CN101638651B - 从富含多糖多酚及次生代谢物质的植物组织中提取总rna的方法 - Google Patents

从富含多糖多酚及次生代谢物质的植物组织中提取总rna的方法 Download PDF

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Abstract

本发明是一种利用异硫氰酸胍-氯仿抽提、Tris饱和酚纯化植物RNA的抽提方法。本发明改良了传统的异硫氰酸胍法，采用裂解后氯仿抽提加酚纯化两步法，分别从红皮梨的叶片和果皮、葡萄的叶片和果肉、果皮组织以及草莓果实和新疆紫草愈伤组织中提取到了高质量的总RNA。该方法的抽提缓冲液中含有异硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸钠、柠檬酸钠、可溶性聚乙烯吡咯烷酮和β-巯基乙醇，既能高效裂解植物细胞释放RNA，有效抑制RNA酶的活性，还能防止酚类物质的氧化和排除次生代谢物质的干扰。第二步用Tris饱和酚纯化粗提RNA溶液，能除去与RNA共沉淀的多糖和蛋白质。本发明操作步骤简单、经济实惠、稳定性好，适用于从富含多糖多酚及次生代谢物质的植物组织中提取高质量总RNA。

Description

从富含多糖多酚及次生代谢物质的植物组织中提取总RNA的方法
技术领域
本发明涉及植物分子生物学技术领域，具体是从富含多糖多酚及次生代谢物质的植物组织中提取和纯化总RNA的方法。
背景技术
RNA的提取是分子生物学的基本内容之一，高质量的RNA是进行基因克隆、基因表达、基因功能分析等研究的必要前提。RT-PCR、Northern、real-time PCR、cDNA文库构建等分子生物学研究的开展首先必须获得纯度高、完整性好的总RNA。植物组织特别是高等植物组织细胞内外组成成分的复杂多样性，使得植物组织RNA的提取比其他生物材料更加困难。对于梨属、柑橘属、中草药的多种植物而言，分离纯化组织中的RNA难度较大，因而严重阻碍了其分子生物学研究的进展。富含酚类化合物和多糖类物质，或含有大量已知和尚未确定的次生代谢产物，或内源RNase含量较高是这些植物RNA提取的主要障碍。很多植物组织含有大量的多酚和多糖类物质，酚类化合物在匀浆时极易被氧化成醌类物质，与RNA不可逆地结合，从而影响RNA的分离纯化。多糖的许多理化性质与RNA相似，在提取过程中能与RNA共沉淀，很难将他们分开。在植物果实的发育过程中，包括RNase在内的各种水解酶大量积累，同时富集多种次生代谢物质。这些都会严重影响到RNA提取的质量和数量。
目前，已经发展了许多RNA的提取方法，如异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法(一步法)、十二烷基硫酸钠(Sodium Dodecyl Sulfate，SDS)法、十六烷基三甲基溴化铵(Cetyltrimethylammonium Bromide，CTAB)法和热硼酸法等。这些方法中核心试剂分别为异硫氰酸胍、SDS、CTAB和硼酸。异硫氰酸胍能迅速破碎细胞，作为强变性剂使核酸-蛋白结构发生变化，并有效解离核蛋白与核酸的复合体，最终释放出核酸。SDS是一种离子去污剂，能从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖。CTAB作为离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使RNA游离出来。热硼酸法的原理是将硼酸缓冲体系、蛋白酶K消化蛋白和LiCl选择性沉淀RNA等步骤偶联在一起。各种总RNA提取方法的步骤基本相似，首先彻底破碎植物细胞的细胞壁，接着使核蛋白复合体中的蛋白质充分变性，实现核蛋白与核酸的分离；同时抑制内源和外源RNA酶的活性，防止RNA受污染而降解，然后将RNA与DNA、蛋白质、多酚、多糖等物质分离，最后检测RNA的质量。
Qiagen公司的RNeasy Plant Mini Kit和Invitrogen公司的Trizol是提取植物RNA的最常用试剂盒，对于拟南芥、烟草、水稻等模式植物，使用总RNA提取试剂盒方便快捷。然而对于富含多糖多酚类物质和次生代谢物质的植物而言，RNeasy Plant Mini Kit和Trizol等试剂盒不能有效地分离和纯化其总RNA。近年来，有关从富含多糖多酚类物质和次生代谢物质植物中抽提RNA的方法已有较多的报道。Hu等(A simple protocol for RNA isolationfrom fruit trees containing high levels of polysaccharides and polyphenol compounds.PlantMolecular Biology Reporter，2002，20：69a-69g)报道用改良的CTAB法从苹果、桃和猕猴桃的果实中提取总RNA。张今今等(葡萄总RNA提取方法的研究。果树学报，2003，20：178-181)用改进的SDS/酚法从葡萄成熟叶片和完熟果实的果皮中成功提取了总RNA。徐昌杰等(柑橘组织RNA提取方法研究。果树学报，2004，21：136-140)用改良Bugos法从甜橙叶片、幼果、完熟果皮和汁囊组织中获得了较高质量的RNA。周波等(富含多糖草莓果实总RNA提取方法的改进。生物技术通讯，2004，15：48-50)提取草莓果实的RNA时，用丙酮去除类黄酮类色素，用乙二醇丁醚去除多糖。Xu等(Extraction of high quality of RNA andconstruction of a suppression subtractive hybridization library from chestnut rose(Rosaroxburghii tratt).Biotechnol Lett，2006，28：587-591)在CTAB裂解液中添加PVP和巯基乙醇，并使用该法从多酚多糖含量特别高的刺梨叶片中获得了高质量RNA。
很多植物尤其是果实富含芳香族的酚类化合物、多糖类化合物和类黄酮等次生代谢产物，使得核酸的提取非常困难。特别是总RNA的提取，常规方法很难奏效。虽然有研究报道丙酮能除去部分类黄酮类色素，乙二醇丁醚或高浓度的LiCl长时间沉淀能去除部分多糖，然而这些方法对RNA提取及纯化障碍物的处理效果并不是很理想。由于处理步骤多，整个抽提过程所需时间较长，将大大增加了RNA被降解的可能性。因此，发展一种应用范围广、快速、成功率高的提取RNA方法对于提高实验效率非常必要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从富含多糖多酚及次生代谢物质的植物组织中提取和纯化总RNA的方法，其通用性强，解决了从富含多糖多酚及次生代谢物质的植物组织中抽提高质量RNA的难题。
本发明的方法采用两步法提取纯化植物的总RNA。第一步异硫氰酸胍法获得总RNA粗提沉淀，第二步采用DEPC处理过的ddH2O溶解RNA沉淀，并用碱性的Tris饱和酚和氯仿纯化RNA，最终获得高质量的总RNA。本发明在异硫氰酸胍裂解液中加入抗氧化剂β-巯基乙醇、酚类化合物螯合剂聚乙烯吡咯烷酮和RNase抑制剂十二烷基肌氨酸钠，高效裂解植物细胞，释放的RNA能进入酸性水相。随后的氯仿抽提步骤能去除基因组DNA、大部分蛋白和次生代谢物质。经异丙醇沉淀的粗提RNA用ddH2O溶解后，借助碱性的Tris饱和酚抽提除去多糖类物质、蛋白以及残留的次生代谢物质。
本发明经过大量的实验，研究出通用性强的适于从富含多糖多酚及次生代谢物质的植物组织中抽提RNA的方法。它包括下述步骤：
(1)匀浆和裂解：取1-2g富含多糖多酚及次生代谢物质的植物组织，用液氮研磨成粉，按组织材料的重量(g)和RNA抽提缓冲液的体积(mL)比为1∶10的比例加入与预冷的RNA抽提缓冲液，混匀后置于冰上5min，再加入3mol L-1醋酸钠(pH 4.5-5.5)1-2mL，上下颠倒混匀；
(2)氯仿抽提：在步骤(1)得到的样品混合液中加入氯仿11-22mL，剧烈震荡将两相混匀，冰上放置10min后于4℃12000g离心10min，取上清液到新的离心管中；
(3)重复(2)中的氯仿抽提步骤1次；
(4)异丙醇沉淀：在上清液中加入10-20mL异丙醇，混匀后置于-20℃中放置30min，接着4℃12000g离心15min得到RNA沉淀物；
(5)乙醇清洗和溶解：用75％乙醇清洗沉淀2次，置于室温干燥20min，用DEPC处理过的水1-2mL彻底溶解RNA沉淀；
(6)酚抽提：在RNA水溶液中加入Tris饱和酚(pH7.8-8.0)1-2mL，剧烈震荡将两相混匀，常温12000g离心10min，取上清液到新离心管中；
(7)氯仿抽提：在上清液中加入氯仿1-2mL，剧烈震荡混匀后，常温12000g离心10min，取上清液到新离心管中；
(8)异丙醇沉淀：在上清液中加入醋酸钠0.1-0.2mL和异丙醇1-2mL，混匀后于-20℃放置30min，4℃12000g离心15min得到纯化的RNA沉淀物；
(9)乙醇清洗和溶解：用75％乙醇清洗RNA沉淀2次，在室温干燥20min后用100-200μL DEPC处理过的ddH2O彻底溶解，得到的高质量RNA。
其中：所述的RNA抽提缓冲液组成成分为4mol L-1异硫氰酸胍，25mmol L-1柠檬酸钠，0.5％(w/v)十二烷基肌氨酸钠，2％(w/v)可溶性聚乙烯吡咯烷酮(PVP，K40)，使用前每100mL抽提缓冲液加入0.5mL β-巯基乙醇；
所述的75％(v/v)乙醇是由7.5份无水乙醇和2.5份DEPC处理过的ddH2O配置；
所述的DEPC处理过的ddH2O为0.1份DEPC加入99.9份ddH2O中涡旋混匀再经高温高压灭菌的纯水。
所述的Tris饱和酚溶液其pH值为7.8-8.0，含8-羟基喹啉和巯基乙醇；
所用的植物材料是新鲜、健康的幼嫩材料。
针对传统的异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法(一步法)不适于多糖、多酚以及次生代谢物质含量丰富的植物组织提取总RNA，本发明将此方法一分为二，并进行了多方面的改进：
在RNA抽提缓冲液中加入了可溶性的聚乙烯吡咯烷酮(PVP，K40)，水溶性PVP能与酚类物质充分结合，并形成螯合物，进而通过氯仿抽提除去酚类物质，有效地防止其与RNA的结合。
此外，在RNA裂解液中加入强还原剂β-巯基乙醇，能提供还原条件，使得多酚类物质不易被氧化，β-巯基乙醇与PVP协同作用，有效抑制了酚类物质的阻碍。
RNA提取和纯化过程中均采用异丙醇沉淀RNA，一方面减少了操作溶液的体积，还有利于选择性沉淀RNA，进一步去除多糖污染。
本发明在获得RNA粗提沉淀之前通过氯仿的抽提能有效减少溶液中次生代谢物质的含量。
本发明在获得RNA粗提物之后用DEPC处理过的ddH2O彻底溶解沉淀，再利用碱性的Tris饱和酚纯化RNA，去除多糖和残余的蛋白，提高了RNA的质量。碱性Tris饱和酚中含有8羟基喹啉，能抑制RNase活性。用酚、氯仿进行长时间的剧烈震荡抽提，可以彻底变性RNase，并通过离心将之除去，防止了可能存在的RNase再复性降解RNA。
本发明通用性强，适用于富含多糖多酚及次生代谢物质的植物。已经利用本发明从云南红皮梨的叶片、已着色果皮、未着色果皮，葡萄的叶片、幼果果皮、果肉，草莓幼果、成熟果实以及新疆紫草的愈伤组织中成功抽提出高质量的RNA。
本发明不需要购买试剂盒和昂贵的分子生物学试剂，所使用的药品多数为价格低廉的国产试剂，因此整个RNA提取及纯化过程花费的成本低。RNA提取及纯化方法简单易行，且耗时少，在8小时内即可完成全部实验，并获得高质量的RNA。
本发明的方法快速、经济、高效、通用性强，适用于富含多糖多酚及次生代谢物质植物的分子生物学操作。利用本方法得到的RNA样品纯度高、完整性好，能在-80℃超低温冰箱中长期保存而不出现降解。
附图说明
图1为云南红皮梨的幼嫩叶片(红色)、已着色果皮、未着色果皮总RNA的琼脂糖凝胶电泳图(浓度为1.2％，缓冲液为1×TAE)。泳道1：叶片总RNA；泳道2：着色果皮RNA；泳道3：为着色果皮总RNA。
图2为从云南红皮梨果皮总RNA中分离的mRNA。泳道1：mRNA；泳道2：分子量标准。
图3为云南红皮梨果皮花青素合成相关基因的RT-PCR分析。
图4为葡萄幼嫩叶片、幼果果皮、果肉总RNA的琼脂糖凝胶电泳图(浓度为1.2％，缓冲液为1×TAE)。泳道1：叶片总RNA；泳道2：幼果果皮总RNA；泳道3：果肉总RNA。
图5为草莓未成熟果实、成熟果实总RNA的琼脂糖凝胶电泳图(浓度为1.2％，缓冲液为1×TAE)。泳道1：幼嫩果实总RNA；泳道2：成熟果实总RNA。
图6为新疆紫草红色愈伤组织以及灰白色愈伤组织总RNA的琼脂糖凝胶电泳图(浓度为1.2％，缓冲液为1×TAE)。泳道1：红色愈伤组织总RNA；泳道2：灰白色愈伤组织总RNA。
具体实施方式
实施例1：云南红皮梨的幼嫩叶片(红色)、已着色果皮、未着色果皮总RNA提取及其应用
(1)取液氮速冻的云南红皮梨幼嫩叶片(红色)、已着色果皮、未着色果皮各1克，用液氮将其研磨成粉末；快速将样品转移至离心管中，并加入10mL预冷的RNA抽提缓冲液，混匀置于冰上5min，再加入pH4.5的3mol L-1醋酸钠1mL，上下颠倒混匀；
(2)接着加入11mL氯仿，剧烈震荡将两相混匀，冰上放置10min后于4℃12000g离心10min，取上清液到新的离心管中；
(3)重复(2)中的氯仿抽提步骤1次；
(4)在上清液中加入10mL异丙醇，混匀后置于-20℃30min，接着4℃12000g离心15min获得RNA沉淀；
(5)用75％乙醇清洗沉淀2次，在室温干燥20min后用1mL DEPC处理过的ddH2O彻底溶解；
(6)在RNA水溶液中加入Tris饱和酚(pH8.0)1mL，剧烈震荡将两相混匀，常温12000g离心10min，取上清到新离心管中；
(7)在上清液中加入1mL氯仿，剧烈震荡混匀后，常温12000g离心10min，取上清液；
(8)在上清液中加入0.1mL的醋酸钠和1mL异丙醇，混匀后于-20℃放置30min，4℃12000g离心15min得到纯化的RNA沉淀；
(9)用75％乙醇清洗RNA沉淀2次，在室温干燥20min后用100μL DEPC处理过的ddH2O彻底溶解沉淀，得到的高质量的RNA。
其中所述的RNA抽提缓冲液组成成分为4mol L-1异硫氰酸胍，25mmol L-1柠檬酸钠，0.5％(w/v)十二烷基肌氨酸钠，2％(w/v)可溶性聚乙烯吡咯烷酮(PVP，K40)，使用前每100mL抽提缓冲液加入0.5mL β-巯基乙醇；所述的75％(v/v)乙醇是由7.5份无水乙醇和2.5份DEPC处理过的ddH2O配置；所述的DEPC处理过的ddH2O为0.1份DEPC加入99.9份ddH2O中涡旋混匀再经高温高压灭菌的纯水。所述的Tris饱和酚溶液的pH值为7.8-8.0，含8-羟基喹啉和巯基乙醇。
应用本实施例，得到云南红皮梨幼嫩叶片、已着色果皮、未着色果皮RNA样品总量分别为420微克、250微克、220微克，产率分别为420微克/克(总RNA量/样品量)、250微克/克、220微克/克。
质量检测：经琼脂糖凝胶电泳结果(附图1)表明RNA完整性好，在紫外分光光度仪上测定260nm与280nm吸光度比值A260/280为1.8～1.9，完全满足分子生物学实验需要。
从云南红皮梨果皮总RNA中分离mRNA
mRNA的分离采用Qiagen公司的
Figure G2009100947049D00061
mRNA Midi Kits进行。取200μg云南红梨果皮的总RNA(溶解于250uL DEPC处理过的ddH2O中)，加入250μL OBB buffer和15μLOligotex Suspension，吸打混匀后70℃温育3min以打破RNA的次级结构，接着室温静置10min。14000g离心2min，弃上清，用1mL Buffer OW2重悬Oligotex，14000g离心2min，弃上清，重复Buffer OW2清洗步骤1次。加入100μL 70℃温育的buffer OEB，吸打3至4次彻底重悬Oligotex，14000g离心2min后取上清至新的离心管中。用1.2％的TAE琼脂糖凝胶电泳检测所分离的mRNA，结果如附图2所示，mRNA片段主要分布于400bp至4000bp之间，可见本发明所提供的方法能获得高质量的总RNA。
云南红皮梨果皮总RNA的逆转录反应和花青素合成相关基因的RT-PCR分析
(1)RNA定量
本实施例中用到的总RNA样品有云南红皮梨未接受光照果皮(白色)的RNA、分别接受2d、4d、6d、8d光照的果皮(红色)。在紫外分光光度仪上测定5个RNA样品的浓度，然后根据测定数据将各样品的RNA浓度调整为0.5μg/μL。并通过1×TAE琼脂糖凝胶电泳验证RNA浓度调整的准确性。
(2)逆转录
cDNA第一链的合成所用逆转录酶为M-MLV Reverse Transcriptase(M-MLV RT，Promega公司产品)。反应体系如下：
Total RNA                            2μg
Oligo(dT)15primer                    0.5μg
加DEPC处理过的ddH2O至总体积为15μL。70℃变性5min，立即置于冰上，冰浴10min之后依次加入下列成分：
M-MLV 5×Reaction Buffer             5μL
dNTP(10mM each)(Promega)             1.25μL
Figure G2009100947049D00071
Ribonuclease Inhibitor(Promega)          1μL
M-MLV RT(Promega)                    1μL
DEPC处理过的ddH2O                    1.75μL
混匀后于42℃反应1.5h，取出置于70℃加热5min使逆转录酶失活。再加入75μLTE，将第一链cDNA稀释4倍，置于-20℃保存。
(3)PCR
取1μl逆转录产物为PCR模板。PCR反应体系(20μL)如下：
ddH2O                                15.9μL
forward primer(5μM)                 0.5μL
reverse primer(5μM)                 0.5μL
10×Taqbuffer                        2μL
dNTP(10mM each)                      0.4μL
Taq DNA Polymerase(5U/μL)(TIANGEN)  0.4μL
模板                                 1μL
PCR反应条件为：94℃2min；94℃30s，X℃30s(根据各引物TM确定)，72℃40s，25cycles；72℃5min。以一对扩增红皮梨肌动蛋白(actin)cDNA的引物进行平行PCR反应作为对照。基因特异引物见表1。PCR结束之后，取8μL产物在1.2％TAE琼脂糖凝胶中进行电泳。结果见附图3，表明采用本发明提取的总RNA质量高，适于进行RT-PCR等分子生物学实验。
表1RT-PCR使用的引物序列
Figure G2009100947049D00081
实施例2：葡萄幼嫩叶片、幼果果皮、果肉总RNA提取
(1)取液氮速冻的葡萄叶片、幼果果皮、果肉各1.2克，用液氮将其研磨成粉末；快速将各样品转移至离心管中，并加入12mL预冷的RNA抽提缓冲液，混匀置于冰上5min，再加入pH4.5的3mol L-1醋酸钠1.2mL，上下颠倒混匀；
(2)接着加入13mL氯仿，剧烈震荡将两相混匀，冰上放置10min后于4℃12000g离心10min，取上清液到新的离心管中；
(3)重复(2)中的氯仿抽提步骤1次；
(4)在上清液中加入12mL异丙醇，混匀后置于-20℃30min，接着4℃12000g离心15min获得RNA沉淀；
(5)用75％乙醇清洗沉淀2次，在室温干燥20min后用1.2mL DEPC处理过的ddH2O彻底溶解；
(6)在RNA水溶液中加入Tris饱和酚(pH8.0)1.2mL，剧烈震荡将两相混匀，常温12000g离心10min，取上清到新离心管中；
(7)在上清液中加入1.2mL氯仿，剧烈震荡混匀后，常温12000g离心10min，取上清液；
(8)在上清液中加入0.12mL的醋酸钠和1.2mL异丙醇，混匀后于-20℃放置30min，4℃12000g离心15min得到纯化的RNA沉淀；
(9)用75％乙醇清洗RNA沉淀2次，在室温干燥20min后用120μL DEPC处理过的ddH2O彻底溶解沉淀，得到的高质量的RNA。
本实施例中所用的RNA抽提缓冲液及其他试剂同实施例1。
应用本实施例，得到葡萄幼嫩叶片、幼果果皮、果肉RNA总量分别为400微克、300微克、280微克，RNA产率分别为400微克/克(总RNA量/样品量)、300微克/克、280微克/克。
质量检测：经琼脂糖凝胶电泳结果(附图4)表明RNA完整性好，在紫外分光光度仪上测定260nm与280nm吸光度比值A260/280为1.7～1.8，完全满足分子生物学实验需要。
实施例3：草莓未成熟果实(绿色)和成熟果实(红色)总RNA提取
(1)取液氮速冻的草莓未成熟果实和成熟果实各2克，用液氮将其研磨成粉末；快速将各样品转移至离心管中，并加入20mL预冷的RNA抽提缓冲液，混匀置于冰上5min，再加入pH4.5的3mol L-1醋酸钠2mL，上下颠倒混匀；
(2)接着加入22mL氯仿，剧烈震荡将两相混匀，冰上放置10min后于4℃12000g离心10min，取上清液到新的离心管中；
(3)重复(2)中的氯仿抽提步骤1次；
(4)在上清液中加入20mL异丙醇，混匀后置于-20℃30min，接着4℃12000g离心15min获得RNA沉淀；
(5)用75％乙醇清洗沉淀2次，在室温干燥20min后用2mL DEPC处理过的ddH2O彻底溶解；
(6)在RNA水溶液中加入Tris饱和酚(pH8.0)2mL，剧烈震荡将两相混匀，常温12000g离心10min，取上清到新离心管中；
(7)在上清液中加入2mL氯仿，剧烈震荡混匀后，常温12000g离心10min，取上清液；
(8)在上清液中加入0.2mL的醋酸钠和2mL异丙醇，混匀后于-20℃放置30min，4℃12000g离心15min得到纯化的RNA沉淀；
(9)用75％乙醇清洗RNA沉淀2次，在室温干燥20min后用200μL DEPC处理过的ddH2O彻底溶解沉淀，得到的高质量的RNA。
本实施例中所用的RNA抽提缓冲液及其他试剂同实施例1。
应用本实施例，得到草莓未成熟果实和完熟果实总RNA量分别为270微克和240微克，RNA产率分别为270微克/克(总RNA量/样品量)和240微克/克。
质量检测：经琼脂糖凝胶电泳结果(附图5)表明RNA完整性好，在紫外分光光度仪上测定260nm与280nm吸光度比值A260/280为1.7～1.8，完全满足分子生物学实验需要。
实施例4：新疆紫草愈伤组织的总RNA提取
(1)取液氮速冻的新疆紫草红色愈伤组织(产生紫草素)和灰白色愈伤组织(未产生紫草素)各1.6克，用液氮将其研磨成粉末；快速将样品转移至离心管中，并加入16mL预冷的RNA抽提缓冲液，混匀置于冰上5min，再加入pH4.5的3mol L-1醋酸钠1.6mL，上下颠倒混匀；
(2)接着加入18mL氯仿，剧烈震荡将两相混匀，冰上放置10min后于4℃12000g离心10min，取上清液到新的离心管中；
(3)重复(2)中的氯仿抽提步骤1次；
(4)在上清液中加入18mL异丙醇，混匀后置于-20℃30min，接着4℃12000g离心15min获得RNA沉淀；
(5)用75％乙醇清洗沉淀2次，在室温干燥20min后用1.6mL DEPC处理过的ddH2O彻底溶解；
(6)在RNA水溶液中加入Tris饱和酚(pH8.0)1.6mL，剧烈震荡将两相混匀，常温12000g离心10min，取上清到新离心管中；
(7)在上清液中加入1.6mL氯仿，剧烈震荡混匀后，常温12000g离心10min，取上清液；
(8)在上清液中加入0.16mL的醋酸钠和1.6mL异丙醇，混匀后于-20℃放置30min，4℃12000g离心15min得到纯化的RNA沉淀；
(9)用75％乙醇清洗RNA沉淀2次，在室温干燥20min后用160μL DEPC处理过的ddH2O彻底溶解沉淀，得到的高质量的RNA。
本实施例中所用的RNA抽提缓冲液及其他试剂同实施例1。
应用本实施例，得到新疆紫草红色愈伤组织和灰白色愈伤组织总RNA量分别为320微克和340微克，RNA产率分别为320微克/克(总RNA量/样品量)和340微克/克。
质量检测：经琼脂糖凝胶电泳结果(附图6)表明RNA完整性好，在紫外分光光度仪上测定260nm与280nm吸光度比值A260/280为1.8～1.9，完全满足分子生物学实验需要。

Claims (4)

1.一种从富含多糖多酚及次生代谢物质的植物组织中提取总RNA的方法，其特征在于它包括以下步骤：
(1)称取1-2克植物组织，在预冷的研钵中用液氮研磨成粉，转入50mL离心管中，迅速加入10-20mL预冷的RNA抽提缓冲液，混匀后置于冰上5分钟，再加入pH4.5-5.5的3mol L-1醋酸钠1-2mL，上下颠倒混匀；RNA抽提缓冲液组成成分为4mol L-1异硫氰酸胍，25mmol L-1柠檬酸钠，0.5％w/v十二烷基肌氨酸钠，2％w/v可溶性聚乙烯吡咯烷酮，使用前每100mL抽提缓冲液加入0.5mL β-巯基乙醇；
(2)加入11-22mL的氯仿，剧烈震荡将两相混匀，冰上放置10分钟后于4℃12000g离心10分钟，取上清液置于新的离心管中；
(3)重复(2)中的氯仿抽提步骤1次；
(4)在上清液中加入10-20mL异丙醇，混匀后置于-20℃30分钟，接着4℃12000g离心15min获得RNA沉淀；
(5)用75％的乙醇溶液清洗沉淀2次，置于室温干燥20分钟，用DEPC处理过的ddH2O1-2mL彻底溶解RNA沉淀
(6)在RNA溶液中加入Tris饱和酚1-2mL，剧烈震荡将两相混匀，常温12000g离心10分钟，取上清液；
(7)在上清液中加入1-2mL氯仿，剧烈震荡混匀后，常温12000g离心10分钟，取上清液；
(8)在上清液中加入pH4.5-5.5的3mol L-1醋酸钠0.1-0.2mL和1-2mL异丙醇，混匀后于-20℃中放置30分钟，4℃12000g离心15分钟得到RNA沉淀；
(9)用75％乙醇溶液洗RNA沉淀物2次，室温干燥20分钟后，用100-200μL DEPC处理过的ddH2O溶解沉淀，获得纯化后的RNA；
2.根据权利1所述的从富含多糖多酚及次生代谢物质的植物组织中提取总RNA的方法，其特征在于植物组织包括红皮梨和葡萄的幼嫩叶片、果肉、果皮组织以及草莓果实和新疆紫草愈伤组织。
3.根据权利要求1所述的从富含多糖多酚及次生代谢物质的植物组织中提取总RNA的方法，其特征在于所述的75％乙醇是由7.5份无水乙醇和2.5份DEPC处理过的ddH2O配制，DEPC处理过的ddH2O是由0.1份DEPC加入99.9份ddH2O中涡旋混匀再经高温高压灭菌的纯 水。
4.根据权利要求1所述的从富含多糖多酚及次生代谢物质的植物组织中提取总RNA的方法，其特征在于所述的Tris饱和酚溶液其pH值为7.8-8.0，含8-羟基喹啉和巯基乙醇。 
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101935648B (zh) * 2010-09-13 2013-04-17 原平皓(天津)生物技术有限公司 一种提取rna的方法和试剂盒
CN102796726B (zh) * 2011-05-24 2014-08-06 博奥生物集团有限公司 混合微生物核酸的提取方法
CN102796727B (zh) * 2011-05-24 2014-06-18 博奥生物有限公司 革兰氏阳性细菌核酸提取方法
CN102329792B (zh) * 2011-11-01 2013-04-24 四川农业大学 一种快速提取悬钩子属植物总rna的方法
CN102424821B (zh) * 2011-12-22 2014-06-11 东北林业大学 饲料型四倍体刺槐叶片总rna的提取方法
CN102690806A (zh) * 2012-05-02 2012-09-26 江苏大学 一种简单、快速提取柳枝稷组织总rna的方法
CN102776174A (zh) * 2012-08-21 2012-11-14 昆明理工大学 一种从百合组织中同时提取dna和rna的方法
CN103484451B (zh) * 2013-09-29 2015-02-18 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 一种植物小rna的快速提取方法
CN103740700A (zh) * 2013-12-31 2014-04-23 华南师范大学 一种高良姜总rna的提取方法
CN103911369B (zh) * 2014-04-04 2017-01-11 中国农业科学院烟草研究所 一种高效提取烟草成熟叶片总rna的方法
CN104164421A (zh) * 2014-08-14 2014-11-26 镇江万山红遍农业园 一种葡萄果皮rna的提取方法
CN104152439B (zh) * 2014-08-30 2016-08-17 中国烟草总公司郑州烟草研究院 一种适用于烟草种子的rna提取方法
CN105463128A (zh) * 2014-10-30 2016-04-06 四川省农业科学院园艺研究所 一种草莓病毒的定量检测方法
CN105506129B (zh) * 2016-01-01 2019-03-15 广州邦德盛生物科技有限公司 一种rna类样本保存稀释液及其制备
CN106047860B (zh) * 2016-06-03 2019-01-01 中国农业科学院特产研究所 一种植物基因组dna提取方法
CN107513529A (zh) * 2017-10-24 2017-12-26 刘俊男 一种纯化rna的方法以及试剂组合
CN108277218A (zh) * 2018-03-31 2018-07-13 中国农业科学院草原研究所 一种萌发初期的羊草种子rna提取方法
CN109055360B (zh) * 2018-09-14 2022-10-11 皖南医学院 一种提取按蚊总rna的方法
CN109136221A (zh) * 2018-10-22 2019-01-04 海南青峰生物科技有限公司 一种提取橡胶树叶片总dna的方法
CN111172152A (zh) * 2018-11-12 2020-05-19 上海力拜生物科技有限公司 Rna纯化液及其制备方法和应用
CN110760508A (zh) * 2019-05-08 2020-02-07 漯河市农业科学院 一种提取小麦总rna的方法
CN110229810A (zh) * 2019-06-24 2019-09-13 福建省农业科学院果树研究所 一种高效提取橄榄叶片核酸物质的方法
CN110195055A (zh) * 2019-07-02 2019-09-03 南宁维尔凯生物科技有限公司 多糖多酚植物组织总rna提取方法
CN114774406B (zh) * 2022-04-20 2024-01-19 荆楚理工学院 一种从蔷薇属植物组织中提取总rna的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19820629A1 (de) * 1998-05-08 1999-11-11 Forschungsanstalt Geisenheim Schnellextraktionsverfahren zur Gewinnung von DNA und RNA aus holzigen und krautigen Teilen verholzender und nichtverholzender Pflanzen
EP1044984A2 (de) * 1999-04-13 2000-10-18 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH RNA-Isolierungs-Kit
CN1587405A (zh) * 2004-09-09 2005-03-02 武汉大学 一种莲藕组织总rna的快速提取方法
CN1986795A (zh) * 2006-09-11 2007-06-27 华中农业大学 从悬铃木组织中抽提总rna的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19820629A1 (de) * 1998-05-08 1999-11-11 Forschungsanstalt Geisenheim Schnellextraktionsverfahren zur Gewinnung von DNA und RNA aus holzigen und krautigen Teilen verholzender und nichtverholzender Pflanzen
EP1044984A2 (de) * 1999-04-13 2000-10-18 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH RNA-Isolierungs-Kit
CN1587405A (zh) * 2004-09-09 2005-03-02 武汉大学 一种莲藕组织总rna的快速提取方法
CN1986795A (zh) * 2006-09-11 2007-06-27 华中农业大学 从悬铃木组织中抽提总rna的方法

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