胞壁破碎问题，同时包括选取菌根、清洗、研磨等诸多环节，给试验带来很多不便。现有技术中，大多将焦点放在怎么破碎细胞上，对于少量样品采用液氮和石英砂结合微型杵，等等，尽管收到明显的效果，但在操作上较繁琐且费力。
因此，针对少量菌丝的真菌及共生结构中真菌基因组的提取，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种提取真菌基因组DNA的方法，旨在解决现有方法费时费力，提取率低的问题。
本发明的技术方案如下：
一种提取真菌基因组DNA的方法，其中，包括步骤：
将真菌的菌丝或菌根加入备有提取液的PCR管中；
将PCR管放入PCR仪中，在90-100°C下处理5-15min；
取出PCR管后加入稀释液；
提取完成，冻存，备用。
所述的提取真菌基因组DNA的方法，其中，所述提取液的配制步骤如下：
（1）在洁净的容器中加入10mL 1M的Tris溶液；
（2）然后加入1.86g的KCl；
（3）加入0.37g的EDTA；
（4）加入80mL的DI水，摇动直至完全溶解；
（5）加入1M NaOH溶液至pH达到9.5；
（6）利用DI水定容至100mL；
（7）无菌过滤器除菌过滤，分装在2mL的离心管，-20°C保存备用。
所述的提取真菌基因组DNA的方法，其中，所述稀释液的配制步骤如下：
（1）加入3g的牛血清蛋白放在洁净容器中，用DI水定容到100mL；
（2）完全溶解后，无菌过滤，分装在2mL的离心管中备用。
所述的提取真菌基因组DNA的方法，其中，以体积计，所述稀释液加入的量为所述提取液的3倍。
所述的提取真菌基因组DNA的方法，其中，在95°C下处理10min。
所述的提取真菌基因组DNA的方法，其中，放入-20°C下冻存。
所述的提取真菌基因组DNA的方法，其中，提取完成后，还包括步骤：通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA的有无。
所述的提取真菌基因组DNA的方法，其中，提取完成后，还包括步骤：采用分光光度计法，通过在260-280nm下的吸光度值得到提取的DNA的浓度。
有益效果：本发明所述的提取真菌基因组DNA的方法，具有以下优点：（1）提取过程简单，省时省力，提取过程不到1小时；（2）提取的基因组DNA相对含量较高，足够为后续的研究奠定基础；（3）成本低。
附图说明
图1为实施例1中玉米的内生真菌LSU序列的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。
图2 为实施例2中菌根样品的内真菌ITS序列的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。
图3为实施例3中采用分光光度计法测定的基因组DNA含量示意图。
图4为实施例3中大型真菌菌丝培养物ITS序列的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
本发明提供一种提取真菌基因组DNA的方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供一种提取真菌基因组DNA的方法，其中，包括步骤：将真菌的菌丝或菌根加入备有提取液（Extraction solution，简称：ES）的PCR管中；
将PCR管放入PCR仪中，在90-100°C下处理5-15min；
取出PCR管后加入稀释液（bovine serum albumin，简称：BSA）；
提取完成，冻存，备用。
具体的，所述提取液的配制步骤如下：
（1）在洁净的容器中加入10mL 1M的Tris溶液；
（2）然后加入1.86g的KCl；
（3）加入0.37g的EDTA；
（4）加入80mL的DI水，摇动直至完全溶解；
（5）加入1M NaOH溶液至pH达到9.5；
（6）利用DI水定容至100mL；
（7）无菌过滤器除菌过滤，分装在2mL的离心管，-20°C保存备用。
具体的，所述稀释液的配制步骤如下：
（1）加入3g的牛血清蛋白放在洁净容器中，用DI水定容到100mL；
（2）完全溶解后，无菌过滤，分装在2mL的离心管中备用。
优选的，在95°C下处理10min。
优选的，放入-20°C下冻存。
与现有提取方法相比，本发明提取方法是利用一定浓度KCl析出DNA，然后在缓冲液的保护下高温去除蛋白质等杂质的过程。提取液及其作用原理如下： Tris溶液提供缓冲体系，DNA在这一体系中成稳定状态；EDTA是DNA酶的抑制剂，是防止在DNA析出后被DNA酶破坏； KCL析出并溶解DNA。
本发明利用盐溶液析出DNA的方法，实现快速提取真菌基因组DNA。
本发明具有以下优点：（1）提取过程简单，省时省力，提取过程不到1小时；（2）提取的基因组DNA相对含量较高，足够为后续的研究奠定基础；（3）成本低。
本发明中，提取完成后，还可通过以下几种检测方法验证其DNA提取质量，常用检测方法有两种：其一，通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA的有无；其二，采用分光光度计法，通过在260-280nm下的吸光度值得到提取样品的DNA的浓度。
下面通过若干实施例对本发明进行详细说明。
本发明实施例1-3中的提取液和稀释液均按照以下方法进行配制：
1、以配制100mL溶液为例，DNA 裂解液，即提取液（Extraction solution，简称：ES）的配制步骤如下：
（1）在洁净的容器中加入10mL 1M的Tris溶液（三羟甲基氨基甲烷溶液）；
（2）然后加入1.86g的KCl；
（3）加入0.37g的EDTA（乙二胺四乙酸）；
（4）加入80mL的DI水（去离子水），摇动直至完全溶解；
（5）加入适量的1M NaOH溶液至pH达到9.5；
（6）利用DI水定容至100mL；
（7）无菌过滤器除菌过滤，分装在2mL的离心管，-20°C保存备用。
2、稀释液BSA（bovine serum albumin，简称：BSA）的配制步骤如下：
（1）加入3g的牛血清蛋白放在洁净容器中，用DI水定容到100mL；
（2）完全溶解后，无菌过滤，分装在2mL的离心管中备用。
实施例1: 对丝状真菌菌丝的基因组DNA进行提取
从玉米根和叶中分离得到的内生真菌进行基因组DNA的提取，样品为：“1”：T4R6A，“2”：T4R6B，“3”：T4R6B1，“4”：T1R2A，“5”：T4R5A，“6”：T4R5B，“7”：T4R2B，“8”：T4R2A。
提取步骤：（1）在超净工作台下，用无菌的跳针挑取少量的固体培养基培养的菌丝放在事先准备好的备有ES溶液的PCR管中；（2）将PCR管放入PCR仪中，然后在95°C温浴10min；（3）取出后加入3倍于ES溶液体积的BSA溶液，提取完毕；（4）验证DNA提取效果，对其LSU片段进行PCR扩增，其扩增结果如图1：分别对8个样品的原DNA稀释10倍和50倍后进行扩增，电泳结果显示，除了第二个样品的10倍稀释液条带较微弱之外，其余条带都很清晰，可以进行测序。
实施例2: 对菌根样品的基因组DNA进行提取
样品来自实验室温室内块菌和栎树菌根合成苗。样品分别为板栗×红汁乳菇，蒙古栎×红汁乳菇，榛子×红汁乳菇，红松×红汁乳菇。
提取步骤：（1）截取少量根样品，用水冲洗去掉培养基质后放入洁净培养皿内，加少量水，在解剖镜下观察，挑取3段根尖放入事先准备好的备有ES溶液的PCR管中；（2）将PCR管放入PCR仪中，在95°C下温浴10 min；（3）取出后加入3倍于ES溶液体积的BSA溶液，提取完毕，-20°C下保存备用；（4）验证DNA提取效果，对其ITS片段进行PCR扩增，其扩增结果如图2：“1”为板栗×红汁乳菇合成菌根样品，“2”为蒙古栎×红汁乳菇合成菌根样品，“3”为榛子×红汁乳菇合成菌根样品，“4”为红松×红汁乳菇合成菌根样品。
实施例3： 对几种大型真菌培养物的基因组DNA进行提取
样品分别为红汁乳菇、牛肝菌、花脸香蘑和榆黄蘑菌丝培养物，编号分别为1、2、3和4。
提取步骤：（1）分别将少量菌丝样品放入事先准备好的备有ES溶液的PCR管中；（2）将PCR管放入PCR仪中，在95°C下温浴10 min；（3）取出后加入3倍于ES溶液体积的BSA溶液，提取完毕；（4）采用分光光度计法测定基因组DNA的含量，其测定结果如图3所示：含量分别为“1” 红汁乳菇菌丝体培养物：596.58 ng/µL，“2” 牛肝菌菌丝体培养物：558.38 ng/µL，“3”： 花脸香蘑菌丝体培养物494.58 ng/µL，“4” 榆黄蘑菌丝培养物：529.58 ng/µL；（5）验证DNA提取效果，对其ITS片段进行PCR扩增，其扩增结果如图4：“1”：红汁乳菇菌丝体培养物，“2”牛肝菌菌丝体培养物，“3”花脸香蘑菌丝体培养物，“4”榆黄蘑菌丝培养物。（6）生物公司测序，Genbank 比对结果和登录号如下：“1”：红汁乳菇，登录号为MH 234511；“2”：牛肝菌，登录号为MH 234512； “3”：花脸香蘑，登录号为MH 234513； “4”：榆黄蘑，登录号为MH234514。
综上所述，本发明提供的提取真菌基因组DNA的方法，利用盐溶液析出DNA，实现快速提取真菌基因组DNA。本发明提取方法具有以下优点：（1）提取过程简单，省时省力，提取过程不到1小时；（2）提取的基因组DNA相对含量较高，足够为后续的研究奠定基础；（3）成本低。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (8)

1.一种提取真菌基因组DNA的方法，其特征在于，包括步骤：
将真菌的菌丝或菌根加入备有提取液的PCR管中；
将PCR管放入PCR仪中，在90-100°C下处理5-15min；
取出PCR管后加入稀释液；
提取完成，冻存，备用。
2.根据权利要求1所述的提取真菌基因组DNA的方法，其特征在于，所述提取液的配制步骤如下：
（1）在洁净的容器中加入10mL 1M的Tris溶液；
（2）然后加入1.86g的KCl；
（3）加入0.37g的EDTA；
（4）加入80mL的DI水，摇动直至完全溶解；
（5）加入1M NaOH溶液至pH达到9.5；
（6）利用DI水定容至100mL；
（7）无菌过滤器除菌过滤，分装在2mL的离心管，-20°C保存备用。
3.根据权利要求1所述的提取真菌基因组DNA的方法，其特征在于，所述稀释液的配制步骤如下：
（1）加入3g的牛血清蛋白放在洁净容器中，用DI水定容到100mL；
（2）完全溶解后，无菌过滤，分装在2mL的离心管中备用。
4.根据权利要求1所述的提取真菌基因组DNA的方法，其特征在于，以体积计，所述稀释液加入的量为所述提取液的3倍。
5.根据权利要求1所述的提取真菌基因组DNA的方法，其特征在于，在95°C下处理10min。
6.根据权利要求1所述的提取真菌基因组DNA的方法，其特征在于，放入-20°C下冻存。
7.根据权利要求1所述的提取真菌基因组DNA的方法，其特征在于，提取完成后，还包括步骤：通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA的有无。
8.根据权利要求1所述的提取真菌基因组DNA的方法，其特征在于，提取完成后，还包括步骤：采用分光光度计法，通过在260-280nm下的吸光度值得到提取的DNA的浓度。
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