CN107164488A - 一种用于鉴定白肉灵芝的引物对及其应用 - Google Patents
一种用于鉴定白肉灵芝的引物对及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于鉴定白肉灵芝的引物对及其应用，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。(1)本发明所述引物对的特异性良好，仅能扩增出白肉灵芝的特异性条带；(2)本发明所述引物对灵敏度高，能够快速准确鉴定白肉灵芝。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段鉴定中药的方法，具体为一种用于鉴定白肉灵芝的引物对及其应用。
背景技术
灵芝是中国名贵中药材，灵芝在我国已有2000多年的药用历史，被历代医药家视为滋补强壮、扶正固本的神奇珍品，经过大量临床研究，灵芝具有调节免疫、抗肿瘤、保肝解毒、防止心血管系统疾病、抗衰老、抗神经衰弱、降血糖血压和抗过敏等功效。2015版《中国药典》收录灵芝为多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子实体(国家药典委员会，2015)。关于中国目前广泛药用的赤芝，其拉丁学名一直存在争议。药典里用的名称最早是1907年法国真菌学家在我国贵州采集得灵芝标本后鉴定命名的，沿用迄今。但近年来的研究发现，我国药用的赤芝和灵芝模式种存在差异，已于2012年被吴声华等分类学家定名为G.lingzhi。
目前，在民间常做药用的芝类除了药典里的赤芝、紫芝外，还有松杉灵芝、四川灵芝、树舌灵芝、血芝(假芝属内多个种的商品名统称，因新鲜子实体创伤会有血样分泌物流出而得名)等。白肉灵芝是新发现的灵芝属中国特有种，是广东省微生物研究所助理研究员胡慧萍等人于2011年在调查西藏林芝地区的野生食药用菌资源时，采集到的生长在青冈树上的野生灵芝。通常夏秋季散生至群生于青冈树腐木上，靠近树干基部，分布于西藏与四川等西南地区，可药用，目前药材市场上与灵芝混淆使用。
但是近几年，西藏林芝地区在白肉灵芝栽培过程中备受菌种混淆、串种及交叉感染之苦，白肉灵芝菌种相对较弱，从母种到原种再到栽培种的栽培全程均有可能受到其他菌种的侵袭而成批被取代，在菌丝体阶段肉眼是完全无法辨别的，等到出芝观察菌肉才发现种瓜得豆，为时已晚。
发明内容
本发明的目的是：为了克服现有技术的缺陷，获得一种鉴定白肉灵芝的有效方法，为白肉灵芝的大规模生产提供保障，本发明提供了一种用于鉴定白肉灵芝的引物对及其应用。
技术方案：一种用于鉴定白肉灵芝的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQ IDNO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
优选的，所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5’端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
表1引物对及发卡结构序列
| 名称 | 序列(5’-3’) | SEQ ID NO. |
| P1-F | GCAGATCTGCGAAGCGTGCT | 1 |
| P1-R | GCAGAGGAGCCGACCGACAG | 2 |
| P2-F | GTTCAGTTTCCGTGCCA | 3 |
| P2-R | CGTCTTCCGACAGGTTA | 4 |
| P3-F | GTCCCACGACTGTTGAAATACG | 5 |
| P3-R | GTGTTGTGAGCTTCGACCAT | 6 |
| 发卡结构 | CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG | 7 |
所述引物对在制备鉴定白肉灵芝试剂盒中的应用。
优选的，所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
优选的，所述试剂盒鉴定白肉灵芝的步骤包括：
(1)提取白肉灵芝样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释100～1000倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10～100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
优选的，所述白肉灵芝样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
优选的，所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
有益效果：(1)本发明所述引物对的特异性良好，仅能扩增出白肉灵芝的特异性条带；(2)本发明所述引物对灵敏度高，能够快速准确鉴定白肉灵芝。
附图说明
图1是实施例1～3PCR鉴定结果电泳图；
其中M为分子量为2000的Maker；1为实施例1PCR产物鉴定结果；2为实施例2PCR产物鉴定结果；3为实施例3PCR产物鉴定结果。
具体实施方式
实施例1
一种用于鉴定白肉灵芝的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5’端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
所述引物对在制备鉴定白肉灵芝试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
所述试剂盒鉴定白肉灵芝的步骤包括：
(1)提取白肉灵芝样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释1000倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述白肉灵芝样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
实施例2
一种用于鉴定白肉灵芝的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5’端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
所述引物对在制备鉴定白肉灵芝试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
所述试剂盒鉴定白肉灵芝的步骤包括：
(1)提取白肉灵芝样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释600倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释20倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述白肉灵芝样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
实施例3
一种用于鉴定白肉灵芝的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5’端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
所述引物对在制备鉴定白肉灵芝试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
所述试剂盒鉴定白肉灵芝的步骤包括：
(1)提取白肉灵芝样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释100倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述白肉灵芝样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
如图1所示，将实施例1～3的扩增产物进行电泳检测，条带清晰可见，产物单一。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州市李良济健康产业有限公司
<120> 一种用于鉴定白肉灵芝的引物对及其应用
<130>
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcagatctgc gaagcgtgct 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcagaggagc cgaccgacag 20
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gttcagtttc cgtgcca 17
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgtcttccga caggtta 17
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gtcccacgac tgttgaaata cg 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gtgttgtgag cttcgaccat 20
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggggg 40
Claims (7)
1.一种用于鉴定白肉灵芝的引物对，其特征在于，所述引物对及其序列为：P1，SEQ IDNO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
2.根据权利要求1所述的一种用于鉴定白肉灵芝的引物对，其特征在于，所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5，端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
3.权利要求1或2所述引物对在制备鉴定白肉灵芝试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒鉴定白肉灵芝的步骤包括：
(1)提取白肉灵芝样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释100～1000倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10～100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述白肉灵芝样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
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