CN103627702A

CN103627702A - 一种提取食用菌dna的方法

Info

Publication number: CN103627702A
Application number: CN201310646321.4A
Authority: CN
Inventors: 章炉军; 尚晓冬; 巫萍; 谭琦; 宋春艳; 张丹; 于海龙
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-12-04
Filing date: 2013-12-04
Publication date: 2014-03-12

Abstract

本发明公开了一种提取食用菌DNA的方法，该方法包括以下步骤：（1）取材：将食用菌菌丝置于缓冲液中；（2）加热：90-110℃加热；（3）离心：7000-9000rpm离心5-10min后吸取上清液，上清液中即含有总DNA。本发明的一种提取食用菌DNA的方法，用时短、操作简单方便、成本低、对环境无污染，制备的DNA完整性好，适于PCR反应。

Description

一种提取食用菌DNA的方法

技术领域

本发明涉及食用菌基因工程领域，具体的说涉及一种提取食用菌DNA的方法。

背景技术

近年来，我国食用菌产业迅速发展，食用菌相关的基础研究也已经深入到分子水平，食用菌的分类，遗传，育种，菌种鉴定，遗传多样性等的研究中都需要提取或制备DNA，这些DNA运用到基因组测序，某个基因或片段的PCR扩增，DNA分子标记应用以及基因工程的研究中，在这些研究中制备的DNA有很大一部分比例都用于各种PCR反应。

目前，各种食用菌DNA的提取方法主要在破壁方法，杂质去除以及核酸沉淀上存在差异。通常采取的破壁方法，包括液氮研磨，石英砂研磨或玻璃珠震荡等，再加入十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）或氯化苄等处理，经过酚—氯仿抽提去杂质，最后用乙醇或异戊醇沉淀核酸。CTAB法作为最常用的食用菌DNA提取方法，利用CTAB这种阳离子去污剂在高盐浓度（>0.7mol/L NaCl）下能与蛋白质和多聚糖形成复合物，但不沉淀核酸的特性，再通过有机溶剂抽提，去除溶液中蛋白，多糖，酚类等杂质，最后通过加入乙醇沉淀核酸的过程。整个提取过程步骤繁琐，耗费大量时间和费用，虽有一些简化方法，但不是增加成本就是需要其他试验工具辅助。总之，目前的食用菌DNA提取方法普遍存在步骤繁琐，提取时间长，提取成本高等不足之处，没有一种的能仅用一种简单的试剂，仅用简单的操作就能完成的DNA制备方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种提取食用菌DNA的方法，该方法包括以下步骤：

（1）取材：将食用菌菌丝置于缓冲液中；

（2）加热：90-110℃加热；

（3）离心：7000-9000rpm离心5-10min后吸取上清液，上清液中即含有总DNA。

其中步骤（2）中优选的加热温度为95-100℃。

其中第（1）步取材，具体的说为：食用菌菌丝为PDA平板上培养生长1～3天的幼嫩气生菌丝，灭菌牙签在平板表面刮取2～3次，至牙签头部有肉眼可见的小团菌丝，刮取的菌丝重量接近0.001g。在200μL小离心管中预先加入200μL TE缓冲液（10mmol/LTris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0），将带有菌丝的牙签置于缓冲液中搅动，至菌丝全部分散在离心管中。

上述第（2）步中，可用PCR仪或水浴调节温度为90-110℃，离心管置于其中保持10min。

上述第（3）步中，经过8000rpm离心后，菌丝处于离心管底部，上清液中即含有总DNA。

用上述方法制备得到的含有总DNA的上清液，可吸取后直接用于PCR反应，不需要再进行稀释，非常便利。

所述食用菌包括香菇，平菇，金针菇，双孢蘑菇，黑木耳，灰树花等。

所述PCR反应，包括确定片段的PCR反应，如ITS片段扩增；多种分子标记扩增，如RAPD，SSR，ISSR，SRAP。

本发明以食用菌幼嫩菌丝体为材料快速制备适于PCR反应的总DNA，该方法的优点如下：

（1）所需材料获取简单、量少，仅需肉眼可见的小团菌丝，可于平板表面或试管斜面刮取，根据不同食用菌品种的生长速度，仅需培养1～3天即可获得试验所需的菌丝量。

（2）该方法无需液氮研磨或其他物理破壁过程，减少了试验工作量。

（3）该方法无需多种试剂多步骤抽提，降低了试验成本和试验繁琐程度。

（4）该方法制备速度极快，整个制备过程可控制在15min内，并可同时制备大量样品。

（5）该方法制备的DNA含量和纯度达到多种PCR反应的要求，DNA完整性优于CTAB提取法，且提取的DNA量可完成100次以上的常规PCR反应。

总之，本发明的一种提取食用菌DNA的方法，操作简单、用时短、成本低、对环境无污染，制备的DNA完整性好，质量稳定，适于PCR反应。

附图说明

图1.PCR反应的扩增效果比较

其中A、B、C、D、E分别为RAPD、SSR、ISSR、SRAP和ITS扩增效果比较，M为Marker，C为CTAB法提取的香菇DNA对照，L为实施例一提取的香菇DNA

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例一、制备香菇，平菇，金针菇，双孢蘑菇，黑木耳和灰树花DNA。

1、材料

香菇（Lentinula edodes），平菇（Pleurotus ostreatus），金针菇（Flammulina velutiper），双孢蘑菇（Agaricus bisporus），黑木耳（Auricularia auricula-judae）和灰树花（Griflolafrondosa）品种均为上海市农业科学院食用菌所菌种保藏中心保存菌种，保藏号分别为，4627、0860、0188、0897、0115和2611。

2、试剂

TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0。

3、DNA提取

（1）取材：香菇，平菇，金针菇，双孢蘑菇，黑木耳和灰树花菌丝在PDA平板上培养生长2天，用灭菌牙签在平板表面刮取幼嫩气生菌丝2～3次，至牙签头部有肉眼可见的小团菌丝，刮取的菌丝重量接近0.001g。在200μL小离心管中预先加入200μL TE缓冲液（10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0），将带有菌丝的牙签置于缓冲液中搅动，至菌丝全部分散在离心管中。

（2）加热：PCR仪设置成98℃，保持10min，将小离心管置于PCR仪内，启动PCR仪；

（3）离心：待PCR仪98℃、10min工作结束后，将小离心管置于离心机内，8000rpm离心5min，吸取上清液用于DNA含量、纯度检测和多种PCR反应验证。

实施例二、DNA含量和纯度检测

将实施例一中提取的DNA用Thermo公司NanoDrop1000分光光度计，检测核酸含量和纯度，以CTAB法提取的0.1g香菇菌丝DNA为对照。检测结果显示：

（1）香菇，平菇，金针菇，双孢蘑菇，黑木耳和灰树花的核酸浓度分别为：65，114，140，100，53和27ng/μL，灰树花最低，金针菇最高。而以CTAB法提取的香菇DNA则为730ng/μL，进行常规PCR反应需要稀释；

（2）OD260/280结果显示：香菇和平菇的OD260/280比值在2.0和2.2之间，与对照相当，其余4种则都在1.6和2.0之间，说明制备的DNA中有蛋白存在；

所以，实施例一方法提取的多种食用菌DNA在浓度上满足PCR的要求。

实施例三、多种PCR反应验证

将实施例一中提取的香菇DNA不经稀释直接进行多种PCR反应，验证DNA样品的含量和纯度是否会达到普通PCR反应的要求。将CTAB法提取的DNA稀释到50ng/μL的浓度作为对照，选取ITS片段作为特定片段扩增试验，RAPD、SSR、ISSR和SRAP作多种分子标记扩增试验，所用引物序列见表1。PCR产物用PAGE电泳，银染法染色，各种PCR反应的扩增效果见图1。

表1：PCR验证用ITS、RAPD、SSR、ISSR和SRAP引物序列

PCR扩增效果显示，实施例一提取的香菇DNA与传统CTAB法提取的DNA相比，多种PCR的扩增效果没有明显差异，主要条带的数目和亮度都没有显著的差异。

Claims

1.一种提取食用菌DNA的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

（1）取材：将食用菌菌丝置于缓冲液中；

（2）加热：90-110℃加热；

2.根据权利要求1所属的提取食用菌DNA的方法，其特征在于步骤（2）中加热温度为95-100℃。