CN104164421A - 一种葡萄果皮rna的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种葡萄果皮RNA的提取方法，属生物技术领域。本发明所解决的技术问题是提供了一种成本较低、效率较高的葡萄果皮RNA的提取方法。本发明所提取的葡萄果皮RNA的方法包括如下步骤：称取0.2g葡萄果皮，液氮研磨后加入预热的裂解液和β-巯基乙醇，涡旋后水浴，加等体积氯仿/异戊醇(24/1)震荡后离心，取上清加等体积的氯仿/异戊醇(24/1)后再离心，重复2次，加入沉淀剂沉淀后离心，乙醇洗涤并回收RNA。
Description
技术领域
本发明涉及一种葡萄果皮RNA的提取方法，属于生物技术领域。
背景技术
能否提取出高质量的RNA是果树分子生物学与功能基因组学研究的关键基础工作之一，如RT-PCR、Northern杂交、cDNA文库构建等都需要高质量的RNA。近年来发展的高通量测序技术和高性能的生物信息分析技术对于RNA的质量要求极高，这使得RNA提取在完整性和纯度方面有了更高的要求。由于RNA酶活性强，故要得到无降解RNA难度比较大。植物细胞具有坚硬的细胞壁，细胞内有较大的液泡及内含物，以及与核酸极性接近的多糖、多酚及其它次生代谢物，使得植物材料RNA的提取难度高于动物材料。
葡萄浆果发育及成熟机制，果皮花青苷含量调控机制的研究是目前葡萄分子生物学研究的重点之一，但是其组织中RNA提取一直是难点。由于葡萄果皮中多糖多酚物质含量较高，其一些理化性质与RNA相似，在去除多糖多酚操作的同时RNA也容易被裹带走，现有的适用于叶片、花等组织中RNA的提取方法，不适用于葡萄浆果，在实际操作过程中很难将它们分开，造成RNA产量的减少。这些问题直接影响到RNA的生物信息分析研究，也很难满足进一步分子生物学研究的需要。
本发明总结出一种适合于葡萄果皮RNA提取的最优方法，能达到提取效率高，RNA纯度高，降解少的目的，有利于进一步的基因表达研究和高性能的生物信息分析技术。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供一种成本较低、效率较高的葡萄果皮RNA的提取方法。
本发明一种葡萄果皮的提取方法包括如下步骤：
(1)将待用的CTAB裂解液放置在65-70℃水浴中预热10min。
(2)取0.2g葡萄果皮，在研钵中用液氮研磨成粉末状后，盛入2ml离心管内。
(3)吸取1ml预热过的CTAB裂解液到2ml离心管内，加入20μLβ-巯基乙醇，缓慢震荡混匀后，放回到65-70℃水浴中，水浴45-50min，期间反复颠倒混匀2-3次。
(4)水浴完成后，将上述样品液加入等体积的氯仿/异戊醇并涡旋混合，12000rpm，4℃离心10min。
(5)吸取一定量上清液至新的2ml离心管内。重复步骤(4)抽提二次。
(6)吸取一定量上清液至一新的1.5ml离心管中，加入-20℃预冷的LiCl溶液，-20℃下沉淀过夜。
(7)4℃，12000rpm离心20-30min，弃上清，用500μl70％乙醇洗涤沉淀2次，4℃，12000rpm离心30s。
(8)用500μl100％乙醇洗涤沉淀，4℃，12000rpm离心30s。
(9)吸干残留上清，干燥15min后，用30μlDEPC水溶解RNA。
所用CTAB裂解液需要提前在65-70℃水浴中预热10min，CTAB提取液的组成成分为0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)，20mmol/L EDTA-Na2，1.4mol/L NaCl，2％CTAB(W/V)，1％PVP(聚乙烯吡咯烷酮)(W/W)；
所用的研钵、镊子、研棒均需在40-60℃下处理3h以上，所用的1.5ml和2ml离心管均需经过DEPC水浸泡处理。
裂解液裂解材料时加入β-巯基乙醇20μL，然后放回65-70℃水浴30-45min，能够提高杂质去除效果。
萃取液为氯仿/异戊醇，氯仿/异戊醇＝24：1(V/V)，能够有效的去除提取液中的多糖多酚；
沉淀剂为-20℃预冷的LiCl，加入体积为吸取上清液体积的1/3，能够在保证RNA总量的前提下不损失5S RNA。
附图说明
图1为本发明不同RNA提取方法的琼脂糖凝胶电泳比较结果图。
其中A为改良CTAB法，B为改良SDS法，C为本发明。
具体实施方式
实施例1 本发明葡萄果皮RNA的提取方法
试剂准备
2％CTAB提取缓冲液：0.1mol/l Tris-HCl(PH8.0)，20mmol/l EDTA-Na2(PH8.0)，1.4mol/lNaCl，2％CTAB(W/V)，1％PVP(聚乙烯吡咯烷酮)(W/W)。即：配置100ml2％CTAB提取缓冲液需加：Tris溶液10ml，EDTANa2溶液4ml，NaCl溶液28ml，CTAB2g，PVP1g，用4mol/lHCl调pH至8.0，定容至100ml。以上试剂均用DEPC水配置，122℃灭菌20min；氯仿/异戊醇＝24：1(V/V)。
具体操作步骤如下：
(1)将待用的CTAB裂解液放置在65-70℃水浴中预热10min。
(2)取0.2g葡萄果皮，在研钵中用液氮研磨成粉末状后，盛入2ml离心管内。
(3)吸取1ml预热过的CTAB裂解液到2ml离心管内，加入20μlβ-巯基乙醇，缓慢震荡混匀后，放回到65-70℃水浴中，水浴45-50min，期间反复颠倒混匀2-3次。
(4)水浴完成后，将上述样品液加入等体积的氯仿/异戊醇并涡旋混合，12000rpm，4℃离心10min。
(5)吸取一定量上清液至新的2ml离心管内。重复步骤(4)抽提二次。
(6)吸取一定量上清液至一新的1.5ml离心管中，加入-20℃预冷的LiCl溶液，-20℃下沉淀过夜。
(7)4℃，12000rpm离心20-30min，弃上清，用500μl70％乙醇洗涤沉淀2次，4℃，12000rpm离心30s。
(8)用500μl100％乙醇洗涤沉淀，4℃，12000rpm离心30s。
(9)吸干残留上清，干燥15min后，用30μlDEPC水溶解RNA。
对比例1改良CTAB法提取葡萄果皮RNA
(1)取果皮0.2g在液氮中充分研磨成粉末后，快速转入含有1mL洗液[Tris-HCl(0.10mol/L)，山梨醇(0.35mol/L)，EDTA(5μmol/L)，PEG6000(100g/L)，2％β-巯基乙醇(W/V，现用现加)]的2.0mL的离心管中，摇匀后放置1min，8000r/min，常温离心10min，弃去上清液。
(2)快速转入加有1.2mL预热的CTAB裂解缓冲液[0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)，0.5mol/L EDTA(pH8.0)，1.4mol/L NaCl，3％CTAB(W/V)，3％PVP(W/V)，3％β-巯基乙醇(W/V，现用现加)]的2mL离心管中，涡旋，震荡均匀。置于65℃水浴裂解30min，期间颠倒混匀3次；
(3)水浴后，自然冷却至室温，加入300-500μL氯仿:异戊醇(24:1，V/V)12000r/min，4℃离心20min；
(4)取上清，加入1/2体积的水饱和酚(pH5.2)混匀后冰上静置5min，再加入1/2体积氯仿:异戊醇涡旋混匀，12000r/min，4℃离心20min；
(5)取上清，再加等体积的氯仿:异戊醇(24:1)重复抽提2～3次，至无蛋白层出现为止。
(6)取上清，加入1/10体积的无水乙醇及1/20体积的NaAc(5mol/L，pH5.2)，冰上或-20℃静置30min，12000r/min，4℃离心15min；
(7)取上清，加入到1.5mL离心管中，加1/4体积的LiCl(10mol/L)，-20℃静置～34h，13000r/min，4℃离心20min；
(8)收集沉淀，用75％乙醇冲洗2遍，无水乙醇冲洗1遍。自然干燥，适量DEPC-H2O水溶解，-20℃保存备用。
对比例2改良SDS法提取葡萄果皮RNA
(1)先在2mL离心管里加入0.8mL洗液[Tris-HCl(0.10mol/L),山梨醇(0.35mol/L)，EDTA(5mmol/L),PEG6000(100g/L),体积分数为2％β-巯基乙醇(现用现加)],然后把磨好的样加入离心管中,充分混匀后室温静止5min,8000r/min离心5min,去上清；
(2)加入SDS裂解缓冲液，成分为5mmol/L EDTA，20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，0.2mol/L NaCl，4.0％SDS(W/V)，3％PVP(W/V)，5％β-巯基乙醇(W/V，现用现加)。
(3)沉淀后加500μL DEPC-H2O溶解沉淀，再加入等体积氯仿-异戊醇抽提，12000r/min，4℃离心15min；
(4)取上清，加入1/10体积的5mol/L NaAc(pH5.2)和2倍体积预冷的无水乙醇，-20℃静置1夜；
(5)4℃，13000r/min离心25min，收集沉淀，用75％的乙醇洗2遍，无水乙醇冲洗1遍。干燥后，适量DEPC-H2O溶解，-20℃保存备用。
试验结果如图1和表1所示。
表1 不同RNA提取方法的RNA浓度和纯度
从表1和图1可以看出，本发明提取得到的葡萄果皮RNA条带清晰完整，浓度高，不存在DNA和蛋白质污染；虽然改良CTAB法和改良SDS法也能得到条带，浓度与本发明差异不大，但是杂质较多，且存在着少量DNA和蛋白污染，在进行cDNA合成或者文库构建以及转录组测序等试验时，很难达到要求。本发明操作简单，节约成本，能够很好的提取葡萄果皮RNA。
Claims (6)
1.一种葡萄果皮RNA的提取方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将待用的CTAB裂解液放置在65-70℃水浴中预热10min；
(2)取0.2g葡萄果皮，在研钵中用液氮研磨成粉末状后，盛入2ml离心管内；
(3)吸取1ml预热过的CTAB裂解液到2ml离心管内，加入20μlβ-巯基乙醇，缓慢震荡混匀后，放回到65-70℃水浴中，水浴45-50min，期间反复颠倒混匀2-3次；
(4)水浴完成后，将上述样品液加入等体积的氯仿/异戊醇并涡旋混合，12000rpm，4℃离心10min；
(5)吸取一定量上清液至新的2ml离心管内,重复步骤(4)抽提二次；
(6)吸取一定量上清液至一新的1.5ml离心管中，加入-20℃预冷的LiCl溶液，-20℃下沉淀过夜；
(7)4℃，12000rpm离心20-30min，弃上清，用500μl70％乙醇洗涤沉淀2次，4℃，12000rpm离心30s；
(8)用500μl100％乙醇洗涤沉淀，4℃，12000rpm离心30s；
(9)吸干残留上清，干燥15min后，用30μlDEPC水溶解RNA。
2.根据权利要求1所述的一种葡萄果皮RNA的提取方法，其特征在于所述CTAB提取液的组成成分为0.1mol/LTris-HCl，20mmol/LEDTA-Na2，1.4mol/LNaCl，质量体积比为2％的CTAB，浓度为1％的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)。
3.根据权利要求1或2所述的一种葡萄果皮RNA的提取方法，其特征在于所用的研钵、镊子、研棒均需要40-60℃下处理3h以上，所用的1.5ml和2ml离心管均需经过DEPC水浸泡处理。
4.根据权利要求1或2所述的一种葡萄果皮RNA的提取方法，其特征在于所述的萃取液氯仿/异戊醇的体积比为24：1，萃取3次。
5.根据权利要求1所述的一种葡萄果皮RNA的提取方法，其特征在于步骤(6)中LiCl溶液的加入体积为吸取上清液体积的1/3。
6.根据权利要求2所述的一种葡萄果皮RNA的提取方法，其特征在于，所述Tris-HCl的pH值为8.0。
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