CN111073887A

CN111073887A - 一种兜兰植物高质量总rna的提取方法及应用

Info

Publication number: CN111073887A
Application number: CN202010076386.XA
Authority: CN
Inventors: 丁勇; 常玮; 邵亚林; 刘小烛
Original assignee: Southwest Forestry University
Current assignee: Southwest Forestry University
Priority date: 2020-01-23
Filing date: 2020-01-23
Publication date: 2020-04-28

Abstract

本发明公开了一种兜兰植物高质量总RNA的提取方法，包括：步骤1：液氮中研磨兜兰植物成熟叶片成粉末，向所得粉末中加入Trizol试剂和β‑巯基乙醇，涡旋振荡充分裂解，得到裂解液；步骤2：将裂解液离心取上清液，并向上清液中加入氯仿，振荡混匀，室温静置、离心,取上清液；步骤3：重复步骤2操作2‑3次，之后,向所得上清液中加入沉淀剂，充分混匀后，‑20℃静置10‑15min；步骤4：将上述静置结束的混合液离心，弃上清取沉淀，并用洗涤液洗涤沉淀2‑3次，离心，弃洗涤液后，风干，得到产品RNA。该方法是在Trizol法基础上进行了改良，所得RNA纯度高，完整性好，为后续开展相关试验研究提供根本性基础。

Description

一种兜兰植物高质量总RNA的提取方法及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学核酸提取领域，特别是涉及一种兜兰植物高质量总RNA的提取方法及应用。

背景技术

兜兰又称拖鞋兰，兰科多年生草本，多数为地生种，杂交品种较多，是栽培最普及的洋兰之一。近些年，兜兰的研究主要集中在形态结构、组织培养与快速繁殖、迁地保护、杂交育种、光合生理和引种栽培等方面，而其分子生物学方面的研究涉及到亲缘关系和系统分类。兜兰作为颇有价值的观赏植物，发展前景较好，但同时受到自然分布区域的限制和野生资源的破坏，导致其种质资源的保护和应用急需开辟新的途径，而高质量的RNA获得是进行相关途径研究的前提。

兜兰属植物富含酚类、多糖等次生代谢产物，发明人前期研究发现其基因组RNA提取存在困难，因此，寻找适合兜兰总RNA提取的方法是分子生物学研究的关键。但是，多数兜兰叶片具有革质化和肉质化特性，总RNA提取较困难。而目前常用的提取植物RNA的方法有多种，比如：试剂盒法、CTAB法、Trizol法，这些方法已经应用于多种植物总RNA的提取，但是针对不同的植物由于其内含有的物质不同，所以提取效果也参差不齐，并且截至目前为止未见报道关于兜兰总RNA提取方法的研究，而针对现有提取RNA的境况，寻找一种兜兰植物高质量RNA的提取方法对于进一步开展基因克隆、转录组测序分析等将具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种兜兰植物高质量总RNA的提取方法及应用，以解决上述现有技术存在的问题，该方法是在Trizol法基础上进行了改良，使得所提取的RNA纯度高，完整性好，适合多种兜兰植物总RNA的提取。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种兜兰植物高质量总RNA的提取方法，包括以下步骤：

步骤1：液氮中研磨兜兰植物成熟叶片成粉末，向所得粉末中加入Trizol试剂和β-巯基乙醇，涡旋振荡充分裂解，得到裂解液；

步骤2：将裂解液离心取上清液，并向上清液中加入氯仿，振荡混匀，室温静置5min后离心,取上清液；

步骤3：重复步骤2的操作2-3次，向所得上清液中加入沉淀剂，充分混匀后，-20℃静置10-15min；

步骤4：将步骤3中静置结束的混合液离心，弃上清取沉淀，并用洗涤液洗涤所述沉淀2-3次，离心，弃洗涤液后，风干，得到产品RNA。

优选的是，步骤1中所述粉末：Trizol试剂按质量体积比为1:10添加，所述粉末：β-巯基乙醇按质量体积比为1：0.2添加。

优选的是，步骤3中所述沉淀剂为预冷的异丙醇，所述预冷的异丙醇为4℃冷处理0.5-1.0h，所述预冷的异丙醇与步骤3中所述上清液等体积添加；

优选的是，步骤4中所述洗涤液为体积分数为75％乙醇。

优选的是，步骤1-步骤4中离心条件均为：4℃ 12000rpm离心5min。

优选的是，步骤4中弃去洗涤液后，在超净工作台风干5-10min，然后用DEPC水溶解沉淀，于-80℃保存。

优选的是，步骤1中成熟叶片为采集的新鲜成熟叶片，用蒸馏水处理表面的污物，然后用脱脂棉吸干水分，按需要的质量称量后置于液氮中速冻，并转移至-80℃冰箱保存所得。

优选的是，步骤1中所述兜兰植物为紫纹兜兰、长瓣兜兰或杏黄兜兰。

本发明还提供所述的兜兰植物高质量总RNA的提取方法在基因克隆、转录组测序分析等不同分子生物学研究中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明针对兜兰植物成熟叶片进行总RNA的提取，通过在原有裂解液Trizol试剂的基础上添加一定量的β-巯基乙醇，可以有效去除酚类化合物，防止RNA被氧化；在抽提过程中，抽提试剂只是氯仿，减除了苯酚和异戊醇2种有机试剂的加入，通过增加氯仿抽提次数(2次)，大大减少了费用成本，同时减少了因使用苯酚对实验者的潜在伤害，也可有效除去蛋白质和其他杂质，提高RNA纯度，抑制RNase活性，保证了RNA的完整性；在RNA沉淀过程中只通过加入4℃预冷的异丙醇沉淀RNA，并置于-20℃条件下静置，可以消除传统方法中在室温条件下较长时间放置导致的RNA降解，相比现有技术可减少试剂比如醋酸钠的应用，又减少了费用成本，同时实验操作更便捷，也避免了醋酸钠等试剂在RNA沉淀中的残留；另外，RNA沉淀后通过用75％乙醇进行2次洗涤，可有效的提高RNA的纯度，相比现有技术减少试剂的应用比如醋酸钠，再次减少了费用成本，同时也再次避免了醋酸钠等试剂在RNA沉淀中的残留，避免影响后续PCR等试验。整个实验操作流程中，还通过缩减离心时间(从10-15min降至5min)等方式来节约实验时间，比已知方法比较，时间大大缩减，节省了实验者的操作时间。本发明所提供的RNA提取方法，相比传统的Trizol法，可明显的缩短提取时间，提高提取纯度，并获得完整性好的总RNA，同时所用试剂可明显的减少，降低提取成本并且效果理想。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为不同方法提取的紫纹兜兰总RNA的电泳图；

图2为不同方法提取的长瓣兜兰总RNA的电泳图；

图3为不同方法提取的杏黄兜兰总RNA的电泳图；

图4以采用本发明改良方法提取的三种兜兰总RNA为模板，RT-PCR克隆1,5-二磷酸核酮糖羧化酶基因(rbcL1)基因产物电泳图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

一种兜兰植物高质量总RNA的提取方法，包括以下步骤：

(1)用液氮将0.1g紫纹兜兰研磨成细粉末状后，转入2mL离心管中，随后加入1mLTrizol试剂和20μL β-巯基乙醇，立即使用旋涡震荡仪剧烈振荡混匀，室温放置5min，使其充分裂解；

(2)4℃ 12000rpm离心5min，取上清液于另一个2mL离心管中，加入200μL氯仿，振荡混匀，室温放置5min；

(3)重复上述步骤(2)；

(4)4℃ 12000rpm离心5min，吸取上清液转移至另一个1.5mL离心管中，向上清液中分别加入等体积的异丙醇(4℃提前预冷0.5h)，上下颠倒至充分混匀，-20℃放置10min；

(5)4℃ 12 000rpm离心5min，弃上清液，向离心管中加入lmL 75％乙醇，洗涤离心管管壁，4℃ 12000rpm离心5min，弃去乙醇；

(6)向离心管中再次加入lmL 75％乙醇，洗涤离心管管壁，4℃ 12 000rpm离心5min，弃去乙醇，得到RNA；

(7)含有RNA沉淀的离心管在超净工作台中风干5min，加入40-60μL DEPC处理水溶解沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存备用。

以上实验设置3次试验重复。

实施例2

与实施例1不同之处在于，样品为长瓣兜兰，其他步骤相同。

实施例3

与实施例1不同之处在于，样品为杏黄兜兰，其他步骤相同。

对比例1

采用试剂盒法，具体根据康为世纪全能型植物RNA提取试剂盒(DNase I)说明书分别提取紫纹兜兰、长瓣兜兰和杏黄兜兰成熟叶片中的总RNA。每个试验设置3次重复。

对比例2

采用CTAB法分别提取紫纹兜兰、长瓣兜兰和杏黄兜兰成熟叶片中的总RNA。具体方法：

(1)用液氮将0.1g兜兰样品研磨成细粉末状后，转入2mL离心管中，随后加入1mL提前预热的CTAB裂解液[2％CTAB，2％PVP，100mmo1·L^-1Tris-HCl(pH 8.0)，25mmo1·L^- ¹EDTA，0.5g·L^-1亚精胺，2mo1·L^-1NaCl，2％巯基乙醇]，60℃水浴15min，每隔3min上下颠倒混匀；

(2)之后加入1mL氯仿:异戊醇(24:1)，剧烈振荡30s，常温静置5min；

(3)4℃ 12000rpm离心10min，取上清液于另一个2mL离心管中，加入上清体积1/4的10mol·L^-1LiCl，于4℃冰箱中静置过夜；

(4)4℃ 12000rpm离心20min，弃上清液，加入1mL 75％乙醇，温和振荡离心管，洗涤沉淀；

(5)4℃ 12000rpm离心2min，尽量弃上清液；

(6)沉淀用40-60μL DEPC处理水溶解，于-80℃保存备用。

以上实验设置3次试验重复。

对比例3

采用Trizol法分别提取紫纹兜兰、长瓣兜兰和杏黄兜兰成熟叶片中的总RNA。具体方法：

(1)用液氮将0.1g样品研磨成细粉末状后，转入2mL离心管中，随后加入1mLTrizol试剂，立即使用旋涡震荡仪剧烈振荡混匀，室温放置5min，使其充分裂解；

(2)4℃ 12000rpm离心10min，取上清液于另一个2mL离心管中，加入200μL氯仿，振荡混匀，室温放置15min；

(3)4℃ 12000rpm离心10min，取上层水相至另一个1.5mL离心管中，加入500μL异丙醇，振荡混匀，室温放置15-30min；

(4)4℃ 12000rpm离心10min，弃上清液，RNA沉于管底，加入1mL 75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；

(5)4℃ 8000rpm离心10min，尽量弃上清液，得到RNA沉淀；

(6)将含有RNA沉淀的离心管在超净工作台中风干5min，再用40-60μL DEPC处理水溶解，于-80℃保存备用。

以上实验设置3次试验重复。

1、所提取的不同兜兰中RNA的质量鉴定

实施例1-3以及对比例1-3所提取的不同兜兰的总RNA，通过分光光度计和琼脂糖凝胶电泳分别检测总RNA的纯度和完整性，具体操作为：取2.5μL RNA样品经1％琼脂糖凝胶电泳后，使用Universal HoodⅡ凝胶成像系统观察其完整性，取1.0μL RNA样品经Nanodrop2000超微量分光光度计测定其A₂₆₀/A₂₈₀吸光度比值和浓度；后续通过RT-PCR扩增检测RNA的质量，取2.5μL PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，使用Universal HoodⅡ凝胶成像系统观察引物特异性。

试验数据通过SPSS 23.0进行单因素方差分析，采用邓肯氏新复极差法进行差异显著性检测。

2、结果及分析

1.1RNA完整性的分析

1.1.1上述实施例1及对比例1-3中采用不同方法提取获得的紫纹兜兰总RNA，经电泳检测结果如图1所示。

结果显示：对比例1采用的试剂盒法提取的总RNA显示较为完整的两条带，分别为28S和18S，但未见其5.8S条带，且条带较暗，说明提取的RNA完整性一般，浓度较低；

其他实施例1以及对比例2-3三种方法提取的总RNA均显示清晰的三条带，分别为28S、18S和5.8S，且条带亮度依次为改良Trizol法(即本发明所采用的方法)>CTAB法>Trizol法，说明这三种方法提取的RNA完整性好，浓度各异，改良Trizol法提取的RNA浓度最高。

1.1.2上述实施例2及对比例1-3中采用不同方法提取获得的长瓣兜兰总RNA，电泳检测结果如图2所示。

结果显示：CTAB法和改良Trizol法提取的总RNA可见清晰、明亮的三条带，说明提取的RNA完整性好，浓度较高；Trizol法提取的总RNA虽可见清晰的三条带，但均显示条带较暗，说明提取的RNA完整性好，浓度一般；而试剂盒法提取的总RNA只可见两条带(28S和18S)，且条带均较暗，说明提取的RNA完整性一般，浓度较低。

1.1.3上述实施例3及对比例1-3中采用不同方法提取获得的杏黄兜兰总RNA，电泳检测结果如图3所示。

结果显示：CTAB法提取的总RNA显示清晰的三条带，三次重复试验中，第4和第5条带清晰明亮，而第6条带较暗，说明提取的RNA完整性好，浓度存在差异。

其他三种方法提取的总RNA条带均较暗，其中，Trizol法和改良Trizol法提取的RNA显示完整的三条带，而试剂盒法提取的RNA只可见28S和18S条带，说明Trizol法和改良Trizol法提取的RNA完整性好，试剂盒法提取的RNA完整性一般，但这三种方法提取的RNA浓度均较低。

1.2RNA纯度分析

1.2.1根据实施例1及对比例1-3不同方法提取的紫纹兜兰总RNA的A₂₆₀/A₂₈₀比值(如表1所示)可以看出，试剂盒法、CTAB法和改良Trizol法获得的RNA比值分别为：2.18、1.81和1.86，说明这三种方法提取的RNA纯度均较好；Trizol法提取的RNA比值为1.65，说明该方法提取的RNA纯度差，存在严重的杂质污染。

1.2.2根据实施例2及对比例1-3不同方法提取的长瓣兜兰总RNA，根据A₂₆₀/A₂₈₀比值可知(如表1所示)，试剂盒法提取的RNA比值最高，为2.11，说明RNA纯度好，无杂质污染；CTAB法和改良Trizol法提取的RNA比值无显著差异，分别为1.86和1.96，说明这两种方法提取的RNA纯度较好，无杂质污染；而采用Trizol法提取的RNA比值最低，为1.54，说明RNA纯度差，存在严重的杂质污染。

1.2.3由实施例2及对比例1-3不同方法提取的杏黄兜兰总RNA，根据A₂₆₀/A₂₈₀比值可知，试剂盒法和改良Trizol法提取的RNA比值分别为2.10和1.79，说明试剂盒法提取的RNA纯度好，无杂质污染，改良Trizol法提取的RNA纯度次之；CTAB法和Trizol法提取的RNA比值分别为1.44和1.51，说明这两种方法提取的RNA纯度均不理想，存在杂质污染。

表1不同方法提取三种兜兰总RNA的纯度分析

注：表中数据为平均值±标准差；同列不同小写字母表示不同提取方法之间在0.05水平存在显著差距。

1.3RNA得率和效率分析

1.3.1根据实施例1及对比例1-3不同方法提取的紫纹兜兰总RNA浓度、得率及提取时间如表2所示。

从RNA的浓度和得率来看，改良Trizol法最高，其他三种方法获得的RNA浓度和得率均较低，且无显著差异，这与图1显示的凝胶电泳图像的亮度相吻合。

从提取时间来看，试剂盒法所需时间最短，为1.0h；改良Trizol法和Trizol法次之，分别为1.5h和2.0h；CTAB法所需时间最长，为17.0h。

综合来看，改良Trizol法提取的浓度、得率和效率均较好，效果理想；试剂盒法提取效率虽好，但浓度和得率最差，整体效果较差；Trizol法提取的浓度和得率较低，耗时较长，提取效果一般；CTAB法提取的浓度和得率稍好于试剂盒法和Trizol法，但耗时最长，从试验提取效率角度来看，不建议使用。

1.3.2根据实施例2及对比例1-3不同方法提取的长瓣兜兰RNA的浓度、得率及提取时间如表2所示。

从RNA浓度和得率来看，改良Trizol法效果最好，CTAB法和Trizol法次之，试剂盒法最差，这与图2显示的凝胶电泳图像相一致。

从提取时间来看，试剂盒法耗时最短，改良Trizol法和Trizol法次之，CTAB法耗时最长。

综合来看，改良Trizol法提取的RNA效果整体优于其他三种方法。

1.3.3根据实施例2及对比例1-3不同方法提取的杏黄兜兰RNA的浓度、得率及提取时间如表2所示。

根据RNA的浓度和得率来看，CTAB法效果较好，其他三种方法获得的浓度和得率均无显著性差异，这与图3显示的结果具有一致性。

根据提取时间，CTAB法所需时间最长，其他三种方法所需时间均较短。综合考虑，CTAB法和改良Trizol法提取效果较优于其他两种方法。

表2不同方法提取三种兜兰总RNA的得率和效率分析

综上所述，考虑到总RNA提取的完整性、纯度、浓度和得率以及提取时间，改良Trizol法适合三种兜兰总RNA的提取。

1.3.4RT-PCR分析

从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库搜索得到兜兰属植物1,5-二磷酸核酮糖羧化酶基因(rbcL1)序列(GenBank：MK161066.1)，并根据该序列设计了一对特异性引物(正反引物序列为，F：5′–CACATCGAAGCCGTTGTTGG-3′，R：5′–TAGGGGACGACCGTACTTGT-3′)，使用该对引物进行RT-PCR扩增可获得一段预期长度为252bp的条带。

以本发明改良Trizol法提取获得的三种兜兰总RNA制备成cDNA作为模板，采用上述引物进行RT-PCR扩增。如图4结果所示，目的基因产物条带单一、清晰明亮，且片段大小在250bp左右，与预期条带长度一致，同时将PCR产物送至生工生物(上海)进行测序，通过Blast比对，原序列与测序序列完全一致。说明改良Trizol法提取的总RNA质量较好，能够满足三种兜兰属植物分子生物学试验要求。

根据上述实施例1-3、对比例1-3以及结果及分析，可以看出：与传统的Trizol法、CTAB法、RNA试剂盒法相比，本发明所提供的改良Trizol法的提取时间明显缩短，提高了提取效率，节约了大量的时间。因此，本发明采用的改良Trizol法能够作为适合兜兰属不同兜兰植物较高质量总RNA提取的新方法使用，其成本较低，经济节约，且能获得纯度高、完整性好的高质量RNA，能为后续开展相关试验研究提供根本性基础。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种兜兰植物高质量总RNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤3：重复步骤2的操作2-3次，之后，向所得上清液中加入沉淀剂，充分混匀后，-20℃静置10-15min；

2.如权利要求1所述的兜兰植物高质量总RNA的提取方法，其特征在于，步骤1中所述粉末：Trizol试剂按质量体积比为1:10添加，所述粉末：β-巯基乙醇按质量体积比为1：0.2添加。

3.如权利要求1所述的兜兰植物高质量总RNA的提取方法，其特征在于，步骤3中所述沉淀剂为预冷的异丙醇，所述预冷的异丙醇为4℃冷处理0.5-1.0h，所述预冷的异丙醇与步骤3中所述上清液等体积添加。

4.如权利要求1所述的兜兰植物高质量总RNA的提取方法，其特征在于，步骤4中所述洗涤液为体积分数为75％乙醇。

5.如权利要求1所述的兜兰植物高质量总RNA的提取方法，其特征在于，步骤1-步骤4中离心条件均为：4℃12000rpm离心5min。

6.如权利要求1所述的兜兰植物高质量总RNA的提取方法，其特征在于，步骤4中弃去洗涤液后，在超净工作台风干5-10min，然后用DEPC水溶解沉淀，于-80℃保存。

7.如权利要求1所述的兜兰植物高质量总RNA的提取方法，其特征在于，步骤1中成熟叶片为采集的新鲜成熟叶片，用蒸馏水处理表面的污物，然后用脱脂棉吸干水分，按需要的质量称量后置于液氮中速冻，并转移至-80℃冰箱保存所得。

8.如权利要求1所述的兜兰植物高质量总RNA的提取方法，其特征在于，步骤1中所述兜兰植物为紫纹兜兰、长瓣兜兰或杏黄兜兰。

9.如权利要求1-8任一项所述的兜兰植物高质量总RNA的提取方法在基因克隆、转录组测序分析不同研究中的应用。