CN103484451B - 一种植物小rna的快速提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学领域，涉及一种植物小RNA的快速提取方法，取植物材料经液氮研磨后与CTAB提取液混合，水浴后经水饱和酚/氯仿抽提，用乙醇沉淀得到总核酸，总核酸用异硫氰酸胍溶解后经两次酚/氯仿抽提，用PEG8000和氯化钠沉淀大片段RNA，取上清液得到小RNA。本发明工艺简单，通过酚/氯仿及异硫氰酸胍抽提去除蛋白、基因组DNA，用PEG8000和氯化钠沉淀的方法去除大片段RNA，避免了LiCl沉淀造成小分子RNA过多丢失的缺点，可以大大降低实验成本，为研究人员在实际工作中提供更多的选择，所提取的小RNA质量高，可以满足RT-PCR，miRNA等研究的需要，能够很好地用于后续的分子生物学实验研究。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种提取方法，具体是一种植物小RNA的快速提取方法。
背景技术
小RNA(non-coding small RNA)是一类长20-30个核苷酸(nucleotide,nt)的内源非编码RNA分子，已在动物，植物，藻类以及真菌等多种真核生物中发现，它可在转录及转录后水平上调控基因的表达。小RNA主要包括小的干扰RNA(small interfering RNAs，siRNAs)和微小RNA(microRNAs,miRNAs)，它们可以通过与互补序列结合的方式，关闭或调节目标基因的表达，从而操纵着许多细胞功能。microRNA(miRNA)是继siRNA之后新的研究热点之一。植物miRNA广泛参与植物的生长发育、细胞代谢、器官形态建成、激素分泌、信号转导、胁迫应答等过程，因此小RNA已成为功能研究的热点。
获得高质量的小RNA是后续表达及功能研究的前提，尤其在构建小RNA文库时，高质量的小RNA是成功建库的关键和前提。
目前，许多关于植物RNA提取的方法已较为成熟，但这些方法大部分都不关注长度小于100bp的小RNA的去留，通常采用LiCl进行RNA的选择性沉淀，结果导致大部分的小RNA丢失。
近几年来，人们对miRNA的研究进展十分迅速。在植物界，虽然已经初步鉴定了拟南芥、水稻等主要模式植物中的miRNA，但大多数miRNA功能还不清楚。此外，除拟南芥、水稻等植物外，其它重要经济作物(如香蕉)的miRNA分离和鉴定工作尚未启动，miRNA的研究工作仍处于起步阶段。
香蕉是一种重要的果粮兼备的热带经济作物，其具有独特的胞质遗传特点，即线粒体父系和叶绿体母系遗传，和其在基因组上具有不同的倍性水平，使得香蕉在研究栽培作物进化、在染色体和序列水平上分析亲本基因组的互作杂交和多倍体作用方面成为最具有吸引力的模式植物，要想获得高质量香蕉叶片小RNA，必须能够有效除去多糖、酚类和蛋白质等干扰物质，并能在整个提取过程中抑制RNase的活性。虽然有关小RNA提取的试剂盒也被开发出来，但对于执拗性的植物（如香蕉）往往效果不佳，且昂贵的价格给研究工作带来很大的经济压力，难以被普遍接受。目前，miRBase20.0数据库中尚未收录香蕉miRNA信息，关于香蕉组织特异性miRNA表达情况的研究亦未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种简单、经济、高效的植物小RNA的快速提取方法，为研究人员在实际工作中提供更多的选择。本方法所提取的小RNA质量高，可以满足RT-PCR，miRNA等研究的需要，同时可以大大降低实验的成本。
本发明所采用的技术方案：
一种植物小RNA的快速提取方法，其步骤如下：
1）取植物组织（如植物的叶片、花蕾、果实等）在液氮中迅速研碎后与CTAB提取液混匀，加入量为每毫升CTAB提取液加入0.2g植物组织，65℃水浴10～60分钟；
2）离心，取上清，用2倍上清液体积的水饱和酚/氯仿混合试剂抽提至无中间相；
3）离心，取上清，加入2倍上清液体积的无水乙醇和1／10上清液体积的pH值为5.2、浓度为3mol／L的醋酸钠溶液，降温至0℃，保持0℃并放置10分钟以上；
4）离心，弃上清，沉淀物用300μl浓度为4mol／L的异硫氰酸胍溶液和100μl pH值为4.0、浓度为2mol／L的醋酸钠溶液重悬，加入1倍上清液体积的水饱和酚/氯仿混合试剂抽提至无中间相；
5）离心，取上清，加入2倍上清液体积的无水乙醇和1／10上清液体积的pH值为5.2、浓度为3mol／L的醋酸钠溶液，降温至0℃，保持0℃并放置10分钟以上；
6）离心，弃上清，沉淀物用400μl DEPC水溶解，加入50μl50%PEG8000和50μl5mol／L氯化钠溶液，降温至0℃，保持0℃并放置30分钟以上；
7）离心，取上清，加入2.5倍上清液体积的无水乙醇和1/10上清液体积的pH值为5.2、浓度为3mol／L的醋酸钠溶液，－70℃放置30分钟以上；
8）离心，沉淀物以75%乙醇洗涤2～3次，风干后用DEPC水溶解，备用。
所述水饱和酚与氯仿组成的混合试剂中水饱和酚与氯仿的体积比为1︰1。
所述植物是指富含多糖多酚的植物。
所述的离心条件为：转速8000～13000rpm，时间5～20分钟。
本发明工艺简单，通过酚/氯仿及异硫氰酸胍抽提去除蛋白、基因组DNA，用PEG8000和氯化钠沉淀的方法去除大片段RNA，避免了LiCl沉淀造成小分子RNA过多丢失的缺点，可以大大降低实验成本，为研究人员在实际工作中提供更多的选择，所提取的小RNA质量高，可以满足RT-PCR，miRNA等研究的需要，能够很好地用于后续的分子生物学实验研究。
附图说明
图1是香蕉不同组织小RNA及RT-PCR电泳图。
(a)1-4：依次是香蕉根系，叶片，雄花和幼果小RNA；
(b)1-2：依次是叶片小RNA反转录产物和空白对照为模板采用茎环引物扩增miR156a的PCR反应；
(c)1-4：依次是香蕉根、雄花、幼果和叶片小RNA反转录产物为模板采用茎环引物扩增miR156a的PCR反应；
M：DNA Marker为D500，条带大小依次为(bp):500，400，300，200，150，100，50。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、香蕉叶片小RNA的提取
1）称取香蕉叶片约0.2g，于液氮中迅速研磨成粉末，加入到含有1.0mLCTAB提取液的2.0mL离心管中，65℃水浴10分钟；
2）4℃，12000rpm离心10分钟，取上清，用2倍上清液体积的水饱和酚/氯仿（1︰1）抽提一次；
3）4℃，12000rpm离心10分钟，取上清，加入2倍上清液体积的无水乙醇和1／10上清液体积的3mol／L醋酸钠溶液（pH值为5.2），降温至0℃，保持0℃并放置10分钟；
4）4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀物用300μl4mol／L异硫氰酸胍和100μl2mol／L醋酸钠溶液（pH值为4.0）重悬，加入1倍上清液体积的水饱和酚/氯仿（1︰1）抽提一次；
5）4℃，12000rpm离心5分钟，取上清，加入2倍上清液体积的无水乙醇和1／10上清液体积的3mol／L醋酸钠溶液（pH值为5.2），降温至0℃，保持0℃并放置10分钟；
6）4℃，12000rpm离心5分钟，弃上清，沉淀物用400μl DEPC水溶解，加入50μl50%PEG8000和50μl5mol／L氯化钠溶液，降温至0℃，保持0℃并放置2小时；
7）4℃，12000rpm离心10分钟，取上清，加入2.5倍上清液体积的无水乙醇和1/10上清液体积的3mol／L醋酸钠溶液（pH值为5.2），－70℃放置1小时；
8）4℃，12000rpm离心10分钟，沉淀物以75%乙醇洗涤2-3次，风干后用DEPC水溶解，备用。
实施例2、香蕉根小RNA的提取
采用的植物组织为香蕉的根系，提取步骤同实施例一，提取的小RNA为根系小RNA。
实施例3、香蕉雄花小RNA的提取
采用的植物组织为香蕉的雄花，提取步骤同实施例一，提取的小RNA为雄花小RNA。
实施例4、香蕉果实小RNA的提取
采用的植物组织为香蕉的幼嫩果实，提取步骤同实施例一，提取的小RNA为果实小RNA。
取上述实施例1-4提取的香蕉不同组织的小RNA，2.5%的琼脂糖凝胶电泳检测结果表明（图1-a）：提取的小分子RNA在150bp以下，谱带的完整性很好，未见DNA和大分子RNA的干扰，用紫外可见分光光度计（岛津UV-2550）检测发现，小分子RNA的OD260/OD280比值在1.96-2.08之间，这说明小分子RNA的质量较高。
以提取的各组织小分子RNA为模板，利用茎环RT-PCR方法检测香蕉保守miRNA。用预测到的maag-miR156a序列（5′-UGA CAG AAG AGA GUG AGCAC-3′）设计茎环反转录引物（5′-CTC AAC TGG TGT CGT GGA GTC CGG CAATTC AGT TGA GGT GCT CAC-3′）和一对PCR引物（156-F:5′-ACA CTC CAGCTG GGT GAC AGA AGA-3′和156-R:5′-AAC TGG TGT CGT GGA G-3′）。扩增片断大小约为70bp。测序结果与预测的maag-miR156a序列一致。RT-PCR反应按北京全式金生物技术有限公司TransScript First-Strand cDNA SynthesisSuperMix说明书进行。RT反应步骤为42℃30min后，85℃5min。取cDNA模板1μL进行PCR扩增，体系为：模板1μL，10×PCR缓冲溶液2.5μL，2.5mmol／L dNTP2μL，上下游引物各1μL，Taq酶0.2μL，最后加灭菌的双蒸水至总体积为25μL。PCR反应条件为：cDNA模板在95℃变性5min后，扩增（95℃30s，55℃20s，72℃10s）35个循环；最后72℃保温7min。以不加模板的PCR产物为对照。反应产物用2.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1-b，c。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种植物小RNA的快速提取方法，其特征在于，其步骤如下：
1)取香蕉叶片、香蕉根、香蕉雄花或香蕉果实在液氮中迅速研碎后与CTAB提取液混匀，加入量为每毫升CTAB提取液加入0.2g植物组织，65℃水浴10分钟；
2)离心，取上清，用2倍上清液体积的水饱和酚/氯仿混合试剂抽提至无中间相；
3)离心，取上清，加入2倍上清液体积的无水乙醇和1/10上清液体积的pH值为5.2、浓度为3mol/L的醋酸钠溶液，降温至0℃，保持0℃并放置10分钟以上；
4)离心，弃上清，沉淀物用300μl浓度为4mol/L的异硫氰酸胍溶液和100μl pH值为4.0、浓度为2mol/L的醋酸钠溶液重悬，加入1倍上清液体积的水饱和酚/氯仿混合试剂抽提至无中间相；
5)离心，取上清，加入2倍上清液体积的无水乙醇和1/10上清液体积的pH值为5.2、浓度为3mol/L的醋酸钠溶液，降温至0℃，保持0℃并放置10分钟以上；
6)离心，弃上清，沉淀物用400μl DEPC水溶解，加入50μl 50％PEG8000和50μl 5mol/L氯化钠溶液，降温至0℃，保持0℃并放置30分钟以上；
7)离心，取上清，加入2.5倍上清液体积的无水乙醇和1/10上清液体积的pH值为5.2、浓度为3mol/L的醋酸钠溶液，－70℃放置30分钟以上；
8)离心，沉淀物以75％乙醇洗涤2～3次，风干后用DEPC水溶解，备用；
所述的离心条件为转速8000～13000rpm，时间5～20分钟；
所述水饱和酚与氯仿组成的混合试剂中水饱和酚与氯仿的体积比为1：1。
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