CN102260680A - 兜兰GLO/PI MADS-box基因序列及其编码的氨基酸序列 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种兜兰GLO/PIMADS-box基因序列及由该基因序列编码的多肽。另外，本发明还公开了获取兜兰GLO/PI基因克隆的方法，该方法是以近源物种GLO/PIMADS-box基因的氨基酸保守区设计兼并引物，从兜兰的花中提取总RNA，用LD-PCR法扩增，结合RACE技术克隆得到兜兰的GLO/PIMADS-box基因的全长cDNA序列。本发明的兜兰GLO/PIMADS-box基因是一个新的与兜兰花发育相关的基因。本发明提供的兜兰GLO/PI基因，不仅为进一步研究兜兰GLO/PI蛋白的功能奠定了基础，而且还为兜兰花器官发育的分子机制提供了一定的依据。

Description

兜兰GLO/PI MADS-box基因序列及其编码的氨基酸序列

技术领域

本发明属于分子生物学中的基因领域，具体涉及兜兰GLO/PI MADS-box基因序列及其编码的氨基酸序列。

背景技术

兜兰（Paphiopedilum spp.），又叫拖鞋兰，属于兰科(Orchidaceae)兜兰属（Paphiopedilum Pfitz.）植物，分布于亚洲热带地区至太平洋一些岛屿；为陆生兰，少数为附生兰；叶基生，带状，二列。兜兰花形奇特，花大色艳，具有很高的盆栽观赏价值和经济价值。目前，兜兰是重要的商业洋兰之一，在洋兰花卉市场中占有举足轻重的地位。因此，探究兜兰花发育的分子机理也具有十分重要的理论和实际应用意义。然而，兜兰花发育的分子机理方面的相关研究报道国内外鲜见。所以，分离和克隆兜兰花发育控制相关的MADS-box基因，进一步鉴定MADS-box蛋白的功能，可为阐明兜兰花发育的分子机制提供理论依据，同时也可指导兜兰的生产。

发明内容

本发明所解决的技术问题在于提供一种兜兰GLO/PI MADS-box基因，该基因是一个与兜兰花发育相关的MADS-box基因。在本专利中GLO/PI MADS-box是GLOBOSA/PISTILLATA MADS-box的简称，在本发明中还存在将GLO/PI MADS-box直接简写成GLO/ PI基因的形式。

本发明所解决的技术问题在于提供一种兜兰GLO/PI MADS-box基因编码的多肽。

本发明所解决的技术问题在于提供一种获取兜兰GLO/PI MADS-box基因克隆的方法。

为了解决上述技术问题，一方面，本发明提供了一种分离出的兜兰GLO/ PI基因，具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

所述的兜兰GLO/PI基因，其特征在于，编码框的位置位于85bp-717bp，在85bp处有起始密码子ATG，在715bp处有终止密码子TGA，在905 bp处有polyA附加信号，该序列无内含子，具有633 bp完整的开放读码框，编码210个氨基酸的多肽。

通过生物信息学分析发现，兜兰GLO/ PI基因在NCBI用Blast软件进行同源性比对，结果表明，该基因cDNA序列与长叶美洲兜兰（Phragmipedium longifolium）的全长GLO-like MADS-box基因的cDNA序列同源性高达99%，与芳香绶草（Spiranthes odorata）的全长GLO-like MADS-box、爪唇兰（Gongora galeata）的全长GLO-like MADS-box、细茎石斛（Dendrobium moniliforme）的全长PI和蕙兰（Cymbidium faberi）的全长PI/GLO基因的cDNA序列同源性都高达94%，与春兰（Cymbidium goeringii）的全长GLO基因的cDNA序列同源性高达93%。ORF Finder分析表明，该基因cDNA全长934bp，在85bp处有起始密码子ATG，在715bp处有终止密码子TGA，在905bp处有polyA附加信号，具有633bp完整的开放读码框，编码210个氨基酸。该基因cDNA序列编码的氨基酸序列在NCBI数据库进行Blast分析表明，该氨基酸序列具有典型的MADS结构域和K结构域，与长叶美洲兜兰、芳香绶草、爪唇兰、细茎石斛、蕙兰和春兰的GLO/PI-like MADS-box基因编码的蛋白序列的同源性依次分别为99% 、94%、94%、94%、94%和93%。系统进化树表明，该兜兰MADS-box基因属于花器官发育B类基因的GLO/PI亚家族（见图4）。

另一方面，本发明还提供了一种由兜兰GLO/PI基因编码的多肽，该多肽具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

另一方面，本发明还提供了一种兜兰GLO/PI MADS-box基因在其花器官中表达模式的分析方法，包括如下步骤：

分别提取兜兰花的子房、萼片、花瓣、唇瓣、蕊柱，以及苞叶的总RNA，再将不同样品的总RNA分别反转录为cDNA第一链；

根据核苷酸序列SEQ ID NO.1，设计如下引物作为Real-time PCR的引物来扩增目的片段长为195bp的特异区段：

GLO/PI F2 (5’→3’): GCAGCCTATCCAGCCCAACT<SEQ ID NO.10>, 

GLO/PI R2 (5’→3’): AGTGCTAAGGCATACACCAA<SEQ ID NO.11>，

以兰花Tubulin为内参基因，设计特异引物：

Tubulin-F(5’→3’): GGATTAGGCTCTCTGCTGTTGG<SEQ ID NO.12>,

Tubulin-R(5’→3’): GTGTGGATAAGACGCTGTTGTATG<SEQ ID NO.13>，

扩增长为130 bp目的片段；

根据Real-time PCR试验结果，根据兜兰GLO/PI MADS-box基因在各花器官中的表达量进行表达模式的分析。

另外，本发明还提供了一种获取兜兰GLO/PI基因克隆的方法。具体而言，本发明是以兰科兜兰属植物中的同色兜兰[ P. concolor (Lindl.) Pfitz.]为实验材料，通过以下技术措施实现：

1、总RNA的提取

取同色兜兰的花，使用如下的提取步骤：

将样品于液氮中研成粉末，按适当样品的量迅速加入Solution D 500 μl，水饱和酚500 μl，3 M醋酸钠（pH 5.2）200 μl，4 M β-巯基乙醇50 μl，充分振荡混匀，室温放置1 min；加入200 μl氯仿，剧烈振荡1 min；4 ℃，12 000 g离心10 min，小心吸取上清液至另一无RNase的离心管中；加入二氧化硅悬浮液100 μl，无水乙醇200 μl，3 M醋酸钠（pH 5.2）200 μl，用微量移液器缓慢混匀，室温，12 000 g离心1 min，弃上清；加入70％乙醇1 ml，用移液器吸打混匀，室温，12 000 g离心1 min，弃上清，重复2次；室温干燥8-10 min，加入20-50 μl灭菌双蒸水，室温孵育5-10 min，室温，12 000 g离心5-10 min；将RNA上清液吸取至另一无RNase的离心管中。

2. cDNA第一链的合成和LD-PCR法扩增全长双链cDNA

取同色兜兰花的总RNA1.0μg，按照SMART^TM PCR cDNA Synthesis Kit（CLONTECH，U.S.A.）的操作步骤，先进行反转录合成cDNA第一链，然后再PCR扩增全长双链cDNA。

3. 设计引物和合成引物

从GenBank数据库中下载近源物种（如长叶美洲兜兰、芳香绶草、爪唇兰、春兰、蕙兰等）GLO/PI-like MADS-box基因编码的氨基酸序列，用CLUSTAL X (1.8)软件进行多序列比对，确定氨基酸序列保守区，根据保守区序列设计兼并引物，扩增片段大小约为430bp。引物设计后由上海英俊生物技术公司合成。兼并引物序列为：

GLO/PI F1 (5’→3’)：CGGCAAGTGACCTTCTCGAAG<SEQ ID NO.3>；   

GLO/PI R1 (5’→3’)：CTTTTATTTTCCTCTTCCAGCAT<SEQ ID NO.4>。

4. 兜兰GLO/PI基因cDNA全长序列的克隆

以上述2合成的cDNA第一链为模板，用上述3设计的兼并引物进行PCR扩增，所扩增的PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，然后从凝胶中割胶纯化回收目的大小的DNA条带（见图2A）。再将纯化的PCR产物连接到pGEM-T easy载体中，转化DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆过夜培养。经菌液PCR电泳检测后，结果为阳性的菌液送至上海英俊生物技术公司进行双向测序。

根据测序获得的cDNA片段，用Primer5.0软件设计特异基因引物，再利用cDNA末端快速扩增技术（Rapid Amplification of cDNA ends，RACE）对目的基因的3’端和5’端进行PCR扩增。

在3’RACE中，以上述2合成的全长双链cDNA为第一次PCR反应的模板，再将第一次PCR产物作为第二次PCR反应的模板。由接头引物和3’RACE基因特异引物分别进行两次PCR反应，然后从凝胶中割胶纯化回收目的DNA条带（见图2B）。

3’RACE接头引物(5’→3’)：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT(₃₀) N_-1N(N=A, C, G, 或 T; N_-1=A, G, 或 C) <SEQ ID NO.5>；

3’RACE基因特异引物(5’→3’)：GAAGCACGAGAACTTGAGC<SEQ ID NO.6>。

在5’RACE中，以上述2合成的全长双链cDNA为第一次PCR反应的模板，再将第一次PCR产物作为第二次PCR反应的模板。利用接头外侧引物和基因特异引物进行第一次PCR扩增，然后用接头内侧引物和基因特异引物进行第二次PCR扩增，最后从凝胶中割胶纯化回收目的DNA条带（见图2C）。

5’RACE接头外侧引物(5’→3’)：

CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT<SEQ ID NO.7>；

5’RACE接头内侧引物(5’→3’)：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT<SEQ ID NO.8>；

5’RACE基因特异引物(5’→3’)：TCGTGCTTCGCGTCCCACAG<SEQ ID NO.9>。

所得到的PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，将PCR产物纯化后，连接到pGEM-T easy载体中，转化DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆过夜培养。经菌液PCR电泳检测后，结果为阳性的菌液送至上海英俊生物技术公司进行双向测序。测序所得的序列再与保守区序列设计兼并引物扩增得到的cDNA片段的序列利用CLUSTAL X (1.8)软件进行拼接。

5. 兜兰GLO/PI基因序列的生物信息学分析

将拼接的测序结果在NCBI用Blast软件进行同源性比对，结果表明，该基因cDNA序列与长叶美洲兜兰（Phragmipedium longifolium）的全长GLO-like MADS-box基因的cDNA序列同源性高达99%，与芳香绶草（Spiranthes odorata）的全长GLO-like MADS-box、爪唇兰（Gongora galeata）的全长GLO-like MADS-box、细茎石斛（Dendrobium moniliforme）的全长PI和蕙兰（Cymbidium faberi）的全长PI/GLO基因的cDNA序列同源性都高达94%，与春兰（Cymbidium goeringii）的全长GLO基因的cDNA序列同源性高达93%。ORF Finder分析表明，该基因cDNA全长934bp，在85bp处有起始密码子ATG，在715bp处有终止密码子TGA，在905bp处有polyA附加信号，具有633bp完整的开放读码框，编码210个氨基酸。该基因cDNA序列编码的氨基酸序列在NCBI数据库进行Blast分析表明，该氨基酸序列具有典型的MADS结构域和K结构域，与长叶美洲兜兰、芳香绶草、爪唇兰、细茎石斛、蕙兰和春兰的GLO/PI-like MADS-box基因编码的蛋白序列的同源性依次分别为99% 、94%、94%、94%、94%和93%。系统进化树表明，该兜兰MADS-box基因属于花器官发育B类基因的GLO/PI亚家族（见图4）。

6. 兜兰GLO/PI基因在其花器官中的表达模式分析

分别提取兜兰花的子房、萼片、花瓣、唇瓣、蕊柱，以及苞叶的总RNA（见图1B），再将不同样品的总RNA分别反转录为cDNA第一链，根据前述的核苷酸序列SEQ ID NO.1，设计半定量RT-PCR引物：GLO/PI F2 (5’→3’): GCAGCCTATCCAGCCCAACT, GLO/PI R2 (5’→3’): AGTGCTAAGGCATACACCAA，目的片段长为195bp。以兰花Tubulin为内参基因，引物序列为Tubulin-F (5’→3’): GGATTAGGCTCTCTGCTGTTGG, Tubulin-R (5’→3’): GTGTGGATAAGACGCTGTTGTATG，目的片段长约为130bp。半定量RT-PCR结果表明，Tubulin在同色兜兰花的各个器官中表达量变化不大，但GLO/PI在其检测的各个器官中都有表达，但表达的丰度不同。GLO/PI在花瓣（PE）中的表达量最高，唇瓣（L）中的表达量次之，苞叶（B）和蕊柱（CO）中的表达量相当，而萼片（SE）又较子房（O）中表达量高（见图5）。

上述结果表明，本发明的兜兰GLO/PI MADS-box基因是一个新的与兜兰花发育相关的基因。本发明提供的兜兰GLO/PI基因，不仅为进一步研究兜兰GLO/PI蛋白的功能奠定了基础，而且还为兜兰花器官发育的分子机制提供了一定的依据。

下面结合附图和具体实施方式进一步详细描述本发明，但本发明不局限于这些实施方式，任何在本发明基本精神上的改进或替代，仍属于本发明权利要求书中所要求保护的范围。

附图说明

图1 总RNA电泳图。图1A，泳道F，同色兜兰花的总RNA；图1B，泳道O、B、SE、PE、L和CO分别为同色兜兰的子房、苞叶、萼片、花瓣、唇瓣和蕊柱的总RNA。

图2兜兰PcGLO/PI基因cDNA全长的克隆。M，为DL2000 DNA Marker；图2A，泳道1，兼并引物扩增的PCR电泳结果；图2B，泳道2，3’ Race PCR产物电泳结果；图2C，泳道3，5’ Race PCR产物电泳结果。

图3兜兰PcGLO/PI基因编码的蛋白通过NCBI保守结构域数据库注释结果。

图4兜兰PcGLO/PI基因的氨基酸序列与其它物种B类主要MADS-box基因的氨基酸序列的系统进化树分析。

图5 兜兰PcGLO/PI基因在其不同器官中的表达分析。M，为DL2000 DNA Marker；O、B、SE、PE、L和CO分别为同色兜兰的子房、苞叶、萼片、花瓣、唇瓣和蕊柱。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。

实施例1  总RNA的提取

取同色兜兰的花，用如下的提取步骤：

将样品于液氮中研成粉末，按10 ml/g样品的量迅速加入Solution D 500 μl，水饱和酚500 μl，3 M醋酸钠（pH 5.2）200 μl，4 M β-巯基乙醇50 μl，充分振荡混匀，室温放置1 min；加入200 μl氯仿，剧烈振荡1 min；4 ℃，12 000 g离心10 min，小心吸取上清液至另一无RNase的离心管中；加入二氧化硅悬浮液100 μl，无水乙醇200 μl，3 M醋酸钠（pH 5.2）200 μl，用微量移液器缓慢混匀，室温，12 000 g离心1 min，弃上清；加入70％乙醇1 ml，用移液器吸打混匀，室温，12 000 g离心1 min，弃上清，重复2次；室温干燥8-10 min，加入20-50 μl灭菌双蒸水，室温孵育5-10 min，室温，12 000 g离心5-10 min；将RNA上清液吸取至另一无RNase的离心管中。

实施例2  cDNA第一链的合成和LD-PCR法扩增全长双链cDNA

cDNA第一链的合成：按照SMART^TM PCR cDNA Synthesis Kit（CLONTECH，U.S.A.）的操作步骤，取同色兜兰花的总RNA 1.0μg，与反转录引物3’ SMART CDS Primer ⅡA (12 μM)1.0μl混合均匀，PCR仪上72℃，3min，接着42℃，2min，快速取出，放于室温，然后加入5×First Strand Buffer 2μl，DTT(100 mM) 0.25μl，dNTP Mix(10 mM of each dNTP) 1μl，SMART ⅡA Oligonucleotide (12 μM) 1μl，Rnase inhibitor 0.25μl，Power Script Reverse Transcriptase(100U) 1μl，反应体系为10μl。反应程序为42℃ 60min，72℃ 7 min，最后-20℃保存备用。

LD-PCR法扩增全长双链cDNA：将PCR仪预热到95℃，取2 μl 稀释后的ss cDNA作为反应模板，Deionized H₂O 82μl，10×Advantage 2 PCR Buffer 10μl，50×dNTP(10mM of each dNTP) 2.0μl， 5’ PCR Primer ⅡA(12 μM) 2.0μl， 50×Advantage 2 Polymerase Mix 2.0μl，反应体系为100μl。PCR扩增程序为95℃ 1min；95℃ 15 s，65℃ 30 s，68℃，6 min，19 cycles。PCR扩增完后，保存于-20℃备用。

实施例3 设计引物和合成引物

从GenBank数据库中下载近源物种（如长叶美洲兜兰、芳香绶草、爪唇兰、春兰、蕙兰等）GLO/PI-like MADS-box基因编码的氨基酸序列，用CLUSTAL X (1.8)进行多序列比对，确定氨基酸序列保守区，根据保守区序列RQVTFSK设计兼并引物GLO/PI F1 (5’→3’)：CGGCAAGTGACCTTCTCGAAG； 根据保守区序列MLEEENKR设计兼并引物GLO/PI R1 (5’→3’)：CTTTTATTTTCCTCTTCCAGCAT。PCR扩增片段大小约为430bp。引物设计后由上海英俊生物技术公司合成。

实施例4 兜兰GLO/PI基因cDNA全长序列的克隆

取上述合成的第一链cDNA 1.0μl为模板，用上述设计的兼并引物进行PCR扩增，反应体系为：10×LA Buffer (Mg²⁺ plus) 2.5μl，dNTP Mix(2.5mM of each dNTP) 4.0μl，LA taq (5U/μl) 0.2μl, Deionized H₂O 15.3μl，10μM 引物GLO/PI F1和GLO/PI R1各1.0μl，反应体系为25μl。PCR反应程序为：94℃ 4 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃，1 min，32 cycles；72℃，7 min。所扩增的PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，然后从凝胶中割胶纯化回收目的大小的DNA条带。再将纯化的PCR产物连接到pGEM-T easy载体中，转化DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆过夜培养。经菌液PCR电泳检测后，结果为阳性的菌液送至上海英俊生物技术公司进行双向测序。

根据测序获得的cDNA中间片段，用Primer5.0软件设计特异基因引物，再利用RACE技术对目的基因的3’端和5’端进行PCR扩增。

在3’RACE中，以上述合成的全长双链cDNA稀释后作为第一次PCR反应的模板，再将第一次PCR产物稀释后作为第二次PCR反应的模板。由接头引物和3’RACE基因特异引物分别进行两次PCR反应。3’RACE接头引物(5’→3’)：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT(₃₀) N_-1N(N=A, C, G, 或 T; N_-1=A, G, 或 C)；3’RACE基因特异引物(5’→3’)：GAAGCACGAGAACTTGAGC。反应体系为：10×LA Buffer (Mg²⁺ plus) 2.5μl，dNTP Mix (2.5mM of each dNTP) 4.0μl，LA taq (5U/μl) 0.2μl, Deionized H₂O 15.3μl，10μM 3’RACE接头引物和3’RACE基因特异引物各1.0μl，反应体系为25μl。PCR反应程序为：94℃ 4 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃，1 min，33 cycles；72℃，7 min。

在5’RACE中，以上述合成的全长双链cDNA稀释后作为第一次PCR反应的模板，再将第一次PCR产物稀释后作为第二次PCR反应的模板。利用接头外侧引物和基因特异引物进行第一次PCR扩增，然后用接头内侧引物和基因特异引物进行第二次PCR扩增。5’RACE接头外侧引物(5’→3’)：

CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT；5’RACE接头内侧引物(5’→3’)：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT；5’RACE基因特异引物(5’→3’)：TCGTGCTTCGCGTCCCACAG。反应体系为：10×LA Buffer (Mg²⁺ plus) 2.5μl，dNTP Mix (2.5mM of each dNTP) 4.0μl，LA taq (5U/μl) 0.2μl, Deionized H₂O 15.3μl，10μM 5’RACE接头外侧引物（5’RACE接头内侧引物，第二次PCR）和5’RACE基因特异引物各1.0μl，反应体系为25μl。PCR反应程序为：94℃ 4 min；94℃ 30 s，62℃（63℃第二次PCR） 30 s，72℃，1 min，33 cycles；72℃，7 min。

所得到的PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，将PCR产物纯化后，连接到pGEM-T easy载体中，转化DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆过夜培养。经菌液PCR电泳检测后，结果为阳性的菌液送至上海英俊生物技术公司进行双向测序。测序所得的序列再与保守区序列设计兼并引物扩增得到的cDNA中间片段的序列利用CLUSTAL X (1.8)进行拼接。

实施例5 兜兰GLO/PI基因序列的生物信息学分析

将拼接的测序结果在NCBI进行Blast同源性比对，结果表明，该基因cDNA序列与长叶美洲兜兰（P. longifolium）的全长GLO-like MADS-box基因的cDNA序列同源性高达99%，与芳香绶草（S. odorata）的全长GLO-like MADS-box、爪唇兰（G. galeata）的全长GLO-like MADS-box、细茎石斛（D. moniliforme）的全长PI和蕙兰（C. faberi）的全长PI/GLO基因的cDNA序列同源性都高达94%，与春兰（C. goeringii）的全长GLO基因的cDNA序列同源性高达93%。ORF Finder分析表明，该基因cDNA全长934bp，在85bp处有起始密码子ATG，在715bp处有终止密码子TGA，在905bp处有polyA附加信号，具有633bp完整的开放读码框，编码210个氨基酸。该基因cDNA序列编码的氨基酸序列在NCBI数据库进行Blast分析表明，该氨基酸序列具有典型的MADS结构域和K结构域，与长叶美洲兜兰、芳香绶草、爪唇兰、细茎石斛、蕙兰和春兰的GLO/PI-like MADS-box基因编码的蛋白序列的同源性依次分别为99% 、94%、94%、94%、94%和93%。系统进化树表明，该兜兰MADS-box基因属于花器官发育B类基因的GLO/PI亚家族。

实施例6 兜兰GLO/PI基因在其不同器官中的表达模式分析

分别提取兜兰花的子房、萼片、花瓣、唇瓣和蕊柱，以及苞叶的总RNA，再将不同样品的总RNA（1μg）分别反转录为cDNA第一链（PrimeScript^TM Reverse Transcriptase kit, Takara）。根据前述的核苷酸序列SEQ ID NO.1，设计半定量RT-PCR引物：GLO/PI F2 (5’→3’): GCAGCCTATCCAGCCCAACT, GLO/PI R2 (5’→3’): AGTGCTAAGGCATACACCAA，目的片段长为195bp。以兰花Tubulin为内参基因，引物序列为Tubulin-F (5’→3’): GGATTAGGCTCTCTGCTGTTGG,  Tubulin-R (5’→3’): GTGTGGATAAGACGCTGTTGTATG，目的片段长约为130bp。以cDNA第一链稀释后作为半定量RT-PCR的反应模板。反应体系为25μl，包含10×Buffer (Mg²⁺ plus) 2.5μl，dNTP Mix (10 mM of each dNTP) 1.0μl，r taq (5U/μl) 0.2μl, Deionized H₂O 17.3μl，10μM正反向基因特异引物各1.0μl，稀释的第一链cDNA 2.0μl。PCR反应程序为：94℃ 4 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃，45 s，30 cycles；72℃，7 min。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

<110> 广东省农业科学院花卉研究所

<120>兜兰GLO/PI MADS-box基因序列及其编码的氨基酸序列

<160> 9

<210> 1

<211> 934

<212> DNA

<213>同色兜兰[ Paphiopedilum concolor(Lindl.) Pfitz.]

<400> 1

1      gctctggtctctttctggggcctttcactcgtcttctggagctcgaaaggtccctccttt

61     tcctcccgttcgattcaggtccgagatggggcggggaaagatagagatcaagcggatcga

121    gaactcaacgaatcggcaagtgaccttctcgaggcggaggaatggaatcatgaagaaggc

181    gaaggagatcagcgttctatgcgatgctcaggtctcgctagtcatcttctccagcctagg

241    aaagatgtccgagtactgcagcccttccaccacgttgtcgaagatgctggagaagtacca

301    gcaaaactcgggaaagaagctgtgggacgcgaagcacgagaacttgagcgcggagataga

361    tcggataaagaaggaaaacgataacatgcagatcgagctcaggcatatgaagggggaaga

421    tctgaactctctcaacccaaaagagcttatcccaatcgaggaagcgcttcagaatggttt

481    gactagtgttcgtgataagcagatgaatttcttgaagatgctcaaaaggaatgaaagaat

541    gctggaagatgaaaataaaaggcttacgtatctgttgcaccaccaggaactggcaatgga

601    aggtagtatgagagaactggacatcagttatcaccagaaagatcgagagtatggaaacca

661    gatgccaatggcctttcgtgtgcagcctatccagcccaacttgcaaggaaataaatgata

721    ctgttgggttaccgttgccttctcaatctgctgaactttgagtattagcattatattgct

781    tttattgtatgaacaggtatgtgccggtaaatcttataagtgcttgctgactggaatact

841    tatatttcagccaacattggtgtatgccttagcactgtgaaattagtagaagacattact

901    gctgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

 

<210> 2

<211> 210

<212> PRT

<213>同色兜兰[ Paphiopedilum concolor(Lindl.) Pfitz.]

<400> 2

MGRGKIEIKRIENSTNRQVTFSRRRNGIMKKAKEISVLCDAQVSLVIFSSLGKMSEYCSPSTTLSKMLEKYQQNSGKKLWDAKHENLSAEIDRIKKENDNMQIELRHMKGEDLNSLNPKELIPIEEALQNGLTSVRDKQMNFLKMLKRNERMLEDENKRLTYLLHHQELAMEGSMRELDISYHQKDREYGNQMPMAFRVQPIQPNLQGNK

 

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

CGGCAAGTGACCTTCTCGAAG 21

 

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

CTTTTATTTTCCTCTTCCAGCAT 23

 

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACTN_-1N 28

 

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

GAAGCACGAGAACTTGAGC 19

 

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 45

 

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 23

 

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

TCGTGCTTCGCGTCCCACAG 20

 

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

GCAGCCTATCCAGCCCAACT 20

 

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400>11

AGTGCTAAGGCATACACCAA 20

 

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

GGATTAGGCTCTCTGCTGTTGG 22

 

<210>13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

GTGTGGATAAGACGCTGTTGTATG 24

 

Claims (4)

1.一种分离出的兜兰GLO/PI MADS-box基因,其特征在于，具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的兜兰GLO/PI MADS-box基因，其特征在于，编码框的位置位于85bp-717bp，在85bp处有起始密码子ATG，在715bp处有终止密码子TGA，在905 bp处有polyA附加信号，该序列无内含子，具有633 bp完整的开放读码框，编码210个氨基酸的多肽。

3.一种如权利要求1或2所述兜兰GLO/PI MADS-box基因编码的多肽，其特征在于，具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

4.一种兜兰GLO/PI MADS-box基因在其花器官中表达模式的分析方法，其特征在于包括如下步骤：

分别提取兜兰花的子房、萼片、花瓣、唇瓣、蕊柱，以及苞叶的总RNA，再将不同样品的总RNA分别反转录为cDNA第一链；

根据核苷酸序列SEQ ID NO.1，设计如下引物作为Real-time PCR的引物来扩增目的片段长为195bp的特异区段：

GLO/PI F2 (5’→3’): GCAGCCTATCCAGCCCAACT<SEQ ID NO.10>, 

GLO/PI R2 (5’→3’): AGTGCTAAGGCATACACCAA<SEQ ID NO.11>，

以兰花Tubulin为内参基因，设计特异引物：

Tubulin-F(5’→3’): GGATTAGGCTCTCTGCTGTTGG<SEQ ID NO.12>,

Tubulin-R(5’→3’): GTGTGGATAAGACGCTGTTGTATG<SEQ ID NO.13>，

扩增长为130 bp目的片段；

根据Real-time PCR试验结果，根据兜兰GLO/PI MADS-box基因在各花器官中的表达量进行表达模式的分析。

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