CN108239636A - 一种从荞麦根、茎、花中提取总rna的方法 - Google Patents

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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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Abstract

本发明提供了一种从荞麦根、茎、花中提取总RNA的方法，属于分子生物学技术领域。本发明先采用物理方法除去脂类物质，巯基乙醇防止酚类物质的氧化，之后用醋酸钾和异丙醇沉淀RNA除去多糖和多酚，并用DNaseI去除RNA中的基因组DNA，最终得到浓度高、质量好、完整性好的RNA。本发明相比现有技术所具备的优点在于：提供了一种适合荞麦各个组织总RNA的提取方法，提取的RNA浓度高，质量好，RNA完整性好，大大节约成本，实验效果好。

Description

一种从荞麦根、茎、花中提取总RNA的方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体是一种从荞麦根、茎、花中提取总RNA的方法。
背景技术
荞麦是一种独特的食药两用粮食作物，同时还含有其他各类粮食作物所不具有的生物类黄酮、芦丁等益于人体健康的物质。由于传统的育种栽培学不能快速的解决其易倒伏易落粒的致命特性，对其进行分子生物学研究迫在眉急。
总RNA的提取技术是荞麦进行分子生物学研究的基础实验技术，高质量即纯度高，完整性好的总RNA是进行一些分子生物学实验包括逆转录RT-PCR、Northern杂交分析、基因克隆、cDNA文库的建立及转录组学分析的关键。荞麦中因含富含多糖多酚、脂类、蛋白质及一些次级代谢产物，这些物质往往会干扰RNA的分离和纯化，能否有效的去除多糖、多酚、蛋白质等是提高RNA质量的关键。但是目前报道的提取RNA方法或者商业化的试剂盒多针对植物幼嫩叶片组织或多糖、多酚含量较低的作物，很少有针对富含多糖多酚的各个器官组织总RNA提取方法。李玉英等(2004)用SDS-异丙醇法提取荞麦幼嫩子叶的RNA，发现提取的RNA完整性较好，但不能提取根、茎、花中的RNA；郭志军等(2007)用SDS酚抽提法和Trizol法提取荞麦子叶总RNA，发现提取的RNA完整性差。目前关于荞麦根、茎、花中总RNA的提取方法还未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现存方法存在不足而专门设计的高效提取荞麦根、茎、花中总RNA的方法，不仅可以有效的去除蛋白质、多糖、多酚及基因组DNA干扰，能得到纯度高，完整性好的RNA，另外可以大大节约实验成本。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案。
一种从荞麦根、茎、花中提取总RNA的方法，包括以下步骤：
1)取0.2-0.4g材料迅速放入预冷的研钵中，加入液氮后快速研磨成粉状，转移至2mL无RNA酶的离心管中；加1mLRNA提取缓冲液，剧烈振荡2-5min，65℃，保温15-20min，剔除漂浮的脂质；
2)加5mol/LKAc至终浓度为1mol/L，充分混匀后冰浴20min，4℃12000g离心10-20min；
3)吸取上清，加0.5-1.0倍体积的氯仿，充分混匀，室温静止5-10min,4℃12000g离心10-20min，重复2次；
4)吸取上清，加0.5-1.0倍体积的异丙醇，混匀，-20℃过夜，4℃12000g离心10-20min；
5)弃上清，沉淀用1mL70％的乙醇清洗，4℃12000g离心10-15min，重复2次；
6)弃掉上清，用1mL100％的乙醇洗沉淀1次，4℃12000g离心10-15min；
7)吸去上清液，自然晾干加20μL灭菌DEPC水溶解，加入DNaseI37℃消化30min，去除RNA中少量的基因组DNA，4℃12000g离心10-15min；
8)弃掉上清，用1mL100％的乙醇洗沉淀1次，4℃12000g离心10-15min；
9)吸去上清液，自然晾干加20-40μL灭菌DEPC水溶解，-80℃保存备用。
上述步骤1)中所用的RNA提取缓冲液包括以下成分：pH8.0，100mmol/LTris，pH8.0，30mmol/LEDTA，1mol/LNaCl,5％β-巯基乙醇，2％CTAB，4％PVP，上述所有步骤中用到的试剂和耗材都经过0.1％DEPC水溶液处理。
与现有技术相比，本发明具有以下的优点：
1.提供了一种适合荞麦各个组织总RNA的提取方法。
2.用KAc和异丙醇共沉淀去除多糖、多酚类物质。
3.用DNaseI除去提取RNA中的基因组DNA污染。
4.异丙醇在-20℃沉淀RNA能最大程度的降低盐的共沉淀，减少盐类物质对后续实验的影响。
5.提取的RNA浓度高，质量好，RNA完整性好。
6.可大大节约成本，实验效果好。
附图说明
图1 Trizol法提取的荞麦根、茎、花、叶中总RNA的琼脂糖凝胶电泳图。
图2本发明方法提取的荞麦根、茎、花、叶中总RNA的琼脂糖凝胶电泳图。
图3以荞麦Histone3基因作为内参，对其根、茎、花和叶中CCoAOMT基因片段进行半定量RT-PCR的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步对本发明的技术方案作详细的阐述，但并不是限制本发明。
实施例1
从荞麦根中提取总RNA的方法，包括以下步骤：
1)称取0.2g荞麦根迅速放入预冷的研钵中，加入液氮后快速研磨成粉状，转移至2mL无RNA酶的离心管中；加1mLRNA提取缓冲液，剧烈振荡5min，65℃，保温15min，剔除漂浮的脂质；
2)加5mol/LKAc至终浓度为1mol/L，充分混匀后冰浴20min，4℃12000g离心15min；
3)吸取上清，加0.8倍体积的氯仿，充分混匀，室温静止5min,4℃12000g离心15min，重复2次；
4)吸取上清，加0.8倍体积的异丙醇，混匀，-20℃过夜，4℃12000g离心15min；
5)弃上清，沉淀用1mL70％的乙醇清洗，4℃12000g离心10min，重复2次；
6)弃掉上清，用1mL100％的乙醇洗沉淀1次，4℃12000g离心10min；
7)吸去上清液，自然晾干加20μL灭菌DEPC水溶解，加入DNaseI37℃消化30min，去除RNA中少量的基因组DNA，4℃12000g离心10min；
8)弃掉上清，用1mL100％的乙醇洗沉淀1次，4℃12000g离心10min；
9)吸去上清液，自然晾干加30μL灭菌DEPC水溶解，-80℃保存备用。
实施例2
从荞麦茎中提取总RNA的方法，包括以下步骤：
1)称取0.2g荞麦茎迅速放入预冷的研钵中，加入液氮后快速研磨成粉状，转移至2mL无RNA酶的离心管中；加1mLRNA提取缓冲液，剧烈振荡5min，65℃，保温15min，剔除漂浮的脂质；
2)加5mol/LKAc至终浓度为1mol/L，充分混匀后冰浴20min，4℃12000g离心15min；
3)吸取上清，加0.8倍体积的氯仿，充分混匀，室温静止5min,4℃12000g离心15min，重复2次；
4)吸取上清，加0.8倍体积的异丙醇，混匀，-20℃过夜，4℃12000g离心15min；
5)弃上清，沉淀用1mL70％的乙醇清洗，4℃12000g离心10min，重复2次；
6)弃掉上清，用1mL100％的乙醇洗沉淀1次，4℃12000g离心10min；
7)吸去上清液，自然晾干加20μL灭菌DEPC水溶解，加入DNaseI37℃消化30min，去除RNA中少量的基因组DNA，4℃12000g离心10min；
8)弃掉上清，用1mL100％的乙醇洗沉淀1次，4℃12000g离心10min；
9)吸去上清液，自然晾干加40μL灭菌DEPC水溶解，-80℃保存备用。
实施例3
从荞麦花中提取总RNA的方法，包括以下步骤：
1)称取0.2g荞麦花迅速放入预冷的研钵中，加入液氮后快速研磨成粉状，转移至2mL无RNA酶的离心管中；加1mLRNA提取缓冲液，剧烈振荡5min，65℃，保温15min，剔除漂浮的脂质；
2)加5mol/LKAc至终浓度为1mol/L，充分混匀后冰浴20min，4℃12000g离心15min；
3)吸取上清，加0.8倍体积的氯仿，充分混匀，室温静止5min,4℃12000g离心15min，重复2次；
4)吸取上清，加0.8倍体积的异丙醇，混匀，-20℃过夜，4℃12000g离心15min；
5)弃上清，沉淀用1mL70％的乙醇清洗，4℃12000g离心10min，重复2次；
6)弃掉上清，用1mL100％的乙醇洗沉淀1次，4℃12000g离心10min；
7)吸去上清液，自然晾干加20μL灭菌DEPC水溶解，加入DNaseI37℃消化30min，去除RNA中少量的基因组DNA，4℃12000g离心10min；
8)弃掉上清，用1mL100％的乙醇洗沉淀1次，4℃12000g离心10min；
9)吸去上清液，自然晾干加40μL灭菌DEPC水溶解，-80℃保存备用。
实施例4
从荞麦叶中提取总RNA的方法，包括以下步骤：
1)称取0.2g荞麦叶迅速放入预冷的研钵中，加入液氮后快速研磨成粉状，转移至2mL无RNA酶的离心管中；加1mLRNA提取缓冲液，剧烈振荡5min，65℃，保温15min，剔除漂浮的脂质；
2)加5mol/LKAc至终浓度为1mol/L，充分混匀后冰浴20min，4℃12000g离心15min；
3)吸取上清，加0.5-1.0倍体积的氯仿，充分混匀，室温静止5min,4℃12000g离心15min，重复2次；
4)吸取上清，加0.8倍体积的异丙醇，混匀，-20℃过夜，4℃12000g离心15min；
5)弃上清，沉淀用1mL70％的乙醇清洗，4℃12000g离心10min，重复2次；
6)弃掉上清，用1mL100％的乙醇洗沉淀1次，4℃12000g离心10min；
7)吸去上清液，自然晾干加20μL灭菌DEPC水溶解，加入DNaseI37℃消化30min，去除RNA中少量的基因组DNA，4℃12000g离心10min；
8)弃掉上清，用1mL100％的乙醇洗沉淀1次，4℃12000g离心10min；
9)吸去上清液，自然晾干加20-40μL灭菌DEPC水溶解，-80℃保存备用。
上述实施例1-4中所用的荞麦品种均为盛花期的庆红荞1号，中早熟，生育期70-80天，株高95-106cm，由陇东学院王百姓副教授主持选育。
总RNA提取完成后进行凝胶电泳检测和用NanoDrop2000/2000c分光光度计进行分析(图2：1、2、3、4分别代表叶、茎、花、根；表1)，对照实施例可参照常规的Trizol法提取荞麦根、茎、花、叶总的RNA(图1：1、2、3、4分别代表根、茎、花、叶)进行分析，通过比较发现，Trizol法提取的RNA通过琼脂糖凝胶电泳并没有发5SRNA条带(图1)，NanoDrop2000/2000c分光光度计分析结果显示RNA浓度较低，且OD260/280比值明显大于2.0，说明所提取的RNA完整性不好。本发明方法提取荞麦根、茎、花、叶中的总RNA的5S条带清晰可见(图2)，进一步经NanoDrop2000/2000c分光光度计分析发现RNA浓度较高，OD260/280的比值在1.9-2.0之间，说明所提取RNA完整性好，本发明方法提取的RNA质量优于Trizol法提取的RNA。
表1本方法提取和Trizol法提取的根、茎、花、叶总RNA的浓度
半定量RT-PCR验证RNA的质量
将本发明提取的荞麦各组织总RNA作模板，用TaKaRa公司提供的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒合成cDNA，合成cDNA第一链。以荞麦的Histone3基因作为内参，按常规PCR扩增方法对盛花期荞麦的根、茎、花和叶中的CCoAOMT基因片段进行半定量RT-PCR扩增，PCR扩增条件为：95℃，5min预变性后，然后95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸7min。对扩增产物进行电泳检测(图3:1、2、3、4分别代表根、茎、花、叶)。从图3可以看出CCoAOMT基因片段在荞麦各组织中表达条带清晰，说明利用本发明提取的荞麦根、茎、花、叶组织的总RNA质量好，可满足于RT-PCR等分子生物学实验。

Claims (7)

1.一种从荞麦根、茎、花中提取总RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取0.2-0.4g材料迅速放入预冷的研钵中，加入液氮后快速研磨成粉状，转移至2mL无RNA酶的离心管中；加1mLRNA提取缓冲液，剧烈振荡2-5min，65℃，保温15-20min，剔除漂浮的脂质；
2)加5mol/LKAc至终浓度为1mol/L，充分混匀后冰浴20min，4℃12000g离心10-20min；
3)吸取上清，加0.5-1.0倍体积的氯仿，充分混匀，室温静止5-10min,4℃12000g离心10-20min，重复2次；
4)吸取上清，加0.5-1.0倍体积的异丙醇，混匀，-20℃过夜，4℃12000g离心10-20min；
5)弃上清，沉淀用1mL70％的乙醇清洗，4℃12000g离心10-15min，重复2次；
6)弃掉上清，用1mL100％的乙醇洗沉淀1次，4℃12000g离心10-15min；
7)吸去上清液，自然晾干加20μL灭菌DEPC水溶解，加入DNaseI37℃消化30min，去除RNA中少量的基因组DNA，4℃12000g离心10-15min；
8)弃掉上清，用1mL100％的乙醇洗沉淀1次，4℃12000g离心10-15min；
9)吸去上清液，自然晾干加20-40μL灭菌DEPC水溶解，-80℃保存备用。
2.根据权利要求1所述的一种从荞麦根、茎、花中提取总RNA的方法，其特征在于：在步骤1)中的材料放入研钵前用灭菌水清洗干净。
3.根据权利要求1所述的一种从荞麦根、茎、花中提取总RNA的方法，其特征在于：在步骤1)中RNA提取缓冲液成分如下：pH8.0，100mmol/LTris，pH8.0，30mmol/LEDTA，1mol/LNaCl,5％β-巯基乙醇，2％CTAB，4％PVP。
4.根据权利要求1所述的一种从荞麦根、茎、花中提取总RNA的方法，其特征在于：在步骤1)中用灭菌的牙签或无RNA酶的枪头剔除脂类物质。
5.根据权利要求1所述的一种从荞麦根、茎、花中提取总RNA的方法，其特征在于：在步骤4)中所用的异丙醇应提前1-2小时-20℃预冷。
6.根据权利要求1所述的一种从荞麦根、茎、花中提取RNA的方法，其特征在于：在步骤5)中所用的70％乙醇应提前1-2小时-20℃预冷。
7.根据权利要求1所述所述的从荞麦根、茎、叶、花中提取RNA的方法，其特征在于：在步骤6)中所用的100％乙醇应提前1-2小时-20℃预冷。
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