CN101182343A - 动物关节软骨组织总rna提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种动物关节软骨组织总RNA提取方法，该方法有以下步骤：(1)取动物关节软骨组织，研磨，加入变性液，β－巯基乙醇，匀浆；(2)冰水浴下，加酸性水饱和酚，摇匀，加醋酸钠，氯仿、异戊醇混合液，冰水浴上15min；(3)4℃下，离心，取上清液，加氯仿、异戊醇混合液，离心取上清，加异丙醇，－20℃下沉淀，离心，得到凝胶状RNA和蛋白多糖混合沉淀，加无RNA酶水，溶解得胶状溶液；(4)取胶状溶液用plant RNAout试剂盒的RNA提取步骤得到总RNA沉淀，取沉淀，乙醇洗涤后用无RNA酶水溶解沉淀，即得关节软骨组织总RNA溶液。采用本发明方法提取的动物关节软骨组织总RNA的收率高，并且纯度高、质量、完整性好，可以满足分子生物学研究应用。

Description

动物关节软骨组织总RNA提取方法

技术领域

本发明涉及一种富含蛋白多糖的RNA提取方法，特别涉及一种动物关节软骨组织总RNA提取方法。

背景技术

各种关节疾病和脊柱关节的疾病的治疗一直是医学界面临的难题，国内外正在开始尝试的基因治疗有望获得该领域治疗的突破。从基因水平对软骨组织进行研究意义重大，而从软骨组织中提取高质量的RNA是各种基因表达研究的基础。

关节软骨基质多，细胞少，细胞成分只占20％，软骨基质的主要成分是II型胶原，由于II型胶原中富含羟赖氨酸，并且羟赖氨酸的羟基几乎全部和糖结合，因而糖化率高，含糖量约为10％，因此软骨基质主要成分是蛋白多糖。关节软骨属于细胞含量少的组织，组织RNA含量低，并且多糖的理化性质与核糖核酸RNA非常相似，在沉淀RNA时，蛋白多糖和RNA一块无区分的沉淀下来，产生富含多糖的凝胶状沉淀，这种含有多糖的RNA沉淀难溶于水，或溶解后产生粘稠状的溶液，这样的RNA由于蛋白多糖的干扰无法进行后续的各种分子生物学试验。在去除多糖的同时RNA也被带走，造成RNA的大量丢失，因此从软骨中提取高质、足量的RNA非常困难。

由于软骨组织的特殊结构，目前尚无有效的方法来解决这一难题，基于酸酚/胍盐原理的总RNA抽提方法是动物组织、细胞核酸分离的主要方法，如一步法、trizol法等，但基于酸酚/胍盐原理的方法不适于富含多糖的动物组织，因为该种方法不能区分理化性质相似的多聚核糖和蛋白多糖，在进行RNA沉淀的时候，蛋白多糖和RNA一起沉淀下来，而去除蛋白多糖的步骤也是RNA损失的步骤。plant RNAout法是基于CTAB裂解法的总RNA提取方法，其优点是操作简便、易行，含CTAB的裂解液是用于富含多糖和多酚的植物总RNA抽提的首选细胞裂解方法，可以有效的分离植物组织中的多糖和RNA，但通过多次实验证明，该方法用于抽提新西兰白兔关节软骨组织的总RNA时引入DAN污染。因此，我们试验证明用一步法、trizol法、anima RNAout法、植物RNA提取法等成熟的RNA提取方法都不能获得高质量总RNA，采用经典的去除多糖的方法如高盐、低醇沉淀法都不能去除大量的多糖。

发明内容

本发明的目的是提供一种动物关节软骨组织总RNA提取方法，它适用于含蛋白多糖的RNA难提组织的小量总RNA提取，采用本发明方法提取的动物关节软骨组织总RNA的收率高，并且质量好、纯度高、完整性好，可以满足分子生物学研究应用。

本发明方法有以下步骤：

(1)取动物关节软骨组织，立即投入液氮中研磨至粉末状，每50重量份的关节软骨组织加入1体积变性液，0.007体积的β-巯基乙醇，匀浆至无明显组织块；

(2)将匀浆液置于冰水浴上，加酸性水饱和酚，摇匀，加醋酸钠，氯仿、异戊醇混合液，置于冰水浴上15min；

(3)4℃下，离心，取上清液，加入氯仿、异戊醇混合液，离心取上清加入异丙醇，-20℃下沉淀30min，离心30分钟，得到凝胶状RNA和蛋白多糖混合沉淀，加入无RNA酶水，溶解沉淀得到胶状溶液；

(4)取胶状溶液用plant RNAout试剂盒的RNA提取步骤得到总RNA沉淀，取沉淀，乙醇洗涤二次后用无RNA酶水溶解沉淀即得关节软骨组织总RNA溶液。

本发明所述的重量与体积的计量单位，采用克与毫升或千克与升或微克与微升等。

通常细胞中约75％的RNA酶存在于胞液中，当细胞裂解后，RNA酶会释放出来，在没有有效的抑制措施下，RNA酶会迅速降解RNA。一步法所用的裂解液主要成分为异硫氰酸胍，它是一种强烈的蛋白质变性剂，能有效的抑制RNase活性，使RNase变性，裂解液中加入的β-巯基乙醇也是RNase的强烈抑制剂，联合应用可有效防止RNA降解。

由于动物RNA提取方法基于酸性环境，而植物RNA提取方法是基于碱性环境。本发明将动物RNA提取方法和植物RNA提取方法两种方法结合，并根据关节软骨组织总RNA的理化性质做进一步的改进，使得提取的动物关节软骨组织总RNA的收率高，完整性好。原因是一步法提取的总RNA沉淀非常彻底，RNA损失少，得率是最高的，而且一步法所用的试济对RNA酶的抑制也是可靠的。用一步法分离DNA和RNA，在移取上清的步骤尽量多取，虽然在已取上清夜中引入了少量的中间层蛋白质，但在后续的氯仿抽提过程可以去除。加入异丙醇后要在-20°沉淀30分钟，沉淀离心时间也延长到30分钟，都能有效的增加RNA的得率，虽然这两个步骤增加了蛋白多糖的污染，但在后续的plantRNAout提取过程中可以有效的去除多糖。

本发明适用于小量关节软骨组织或其他部位软骨组织的RNA提取，并且有方法简单、经济、适用的优点适合于分子生物学研究应用。采用本发明方法提取的动物关节软骨组织总RNA的收得率、质量和纯度均高于动物RNA提取方法和植物RNA提取方法。

附图说明

图1为一步法提取RNA电泳图；

图2为Trizol法提取RNA电泳图；

图3为animal RNAout法提取RNA电泳图；

图4为plant RNAout法提取总RNA电泳图；

图5为酶消化实验电泳图；

图6为本发明方法提取总RNA电泳图；

图7为用所提取总RNA经过不同循环数LD-PCR合成的双链cDAN电泳图。

具体实施方式

实施例采用的试剂和设备：

本发明所述试剂均采用市售的分析纯试剂。

1.无RNase的DEPC水：

双蒸水中加0.1％的DEPC摇匀后置室温内过夜，再进行高压灭菌处理即可使用。

2.变性液：

秤异硫氰酸胍23.6320g，柠檬酸三钠0.3676g，十二烷基肌氨酸钠0.25g，加入25ml高压灭菌三蒸水，定容到50ml。

3.pH为4.0的2mol/L醋酸钠50ml：

无水醋酸钠8.28g，三蒸水30ml溶解，冰醋酸调pH值到4.0加水定容至50ml。

4.氯仿、异戊醇混合液：氯仿∶异戊醇为49∶1；

吸取氯仿49ml，加入异戊醇1ml混匀；

5.75％乙醇100ml：

取新开瓶乙醇75ml，加入进行了无RNase处理的瓶子，加入无RNase水25ml；

6.plant RNAout试剂盒由绵羊天择基因公司生产的同名产品；

7.PH为4.5的酸性水饱和酚由上海生工公司生产的产品；

8.AJ-30I型低温超速离心机(Beckman，USA)；

9.Chemilmager 5500型凝胶成像仪(Alpha Innotech，USA)；

10.DU-800型核酸/蛋白检测仪(Beckman，USA)；

实施例1  关节软骨组织总RNA的提取

组织匀浆：取新西兰白兔关节软骨组织后立即投入液氮中，按每50mg新西兰白兔关节软骨组织加入变性液1ml中裂解，7μl β-巯基乙醇，匀浆。

将匀浆液分装入无酶无菌(无RNase)1.5ml离心管，每管0.5ml，置于冰水浴上，每管加500μl酸性水饱和酚，用力摇匀，每管加50μl 2mol/L pH为4.0的醋酸钠溶液，100μl氯仿∶异戊醇(49∶1)混合液，用力摇匀，置于冰水浴上15min。

于4℃，12,000g，离心10min，取上清加入无RNase 1.5ml离心管，每管加500μl氯仿∶异戊醇(49∶1)混合液，用力摇匀。

于4℃，12,000g，离心5min，取上清加入无RNase 1.5ml离心管。

每管加等体积异丙醇，用力摇匀，置于-20℃沉淀30min。

于4℃，14,000g，离心30min，小心将上清吸出并抛弃。

加入20μl用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的无RNA酶水无RNA酶水，振荡溶解沉淀，得到沉淀溶解后的胶状溶液，将胶状溶液合并于一个无RNase 1.5ml离心管。

加入1ml溶液A，充分混匀后加入0.3ml溶液B和0.2ml氯仿，充分混匀。

于4℃，15,000g，离心5min，小心将上清吸出转移到另一个1.5ml离心管。

加入0.3ml溶液C和0.2ml氯仿，充分混匀。

于4℃，15,000g，离心3min，小心将上清吸出转移到另一个1.5ml离心管。

加入1/2体积溶液D，充分混匀。

于4℃，15,000g，离心30min。

小心吸弃上清液，加入1ml 75％乙醇，轻摇离心管洗沉淀30秒。

于4℃，15,000g，离心3min。

小心吸弃上清液，加入1ml 75％乙醇，轻摇离心管洗沉淀30秒。

于4℃，15,000g，离心3min。

简单离心，将残存乙醇聚于管低，小心用移液器吸弃。

室温干燥5分钟，加入适量无RNA酶水溶解沉淀。

实施例2  各种试验方法的比较：

见下表

方法	OD260/280	新西兰白兔关节软骨组织	电泳图	结果
					一步法	1.5	1.4微克/100毫克	参见图1，提取RNA量少，条带模糊，依稀可见5S\28\18S条带	有大量不溶白色沉淀(蛋白多糖)
Trizol法	1.6	2微克/100毫克	参见图2，提取RNA量少，条带模糊，依稀可见5S\28\18S条带	有大量不溶白色沉淀(蛋白多糖)
					animalRNAout法	1.6	2微克/100毫克	参见图3，提取RNA量少，未见明显条带，依稀可见5S\28\18S条带	有大量不溶白色沉淀(蛋白多糖)

植物RNA提取法	2.0	13微克/100毫克	参见图4，5S\28\18S条带可见，点样孔有荧光亮带，酶消化实验明为DNA污染	加样孔荧光试验验证为DNA污染
					酶消化实验			参见图5，左侧泳道：RNA样品电泳；中间泳道：RNA样品加RNA酶消化15分钟后电泳；右侧泳道：样品加RNA酶和DNA酶消化15分钟后电泳，证明点样孔为DNA污染	证明加样孔荧光为DNA污染
本发明方法	2.0	10微克/100毫克	参见图6，5S\28S\18S条带清晰，28S无降解，点样孔未见荧光条带	无污染，完整性好，获得高质量的RNA

结论：一步法、Trizol法和animal RNAout法的共同特点是提取物中含有大量白色不溶解沉淀，为蛋白多糖，所得RNA纯度差，得率低，增加抽提次数仍不能去除蛋白多糖；植物RNA提取法为植物RNA提取方法的尝试，多次试验结果显示有基因组DNA污染。本发明方法获得高质量、高纯度、完整性好、收率较高的RNA，完全满足后续分子生物学试验要求。

实施例3  总RNA的逆转录及LD-PCR扩增

采用美国CLONTECH公司的SMART^TM PCR cDNA Synthesis Kit进行逆转录。用LD-PCR方法，用本发明方法提取的新西兰白兔关节软骨总RNA为模板，利用引物SMART II A Oligonueleotide和3′SMART CDS Primer IIA在反转录酶作用下首先合成两端带有接头的cDNA，通过引物5 PCR Primer IIA继续合成并扩增双链cDNA。实验在PTC-200型PCR仪上进行15、18、21个循环，并确定17个循环为最优循环数字。提取的总RNA的LD-PCR结果见图7，由左至右依次为Marker、15、18、21循环，因此，用本发明方法提取的总RNA获得LD-PCR的成功。

结论：LD-PCR对RNA质量的要求高于普通的逆转录PCR，将分本发明方法所获得的总RNA进行LD-PCR获得成功说明总RNA质量好，完全满足分子生物学实验要求。

Claims (4)

1.一种动物关节软骨组织总RNA提取方法，其特征在于该方法有以下步骤：

(1)取动物关节软骨组织，立即投入液氮中研磨至粉末状，每50重量份的关节软骨组织加入1体积变性液，0.007体积的β-巯基乙醇，匀浆至无明显组织块；

(2)将匀浆液置于冰水浴上，加酸性水饱和酚，摇匀，加醋酸钠，氯仿、异戊醇混合液，置于冰水浴上15min；

(3)4℃下，离心，取上清液，加入氯仿、异戊醇混合液，离心取上清加入异丙醇，-20℃下沉淀30min，离心30分钟，得到凝胶状RNA和蛋白多糖混合沉淀，加入无RNA酶水，溶解沉淀得到胶状溶液；

(4)取胶状溶液用plant RNAout试剂盒的RNA提取步骤得到总RNA沉淀，取沉淀，乙醇洗涤二次后用无RNA酶水溶解沉淀即得关节软骨组织总RNA溶液。

2.根据权利要求1所述动物关节软骨组织总RNA提取方法，其特征在于步骤(1)中所述的变性液的组成为：

秤异硫氰酸胍            23.6320重量份

柠檬酸三钠              0.3676重量份

十二烷基肌氨酸钠        0.25重量份

加入25重量份三蒸水，定容至50体积。

3.根据权利要求1所述动物关节软骨组织总RNA提取方法，其特征在于：步骤(2)、(3)中所述的氯仿、异戊醇混合液中的氯仿：异戊醇为49∶1。

4.根据权利要求1所述动物关节软骨组织总RNA提取方法，其特征在于：步骤(2)中所述的醋酸钠溶液的浓度为2mol/L。

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