CN101514364B

CN101514364B - 松杉灵芝菌株或其子实体分子标记及其获得方法与应用

Info

Publication number: CN101514364B
Application number: CN200810204550A
Authority: CN
Inventors: 唐传红; 张劲松
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2008-12-12
Filing date: 2008-12-12
Publication date: 2012-09-05
Anticipated expiration: 2028-12-12
Also published as: CN101514364A

Abstract

本发明涉及一种松杉灵芝菌株或其子实体分子标记及其获得方法与应用，该标记是PCR扩增后为323bp的特异DNA片断，其PCR扩增引物对序列为5'-GTTCAGTTTCCGTGCCA-3’和5’-CGTCTTCCGACAGGTTA-3，获得方法：1)菌株或子实体基因组DNA的提取；2)获得特异DNA片段；3)获得特异PCR扩增引物；4)用特异PCR扩增引物对对松杉灵芝菌株或子实体的基因组DNA进行扩增；5)琼脂糖凝胶电泳检测。应用：用于快速鉴定和检测松杉灵芝菌株及市售灵芝类产品的真伪。本方法与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高的优点。

Description

松杉灵芝菌株或其子实体分子标记及其获得方法与应用

技术领域

本发明属灵芝菌株鉴别领域，特别是涉及一种松杉灵芝菌株或其子实体分子标记及其获得方法与应用。

背景技术

据《神农本草经》和《本草纲目》记载，灵芝有益心气、养心生血、助心充脉、安神、益脾益肺、强筋骨、利关节、治耳聋等功效。近代研究发现灵芝不但对人类三大死因的癌症、脑溢血和心脏病有疗效，还对胃肠、肝脏、肾脏、白血病、神经衰弱、慢性支气管炎、哮喘、过敏等疾病有显著疗效。林志彬认为松杉灵芝具有增强脾脏NK细胞活性、促血浆IFN因子生成及保肝、抗肿瘤的作用。卫生部发布可用于保健食品的真菌菌种名单目录中，公布了灵芝3个种，即赤芝(G.lucidum)、紫芝(G.sinense)和松杉灵芝(G.tsugae)。

随着对灵芝的生物学功效的不断了解，以其为原料开发的产品越来越多，销售量也越来越大，灵芝原料的质量越来越受到重视。近年来，随着灵芝各种产品的商品化，大大带动了中国灵芝栽培生产的迅速发展，同时灵芝的种质资源也在不断扩大，但是由于我国食药用菌品种登记制度尚未完善，因此灵芝的生产用菌种比较混乱，同种异名和异名同种的现象在栽培生产上非常普遍，这不仅给菌种的管理带来了难度，也给以灵芝为原料的保健品及药品等的相关产业造成了一定的经济损失。现在因为菌种问题常常造成我国灵芝产品质量难以稳定的局面，也严重地制约了我国灵芝产品走出国门，走向国际市场的步伐。

传统的分类鉴定主要依据子实体的形态学特征来进行，包括担孢子的大小和子实体真皮菌丝的形态特征，但是子实体的许多形态学特征往往随着生长条件的不同而发生变化，而且许多鉴别性特征经常是几个种所共有的，这给传统的分类学带来了很大的困难，仅仅依据形态学特征进行菌种鉴定不是很可靠。因此，寻找可靠的鉴定手段，对灵芝产业的进一步发展尤为重要。

近年来，国内对栽培灵芝菌株的分类研究也越来越多，主要是集中在应用拮抗实验、RAPD(Random amplified polymorphic DNA，随机扩增的多态性DNA)分析及同工酶分析技术方面。

张松等(1995)通过对4株灵芝菌株的醋酶同工酶酶谱的分析发现，供试的四个菌株存在5条相同的酶带，说明它们具有灵芝的某些共同的遗传特征，在其代谢过程中具有某些相似的生理活动，但各菌株在酶带数目、Rf值及含量百分比上存在差异，均具有自己的特征酶带，同时发现子实体形态学特征相似的，酯酶同工酶酶谱也相似，亲缘关系比较近，这些说醋酶同工酶分析对于灵芝的分类鉴定有一定的价值。

赵明文等(2003)利用RAPD技术对生产中常用的灵芝属8个菌株的亲缘关系进行了分析。根据UPGMA构建的树状图将8个菌株在较低的相似水平上分成3个明显不同的组：第1组包括黑芝(Ganoderma atrum)、松杉灵芝(Ganoderma tsugae)、圆芝(Ganodermarotundatum)、灵芝0770(Ganoderma lucidum 0770)和韩国灵芝(Ganodermalucidum HG)；第2组包括密纹灵芝(Ganoderma crebrostriatum)和紫灵芝(Ganodermasinense)；第3组为树舌灵芝(Ganoderma applanaum)。这结果与经典分类结果基本相符，表明RAPD技术可以用来区分生产中一些常用的灵芝种，同时说明灵芝生产用种之间遗传差异较大，可能是造成灵芝产品研究比较混乱的重要原因。

1999年我国签署了《国际植物新品种保护法》，这不仅要求我们尊重其它国家的品种知识产权，同时也要加强保护我们国家自己的品种知识产权，为了建立食用菌新品种登记制度来真正保护我国的品种产权，必须首先建立成熟的品种鉴定技术，为新品种登记奠定基础。

随着分子生物学技术的快速发展，特别是分于标记和基因标记技术的建立与成熟，为发展简便、快速、准确的鉴定技术提供了有效手段。SCAR(Sequence CharacterizedAmplified Region)标记是一种十分稳定的分子标记，在应用上具有迅速、简便、低成本的特点，但目前尚未有对松杉灵芝的SCAR分子标记，以快速鉴定松杉灵芝。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种松杉灵芝菌株或其子实体特异性分子标记及其获得方法与应用，以便对赤芝菌种121进行简便、快速、准确的鉴定和检测。

本发明的一种松杉灵芝菌株或其子实体特异性分子标记，是一种基因SCAR分子标记，是PCR扩增后为323bp的特异DNA片断，其PCR扩增引物对序列见序列表SEQ.ID.NO1-2。

本发明的一种松杉灵芝菌株或其子实体特异性分子标记的获得方法，包括下列步骤：

I.菌株或子实体基因组DNA的提取

(1)菌株基因组DNA的提取

将4-6℃的松杉灵芝菌种转接到PDA斜面上，26-28℃培养活化，5-7天后转接到马铃薯葡萄糖培养液中，26-28振荡培养10-14天，收集菌丝，用LETS法提取基因组DNA将4-6℃的赤芝菌种转接到PDA斜面上，26-28℃培养活化，5-7天后转接到马铃薯葡萄糖培养液中，26-28振荡培养10-14天，收集菌丝，用LETS法提取基因组DNA，DNA稀释至10-20ng/μL，保存备用；

(2)子实体基因组DNA的提取

将子实体1-2g剪碎，用体积比为1∶2-3的95％(V/V)酒精和0.5mol/L EDTA·Na2混合物浸泡处理20-30小时，过滤，水冲洗，研磨粉碎后，加入800-1000μL pH 8.0CNETS溶液分装于2ml离心管中，60-70℃保温1-3小时，10000-12000g离心2-5min后，取上清，按照酚/氯仿法提取子实体基因组DNA，其中的CNETS溶液组成是1％(m/V)CTAB、1mol/L NaCl、10m mol/L EDTA、20m mol/L Tris-Cl、1％(m/V)SDS；

II.松杉灵芝菌株或子实体特异DNA片段的获得

采用PCR法，其中引物对序列见序列表SEQ.ID.NO3-4，得松杉灵芝菌株或子实体特异DNA片段；

III.特异性PCR引物的获得

以得到的特异性DNA片段的序列为基础，设计特异PCR扩增引物，引物对的序列见序列表SEQ.ID.NO1-2；

IV.用特异PCR扩增引物对对松杉灵芝菌株或子实体的基因组DNA进行PCR扩增

V.琼脂糖凝胶电泳检测。

所述步骤I(1)中所述的LETS提取法：

①将冻干的菌丝大约20-30mg置于预冷的无菌研钵中迅速研磨成细粉，后迅速向研钵中加入1000ml已配置好的LETS缓冲液，分装于2个1.5ml的离心管中；

②向每个管中加入600-800μL的苯酚∶氯仿异∶戊醇(缩写为PCI)(比例为25∶24∶1)上下颠倒，充分混匀，4-10℃ 16000g离心8-15分钟；

③轻轻吸取上清于新的离心管中，加入500μL的PCI，4℃ 16000g离心8-15分钟；

④重复步骤③，直到两相的界面没有杂质为止；

⑤取上清，向上清液中加入2倍体积的已20℃预冷的无水乙醇或95％乙醇，轻轻混匀，置于-20℃冰箱中静置5-10分钟；

⑥取出，4℃ 16000g离心10-15分钟；

⑦倒去上清，再向管中加入500μL预冷的70％(V/V)乙醇，用指头轻轻敲打沉淀使其溶解，静置一会儿，4℃ 16000g离心10分钟；

⑧重复步骤⑦1次；

⑨倒去上清，待管中酒精挥发后，加入适量体积的TE缓冲液(pH8.0)，按100mlTE缓冲液加入2μL 1mg/ml的DNase-free RNase；37℃温浴1-2个小时；

⑩将获得的基因组DNA经过ITS-PCR扩增后再通过1.0％琼脂糖凝胶电泳、检测，以确定其质量是否满足试验需要。

所述步骤I(2)中所述的酚/氯仿提取法，步骤包括：

①将已经预处理过得子实体置于预冷的无菌研钵中迅速研磨成细粉，后迅速向研钵中加入1000ml已配制定好的CNETS缓冲液，分装于2个2.0ml的离心管中；

②向每个离心管中加入600-800μL饱和苯酚混匀，12000-14000g离心10-15min；

③取上清，重复重复步骤②1-2次；

④取上清，加入600-800μL 1∶1(V/V)苯酚氯仿混合物混匀，12000-14000g离心10-15min；

⑤取上清，加入500-600μL 49∶1(V/V)氯仿异戊醇混匀，12000-14000g离心10-15min；

⑥去上清，向沉淀中加入70％(V/V)的酒精，振荡；10000-12000g离心5-15min；

⑦倒去上清，待管中酒精挥发后，加入20-30μL的TE缓冲液(pH8.0)，按100mlTE缓冲液加入2μL 1mg/ml的DNase-free RNase；37℃温浴1-2个小时；

⑧将获得的基因组DNA经过ITS-PCR扩增后再通过1.0％琼脂糖凝胶电泳、检测，以确定其质量是否满足试验需要。

所述步骤II中，PCR法扩增反应体系(25μl)：10×PCR buffer(Promega)2.5μL，25mmol/LMgCl2(Promega)2.0μL，10mmol/L dNTPs 0.5μL，引物SEQ.ID.NO3和SEQ.ID.NO4(20μmol/L)0.5μL，Taq酶(5U/μL)(Promega)0.25μL，DNA模板(10-20ng/μL)1.0μL，加无菌双蒸水补足25μl，PCR反应条件：94℃ 2min；94℃ 15s，62℃30s，72℃ 1min，35个循环；72℃ 5min，松杉灵芝菌株或子实体特异DNA片段，大小为655bp，其序列见序列表SEQ.ID.NO5。

所述步骤IV中，PCR扩增的反应体系总体积为25μL：10×PCR buffer 2.5μL，25mmol/L MgCl22.0μL，10mmol/L dNTP 0.5μL，20μmol/L特异引物对各0.5μL，5U/μL Taq酶0.25μL，10-20ng/μL DNA模板1.0μL，加无菌双蒸水补足25μL；PCR反应条件为：94℃ 2min；94℃ 15s，64℃ 30s，72℃ 1min，30个循环；72℃ 5min。

本发明的松杉灵芝菌株或子实体的特异分子标记应用于快速鉴定和检测松杉灵芝菌株及市售灵芝类产品的真伪。

有益效果：

(1)只有松杉灵芝能PCR扩增出分子量为323bp的专一扩增条带，而灵芝属的其它菌种均未出现该特异性片断；

(2)采用这种特异性分子标记进行检测，与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高的优点，该检测所需时间只需要2-3天，而常规的拮抗试验所需时间至少需要两周时间，出菇试验则需要5-6个月的时间。

附图说明

图1是ITS-PCR扩增产物电泳图；

图2是松杉灵芝特异引物对PCR扩增产物电泳图。

其中，生产用种(136支)：1-27，29，30，32-38，40-42，44-49，52，54，59，60，62，63，65-86，88-101，103，104，106-109，111-113，115-117，120，146，149-154，157-189；来自ATCC(24支)：121-126，128-145；

标号中间有断开的，这是因为在菌种保藏过程中失去活力了，但并未因此改变其他菌株的编号。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

菌种：收集到来自国内的140支灵芝属生产用菌种以及来自ATCC 24支共计164支菌株，它们分属于赤芝、紫芝、树舌、松杉灵芝、树舌、密纹薄芝、紫光灵芝、近拟鹿角灵芝、黄灵芝以及无柄灵芝等10余个种。对它们的基因组DNA和松杉灵芝134号的子实体基因组(编号190)DNA共计165个样品进行PCR扩增。

一、基因组DNA的提取

1.菌丝培养和基因组DNA的提取

将4-6℃的松杉灵芝菌种转接到PDA斜面上，26-28℃培养活化，5-7天后转接到马铃薯葡萄糖培养液中，26-28振荡培养10-14天，收集菌丝，用LETS法提取基因组DNA；DNA稀释至10-20ng/μL，-20℃保存。

2.子实体基因组DNA的提取

①将子实体1-2g剪碎，用体积比为1∶2-3的95％(V/V)酒精和0.5mol/L EDTANa₂混合物浸泡处理20-30小时，过滤；

②过滤后用灭过菌的双蒸水冲洗，放在灭过菌的研钵中用液氮处理并进行研磨；

③向每个离心管中加入600-800μL饱和苯酚混匀，12000-14000g离心10-15min；

④取上清，重复重复步骤②1-2次；

⑤取上清，加入600-800μL 1∶1(V/V)苯酚氯仿混合物混匀，12000-14000g离心10-15min；

⑥取上清，加入500-600μL 49∶1(V/V)氯仿异戊醇混匀，12000-14000g离心10-15min；

⑦去上清，向沉淀中加入70％(V/V)的酒精，振荡；10000-12000g离心5-15min；

⑧倒去上清，待管中酒精挥发后，加入20-30μL的TE缓冲液(pH8.0)，按100mlTE缓冲液加入2μL 1mg/ml的DNase-free RNase；37℃温浴1-2个小时；

⑨DNA稀释至10-20ng/μL，-20℃保存。

二、特异性PCR扩增

10×PCR buffer 2.5μL，25mmol/L MgCl₂ 1.5μL，10mmol/L dNTP 0.5μL，20μmol/L特异引物对各0.5μL，5U/μL Taq酶0.20μL，10-20ng/μL DNA模板2.0μL，加无菌双蒸水补足25μl；PCR反应条件为94℃ 3min；94℃ 1min，62℃ 50s，72℃ 1min，30个循环；72℃ 10min。

三、琼脂糖凝胶电泳检测

取特异性PCR扩增产物6-8μL，与0.5μL加样缓冲液混匀，点样于1.2-1.5％的琼脂糖凝胶上，于1.0×TAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用溴化乙锭溶液染色5-10min，自来水冲洗后在凝胶成像仪上照相。

结果发现，在这些样品中只有松杉灵芝能扩增出分子量为323bp的专一扩增条带，而灵芝属的其它菌种均未出现该特异性片断。

说明书核苷酸和氨基酸序列表

SEQUENCE LISTING

<110>上海市农业科学院

<120>松杉灵芝菌株或其子实体分子标记及其获得方法与应用

<130>1

<160>5

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>17

<212>DNA

<213>PCR扩增引物1

<400>1

gttcagtttc cgtgcca 17

<210>2

<211>17

<212>DNA

<213>PCR扩增引物2

<400>2

cgtcttccga caggtta 17

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>PCR扩增引物3

<400>3

tcccacgact gttgaaatac g 21

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>PCR扩增引物4

<400>4

tgttgtgagc ttcgaccat 19

<210>5

<211>655

<212>DNA

<213>松杉灵芝菌株或其子实体特异DNA片段

<400>5

gcctctgtca atgtcataag gtgcatgcag gcagcgagtg gatcgtcctc gagcgtgagg 60

gtgatctgca tgaacgcaat ctcttcacgt aagagccagt cctcacttcc gccctggtcg 120

acagcagggt ctggttcagt ttccgtgcca tcgacaattt tccagagttt gcgctgcatg 180

aggatgtgtt ggattcggaa tttccatgtt gtatagtttg agctgtcgtc cttgagaaaa 240

gagacgtcgt acagacgatt ggaaaggcta ggcactgagg cggccattct ggggagtggg 300

accgtgtgag ccatcaggga agaagtgagg aagggacact gaaacaaatg aatagagttt 360

aacgagctgt gagcgctttg gaagcgtagt gtgcatagaa tgaatgttcc tgggtgctag 420

tttgcgagca cggggctcat aacctgtcgg aagacgtggg gcagtggcct agcgggacac 480

ggactcagtc tggtgcacgg agtgacaaca gctgaggaaa gacgagcagg aaaatgtgtc 540

aagagggagc atcggcgata taaacagaac caaacaagtc gtcggcgcct actatgtagt 600

acgtccgtat ccgatgaacg tacaactaac tatcgtattt caacagtcgt gggaa 655

Claims

1.一种松杉灵芝菌株或其子实体特异性分子标记，其特征在于：该标记是一种基因SCAR分子标记，其PCR扩增引物对序列见序列表SEQ.ID.NO1-2。

2.一种松杉灵芝菌株或其子实体特异性分子标记的获得方法，包括下列步骤：

I.菌株或子实体基因组DNA的提取

(1)菌株基因组DNA的提取

(2)子实体基因组DNA的提取

将子实体1-2g剪碎，用体积比为1∶2-3的95％V/V酒精和0.5mol/L EDTA·Na₂混合物浸泡处理20-30小时，过滤，水冲洗，研磨粉碎后，加入800-1000μL pH 8.0CNETS溶液分装于2ml离心管中，60-70℃保温1-3小时，10000-12000g离心2-5min后，取上清，按照酚/氯仿法提取子实体基因组DNA，其中的CNETS溶液组成是1％m/VCTAB、1mol/LNaCl、10m mol/L EDTA、20m mol/L Tris-Cl、1％m/VSDS；

II.松杉灵芝菌株或子实体特异DNA片段的获得

III.特异性PCR引物的获得

V.琼脂糖凝胶电泳检测。

3.根据权利要求2所述的松杉灵芝菌株或其子实体特异性分子标记的获得方法，其特征在于：所述步骤I(1)中所述的LETS提取法：

②向每个管中加入600-800μL的苯酚∶氯仿异∶戊醇PCI比例为25∶24∶1上下颠倒，充分混匀，4-10℃16000g离心8-15分钟；

④重复步骤③，直到两相的界面没有杂质为止；

⑤取上清，向上清液中加入2倍体积的已-20℃预冷的无水乙醇或95％乙醇，轻轻混匀，置于-20℃冰箱中静置5-10分钟；

⑥取出，4℃16000g离心10-15分钟；

⑦倒去上清，再向管中加入500μL预冷的70％V/V乙醇，用指头轻轻敲打沉淀使其溶解，静置一会儿，4℃16000g离心10分钟；

⑧重复步骤⑦1次；

⑨倒去上清，待管中酒精挥发后，加入适量体积的TE缓冲液pH8.0，按100mlTE缓冲液加入2μL 1mg/ml的DNase-free RNase；37℃温浴1-2个小时；

4.根据权利要求2所述的松杉灵芝菌株或其子实体的特异性分子标记的获得方法，其特征在于：所述步骤I(2)中所述的酚/氯仿提取法，步骤包括：

③取上清，重复重复步骤②1-2次；

④取上清，加入600-800μL 1∶1V/V苯酚氯仿混合物混匀，12000-14000g离心10-15min；

⑤取上清，加入500-600μL 49∶1V/V氯仿异戊醇混匀，12000-14000g离心10-15min；

⑥去上清，向沉淀中加入70％V/V的酒精，振荡；10000-12000g离心5-15min；

⑦倒去上清，待管中酒精挥发后，加入20-30μL的TE缓冲液pH8.0，按100mlTE缓冲液加入2μL 1mg/ml的DNase-free RNase；37℃温浴1-2个小时；

5.根据权利要求2所述的松杉灵芝菌株或其子实体特异性分子标记的获得方法，其特征在于：所述步骤II中，PCR法扩增反应体系25μl：10×PCR buffer Promega2.5μL，25mmol/LMgCl₂ Promega2.0μL，10mmol/L dNTPs 0.5μL，引物SEQ.ID.NO3和SEQ.ID.NO420μmol/L 0.5μL，Taq酶5U/μL Promega 0.25μL，DNA模板10-20ng/μL 1.0μL，加无菌双蒸水补足25μl，PCR反应条件：94℃ 2min；94℃ 15s，62℃30s，72℃ 1min，35个循环；72℃ 5min，松杉灵芝菌株或子实体特异DNA片段，大小为655bp，其序列见序列表SEQ.ID.NO5。

6.根据权利要求2所述的松杉灵芝菌株或其子实体特异性分子标记的获得方法，其特征在于：所述步骤IV中，PCR扩增的反应体系总体积为25μL：10×PCR buffer 2.5μL，25mmol/L MgCl₂ 2.0μL，10mmol/L dNTP 0.5μL，20μmol/L特异引物对各0.5μL，5U/μL Taq酶0.25μL，10-20ng/μL DNA模板1.0μL，加无菌双蒸水补足25μL；PCR反应条件为：94℃ 2min；94℃ 15s，64℃ 30s，72℃ 1min，30个循环；72℃ 5min。

7.根据权利要求2所述的松杉灵芝菌株或其子实体的特异性分子标记的获得方法，其特征在于：所述步骤V中，琼脂糖凝胶电泳检测的条件是PCR扩增产物6-8μL，与0.5μL加样缓冲液混匀，于1.2-1.5％的琼脂糖凝胶上，在1.0×TAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳后，用溴化乙锭溶液染色5-10min，凝胶成像仪上照相。

8.松杉灵芝菌株或其子实体的特异分子标记应用于快速鉴定和检测松杉灵芝菌株及市售松杉灵芝类产品的真伪。