CN105063018A - 一种从葡萄成熟果实中提取总rna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从葡萄成熟果实中提取总RNA的方法，具体是利用CTAB、氯仿抽提，酸性水饱和酚纯化的步骤从葡萄成熟果实中提取总RNA的方法。本发明在传统CTAB法提取液中加入了聚乙烯吡咯烷酮、亚精胺、β-巯基乙醇及高浓度的氯化钠，既能高效抑制RNA酶的活性，又能有效防止多糖多酚物质对RNA的干扰。提取过程中利用酸性水饱和酚纯化粗提总RNA，既能最大限度地去除与RNA共沉淀的DNA，又能清除残留的蛋白质与多糖。本发明方法成本较低，稳定性好，提取的RNA样品纯度高、完整性好。
Description
技术领域：
本发明涉及植物分子生物学技术领域，具体是从完全成熟后采摘、富含花色素的葡萄果实组织中提取总RNA的方法。
技术背景:
RNA提取是分子生物学的基本技术之一，高质量的RNA是后续进行RT-PCR、荧光定量PCR、Stem-loopRT-PCR、Northernblot等分子生物学研究的必要前提。目前，已经发展了多种RNA的提取方法，如异硫氰酸胍法、热硼酸法、十二烷基硫酸钠(SodiumDodecylSulfate，SDS)法、十六烷基三甲基溴化铵(CetyltrimethylammoniumBromide，CTAB)法等。异硫氰酸胍能强烈抑制组织及提取液中RNase的活性，方法操作简单、产量高、成本低，但提取的RNA纯度不是很高，需要做进一步纯化。热硼酸法是通过高浓度的硼酸盐抑制氧化酶，使RNA免受多酚的干扰，且蛋白酶K可降解能氧化酚类和次生物质的酶类，因此获得的RNA纯度最高，但是该法所需药品多、价格高、操作较复杂、容易被外源RNA酶降解。SDS法可以去除果实中的多糖和酚类物质，但提取的RNA纯度仍不是很高。而CTAB法能较好地解决以上4种方法中存在的问题，所提取的总RNA完整性最好，获得的数量也比较大，且所需药品简单，是提取果实总RNA较有效的一种方法。
葡萄果实是一种富含多糖多酚及次生代谢物质的植物组织。酚类化合物在匀浆时极易被氧化成醌类物质，与RNA不可逆地结合，从而影响RNA的分离纯化。多糖的理化性质与RNA相似，在提取过程中能与RNA共沉淀，很难将它们分开，这些都会严重影响到RNA的提取质量。随着贮藏时间的延长，葡萄果实中酚类化合物及次生代谢物的含量也随之增加，使得RNA的提取更加困难。采用传统的CTAB法已经不能实现从葡萄成熟果实中提取高质量的总RNA。
发明内容：
本发明的目的是建立一种简便，易行，效果良好的从葡萄果实中提取总RNA的方法，有效解决从富含多糖多酚及次生代谢物质的植物组织中提取总RNA的难题。
本发明经过大量的实验，研究出了适用于从完全成熟的、富含花色素的、不同贮藏期间的葡萄果实组织中提取总RNA的方法，具体包括如下步骤：
(1)吸取RNA提取液于离心管中，65℃预热；所述的RNA提取液组份为：2％(W/V)十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，2％(W/V)聚乙烯吡咯烷酮(PVP，K40)，100mmol·L-1三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl，pH8.0)，100mmol·L-1乙二胺四乙酸(EDTA，pH8.0)，2.5mol·L-1氯化钠(NaCl)，0.5g·L-1亚精胺；
(2)按每1克葡萄果实加入10毫升RNA提取液的比例，称取葡萄果实，迅速转移至用液氮预冷的研钵中，充分研磨直至成粉末状；
(3)向步骤(1)中预热的RNA提取液中加入少许β-巯基乙醇，迅速将葡萄果实粉末转移至离心管中，晃动离心管，使液氮完全挥发，盖住离心管盖，剧烈震荡混匀，60-65℃孵育10-20min；
(4)加入等体积的体积比为24：1的氯仿-异戊醇，涡旋混匀；于4℃，8500rpm离心15-25min，取上清至新的离心管中；
(5)重复步骤(4)2-3次；
(6)在上清液中加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀后于4℃放置0.5-1h；之后4℃，8500rpm离心20-30min，去上清，得到透明胶状RNA粗提沉淀；
(7)用DEPC水配制的75-90％乙醇清洗沉淀2次，室温下风干，将沉淀溶于DEPC水中得到RNA溶液；
(8)在RNA溶液中加入等体积的体积比为5:1的酸性酚-氯仿，涡旋混匀，14000rpm，4℃离心10-20min，取上清置于新的离心管中；
(9)重复步骤(8)1次；
(10)在上清液中加入5mol·L-1NaCl溶液和体积比为24：1的氯仿-异戊醇，涡旋混匀，14000rpm，4℃离心10-15min，将上清转移至新的离心管中；
(11)在上清液中加入等体积的异丙醇，混匀后于4℃放置0.5-1h沉淀RNA；之后4℃，8500rpm离心20-30min，去上清，得到透明胶状RNA沉淀；
(12)用DEPC水配制的75-90％乙醇清洗RNA沉淀2次，室温下风干，将沉淀溶于DEPC水中。
所述的RNA提取液中的亚精胺可用三盐酸精脒代替。所述步骤(8)中的酸性酚为pH值为4.5±0.2的水饱和酚。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
在本发明中，亚精胺作为RNase抑制剂，有效地保证了RNA的完整性。
在RNA提取液中加入可溶性PVP(K40)，PVP能与酚类物质充分结合形成螯合物，通过氯仿抽提将其除去，有效阻止酚类物质与RNA结合。
于加样前在预热的提取液中加入强还原剂β-巯基乙醇，与PVP协同作用，有效抑制了酚类物质的氧化，这种处理比在提取液中单独加入β-巯基乙醇或PVP的效果要好。
提高RNA提取液中NaCl的浓度为2.5mol·L-1，在高浓度NaCl溶液中，由于溶解度差异，CTAB与多糖形成复合物沉淀，以有效去除多糖。
酸性酚在酸性条件下，RNA被分配于水相，DNA和蛋白质在有机相，从而最大限度的除去蛋白和DNA，提高RNA的产率和纯度。
本发明的方法经济、稳定，提取的RNA样品纯度高、完整性好，适用于从葡萄成熟果实中提取总RNA。
附图说明：
图1为玫瑰香葡萄果实贮藏期间对照组与SO2保鲜组总RNA的凝胶电泳图。泳道1：贮藏初期葡萄果实总RNA；泳道2、4：对照组在贮藏20d、60d后葡萄果实总RNA；泳道3、5：SO2保鲜组在贮藏20d、60d后葡萄果实总RNA。
图2为玫瑰香葡萄果实不同贮藏时期对照组与SO2保鲜组中相关基因的RT-PCR分析。
具体实施方式：
实施例1：
玫瑰香葡萄果实不同贮藏时期对照组与SO2保鲜组总RNA提取
(1)吸取2ml提取液于离心管中，65℃预热；RNA提取液组份为：2％(W/V)十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，2％(W/V)聚乙烯吡咯烷酮(PVP，K40)，100mmol·L-1三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl，pH8.0)，100mmol·L-1乙二胺四乙酸(EDTA，pH8.0)，2.5mol·L-1氯化钠(NaCl)，0.5g·L-1亚精胺。
(2)取液氮速冻的不同贮藏时期对照组与SO2保鲜组(贮藏初期、贮藏20d和60d)玫瑰香葡萄果实各200mg左右，在液氮中将其研磨成粉末。
(3)向向步骤(1)中预热的RNA提取液中加入25μLβ-巯基乙醇，迅速将葡萄果实粉末转移至离心管中，晃动离心管，使液氮完全挥发，盖住离心管盖，剧烈震荡混匀，65℃孵育10min，每隔2-3min涡旋一次。
(4)向离心管中加入等体积的氯仿-异戊醇(24：1，V/V)，涡旋混匀；于4℃，8500rpm离心15min，取上清到新的离心管中。
(5)重复步骤(4)2-3次。
(6)在上清液中加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀后于4℃放置1h；之后4℃，8500rpm离心30min，去上清，得到透明胶RNA粗提沉淀。
(7)用80％乙醇(DEPC水配制)清洗沉淀2次，室温下风干，之后将沉淀溶于600μLDEPC水中得到RNA溶液。
(8)在RNA溶液中加入等体积的酸性酚-氯仿(5:1，V/V)，涡旋混匀，14000rpm，4℃离心10min，取上清置于新的离心管中。
(9)重复步骤(8)1次。
(10)在上清液中补DEPC水至500μL，加入50μL5mol·L-1NaCl溶液和550μL氯仿-异戊醇(24：1，V/V)，涡旋混匀，14000rpm，4℃离心10min，将上清(最多500μL)转移至新的离心管中。
(11)在上清液中加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀后于4℃放置1h沉淀RNA。之后4℃，8500rpm离心20min，去上清，得到透明胶状RNA沉淀。
(12)用80％乙醇(DEPC水配制)清洗沉淀2次，室温下风干，将沉淀溶于50μLDEPC水中。
应用本实施例，得到贮藏初期、对照组和SO2保鲜组贮藏20d和60d后玫瑰香葡萄果实总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测结果(图1)表明RNA完整性良好。紫外分光光度计测定260nm和280nm处的吸光度值，证实所提RNA质量和产量(表1)较好，综合表明，所提RNA满足实验要求。
表1玫瑰香葡萄果实不同贮藏时期对照组与SO2保鲜组总RNA的质量与产量分析
实施例2：
玫瑰香葡萄果实不同贮藏时期对照组与SO2保鲜组总RNA的反转录及病程相关蛋白的RT-PCR分析
(1)反转录
cDNA第一链反应(北京全式金生物技术有限公司产品)体系如下：
轻轻混匀后，42℃孵育30min，85℃加热5min使EasyScriptRTEnzyme失活。将合成的cDNA至于-20℃保存备用。
(2)RT-PCR
20μlPCR反应体系如下：
X为Actin2基因调平时各样品所加入的cDNA的量。
PCR反应程序为：
退火温度(Tm)及循环数(N)根据扩增基因而有所不同，基因特异引物序列见表2。
表2玫瑰香葡萄果实不同贮藏时期对照组与SO2保鲜组中相关基因RT-PCR使用的引物序列
PCR扩增产物如附图2所示，说明本发明提取的总RNA质量高，适于进行RT-PCR等分子生物学实验。
Claims (3)
1.一种从葡萄成熟果实中提取总RNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)吸取RNA提取液于离心管中，65℃预热；所述的RNA提取液组份为：2％十六烷基三甲基溴化铵，2％聚乙烯吡咯烷酮，pH为8.0的100mmol·L-1三羟甲基氨基甲烷，pH为8.0的100mmol·L-1乙二胺四乙酸，2.5mol·L-1氯化钠，0.5g·L-1亚精胺；
(2)按每1克葡萄果实加入10毫升RNA提取液的比例，称取葡萄果实，迅速转移至用液氮预冷的研钵中，充分研磨直至成粉末状；
(3)向步骤(1)中预热的RNA提取液中加入少许β-巯基乙醇，迅速将葡萄果实粉末转移至离心管中，晃动离心管，使液氮完全挥发，盖住离心管盖，剧烈震荡混匀，60-65℃孵育10-20min；
(4)加入等体积的体积比为24：1的氯仿-异戊醇，涡旋混匀；于4℃，8500rpm离心15-25min，取上清至新的离心管中；
(5)重复步骤(4)2-3次；
(6)在上清液中加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀后于4℃放置0.5-1h；之后4℃，8500rpm离心20-30min，弃上清，得到透明胶状RNA粗提沉淀；
(7)用DEPC水配制的75-90％乙醇清洗沉淀2次，室温下风干，将沉淀溶于DEPC水中得到RNA溶液；
(8)在RNA溶液中加入等体积的体积比为5:1的酸性酚-氯仿，涡旋混匀，14000rpm，4℃离心10-20min，取上清置于新的离心管中；
(9)重复步骤(8)1次；
(10)在上清液中加入5mol·L-1NaCl溶液和体积比为24：1的氯仿-异戊醇，涡旋混匀，14000rpm，4℃离心10-15min，将上清转移至新的离心管中；
(11)在上清液中加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀后于4℃放置0.5-1h沉淀RNA；之后4℃，8500rpm离心20-30min，弃上清，得到透明胶状RNA沉淀；
(12)用DEPC水配制的75-90％乙醇清洗RNA沉淀2次，室温下风干，将沉淀溶于DEPC水中。
2.如权利要求1所述的从葡萄成熟果实中提取总RNA的方法，其特征在于所述的RNA提取液中的亚精胺用三盐酸精脒代替。
3.如权利要求1所述的从葡萄成熟果实中提取总RNA的方法，其特征在于所述步骤(8)中的酸性酚为pH值为4.5±0.2的水饱和酚。
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