CN116694623B - 用于从微量动物或植物组织中同时快速高效提取dna、rna以及蛋白质的裂解液及其提取方法 - Google Patents

用于从微量动物或植物组织中同时快速高效提取dna、rna以及蛋白质的裂解液及其提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于从微量动物或植物组织中同时快速高效提取DNA、RNA以及蛋白质的裂解液，其由柠檬酸、EDTA、NaCl、表面活性剂、胍盐和RNA保护剂组成，其中，表面活性剂为十二烷基肌氨酸钠。本发明还公开了所述的裂解液从微量动物或植物组织中同时快速高效提取DNA、RNA以及蛋白质的提取方法。本发明的裂解液能够实现从一块组织中同时提取DNA、RNA以及蛋白质，不仅可以节省宝贵的样本，特别是人体样本，同时由于三者均来源于同一块组织，避免了选取组织部位的不同造成的差异，使得实验结果更准确，且提取的DNA、RNA以及蛋白质得率均比现有试剂盒的高，完整性较好，纯度较高。

Description

用于从微量动物或植物组织中同时快速高效提取DNA、RNA以 及蛋白质的裂解液及其提取方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及用于从微量动物或植物组织中同时快速高效提取DNA、RNA以及蛋白质的裂解液及其提取方法。
背景技术
临床样本是医学研究的珍贵资源，其中蕴藏着丰富的DNA、RNA以及蛋白质的变化。但是，临床样本的获得十分有限，往往在毫克级。能够从一块组织中同时提取DNA、RNA以及蛋白质，不仅可以节省宝贵的样本，同时由于三者均来源于同一块组织，避免了选取组织部位的不同造成的差异，使得实验结果更有说服力。然而，由于获取组织来源DNA、RNA和蛋白质的方法和原理差异，目前，现有技术中，同时在微量组织中提取DNA、RNA和蛋白的技术方法仍不成熟，具体包括：
1、传统的有Trizol的方法(来源赛默飞公司)，对于RNA会有较好的得率和纯度，但是DNA和蛋白的质量差。
2、市售有天根的试剂盒的方法，其DNA提取质量尚可，但在提取RNA的纯度和完整性以及提取蛋白质的量方面存在一定的不足。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种用于从微量动物或植物组织中同时快速高效提取DNA、RNA以及蛋白质的裂解液，其实现了从一块组织中同时提取DNA、RNA以及蛋白质，不仅可以节省宝贵的样本，同时由于三者均来源于同一块组织，避免了选取组织部位的不同造成的差异，使得实验结果更准确。
本发明还有另外一个目的是提供一种采用裂解液从微量动物或植物组织中同时快速高效提取DNA、RNA以及蛋白质的提取方法，其通过采用上述裂解液，同时提取了得率高、完整性较好，纯度较高的DNA、RNA以及蛋白质。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种用于从微量动物或植物组织中同时快速高效提取DNA、RNA以及蛋白质的裂解液，其由柠檬酸、EDTA、NaCl、表面活性剂、胍盐和RNA保护剂组成；
其中，柠檬酸在裂解液中的浓度为40～60mM；
EDTA在裂解液中的浓度为10～30mM；
NaCl在裂解液中的浓度为1.0～2.0M；
表面活性剂为十二烷基肌氨酸钠，其在裂解液中的质量体积比为1.0～2.0％；
胍盐在裂解液中的质量浓度为250～300g/L；
RNA保护剂在裂解液中的浓度为10～40mM；
所述裂解液的pH为5～7。
优选的是，其中，柠檬酸在裂解液中的浓度为50mM；EDTA在裂解液中的浓度为20mM；NaCl在裂解液中的浓度为1.4M；十二烷基肌氨酸钠表面活性剂在裂解液中的质量体积比为1.5％；胍盐在裂解液中的质量浓度为274g/L；RNA保护剂在裂解液中的浓度为20mM；所述裂解液的pH为6.4。
优选的是，其中，RNA保护剂为β-巯基乙醇、RNase抑制剂、RNAlater、DNaseI或RVC。
优选的是，其中，胍盐为异硫氰酸胍。
优选的是，其中，RNA保护剂为RVC。
本发明的目的还可以进一步由采用裂解液从微量动物或植物组织中同时快速高效提取DNA、RNA以及蛋白质的裂解液的提取方法来实现，其包括如下步骤：
步骤一、样品前处理：采用裂解液对样品进行裂解处理得裂解产物；
步骤二、DNA提取：将步骤一所得裂解产物12,000rpm室温离心1min，取上清液加入DNA吸附柱中，室温静置2min；12,000rpm室温离心1min，保留穿透液用于RNA和蛋白质提取；DNA吸附柱中加入DNA洗涤液、离心两次后，将吸附柱转移到无菌离心管中，加入TE，室温静置2min，离心得DNA，-20℃存放；
步骤三、RNA提取：将步骤二所得穿透液加入RNA纯化液中，混匀、12,000rpm室温离心1min，取上清液转移到RNase-free离心管中，保留下层液体用于蛋白质提取，在上清液中加入与其等体积的异丙醇，混匀，转移到RNA吸附柱中，静置、离心，加入DNA清除液，静置、离心得穿透液，向穿透液中加入去蛋白液，混匀，加入到RNA吸附柱中，离心，弃穿透液，向RNA吸附柱中加入RNA洗涤液，离心两次后，将RNA吸附柱转移到新得RNase-free离心管中，加入DNase&RNase-free水，静置，离心、洗脱得RNA，-80℃存放；
步骤四、蛋白质提取：在步骤三所得的下层液体中加入其1.5倍体积的异丙醇，静置、离心去除上清液，沉淀中加入蛋白洗涤液重悬，室温孵育、离心、弃上清液、重复洗涤一次，向沉淀中加入无水乙醇，重悬、室温静置、离心、弃上清液，室温晾干沉淀得蛋白质，-80℃存放。
优选的是，其中，步骤二中，DNA洗涤液由NaCl、Tris-HCl、水和乙醇组成。
优选的是，其中，步骤二中，离心两次具体包括：12,000rpm室温离心1min，弃穿透液；将DNA吸附柱12,000rpm室温离心30s，以甩干DNA洗涤液中的乙醇。
优选的是，其中，步骤三中，离心两次具体包括：12,000rpm，4℃下离心1min；将结合有RNA的纯化柱于12,000rpm，4℃下离心1min，以甩干RNA洗涤液中的乙醇。
优选的是，其中，步骤四中，蛋白洗涤液由0.3M盐酸胍溶于95％乙醇制成。
本发明至少包括以下有益效果：
1、本发明用于从微量动物或植物组织中同时快速高效提取DNA、RNA以及蛋白质的裂解液能够实现从一块组织中同时提取DNA、RNA以及蛋白质，不仅可以节省宝贵的样本，同时由于三者均来源于同一块组织，避免了选取组织部位的不同造成的差异，使得实验结果更有说服力。
2、本发明用于从微量动物或植物组织中同时快速高效提取DNA、RNA以及蛋白质的裂解液的柠檬酸组分可以有效提取DNA和RNA，并有一定的试剂稳定作用。常规的裂解液中的Tris-HCl特别用于DNA的提取(常规的SDS提取法，CTAB提取法)，对于RNA的提取效果欠佳；乙酸-乙酸钠特别用于RNA的提取(比如Trizol)，对于DNA的提取差一些。
3、本发明的用于从微量动物或植物组织中同时快速高效提取DNA、RNA以及蛋白质的裂解液组分中采用十二烷基肌氨酸钠(SLS)替代了SDS，可以有效避免SDS在低温的洗出，在兼具裂解效果的基础上，提高了裂解液的使用便捷性。
4、本发明的用于从微量动物或植物组织中同时快速高效提取DNA、RNA以及蛋白质的裂解液添加剂RVC，在异硫氰酸胍抑制蛋白活性的保障下，保护RNA的完整性。
5、本发明的用于从微量动物或植物组织中同时快速高效提取DNA、RNA以及蛋白质的裂解液中优化控制异硫氰酸胍(胍盐)的浓度，避免浓度太高，DNA和RNA均会被截留在硅胶膜上；浓度太低，会导致DNA不能截留。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为采用传统Trizol法对水稻叶片、大鼠心脏和大鼠肝脏进行提取的DNA电泳图；
图2为采用传统Trizol法对水稻叶片、大鼠心脏和大鼠肝脏进行提取的RNA电泳图；
图3为采用本发明裂解液以及提取方法对水稻叶片、大鼠心脏和大鼠肝脏进行提取的DNA电泳图；
图4为采用本发明裂解液以及提取方法对水稻叶片、大鼠心脏和大鼠肝脏进行提取的RNA电泳图；
图5为采用本发明裂解液以及提取方法对水稻叶片、大鼠心脏和大鼠肝脏进行提取的蛋白质电泳图；
图6为采用现有试剂盒和本发明裂解液提取基因组DNA电泳对比图；
图7为采用现有试剂盒和本发明裂解液提取RNA电泳对比图；
图8为采用现有试剂盒和本发明裂解液提取总蛋白电泳对比图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
<实施例1>
一种用于从微量动物或植物组织中同时快速高效提取DNA、RNA以及蛋白质的裂解液，其包括柠檬酸、EDTA、NaCl、十二烷基肌氨酸钠(SLS)、异硫氰酸胍和RVC；
其中，柠檬酸在裂解液中的浓度为50mM；
EDTA在裂解液中的浓度为20mM；
NaCl在裂解液中的浓度为1.4M；
SLS在裂解液中的质量体积比为1.5％；
异硫氰酸胍在裂解液中的质量浓度为274g/L；
RVC在裂解液中的浓度为20mM；
裂解液的pH为6.4。
<实施例2>
一种用于从微量动物或植物组织中同时快速高效提取DNA、RNA以及蛋白质的裂解液，其包括柠檬酸、EDTA、NaCl、十二烷基肌氨酸钠(SLS)、异硫氰酸胍和RVC；
其中，柠檬酸在裂解液中的浓度为40mM；
EDTA在裂解液中的浓度为10mM；
NaCl在裂解液中的浓度为1.0M；
SLS在裂解液中的质量体积比为1.0％；
异硫氰酸胍在裂解液中的质量浓度为250g/L；
RVC在裂解液中的浓度为10mM；
裂解液的pH为5。
<实施例3>
一种用于从微量动物或植物组织中同时快速高效提取DNA、RNA以及蛋白质的裂解液，其包括柠檬酸、EDTA、NaCl、十二烷基肌氨酸钠(SLS)、异硫氰酸胍和RVC；
其中，柠檬酸在裂解液中的浓度为60mM；
EDTA在裂解液中的浓度为30mM；
NaCl在裂解液中的浓度为2.0M；
SLS在裂解液中的质量体积比为2.0％；
异硫氰酸胍在裂解液中的质量浓度为300g/L；
RVC在裂解液中的浓度为40mM；
裂解液的pH为7。
<实施例4>
一种采用实施例1中裂解液从微量动物或植物组织中同时快速高效提取DNA、RNA的提取方法，其包括如下步骤：
步骤一、样品前处理：采用裂解液对样品进行裂解处理得裂解产物；
1、对贴壁细胞(10平方厘米)：吸尽培养液，加入600μL的裂解液用枪充分吹打确保细胞全部裂解，然后将裂解液转移至干净的1.5mL塑料离心管中；
2、对悬浮细胞(五百万至一千万个)：离心收集细胞，吸尽液体，加入600μL的裂解液，用枪充分吹打确保细胞全部裂解，然后将裂解液转移到干净的1.5mL塑料离心管中；
3、对新鲜组织(50-100mg)：将新鲜组织剪切成小块(0.5cm3)，放入10mL或15mL塑料离心管中，加入600μL的裂解液，用匀浆器匀浆充分，将匀浆液转移至新的1.5mL塑料离心管中；注意：对肝、脾、胰、肾等细胞分裂十分旺盛的组织，使用量不要超过30-50mg。(如无匀浆条件，可以将组织液氮研磨之后，加入600μL的裂解液，用枪充分吹打确保细胞全部裂解，然后将裂解液转移到干净的1.5mL塑料离心管中；
4、可选方案：如匀浆或者研磨之后的裂解液中有很多悬浮或者不溶物(如肌肉，植物块茎等组织)，请将匀浆液于室温10,000rpm下离心10min。将上清转移至新的离心管中；
步骤二、DNA提取：
1、步骤一所得裂解产物12,000rpm室温下离心1min，取上清加入DNA吸附柱中，室温静置2min；
2、12,000rpm室温下离心1min，保留穿透液(穿透液含RNA和蛋白，可用于后续提取)，DNA结合在吸附柱中；
3、在DNA吸附柱中加入500μL的DNA洗涤液，12,000rpm室温离心1min，弃穿透液；其中，每升DNA洗涤液含：5M的NaCl(16mL)，1M的Tris-HCl(pH＝7.5，8mL)，水(176mL)和乙醇(800mL)；
4、将DNA吸附柱12,000rpm室温下离心30s，以甩干DNA洗涤液中的乙醇；
5、弃收集管，将吸附柱转移到新的1.5mL无菌离心管中，加入30-50μL的TE，室温放置2min，12,000rpm，室温下离心1min；
6、得到的DNA可直接用于后续实验或者-20℃存放；
步骤三、RNA提取：
1、在步骤二(2)中所得的穿透液中加入200μL RNA纯化液(酚氯仿异戊醇混合液：其中，体积百分占比，Tris饱和酚50％，氯仿48％，异戊醇2％)；
2、震荡混匀，12,000rpm室温下离心1min得上清液和下层液体，上清液用于RNA提取，下层液体(蛋白相)用于蛋白质提取；
3、将上清液(约500μL)转移到另一干净的2mL RNase-free离心管中，在上清液中加入等体积的异丙醇(自备)，颠倒混匀得混合液；
4、将混合液全部转移到RNA吸附柱中，室温静置2min，12,000rpm室温下离心2min；
5、在RNA吸附柱中加入50μL的DNA清除液(0.05U/μL DNase I，10mM Tris-HCl(pH＝7.5，25℃，2.5mM MgCl2,0.1mM CaCl2)，室温静置1min，12,000rpm室温下离心2min，保留穿透液；
6、向穿透液中加入500μL的去蛋白液(5M硫氰酸钾，0.5M乙酸钾，pH 5.5)混匀后，加入到步骤4中的RNA吸附柱中，12,000rpm室温下离心1min，弃穿透液；
7、向纯化柱中加入500μL RNA洗涤液(700mL乙醇，300mL DEPC水)，12,000rpm 4℃下离心1min；
8、将结合有RNA的纯化柱12,000rpm 4℃下离心1min，甩干乙醇；
9、弃收集管，将吸附柱转移到新的1.5mL RNase-free离心管中，加入30-50μLDNase&RNase-free水，室温放置1min，12,000rpm离心1min洗脱RNA；
10、得到的RNA可直接用于后续实验或者-80℃存放；
11、如果要提高RNA产量，加入30-50μL DNase&RNase-free水重复洗脱一次，合并两次穿透液；如果要提高RNA浓度，使用第一次的洗脱液加回到纯化柱中重复洗脱。
步骤四、蛋白质提取：
1、在步骤三(2)中所得的蛋白相中加入1.5倍体积(约600μL)的异丙醇(自备)，室温静置10min；
2、12,000rpm 4℃下离心10min，小心去除上清液，沉淀为蛋白质；
3、取1mL蛋白洗涤液重悬蛋白质沉淀，室温孵育2min，12,000rpm 4℃下离心5min；弃上清液，重复洗涤一次；
4、向沉淀中加入1mL无水乙醇自备，重悬室温静置2min，12,000rpm室温下离心5min；
5、弃上清液，室温晾干5-10min，-80℃冻存。
<实施例5>
采用传统Trizol法、本发明实施例4提取方法提取水稻叶片小鼠心脏和大鼠肝脏DNA、RNA和蛋白的对比实验。
如图1为采用传统Trizol法对水稻叶片、大鼠心脏和大鼠肝脏进行提取的DNA的电泳图；图2为采用传统Trizol法对水稻叶片、大鼠心脏和大鼠肝脏进行提取的RNA电泳图，图3为采用本发明实施例4提取方法提取水稻叶片、大鼠心脏和大鼠肝脏进行提取的DNA的电泳图；图4为采用本发明实施例4提取方法提取水稻叶片、大鼠心脏和大鼠肝脏进行提取的RNA的电泳图；图5为采用本发明实施例4提取方法提取水稻叶片、大鼠心脏和大鼠肝脏进行提取的蛋白质的电泳图，其中，图中，Rice-1和Rice-2为水稻叶片，rat-1和rat-2为大鼠心脏组织；rat-3和rat-4为大鼠肝脏组织；图1、2、3和4中，M为DNAMarker；图5中，M为蛋白Marker；图中，DNA上样量均为3μL，RNA上样量均为0.5μL，蛋白上样量为5μL。
从图1-图5中结果可以看出，用Trizol法未提取出水稻叶片中的DNA，提取大鼠心脏和肝脏组织中的DNA纯度低，且稳定性差，Trizol法提取水稻叶片、大鼠心脏和肝脏中的RNA降解严重且有基因组的污染。
采用本发明实施例4提取方法提取水稻叶片、大鼠心脏和肝脏中的DNA、RNA和蛋白纯度高，稳定性强，效果好。
<实施例6>
现有国产共提试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司生产的DNA/RNA/蛋白质共提试剂盒(离心柱型))提取方法与本发明实施例4提取方法共同提取DNA、RNA和蛋白的对比实验。
图6为采用现有试剂盒和本发明裂解液提取基因组DNA电泳对比图；图7为采用现有试剂盒和本发明裂解液提取RNA电泳对比图；图8为采用现有试剂盒和本发明裂解液提取总蛋白电泳对比图。图中，TG-Rice为现有国产共提试剂盒提取的水稻叶DNA、RNA和蛋白，LJ-Rice为本发明实施例4提取方法提取的水稻DNA、RNA和蛋白，TG-Wheat为现有国产共提试剂盒提取的小麦叶片DNA、RNA和蛋白，LJ-Wheat为本发明实施例4提取方法提取的小麦叶片DNA、RNA和蛋白，TG-Rat为现有国产共提试剂盒提取的大鼠肝脏DNA、RNA和蛋白，LJ-Rat为本发明实施例4提取方法提取的大鼠肝脏DNA、RNA和蛋白；图6和图7中，M为DNAMarker；图8中，M为蛋白Marker。图中DNA上样量均为3μL，RNA上样量均为0.5μL，蛋白上样量均为5μL。
从图6-图8可以看出，采用现有国产共提试剂盒提取水稻叶片、小麦叶片和大鼠肝脏的DNA和RNA完整性好、但是得率低、且不稳定，未提取出蛋白。
采用本发明实施例4提取方法提取水稻叶片、小麦叶片和大鼠肝脏的DNA、RNA和蛋白得率，均比某国产试剂盒高，且完整性较好，纯度较高。
综上，本发明的裂解液能够从一块组织中同时提取DNA、RNA以及蛋白质，不仅可以节省宝贵的样本，且提取DNA和RNA完整性好，得率高，纯度较高。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (3)

1.一种从微量动物或植物组织中同时快速高效提取DNA、RNA的提取方法，其包括如下步骤：
步骤一、样品前处理：采用裂解液对样品进行裂解处理得裂解产物；其中，所述裂解液由柠檬酸、EDTA、NaCl、表面活性剂、胍盐和RNA保护剂组成，柠檬酸在裂解液中的浓度为40～60mM；EDTA在裂解液中的浓度为10～30mM；NaCl在裂解液中的浓度为1.0～2.0M；表面活性剂为十二烷基肌氨酸钠，其在裂解液中的质量体积比为1.0～2.0％；胍盐在裂解液中的质量浓度为250～300g/L；RNA保护剂在裂解液中的浓度为10～40mM；所述裂解液的pH为5～7；其中，RNA保护剂为β-巯基乙醇、RNase抑制剂、RNAlater或RVC；胍盐为异硫氰酸胍；
步骤二、DNA提取：将步骤一所得裂解产物12,000rpm室温离心1min，取上清液加入DNA吸附柱中，室温静置2min；12,000rpm室温离心1min，保留穿透液用于RNA和蛋白质提取；DNA吸附柱中加入DNA洗涤液、离心两次后，将吸附柱转移到无菌离心管中，加入TE，室温静置2min，离心得DNA，-20℃存放；其中，每升DNA洗涤液含：5M的NaCl：16mL，1M的Tris-HCl：pH＝7.5，8mL，水：176mL，乙醇：800mL；
步骤三、RNA提取：将步骤二所得穿透液加入RNA纯化液中，混匀、12,000rpm室温离心1min，取上清液转移到RNase-free离心管中，保留下层液体用于蛋白质提取，在上清液中加入与其等体积的异丙醇，混匀，转移到RNA吸附柱中，静置、离心，加入DNA清除液，静置、离心得穿透液，向穿透液中加入去蛋白液，混匀，加入到RNA吸附柱中，离心，弃穿透液，向RNA吸附柱中加入RNA洗涤液，离心两次后，将RNA吸附柱转移到新得RNase-free离心管中，加入DNase&RNase-free水，静置，离心、洗脱得RNA，-80℃存放；其中，去蛋白液为5M硫氰酸钾和0.5M乙酸钾，去蛋白液的pH为5.5；
步骤四、蛋白质提取：在步骤三所得的下层液体中加入其1.5倍体积的异丙醇，静置、离心去除上清液，沉淀中加入蛋白洗涤液重悬，室温孵育、离心、弃上清液、重复洗涤一次，向沉淀中加入无水乙醇，重悬、室温静置、离心、弃上清液，室温晾干沉淀得蛋白质，-80℃存放；其中，蛋白洗涤液由0.3M盐酸胍溶于95％的乙醇制成。
2.如权利要求1所述的提取方法，其中，步骤二中，离心两次具体包括：12,000rpm室温离心1min，弃穿透液；将DNA吸附柱12,000rpm室温离心30s，以甩干DNA洗涤液中的乙醇。
3.如权利要求1所述的提取方法，其中，步骤三中，离心两次具体包括：12,000rpm，4℃下离心1min；将结合有RNA的纯化柱于12,000rpm，4℃下离心1min，以甩干RNA洗涤液中的乙醇。
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