CN105950776B - 一种平菇菌种鉴别的方法及专用dna条形码片段 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种平菇菌种鉴别的方法及专用DNA条形码片段。本发明提供了DNA片段，为如下1)或2)：1)、序列3所示的DNA片段；2)、为与1)所示片段的核苷酸序列同源性大于99％的片段。本发明提供的平菇DNA条形码片段，其可以用于鉴别平菇菌种，用该片段鉴别有利于缩短平菇菌种鉴定时间，提高鉴定准确性，用该方法最快48小时可以准确鉴定平菇菌种，避免栽培出菇以后才发现菌种错误的后果。

Description

一种平菇菌种鉴别的方法及专用DNA条形码片段
技术领域
本发明涉及生物技术领域，涉及DNA条形码快速鉴别食用菌菌种，尤其涉及一种平菇菌种鉴别的方法及专用DNA条形码片段。
背景技术
食用菌是我国主要的经济作物和出口农产品。我国食用菌产业经过30多年高速发展，2014年产量已超过2800万吨、产值超过2000亿元，已成为世界上最大的食用菌生产大国。其中平菇产量最大，达560万吨，居世界第一。菌种质量好坏对食用菌产业发展十分重要。食用菌产业有“一支母种影响一个食用菌产业”的说法。菌种在平菇产业的发展中起着重要的、不可替代的作用。近年来菌种事故多数是菌种错误造成的，菌种随意改名，假冒伪劣菌种扰乱市场，坑农时间时有发生。因此，菌种的真实性检测在平菇菌种质量检测中显得至关重要。
常规检测手段主要有：肉眼感官观察、菌丝生长速度、农艺性状和商品性状检验、同工酶电泳法、ISSR法等。这些方法耗时多，具有一定的组织与发育阶段的特异性，结果不可靠。
DNA条形码技术是利用一段标准、通用的DNA序列，实现对物种进行快速准确鉴定的目的。该技术鉴定样品具有不受其生长发育阶段影响、所需材料少，操作简单，所需时间短，结果可靠等优势，可以实现对平菇菌种快速可靠的物种鉴定。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种DNA片段。
本发明提供的DNA片段，为如下1)或2)或3)：
1)、序列3所示的DNA片段；
2)、序列3第21-375位核苷酸所示的DNA片段；
3)、为与1)或2)所示片段的核苷酸序列同源性大于99％的片段。
本发明的另一个目的是提供所述DNA片段的新用途。
本发明提供了所述DNA片段在鉴别或辅助鉴别平菇菌种中的应用。
本发明第3个目的是提供检测平菇菌种基因组中是否含有所述DNA片段的物质的新用途。
本发明提供了检测平菇菌种基因组中是否含有所述DNA片段的物质在鉴别平菇菌种中的应用。
上述应用中，所述检测平菇菌种基因组中是否含有所述DNA片段的物质为如下1)或2)：
1)用于扩增所述DNA条形码片段的引物对；
2)含有所述引物对的PCR试剂或试剂盒。
上述应用中，所述引物对由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成。
或所述PCR试剂中，所述引物1和所述引物2的摩尔比为1:1。
或所述PCR试剂中，所述引物1和所述引物2的浓度均为10μmol/L。
本发明第4个目的是提供一种鉴别或辅助鉴别平菇菌种的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：检测待测样品中是否含有所述DNA片段；如果含有，则待测样品为或候选为平菇菌种；如果不含有，则待测样品不为或候选不为平菇菌种。
上述方法中，
所述检测待测样品中是否含有所述DNA片段的方法包括如下步骤：
1)用序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成的引物对对待测样品进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
2)测序所述PCR扩增产物，将所述PCR扩增产物的序列与所述DNA片段进行比对，若同源性大于99％，则待测样品中含有所述DNA片段，若同源性小于等于99％，则待测样品中不含有所述DNA片段。
上述方法中，
所述PCR扩增的模板为待测样品的基因组DNA。
本发明第5个目的是提供检测平菇菌种基因组中是否含有所述DNA片段的物质。
本发明提供的检测平菇菌种基因组中是否含有所述DNA片段的物质，其为如下1)或2)：
1)用于扩增所述DNA条形码片段的引物对；
2)含有所述引物对的PCR试剂或试剂盒。
上述物质中，所述引物对由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成。
或所述PCR试剂中，所述引物1和所述引物2的摩尔比为1:1。
或所述PCR试剂中，所述引物1和所述引物2的浓度均为10μmol/L。
为克服形态特征、生化及传统分子标记鉴定平菇菌种的缺陷，本发明提供了一种平菇(Pleurotus cornucopiae，白黄侧耳，又名小平菇、美味侧耳、紫孢平菇、平菇)菌种DNA条形码鉴定方法，可以快速准确地鉴别平菇菌种。
本发明的实验证明，本发明提供的平菇DNA条形码片段，其可以用于鉴别平菇菌种，用该片段鉴别有利于缩短平菇菌种鉴定时间，提高鉴定准确性，用该方法最快48小时可以准确鉴定平菇菌种，避免栽培出菇以后才发现菌种错误的后果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、平菇菌种鉴别DNA条形码片段的获得及方法的建立
1、平菇菌种的基因组DNA获得
提取平菇菌种的基因组DNA。
2、PCR扩增
以上述1得到的基因组DNA为模板，用引物728F和引物1567R进行PCR扩增。
728F：5'-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3'(序列1)
1567R：5'-ACHGTRCCRATACCACCRATCTT-3’(序列2)
上述PCR扩增体系为如下表1：
表1为PCR反应体系的组成(25μL)
上述PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，63℃退火55s，每个循环降低1℃，72℃延伸90s，10个循环；94℃变性30s，53℃退火55s，72℃延伸90s，36个循环；最后72℃7min。
得到800bp左右的PCR扩增产物。
将800bp左右的PCR扩增产物送去测序，测序引物为728F和Efjr；引物序列为：Efjr:5'-TGYTCNCGRGTYTGNCCRTCYTT-3'。
该PCR产物具有序列表中序列3所示的核苷酸，其中序列3第1-20位为上游引物728F，序列3第376-398位为下游引物Efjr的反向互补序列，该序列所示的片段或序列3第21-375为平菇菌种鉴别DNA条形码片段。
平菇菌种鉴别DNA条形码片段可用于鉴别平菇，具体方法如下：
检测待测样品的基因组中是否含有平菇菌种标准鉴别DNA条形码片段或含有与其同源性在99％以上的片段，若含有，则待测样品是平菇菌种，若不含有，则待测样品不是平菇菌种。
实施例2、鉴别平菇菌种
1、本发明方法特异性检测
分别提取已知品种的平菇菌种、杏鲍菇菌种的基因组DNA。
以各品种的基因组DNA作为模板，用上述引物728F和1567R扩增，得到各品种的PCR产物。
将各品种的PCR产物送去测序，结果如下:
已知品种的平菇菌种的PCR产物的核苷酸序列为序列3(平菇菌种鉴别DNA条形码片段)。
已知品种的杏鲍菇菌种的PCR产物的核苷酸序列为序列4(序列4第1-20位为上游引物728F，序列4第375-397位为下游引物Efjr的反向互补序列)；
已知品种的平菇菌种用本发明方法也鉴别为平菇菌种；
已知品种的杏鲍菇菌种的PCR产物的序列4第21-374位核苷酸与平菇鉴别DNA条形码片段序列3第21-375位核苷酸进行比对，同源性为96.6％，已知品种的杏鲍菇菌种用本发明方法鉴别不为平菇菌种。
2、ITS鉴定与本发明方法比较
分别提取已知品种的小平菇菌种与杏鲍菇菌种的基因组DNA。
以各品种的基因组DNA作为模板，用上述引物ITS1和引物ITS4扩增，得到各品种的PCR产物。
ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’
ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
上述PCR扩增体系为表2：
表2PCR反应体系的组成(25μL)
上述PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃10min。
得到650bp左右的PCR扩增产物。
将650bp左右的PCR扩增产物送去测序，得到小平菇菌种ITS序列(序列5，其中1-19位为引物ITS1，614-633位为引物ITS4反向互补序列)与杏鲍菇菌种ITS序列(序列6，其中1-19位为引物ITS1，613-632位为引物ITS4反向互补序列)。
序列5第20-613位与序列6第20-612位同源性为：98.0％(该同源性为均不含上下游引物的序列的比较)，异质性为2.0％，即小平菇菌种与杏鲍菇菌种ITS序列的异质性为2.0％。而本方法得到的两者同源性为96.6％，异质性为3.4％。灵敏度高于ITS序列。

Claims (9)

1.一种专用DNA条形码在鉴别或辅助鉴别平菇（Pleurotus cornucopiae）菌种中的应用。
所述专用DNA条形码为序列3第21-375位核苷酸所示的DNA片段。
2.检测平菇（Pleurotus cornucopiae）菌种基因组中是否含有权利要求1中所述专用DNA条形码的物质在鉴别平菇（Pleurotus cornucopiae）菌种中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于:所述物质为如下1）或2）：
1）用于扩增所述专用DNA条形码的引物对；
2）含有所述引物对的PCR试剂或试剂盒。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:所述引物对由引物1和引物2组成；所述引物1序列表中序列1所示的单链DNA分子；所述引物2为序列表中序列2所示的单链DNA分子；
所述PCR试剂中，所述引物1和所述引物2的摩尔比为1:1；所述引物1和所述引物2的浓度均为10 μmol/L。
5.一种鉴别或辅助鉴别平菇（Pleurotus cornucopiae）菌种的方法，包括如下步骤：检测待测样品中是否含有权利要求1中所述专用DNA条形码；如果含有，则待测样品为或候选为平菇（Pleurotus cornucopiae）菌种；如果不含有，则待测样品不为或候选不为平菇（Pleurotus cornucopiae）菌种。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述检测待测样品中是否含有权利要求1中所述专用DNA条形码的方法包括如下步骤：
1）用序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成的引物对对待测样品进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
2）测序所述PCR扩增产物，将所述PCR扩增产物的序列与所述DNA片段进行比对，若同源性大于99%，则待测样品中含有所述DNA片段，若同源性小于等于99%，则待测样品中不含有所述DNA片段。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：
所述PCR扩增的模板为待测样品的基因组DNA。
8.检测平菇菌种基因组中是否含有权利要求1中所述专用DNA条形码的物质，其为如下1）或2）：
1）用于扩增所述专用DNA条形码的引物对；
2）含有所述引物对的PCR试剂或试剂盒。
9.根据权利要求8所述的物质，其特征在于：
所述引物对由引物1和引物2组成；所述引物1序列表中序列1所示的单链DNA分子；所述引物2为序列表中序列2所示的单链DNA分子；
所述PCR试剂中，所述引物1和所述引物2的摩尔比为1:1；所述引物1和所述引物2的浓度均为10 μmol/L。
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