CN106939314A - 盐生草抗旱基因Hg.S4及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及盐生草抗旱基因Hg.S4及其应用，属于植物生物工程技术领域。本发明首次从盐生植物盐生草中克隆到抗旱基因Hg.S4，该基因cDNA的核苷酸序列见SEQ ID NO.1，分子量为619bp，其cDNA编码序列为SEQ ID NO.1中第228至第341位所述的核苷酸序列，分子量为114bp，氨基酸序列见SEQ ID NO.3，由37个氨基酸组成。盐生草抗旱基因Hg.S4基因能够显著提高转基因拟南芥的抗旱性。本发明所述的抗旱基因将促进于抗旱作物和植物新品种(系)的培育进程。

Description

盐生草抗旱基因Hg.S4及其应用
技术领域
本发明属于植物生物工程和转基因技术领域，具体涉及盐生植物盐生草抗旱基因Hg.S4及其应用。
背景技术
随着世界人口的持续增加和经济的快速发展，水资源短缺问题日趋严重，尤其是近年来全球气候变暖不断加剧，更是导致了干旱地区的迅速扩大和干旱化程度加重。在全球农业生产中，干旱胁迫已成为造成作物减产的最主要非生物胁迫，同样在我国，干旱造成的粮食损失占全部自然灾害的50％以上，尤其是北方旱作农业区，解决干旱问题是实现农业可持续发展的重要挑战。
由于传统作物抗旱育种周期长、投入大且受抗旱种质资源狭窄等因素的制约，使得当前抗旱育种进展缓慢。当前迅速发展的生物技术育种，尤其是转基因技术打破了物种间限制，为高效抗旱育种提供了新的途径，但抗旱基因资源的获得是抗旱转基因作物新品种的关键。我国西北旱区生长的盐生植物盐生草(Halogeton glomeratus)，具有抗旱、耐盐的双重特性，是挖掘抗旱基因的优异材料，从中克隆的抗旱基因在植物抗旱育种中更具有重要价值。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种盐生草抗旱基因Hg.S4，以解决当前抗旱基因资源匮乏的现状。
本发明的又一目的在于提供一种盐生草抗旱基因Hg.S4的制备方法，实现该基因在盐生草中的快速、准确分离。
本发明最后一目的在于提供盐生草抗旱基因Hg.S4在提高植物抗旱性中的应用。
依据前期盐生草盐胁迫响应转录组学测序结果(Transcriptomic profiling ofthe salt-stress response in the halophyte Halogeton glomeratus[J].BMCgenomics,2015,16(1):169)，鉴定到盐胁迫诱导表达基因HgS4，申请人以盐生草叶片为材料，分离出HgS4基因，将该基因构建表达载体，转化到拟南芥后，可显著提高植株的耐旱能力。利用本发明所述基因，构建各种植物表达载体，可广泛应用于转基因植物和作物抗旱新品种的培育。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种盐生草抗旱基因Hg.S4，其主要特点在于从盐生草叶片中分离到Hg.S4基因cDNA的核苷酸序列SEQ ID NO.1如下，分子量为619bp；
所述的盐生草抗旱基因Hg.S4的编码序列为上述Hg.S4基因cDNA的核苷酸序列中第228至第341位所述的核苷酸序列SEQ ID NO.2如下，分子量为114bp：
所述的盐生草抗旱基因Hg.S4的编码序列编码的蛋白质氨基酸序列SEQ ID NO.3，由37个氨基酸组成：
所述的盐生草抗旱基因HgS4，其特异引物为：
HgS4-F1 5’-ACCCCCATACTCTCGTAACCCTATA-3’
HgS4-R1 5’-AGTCGAAACATACTTCCCATTAAAG-3’。
由上海生工生物工程公司合成。
所述的盐生草抗旱基因Hg.S4的制备方法，其主要特点在于步骤为：
以200-500mM NaCl胁迫处理3-7d盐生草幼苗的叶片为材料，Trizol法提取总RNA，采用cDNA合成试剂盒(大连宝生物工程有限公司)，反转录合成cDNA第一链，扩增该基因片段，PCR反应体系为dNTP Mixture 2.5mM 2ul，10×Ex Taq Buffer Mg2+Plus 2.5ul，上游引物5’-ACCCCCATACTCTCGTAACCCTATA-3’10μM 1ul，下游引物5’-AGTCGAAACATACTTCCCATTAAAG-3’10μM 1ul，cDNA 1ul，Ex Taq酶5U/ul 0.2ul，ddH2O17.3ul，总体积25ul；
扩增程序为94℃4min，94℃50s，59.0-59.5℃30s，72℃25s，共32-35个循环，72℃延伸8min；利用胶回收试剂盒(大连宝生物工程有限公司；Gel Extraction Mini Kit)回收PCR产物，接着将回收产物与pMD19-T(大连宝生物工程有限公司)载体连接，得到重组质粒pMD19-HgS4，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选蓝白斑并测序。PCR测定序列如SEQ ID NO.1。
所述的盐生草抗旱基因HgS4表达载体的构建方法，其步骤为：
在所述的盐生草抗旱基因HgS4的上下游引物上分别添加Kpn I和BamH I这两个酶切位点，上游引物F1为5’-GGGGTACCACCCCCATACTCTCGTAACCCTATA-3’、下游引物R1为5’-CGGGATCCAGTCGAAACATACTTCCCATTAAAG-3’；
以200-500mM NaCl胁迫处理3-7d盐生草幼苗的叶片为材料，Trizol法提取总RNA，采用cDNA合成是试剂盒(大连宝生物工程有限公司生产)反转录合成cDNA第一链，扩增该基因片段，PCR反应体系为dNTP Mixture(2.5mM)2ul，10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus)_2.5ul，上游引物5’-GGGGTACCACCCCCATACTCTCGTAACCCTATA-3’10μM 1ul，下游引物5’-CGGGATCCAGTCGAAACATACTTCCCATTAAAG-3’10μM 1ul，cDNA 1ul，Ex Taq酶(5U/ul)0.2ul，ddH2O 17.3ul，总体积25ul。
扩增程序为94℃4min，94℃50s，59.0-59.5℃30s，72℃25s，共32-35个循环，72℃延伸8min。PCR扩增产物电泳如图1所示，按照说明书步骤，利用胶回收试剂盒(大连宝生物工程有限公司；Gel Extraction Mini Kit)回收PCR产物，接着将回收产物与pMD19-T(大连宝生物工程有限公司)载体连接，得到重组质粒pMD19-HgS4，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选蓝白斑并测序，PCR测定序列如SEQ ID NO.1：
对HgS4再次进行PCR扩增，并连接到T-载体测序，测序结果同SEQ ID NO.1。提取含有HgS4基因的T-载体和植物表达载体pCAMBIA3301质粒DNA并用Kpn I和BamH I两种内切酶对所提质粒进行双酶切，酶切体系Kpn I 1ul，BamH I 1ul，10×T 3ul，BSA 2ul，质粒DNA4ul，ddH2O 9ul，总体积20μL在37℃酶切2-2.5h，并对酶切产物进行纯化。
接着用T4 DNA连接酶，对纯化回收的载体及目的片段进行连接，连接体系为10×T4 DNA Ligase 1ul，目的片段HgS4基因7ul，载体pCAMBIA3301(甘肃农业大学干旱生境作物学重点实验室保存)DNA 1ul，总体积9μL。在65℃水浴保温3min，即可冰浴1-2min，然后加T4 DNA Ligase 1ul于16℃连接12-16h。将链接好的重组质粒pCAMBIA3301-HgS4转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选蓝白斑并测序。
同时对重组质粒在37℃酶切2-2.5h，其双酶切体系Kpn I 1μL，BamH I 1μL，10×T2μL，BSA 2μL，质粒DNA 6μL，ddH2O 8μL，总体积20μL。并对双酶切产物进行电泳检测。
所述的盐生草抗旱基因Hg.S4在提高植物抗旱性中的应用。
本发明中重组质粒pCAMBIA3301-HgS4，所述质粒为插入SEQ ID NO.1所示的HgS4基因cDNA的核苷酸序列或cDNA编码序列。同样，任何可以将外源基因导入植物的表达载体都可用于本发明。
本发明提供的抗旱基因HgS4的作用主要体现在可提高植物抗旱性，可广泛运用于抗旱作物、植物新品种(系)的选育。
本发明的有益效果在于首次从抗旱、耐盐植物盐生草中克隆到一个新的抗旱基因，进一步转化拟南芥进行抗旱性鉴定，结果发现转化HgS4基因的拟南芥株系抗旱性优异。同时HgS4其分子量仅为619bp，编码蛋白只含有37氨基酸，更方便于遗传转化操作，本发明中抗旱基因的获得为抗旱作物和植物新品种(系)培育提供了珍贵的基因资源。
附图说明：
图1HgS4基因cDNA编码核苷酸序列的扩增结果。M:D1000 Marker；1-2为HgS4基因PCR产物。
图2导入pCAMBIA3301-HgS4质粒的农杆菌PCR鉴定。1-2均为单克隆摇菌的菌液编号，“M”为Marker，“-”为空白对照，“+”为质粒，。
图3转化HgS4基因拟南芥T2代阳性植株分子检测结果。M：DL2000 Marker；4-24：抗性苗PCR产物；“WT”：野生型拟南芥；“+”：质粒；“-”：空白对照。
图4转化HgS4 T2代株系在自然干旱胁迫下的生长状态。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下面对本发明的内容进行详细的说明。
以下的实施例便于更好地理解本发明，并不是限制本发明。下面实施例的实验方法等，若无特殊说明，均为常规方法。
实施例1：所述的盐生草抗旱基因Hg.S4的制备方法，其主要特点在于步骤为：
以200mM NaCl胁迫处理7d的盐生草幼苗叶片为材料，Trizol法提取总RNA，采用cDNA合成是试剂盒(大连宝生物工程有限公司生产)反转录合成cDNA第一链，根据HgS4的序列设计上、下游引物F1(5’-ACCCCCATACTCTCGTAACCCTATA-3’)和R1(5’-AGTCGAAACATACTTCCCATTAAAG-3’)由上海生工生物工程公司合成。扩增该基因片段，PCR反应体系为dNTP Mixture(2.5mM)2ul，10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus)2.5ul，上游引物5’-ACCCCCATACTCTCGTAACCCTATA-3’10μM 1ul，下游引物5’-AGTCGAAACATACTTCCCATTAAAG-3’10μM 1ul，cDNA 1ul，Ex Taq酶(5U/ul)0.2ul，ddH2O 17.3ul，总体积25ul。
扩增程序为94℃4min，94℃50s，59.5℃30s，72℃25s，共35个循环，72℃延伸8min。PCR扩增产物电泳如图1所示，按照说明书步骤，利用胶回收试剂盒(大连宝生物工程有限公司；Gel Extraction Mini Kit)回收PCR产物，接着将回收产物与pMD19-T(大连宝生物工程有限公司)载体连接，得到重组质粒pMD19-HgS4，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选蓝白斑并测序，PCR测定序列如SEQ ID NO.1：
分离到Hg.S4基因cDNA的核苷酸序列SEQ ID NO.1如下，分子量为619bp；
所述的盐生草抗旱基因Hg.S4的编码序列为上述基因中第228至第341位所述的核苷酸序列如下，分子量为114bp：
所述的盐生草抗旱基因Hg.S4的编码序列编码的蛋白质氨基酸序列，由37个氨基酸组成：
实施例2：所述的盐生草抗旱基因Hg.S4的制备方法，其主要特点在于步骤为：
以500mM NaCl胁迫处理3d盐生草幼苗的叶片为材料，Trizol法提取总RNA，采用cDNA合成试剂盒(大连宝生物工程有限公司)，反转录合成cDNA第一链，扩增该基因片段，PCR反应体系为dNTP Mixture 2.5mM 2ul，10×Ex Taq Buffer Mg2+Plus 2.5ul，上游引物5’-ACCCCCATACTCTCGTAACCCTATA-3’10μM 1ul，下游引物5’-AGTCGAAACATACTTCCCATTAAAG-3’10μM 1ul，cDNA 1ul，Ex Taq酶5U/ul 0.2ul，ddH2O 17.3ul，总体积25ul；
扩增程序为94℃4min，94℃50s，59.0℃30s，72℃25s，共32个循环，72℃延伸8min；利用胶回收试剂盒(大连宝生物工程有限公司；Gel Extraction Mini Kit)回收PCR产物，接着将回收产物与pMD19-T(大连宝生物工程有限公司)载体连接，得到重组质粒pMD19-HgS4，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选蓝白斑并测序。PCR测定序列如SEQ ID NO.1。
实施例3：所述的盐生草抗旱基因HgS4表达载体的构建方法，其步骤为：
在所述的盐生草抗旱基因HgS4的上下游引物上分别添加Kpn I和BamH I这两个酶切位点，上游引物F1为5’-GGGGTACCACCCCCATACTCTCGTAACCCTATA-3’、下游引物R1为5’-CGGGATCCAGTCGAAACATACTTCCCATTAAAG-3’；
以300mM NaCl胁迫处理5d盐生草幼苗的叶片为材料，Trizol法提取总RNA，采用cDNA合成是试剂盒(大连宝生物工程有限公司生产)反转录合成cDNA第一链，扩增该基因片段，PCR反应体系为dNTP Mixture(2.5mM)2ul，10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus)2.5ul，上游引物5’-GGGGTACCACCCCCATACTCTCGTAACCCTATA-3’10μM 1ul，下游引物5’-CGGGATCCAGTCGAAACATACTTCCCATTAAAG-3’10μM 1ul，cDNA 1ul，Ex Taq酶(5U/ul)0.2ul，ddH2O 17.3ul，总体积25ul。
扩增程序为94℃4min，94℃50s，59.0-59.5℃30s，72℃25s，共35个循环，72℃延伸8min。PCR扩增产物电泳如图1所示，按照说明书步骤，利用胶回收试剂盒(大连宝生物工程有限公司；Gel Extraction Mini Kit)回收PCR产物，接着将回收产物与pMD19-T(大连宝生物工程有限公司)载体连接，得到重组质粒pMD19-HgS4，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选蓝白斑并测序，PCR测定序列如SEQ ID NO.1：
对HgS4再次进行PCR扩增，并连接到T-载体测序，测序结果同SEQ ID NO.1。提取含有HgS4基因的T-载体和植物表达载体pCAMBIA3301质粒DNA并用Kpn I和BamH I两种内切酶对所提质粒进行双酶切，酶切体系Kpn I 1ul，BamH I 1ul，10×T 3ul，BSA 2ul，质粒DNA4ul，ddH2O 9ul，总体积20μL在37℃酶切2h，并对酶切产物进行纯化。
接着用T4 DNA连接酶，对纯化回收的载体及目的片段进行连接，连接体系为10×T4 DNA Ligase 1ul，目的片段HgS4基因7ul，载体pCAMBIA3301(甘肃农业大学干旱生境作物学重点实验室保存)DNA 1ul，总体积9μL。在65℃水浴保温3min，即可冰浴1-2min，然后加T4 DNA Ligase 1ul于16℃连接12h。将链接好的重组质粒pCAMBIA3301-HgS4转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选蓝白斑并测序。
同时对重组质粒在37℃酶切2h，其双酶切体系Kpn I 1μL，BamH I 1μL，10×T 2μL，BSA 2μL，质粒DNA 6μL，ddH2O 8μL，总体积20μL。并对双酶切产物进行电泳检测。
实施例4：所述的盐生草抗旱基因HgS4表达载体的构建方法，其步骤为：
根据表达载体构建的需要，在上述实施例1基因HgS4的上下游引物上分别添加KpnI和BamH I这两个酶切位点，上游引物F1为5’-GGGGTACCACCCCCATACTCTCGTAACCCTATA-3’、下游引物R1为5’-CGGGATCCAGTCGAAACATACTTCCCATTAAAG-3’，(由上海生工生物工程公司)。
以500mM NaCl胁迫处理5d的盐生草幼苗叶片为材料，Trizol法提取总RNA，采用cDNA合成是试剂盒(大连宝生物工程有限公司生产)反转录合成cDNA第一链，扩增该基因片段，PCR反应体系为dNTP Mixture(2.5mM)2ul，10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus)2.5ul，上游引物5’-GGGGTACCACCCCCATACTCTCGTAACCCTATA-3’10μM 1ul，下游引物5’-CGGGATCCAGTCGAAACATACTTCCCATTAAAG-3’10μM 1ul，cDNA 1ul，Ex Taq酶(5U/ul)0.2ul，ddH2O 17.3ul，总体积25ul。
扩增程序为94℃4min，94℃50s，59.0℃30s，72℃25s，共32个循环，72℃延伸7min。PCR扩增产物电泳如图1所示，按照说明书步骤，利用胶回收试剂盒(大连宝生物工程有限公司；Gel Extraction Mini Kit)回收PCR产物，接着将回收产物与pMD19-T(大连宝生物工程有限公司)载体连接，得到重组质粒pMD19-HgS4，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选蓝白斑并测序，PCR测定序列如SEQ ID NO.1：
对HgS4再次进行PCR扩增，并连接到T-载体测序，测序结果同SEQ ID NO.1。提取含有HgS4基因的T-载体和植物表达载体pCAMBIA3301质粒DNA并用Kpn I和BamH I两种内切酶对所提质粒进行双酶切，酶切体系Kpn I 1ul，BamH I 1ul，10×T 3ul，BSA 2ul，质粒DNA4ul，ddH2O 9ul，总体积20μL在37℃酶切2.0h，并对酶切产物进行纯化。
接着用T4 DNA连接酶，对纯化回收的载体及目的片段进行连接，连接体系为10×T4 DNA Ligase 1ul，目的片段HgS4基因7ul，载体pCAMBIA3301(甘肃农业大学干旱生境作物学重点实验室保存)DNA 1ul，总体积9μL。在65℃水浴保温3min，即可冰浴1-2min，然后加T4 DNA Ligase 1ul于16℃连接12h。将链接好的重组质粒pCAMBIA3301-HgS4转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选蓝白斑并测序，确认。
同时对重组质粒在37℃酶切2.5h，其双酶切体系Kpn I 1μL，BamH I 1μL，10×T 2μL，BSA 2μL，质粒DNA 6μL，ddH2O 8μL，总体积20μL。并对双酶切产物进行电泳检测。
实施例5农杆菌拟南芥转化与培养方法
制备LBA4404农杆菌并活化，将重组质粒pCAMBIA3301-HgS4转入感受态农杆菌中(见图2)，制备农杆菌浸染液，采用蘸花法侵染拟南芥花序，然后将侵染的植株覆盖塑料薄膜避光培养24h后移至温室中常规培养，待拟南芥成熟后分单株收获种子。收获的拟南芥种子低温处理、灭菌后撒播在含抗生素Kan(50ug/ml)的1/2MS固体培养基中筛选抗性苗，并移栽培养，待幼苗长大后，剪取植株叶片提取RNA，用实施例1中HgS4基因上下游引物扩增表达载体pCAMBIA3301-HgS4中HgS4基因片段。连续筛选抗生素Kan筛选，并进行目标基因PCR检测(见图3)，直到获得T2转HgS4基因拟南芥纯系。
实施例6转HgS4基因拟南芥抗旱性鉴定
将实施例5中获得T2转HgS4基因拟南芥纯系植株和野生型拟南芥(Col-1)种子播种于培养基质(草炭：蛭石：珍珠岩为1:3:0.5体积比混合)中，在人工温室中培养，待幼苗长至1个月后，停止浇灌营养液，进行自然干旱处理，并观察幼苗生长情况，结果发现，转HgS4基因拟南芥生长速度明显快于野生型拟南芥，在干旱处理11d时(土壤含水量降到至12.18％)，野生型拟南芥植株严重萎蔫，到13d时(土壤含水量降至7.16％)已完全干枯，在复水后无生命现象，全部死亡；而转HgS4基因拟南芥抗旱性良好，复水5d后，植株均长出新叶芽，能够继续存活(见图4)。由此，HgS4基因能够显著提高拟南芥抗旱性，该基因可用于植物或作物抗旱育种。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 甘肃农业大学
<120> 盐生草抗旱基因Hg.S4及其应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 619
<212> DNA
<213> 盐生草抗旱基因Hg.S4
<400> 1
gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaccca acccccatac tctcgtaacc ctataatggc 60
ttagttcccc acaaccctca attcctccca tccgccactc tcatccttaa tttctctcat 120
ctgacctcct ttccctcatc gccatctctt atcctcctct ctcatcttca tcttctttct 180
caccctcaat tcctccctca tcccccacat ccgacgtttc tctctcaatg cgaggcatca 240
ttgcccacca ctttcagctc aggcgtgagt ttacgatgaa tccttcgaag atttcgagga 300
agttgacctt aaaacaattg ctaaagcttc ttataatgtg aaatttgata aaattatttt 360
gattggtaag ttttaacaga ttaaggtttc aattttttat tcctctcttt tgtttgttcg 420
gaattgtgag ttttcgatta ttgtagatat gaaattggtt tgcttacttt tttatttggg 480
tcaaattact ttacattttg atccagttac atcataattc ttgatttgta tcttaatcct 540
atgatctgac tcaatttcat ctttaatggg aagtatgttt cgactaaaaa aaaaaaaaaa 600
aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 619
<210> 2
<211> 114
<212> DNA
<213> 盐生草抗旱基因Hg.S4的编码序列
<400> 2
atgcgaggca tcattgccca ccactttcag ctcaggcgtg agtttacgat gaatccttcg 60
aagatttcga ggaagttgac cttaaaacaa ttgctaaagc ttcttataat gtga 114
<210> 3
<211> 37
<212> PRT
<213> MRGIIAHHFQLRREFTMNPSKISRKLTLKQLLKLLIM
<400> 3
Met Arg Gly Ile Ile Ala His His Phe Gln Leu Arg Arg Glu Phe Thr
1 5 10 15
Met Asn Pro Ser Lys Ile Ser Arg Lys Leu Thr Leu Lys Gln Leu Leu
20 25 30
Lys Leu Leu Ile Met
35

Claims (7)

1.一种盐生草抗旱基因Hg.S4，其特征在于从盐生草叶片中分离到Hg.S4基因cDNA的核苷酸序列如下，分子量为619bp；
2.如权利要求1所述的盐生草抗旱基因Hg.S4，其特征在于所述的盐生草抗旱基因Hg.S4的编码序列为权利要求1中第228位至第341位，所述的核苷酸序列如下，分子量为114bp：
。
3.如权利要求2所述的盐生草抗旱基因Hg.S4，其特征在于所述的盐生草抗旱基因Hg.S4的编码序列的蛋白质氨基酸序列，由37个氨基酸组成：
4.如权利要求1所述的盐生草抗旱基因HgS4，其特征在于特异引物为：
HgS4-F1 5’-ACCCCCATACTCTCGTAACCCTATA-3’
HgS4-R1 5’-AGTCGAAACATACTTCCCATTAAAG-3’。
5.如权利要求1所述的盐生草抗旱基因Hg.S4的制备方法，其特征在于步骤为：
以200-500mM NaCl胁迫处理3-7d盐生草幼苗的叶片为材料，Trizol法提取总RNA，采用cDNA合成试剂盒，反转录合成cDNA第一链，扩增该基因片段，PCR反应体系为dNTP Mixture2.5mM2ul，10×Ex Taq Buffer Mg2+Plus 2.5ul，上游引物5’-ACCCCCATACTCTCGTAACCCTATA-3’10μM 1ul，下游引物5’-AGTCGAAACATACTTCCCATTAAAG-3’10μM 1ul，cDNA 1ul，Ex Taq酶5U/ul 0.2ul，ddH2O 17.3ul，总体积25ul；
扩增程序为94℃4min，94℃50s，59.0-59.5℃30s，72℃25s，共32-35个循环，72℃延伸7-8min；利用胶回收试剂盒回收PCR产物，接着将回收产物与pMD19-T载体连接，得到重组质粒pMD19-HgS4，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选蓝白斑并测序。
6.如权利要求1所述的盐生草抗旱基因HgS4表达载体的构建方法，其特征在于步骤为：
在所述的盐生草抗旱基因HgS4的上下游引物上分别添加Kpn I和BamH I这两个酶切位点，上游引物F1为5’-GGGGTACCACCCCCATACTCTCGTAACCCTATA-3’、下游引物R1为5’-CGGGATCCAGTCGAAACATACTTCCCATTAAAG-3’；
以200-500mM NaCl胁迫处理3-7d盐生草幼苗的叶片为材料，Trizol法提取总RNA，采用cDNA合成试剂盒，反转录合成cDNA第一链，扩增该基因片段，PCR反应体系为dNTP Mixture2.5mM 2ul，10×Ex Taq Buffer Mg2+Plus 2.5ul，上游引物5’-GGGGTACCACCCCCATACTCTCGTAACCCTATA-3’10μM 1ul，下游引物5’-CGGGATCCAGTCGAAACATACTTCCCATTAAAG-3’10μM 1ul，cDNA 1ul，Ex Taq酶5U/ul0.2ul，ddH2O 17.3ul，总体积25ul；
扩增程序为94℃4min，94℃50s，59.0-59.5℃30s，72℃25s，共32-35个循环，72℃延伸7-8min:按照说明书步骤，利用胶回收试剂盒回收PCR产物，接着将回收产物与pMD19-T载体连接，得到重组质粒pMD19-HgS4，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选蓝白斑并测序：
对HgS4再次进行PCR扩增，并连接到T-载体测序；提取含有HgS4基因的T-载体和植物表达载体pCAMBIA3301质粒DNA并用Kpn I和BamH I两种内切酶对所提质粒进行双酶切，酶切体系Kpn I 1ul，BamH I 1ul，10×T 3ul，BSA 2ul，质粒DNA 4ul，ddH2O 9ul，总体积20μL在37℃酶切2.5h，并对酶切产物进行纯化；
接着用T4DNA连接酶，对纯化回收的载体及目的片段进行连接，连接体系为10×T4DNALigase 1ul，目的片段HgS4基因7ul，载体pCAMBIA3301DNA 1ul，总体积9μL。在65℃水浴保温3min，即可冰浴1-2min，然后加T4DNA Ligase 1ul于16℃连接12-16h；将链接好的重组质粒pCAMBIA3301-HgS4转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选蓝白斑并测序；
同时对重组质粒在37℃酶切2-2.5h，其双酶切体系Kpn I 1μL，BamH I1μL，10×T 2μL，BSA 2μL，质粒DNA 6μL，ddH2O 8μL，总体积20μL。
7.如权利要求1或2所述的盐生草抗旱基因Hg.S4在提高植物抗旱性中的应用。
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