CN107130039A - 一种用于鉴定凉山虫草的引物对及其应用 - Google Patents

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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract

本发明公开了一种用于鉴定凉山虫草的引物对及其应用，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。(1)本发明克服了传统分类学研究的弊端，实现了凉山虫草的快速准确鉴定；(2)本发明所述引物对具有很高的稳定性，不仅可以区分鉴定基原物种，还可以用来澄清虫草属一些特定种类或复合种的分类问题，对虫草属的系统学和分类提供技术支持。

Description

一种用于鉴定凉山虫草的引物对及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段鉴定中药的方法，具体为一种用于鉴定凉山虫草的引物对及其应用。
背景技术
凉山虫草为麦角菌科真菌凉山虫草菌，寄生在鳞翅目幼虫上的子座及幼虫的干燥复合体，以四川、云南等省区为其主产区，分布于海拔1500m左右的竹林下。其药性甘，味平，归肾、肥经，具有补肺益肾的功效。凉山虫草分布海拔较低、对生态环境要求不高，资源量丰富，极有可能发展成为一种优良的冬虫夏草替代资源。在民间，当地人将其当作正品虫草入药使用。基于凉山虫草与冬虫夏草在功效上的相似性，在四川、云南等地将凉山虫草代正品虫草使用，《四川省中药材标准》1987年版(增补本)收载了凉山虫草。除冬虫夏草外，在民间还有一些虫草的近源物种常亦于药用，如亚香棒、戴氏虫草等。鉴于民间对于虫草物种的鉴别不清，且不同虫草的化学成分和药理作用也不同，这些虫草物种的混用容易造成用药安全隐患。
虫草属寄生真菌与寄主类群复杂的寄生关系，由于虫草属生活史的复杂性和形态的相似性，且遇当下面临着生药鉴定人才队伍不断缩减的现状，使得虫草物种的鉴别存在一定的盲区，其物种是否为一个单系群或是否具有多个起源等系统学问题都有待深入研究，而这些问题仅通过传统分类方法解决存在很大的难度。
发明内容
本发明的目的是：为了克服现有技术的缺陷，在传统分类学研究的基础上，采用现代分子生物学技术获得一种能够快速准确鉴定的方法，本发明提供了一种用于鉴定凉山虫草的引物对及其应用。
技术方案：一种用于鉴定凉山虫草的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQ IDNO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
优选的，所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5’端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
表1引物对及发卡结构序列
名称 序列(5’-3’) SEQ ID NO.
P1-F GGTCCTCCGCTTATTGATATGC 1
P1-R GGAAGTAAAAGTGC 2
P2-F GGTCAACCCATCATATTGATATTG 3
P2-R GGTAAACTACAGGGTGACCAATTTTAA 4
P3-F TCCTCCGCTTATTGATATGC 5
P3-R GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 6
发卡结构 CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG 7
所述引物对在制备鉴定凉山虫草试剂盒中的应用。
优选的，所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
优选的，所述试剂盒鉴定凉山虫草的步骤包括：
(1)提取凉山虫草样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释100～1000倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10～100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
优选的，所述凉山虫草样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
优选的，所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
有益效果：(1)本发明克服了传统分类学研究的弊端，实现了凉山虫草的快速准确鉴定；(2)本发明所述引物对具有很高的稳定性，不仅可以区分鉴定基原物种，还可以用来澄清虫草属一些特定种类或复合种的分类问题，对虫草属的系统学和分类提供技术支持。
附图说明
图1是实施例1～3PCR鉴定结果电泳图；
其中M为分子量为2000的Maker；1为实施例1PCR产物鉴定结果；2为实施例2PCR产物鉴定结果。
具体实施方式
实施例1
一种用于鉴定凉山虫草的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5’端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
所述引物对在制备鉴定凉山虫草试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
所述试剂盒鉴定凉山虫草的步骤包括：
(1)提取凉山虫草样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释1000倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述凉山虫草样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
实施例2
一种用于鉴定凉山虫草的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5’端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
所述引物对在制备鉴定凉山虫草试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
所述试剂盒鉴定凉山虫草的步骤包括：
(1)提取凉山虫草样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释100倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述凉山虫草样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
如图1所示，将实施例1～2的扩增产物进行电泳检测，条带清晰可见，产物单一。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州市李良济健康产业有限公司
<120> 一种用于鉴定凉山虫草的引物对及其应用
<130>
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggtcctccgc ttattgatat gc 22
<210> 2
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggaagtaaaa gtgc 14
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggtcaaccca tcatattgat attg 24
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggtaaactac agggtgacca attttaa 27
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggggg 40

Claims (7)

1.一种用于鉴定凉山虫草的引物对，其特征在于，所述引物对及其序列为：P1，SEQ IDNO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
2.根据权利要求1所述的一种用于鉴定凉山虫草的引物对，其特征在于，所述引物对P1、P2和P3的上游引物的5，端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.7。
3.权利要求1或2所述引物对在制备鉴定凉山虫草试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒鉴定凉山虫草的步骤包括：
(1)提取凉山虫草样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释100～1000倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释10～100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；
(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述凉山虫草样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
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