CN106811507A - 一种桑黄快速鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种桑黄快速鉴定方法，其中，所述方法包括：提取待检测真菌的基因组DNA；通过PCR对所述基因组DNA的ITS区域进行扩增并获取扩增后PCR产物；对所述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳并观察电泳结果；当所述PCR扩增产物具有DNA长度大致为750bp的条带时，判断所述待检测真菌为桑黄。用PCR特异性的扩增真菌的ITS区域，通过琼脂糖凝胶电泳来检测是否存在750bp左右的条带来进行桑黄鉴定。上述利用分子生物学的方法，从基因层面上对桑黄进行鉴定。其鉴定过程与现有的性状分析方法相比，可靠性及准确性有大幅的提高，无需依赖鉴定人的个人经验。而且，鉴定速度较快，一般在4小时内即可完成整个鉴定流程。

Description

一种桑黄快速鉴定方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于基因鉴定方法的桑黄快速鉴定方法。

背景技术

桑黄(Inonotus Sang Huang)，又名桑耳，桑臣，以寄生于桑树上面而得名。桑黄作为一种珍贵的药用真菌，具有提高机体免疫力，抗肿瘤，抵抗细胞突变，抗菌，抑制肝纤维化，止血活血降血糖、抑菌消炎，治疗癌症、肝炎等作用。大量科学研究发现桑黄有抑制癌细胞生长作用，抗癌率高达96.7％，为目前国际公认的生物抗癌领域中药效最好的药用真菌。桑黄因其极高的保健功效，被誉为“森林黄金”。

桑黄在已经被大家熟知的抗癌菌类中作用是最明显的，人们慢慢了解到桑黄的抗癌原理，深层栽培的技术逐渐成熟，应用前景非常乐观。韩国桑黄的子实体的售价已达到2300美元，相当于非常珍贵的药材的价格了，根据经济学的定价理论，珍贵药材桑黄的药用前景十分明朗，因此桑黄的鉴别对于桑黄的应用有十分重大的意义。

然而目前市场上桑黄种类繁多，很多商家以次充好，甚至鱼目混珠。而在桑黄使用的过程中如果出现了不同种的桑黄错误使用，滥用，会损害到接下来的食品研发或者产品质量等问题。但现有技术中通常使用对不同性状进行分析等的分辨方法，其结果准确性依赖于鉴定人的个人经验，其可靠性及鉴定速度均很有限。

因此，现有技术还有待发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种桑黄快速鉴定方法，旨在解决现有技术中的桑黄鉴定方法可靠性不佳、速度较慢的问题。

为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：

一种桑黄快速鉴定方法，其中，所述方法包括：

提取待检测真菌的基因组DNA；

通过预设的PCR反应条件及特异性引物对，对所述基因组DNA的ITS区域进行PCR扩增；

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；

当所述PCR扩增产物具有DNA长度为750bp左右的条带时，判断所述待检测真菌为桑黄。

所述的桑黄快速鉴定方法，其中，所述PCR的反应条件具体为：

首先、94℃预变性3min；94℃预变性30s；72℃3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，5个循环；

然后94℃变性30s，53℃退火15s，55℃退火，15s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸3min，4℃保存PCR扩增产物。

所述的桑黄快速鉴定方法，其中，所述特异性引物对具体为ITS1通用引物和ITS4通用引物。

所述的桑黄快速鉴定方法，其中，在“提取待检测真菌的基因组DNA”的步骤之后，所述方法还包括：

检测提取的待检测真菌的基因组DNA的浓度及纯度；选择使用符合预设实验要求的的基因组DNA进行PCR扩增。

所述的桑黄快速鉴定方法，其中，所述“提取待检测真菌的基因组DNA”的步骤具体包括：获取所述待检测真菌的菌丝体；将所述菌丝体置于研钵中，加入液氮研磨至粉末状；使用真菌DNA提取试剂盒提取所述粉末状菌丝体的基因组DNA。

有益效果：本发明提供的一种桑黄快速鉴定方法，利用PCR特异性的扩增真菌的ITS区域，通过琼脂糖凝胶电泳来检测是否存在为750bp左右的条带来进行桑黄鉴定。上述利用分子生物学的方法，从基因层面上对桑黄进行鉴定。其鉴定过程与现有的性状分析方法相比，可靠性及准确性有大幅的提高，无需依赖鉴定人的个人经验。而且，鉴定速度较快，一般在4小时内即可完成整个鉴定流程。

附图说明

图1为本发明具体实施例的一种桑黄快速鉴定方法的方法流程图。

图2为本发明具体实施例的桑黄快速鉴定方法的电泳结果图。

图3为本发明具体实施例的桑黄快速鉴定方法的提取待检测真菌的基因组DNA方法的方法流程图。

具体实施方式

本发明提供一种桑黄快速鉴定方法。为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

如图1所示，为本发明具体实施例的一种桑黄快速鉴定方法。所述方法包括：

S1、提取待检测真菌的基因组DNA。

S2、通过PCR对所述基因组DNA的ITS区域进行扩增并获取扩增后PCR产物。

PGR是指聚合酶链式反应。其利用DNA在体外95℃高温时变性，接螺旋形成单链(通常称为“变性”)，低温(经常是60℃左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合(通常称为“退火”)，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72℃左右)，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5′-3′)的方向合成互补链(通常称为“延伸”)。

在PCR过程中，通过选择合适的引物即可特异性的大量扩增模板上的目标区域。亦即选择相应的特异性引物对真菌的ITS区域进行特异性扩增。

S3、对所述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳并观察电泳结果。

S4、当所述PCR扩增产物具有DNA长度为750bp左右的特异性条带时，判断所述待检测真菌为桑黄。亦即，上述用于判断的特异性条带并非精确的为750bp。其具体的长度会由于实际情况的影响存在些微的变化(例如PCR、不同桑黄菌种等)，但总是在750bp左右的一个大致范围内。

在本技术领域中，上述750bp左右的描述是清楚而且常用的，本领域技术人员可以依据电泳图清晰，明确的判断是否存在有750bp左右的特异性条带。若待检测真菌的PCR扩增产物没有出现750bp左右的特异性条带时，可以判断其并非桑黄。

经过对多种不同真菌进行对比实验后可以得出，桑黄品种会在750bp左右出现特异性条带，而其他品种的真菌并不具备这一特点。因此，可以以此作为桑黄分子学鉴定的特异性条带位点。

具体的，在所述步骤S1之后，所述方法还包括如下步骤：首先，检测提取的待检测真菌的基因组DNA的浓度及纯度。然后，依据预设的实验要求，筛选符合实验要求的基因组DNA进行PCR扩增。亦即选择较为合适的DNA浓度及纯度的基因组DNA作为PCR扩增的模板以保证后续的PCR扩增效果及电泳结果。

更具体的，如图3所示，所述“提取待检测真菌的基因组DNA”的步骤具体包括：

S11、用液氮研磨待检测真菌的菌丝体。

S12、使用真菌DNA提取试剂盒提取待检测真菌的基因组DNA。以此为模板，通过PCR的方式特异性的扩增ITS区域的DNA。

实施例1

采用0mega的真菌基因组DNA提取试剂盒提取待检测真菌的基因组DNA的具体实施例：

其具体步骤如下：

A1、刮取适量的菌丝体，置于小研钵中，加入适量液氮，研磨至粉末状。

A2、收集研磨的粉末100-200毫克于EP管中，并加入600μL FG1(试剂盒中的溶液编号，具体成分组成及作用可参见试剂盒说明书)

A3、将装有混合体的EP管在65℃的水浴锅中放置10分钟，期间不间断的上下翻转EP管，保证其受热均匀。

A4、水浴结束之后，向EP管中加入140μLFG2，涡旋，直至没有固体可见物为止，在12000rpm下离心10分钟。

A5、轻移上清液至新的EP管中，并向其中加入0.7倍体积的异丙醇。

A6、将步骤A5所得的溶液立即在12000rpm下离心2分钟。

A7、将上清液倾去，向沉淀中加入300μL预热过的65℃的去离子水，再次涡旋至固体不可见，随后加入4μL的RNase，并混合。

A8、向上述溶液中加入150μL的FG3以及300μL的无水乙醇，涡旋。

A9、将涡旋后的溶液上柱，在12000rpm下离心1分钟。

A10、将柱子上新的收集管，加入700μL稀释过的wash buffer(洗涤缓冲液)，12000rpm离心1分钟。并将步骤A10重复执行一次。

A11、将空管在12000rpm下离心2分钟。

A12、转移柱子至新的EP管中，向柱子中加入100μL65℃的Elution buffer(洗脱缓冲液)，室温静置2-3分钟后，在12000rpm下离心1分钟。并将步骤A12重复执行一次。

实施例2

PCR的反应体系及扩增程序的具体实施例：

采用25μL反应体系，所述反应体系包括：

其中，forward primer表示正向引物，具体为ITS1通用引物，reverseprimer表示反向引物，具体为ITS4通用引物。

ITS(Internal Transcribed Spacer)是指内转录间隔区。其为真菌核糖体RNA(rRNA)基因非转录区的一部分，其基因具有非常高的保守性，在进化过程中承受的自然选择压力非常小，能够容忍更多的变异，在真核生物中具有极为广泛的序列多态性。

PCR扩增程序：

94℃预变性3min；然后94℃变性40s，55℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

将PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测PCR的效果。

实施例3

其他步骤与实施例2相同，仅将PCR扩增程序修改为：

94℃预变性3min；94℃预变性30s；72℃3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，5个循环。

然后94℃变性30s，53℃退火15s，55℃退火，15s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸3min，4℃保存。

其中，循环是指重复进行步骤的次数。

由于ITS区域属于高度保守序列，其使用一般的，常用的PCR扩增方法的扩增效果并不能有效的把各种类型的真菌的ITS片段特异性扩增，容易造成误检或者错检。

而使用本实施例所述的PCR扩增程序，能够有效的将ITS片段扩增。与实施例2所使用的一般的PCR扩增程序相比，能够扩增出多种不同种类样品的ITS片段，实现更广泛及更准确的检测。

如图2所示，为本发明实施例3的1％琼脂糖凝胶电泳结果示意图。其中，M表示Marker、SG：桑黄(Inonotus sang huang品种)、PL：桑黄(Inonotus baumii品种)、CE：侧耳、JCH：金蝉花、LZ：灵芝、LZJ：裂褶菌、YC：蛹虫草、G4：内生镰刀菌、G12：黄绿僵菌、L1：附球霉。所述1％琼脂糖凝胶电泳的具体操作过程为本领域技术人员所熟知，在此不作赘述。

在进行电泳检测后，还可以进一步对电泳片段进行DNA测序从而最终确认检测效果。具体的，本发明实施例3中各样品的DNA测序结果如下：

SG：桑黄(Inonotus sang huang品种)：

TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATCGAGTTTTGAAAGCGAGACCTGCTGCTGGTGCGAAATCGCGCATGTGCACGGTCTTCGCGCTCAAATCCAACTCAAACCCCTGTGCACCTTATATATCGCGAGTCGAAGTTAGTAGCCTGAGGTCTTGTAAGTAATTAGTAGAAGGGCGAAAGCGAGTCTTGCTCGTTAGGTAGCCTTTCGAAAATGAAAGCGAGTGCGTCGGGTGAAGACTTCGGCTTGTCGTTACAAAACACCTTATATTGTCTTTGTGAATGTAATGCTCCTTGTGGGCGAAAATAAATACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGTTTATCTCAAACCGCTCGTCTTTCTTAATTGAAGGGCTTGAGGTTTGGACTTGGAGGTTTACTGCTGGCGCCTTTCGAGGGGTCGGCTCCTCTTAAATACATTAGCTGGGCTTTGGCTCGCGTTTACGGTGTAATAGTTGATTCCATTCACCAACGAGCGCTTGCCTGACGAGCTTGCTTCTAGCCGTCCGCGTCGTCGGACAAGGAGTCACCTCCTTCTTGACACCTTTGACCTCAAATCAGGTAGGATTACCCGCCGAACTTAAGCATATCAATAAGCCGGAGGA。

PL：桑黄(Inonotus baumii品种)：

TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATCGAGTTTTGAAAGCGAGATTTGCTGCTGGCGCGAATGAATTTTTGCGCATGTGCACGGCCTTCGCGCTCAAATCCAACTCTCAAACCCCCTGTGCACCTTATCATATCGCGAGTCGAAGTTAGTAGTCTGAGGTCTGTCTTGTAAGTAATGAGTAGAAGGGCGAAAGCGAGCGAGTGTTGCTCGTTAGGTAACCCTTCGAAAATGAAAGCGAGCGGGAGTGCGTCGGGTGAAGACTTGGGCTTGTTGTTACAAACCCCCCCCTTATATTGTCTTTGTGAATGTAATGCTCCTCGTGGGCGAAAATCAATACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGTTTATCTCAAACCGCTCGTCTTTCTTTAATTGAAGGGCTTGAGGTTTGGACTTGGAGGTTTACTGCTGGCCGCCTTTCGAAGGGGGTCGGCTCCTCTTAAATACATTAGCTGGGCTTTGGCTCGCGCTTACGGTGTAATAGTTGATTCCGTTCACCAACGAGCGCTTGCCTAACGAGCTTGCTTCTAACGGTCCGCTTGGTCGGACAAGGAGTTGTTGTTACCTCCTTTTTCTTGACACCTTTGACCTCAAATCAGGTAGGATTACCCGCCGAACTTAAGCATATCAATAAGCCGGA

CE：侧耳：

TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAATGAATTCACTATGGAGTTGTTGCTGGCCTCTAGGGGCATGTGCACGCTTCACTAGTCTTTCAACCACCTGTGAACTTTTGATAGATCTGTGAAGTCGTCTTTCAAGTCGTCAGACTTGGTTTGCTGGGATTTAAACGTCTCGGTGTGACAACGCAGTCTATTTACTTAACACACCCCAAATGTATGTCTACGAATGTCATTTAATGGGCCTTGTGCCTTTAAACCATAATACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCATTAAATTCTCAAACTCACTTTGGTTTTTTCCAATTGTGATGTTTGGATTGTTGGGGGCTGCTGGCCTTGACAGGTCGGCTCCTCTTAAATGCATTAGCAGGACTTCTCATTGCCTCTGCGCATGATGTGATAATTATCACTCATCAATAGCACGCATGAATAGAGTCCAGCTCTCTAATCGTCCGCAAGGACAATTTGACAATTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCCGGA。

LZJ：裂褶菌：

TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGAATCAAACAAGTTCATCTTGTTCTGATCCTGTGCACCTTATGTAGTCCCAAAGCCTTCACGGGCGGCGGTTGACTACGTCTACCTCACACCTTAAAGTATGTTAACGAATGTAATCATGGTCTTGACAGACCCTAAAAAGTTAATACAACTTTCGACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCCCTTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCATTAAATACCATCAACCCTCTTTTGACTTCGGTCTCGAGAGTGGCTTGGAAGTGGAGGTATGCTGGAGCCTAACGGAGCCAGCTCCTCTTAAATGTATTAGCGGATTTCCCTTGCGGGATCGCGTCTCCGATGTGATAATTTCTACGTCGTTGACCATCTCGGGGCTGACCTAATCAGTTTCAATAGGAGTCTGCTTCTAACCGTCTCTTGACCGAGACTAGCGACTTGTGCGCTAACTTTTGACTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCCGGA。

G4：内生镰刀菌：

TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCCTGTGAACATACCTATACGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCGCCCCGTAAAACGGGACGGCCCGCCGCAGGATCCACAAACCCTGAATTTTTATTGTAACTTCTGAGTCTAAAAAACAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCCCCCGGGTTTGGTGTTGGGGATCGGGAATCGCGGTTCTGCCGCCTCCCGGCCCCGAAATCTAGTGGCGGTCTCGCTGCAGCCTCCATTGCGTAGTAGCTAACACCTCGCAACTGGAACGCGGCGCGGCCAAGCCGTTAAACCCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCCGGA。

G12：黄绿僵菌

TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAAACTCCCAAACCCAATGTGAACATACCTATCTTACTGTTGCTTCCCCGCCGTGGGTAAAACCGCTGCGGGGGAGGACACAGCCACAAACTCTGTAATTTACTACTGTAACTGTCTGAGTAAACATCATTTATAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGGATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGTCCCCGTGGACTTGGTGTTGGGGACCGGAACTATATTTGGGAGGTGAAACCGGGCACTTCAGCCAAAATCAATTGTGAGGTTGAAGGTACTATTCTTACGCGTCCAATAGGTTGATACACTATTTTAACGACTTAAGTTTGGATCTTGCACCACCCCCGATTTGGAACATGGGCACAACTTTGAACACTGGTTACCGCCAATCTGAACATTGCAGAATTATAATGAAACTAGGATTTTTTTTTTTTTTGAGCGACCCCTGCCCCCGTCCTTAACTAGAGGGAAAGCTTTTTCGTGCGCGAGTCCCTGTCCAGACACGGTCAGGGCAGTGATTGAACCGCAAATGCTCAGATGCACAGCCCCCGCATGGAAAAACGGTTGATGTATCCTCACTATATATGAAATAATCCCCCCGTTCGTATTCCCTGTTGTTAAAATCTGCACAGCCAAAATGGATTAATGGATATGTGCATCGTGGGAAAAATTGGTAGCCCTCGCGACTTCCTTAATATTTAAATTCCCC。

L1：附球霉：

TCCGGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAAGAGTGTAAAAATGTACTTTTGGACGTCGTCGTTATGAGTGCAAAGCGCGAGATGTACTGCGCTCCGAAATCAATACGCCGGCTGCCAATTGTTTTAAGGCGAGTCTACACGCAGAGGCGAGACAAACACCCAACACCAAGCAGAGCTTGAAGGTACAAATGACGCTCGAACAGGCATGTCCCATGGAATACCAAGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACACTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTGTAACTATTATGTTTTTTCAGACGCTGATTGCAACTGCAAAGGGTTTGAATGTTGTCCAATCGGCGGGCGGACCCGCCGAGGAAACGAAGGTACTCAAAAGACATGGGTAAGAGGTAGCAGACCGAAGTCTACAAACTCTAGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGA。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (5)

1.一种桑黄快速鉴定方法，其特征在于，所述方法包括：

提取待检测真菌的基因组DNA；

通过预设的PCR反应条件及特异性引物对，对所述基因组DNA的ITS区域进行PCR扩增；

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；

当所述PCR扩增产物具有DNA长度为750bp左右的条带时，判断所述待检测真菌为桑黄。

2.根据权利要求1所述的桑黄快速鉴定方法，其特征在于，所述PCR的反应条件具体为：

首先、94℃预变性3min；94℃预变性30s；72℃3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，5个循环；

然后94℃变性30s，53℃退火15s，55℃退火，15s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸3min，4℃保存PCR扩增产物。

3.根据权利要求1所述的桑黄快速鉴定方法，其特征在于，所述特异性引物对具体为ITS1通用引物和ITS4通用引物。

4.根据权利要求1所述的桑黄快速鉴定方法，其特征在于，在“提取待检测真菌的基因组DNA”的步骤之后，所述方法还包括：

检测提取的待检测真菌的基因组DNA的浓度及纯度；选择使用符合预设实验要求的的基因组DNA进行PCR扩增。

5.根据权利要求1所述的桑黄快速鉴定方法，其特征在于，所述“提取待检测真菌的基因组DNA”的步骤具体包括：

获取所述待检测真菌的菌丝体；

将所述菌丝体置于研钵中，加入液氮研磨至粉末状；

使用真菌DNA提取试剂盒提取所述粉末状菌丝体的基因组DNA。