CN107523564A - 一种简单经济钉螺组织总rna的提取方法 - Google Patents

一种简单经济钉螺组织总rna的提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种简单经济钉螺组织总RNA的提取方法，包括：制备细胞裂解液，钉螺组织总RNA的粗提取，低浓度胍盐纯化钉螺组织总RNA，离心乙醇洗涤，DEPC水中溶解等步骤。本发明与现有技术相比，能够解决提取钉螺总RNA不完整、纯度低等问题，且使用本方法得到的钉螺总RNA不仅纯度高，而且方法简单经济，提取的总RNA能进一步满足RT‑PCR等分子生物学实验的要求。此外，本发明也可适用于其他小型软体动物的RNA提取。

Description

一种简单经济钉螺组织总RNA的提取方法
技术领域
本发明属于核酸分离纯化技术领域，具体涉及一种提取高质量钉螺总RNA的方法。
背景技术
从钉螺组织中提取RNA是进行钉螺生物学研究的重要环节之一，要进行Northern(印迹)杂交分析、纯化mRNA以用于体外翻译或建立cDNA文库、RT-PCR及差示分析等下游分子生物学研究。而上述实验的成败主要取决于钉螺组织总RNA的质量。
目前提取RNA的方法有异硫氰酸胍苯酚法、酚-SDS法、CTAB法，热硼酸法等。然而，已发表的大量文章都反映出在分离高质量的RNA时存有不同的困难，主要表现为RNA易受RNase的降解。除此之外，钉螺组织还含有大量多糖，分离高质量RNA难度较大。而高质量RNA的提取是研究钉螺与日本血吸虫相互关系的重要步骤之一，也是进行分子生物学基因表达研究的必要前提。
因此我们期望通过获得完整的钉螺RNA，提供基础资料。在所有提取RNA的方法中，Trizol试剂法由于其实现商业化而最为常用，TRIzol试剂是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。其最大的特点是Trizol试剂含有多组分离作用，可同时分离一个样品的RNA、DNA、蛋白质，但是存在分离效率不高，RNA纯度不稳定等缺点。目前，关于用TRIzol法提取钉螺RNA的研究较少，而且如何提高钉螺提取的RNA的质量也有待解决，本发明针对这些问题，通过SDS粗提核酸、低浓度胍盐纯化核酸、75％乙醇二次洗涤等步骤建立起一种能够成功提取质量较好的钉螺总RNA的新方法，且所提总RNA能进一步满足RT-PCR等分子生物学实验的要求。
发明内容
鉴于以上所述，本发明的目的在于提供一种简单经济钉螺组织总RNA的提取方法，能够解决提取钉螺总RNA不完整、纯度低等问题，且使用本方法得到的钉螺总RNA不仅纯度高，而且方法简单经济。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种简单经济钉螺组织总RNA的提取方法，包括以下步骤：
(1)配置酚抽提液1：向一号1.5mL离心管中依次加入水饱和酚、氯仿和异戊醇，上下震荡混合均匀，得到酚抽提液1，待用；其中，水饱和酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1；
(2)配置酚抽提液2：向二号1.5mL离心管中依次加入水饱和酚、氯仿和异戊醇，上下震荡混合均匀，得到酚抽提液2，待用；其中，水饱和酚、氯仿和异戊醇的体积比为125:24:1；
(3)制备细胞裂解液：在三号1.5mL离心管中配置1mL的裂解液，放入4℃冰箱内保存，待用；其中，细胞裂解液的成分为按体积比为2:1:1的步骤(1)所得的酚抽提液1、质量浓度为6％的SDS和2mol/L的醋酸钠；
(4)钉螺组织总RNA的粗提取：取多只去除螺壳及消化系统的钉螺腹足肌肉共计40-50mg，洗涤干净后并用滤纸吸去表面水分，置于玻璃研磨器中加入液氮研磨成粉末，迅速转移到步骤(3)所得的含有细胞裂解液的三号1.5mL离心管中，盖紧盖后上下颠倒离心管混匀，4℃放置5-8min；
(5)于4℃，12000rpm/min，离心10-15min，得到第1上清液；
(6)将步骤(5)离心后的第1上清液完全转移至四号2.0mL离心管中，向离心管中依次加入异硫氰酸胍溶液和醋酸钠缓冲液，然后再加入步骤(2)所得的酚抽提液2，盖紧盖后迅速在振荡器上充分震荡30s-60s；其中，第1上清液、异硫氰酸胍溶液、醋酸钠缓冲液和酚抽提液2的体积比为1:0.9:0.1:2；
(7)于4℃，12000rpm/min，离心10-15min，得到第2上清液，将离心后的第2上清液完全转移至五号2.0mL离心管中，加入等体积异丙醇，盖紧盖后上下颠倒离心管至混匀，放置6-10min；
(8)于4℃，12000rpm/min，离心10min，弃去第3上清液，用体积浓度为70％-80％的乙醇洗涤沉淀，重复洗涤2次，室温空气干燥5-8min，溶解在20μL-30μLDEPC水中低温保存。
在步骤(6)中，所述异硫氰酸胍溶液的摩尔浓度为4mol/L，所述醋酸钠缓冲液的pH为3.4-3.6。
本发明的有益效果：本发明所建立的一种简单经济钉螺组织总RNA的提取方法，是对传统TRIzol法的一种改良，但与现有技术中的传统TRIzol法提取的总RNA相比，能够解决提取钉螺总RNA不完整、纯度低等问题，且使用本方法得到的钉螺总RNA不仅纯度高，而且方法简单经济，提取的总RNA能进一步满足RT-PCR等分子生物学实验的要求。此外，本发明也可适用于其他小型软体动物的RNA提取。
附图说明
图1为根据实施例1步骤提取的钉螺组织总RNA与传统TRIzol法提取钉螺组织总RNA进行琼脂糖凝胶电泳的结果对比图；
在图中，A为实施例1提取的钉螺组织总RNA；B为传统TRIzol法提取的钉螺组织总RNA；M为DNAMarkerVII；
图2为根据实施例1步骤提取的钉螺组织总RNA经RT-PCR后扩增后的产物进行琼脂糖凝胶的电泳图；
在图中，M为DL2000DNAMarker；A为实施例1提取的钉螺组织总RNA扩增后的产物。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明，应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用来说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
其中，利用核酸蛋白分析仪分别测定本发明的方法与传统TRIzol法(采用总RNA提取试剂盒(TRIzol法)，北京百泰克生物技术有限公司)提取的总RNA样本的浓度、A260/A280、A260/A230值；并利用琼脂糖凝胶电泳检测其完整性；选用钉螺β-acting基因进行扩增，进一步验证本发明的方法所提总RNA是否能够满足RT-PCR等分子生物学实验的要求。
实施例1
一种简单经济钉螺组织总RNA的提取方法，包括以下步骤：
(1)配置酚抽提液1：向一号1.5mL离心管中依次加入250μL水饱和酚、240μL氯仿和10μL异戊醇，上下震荡混合均匀，得到酚抽提液1，待用；
(2)配置酚抽提液2：向二号1.5mL离心管中依次加入1000μL水饱和酚、192μL氯仿和8μL异戊醇，上下震荡混合均匀，得到酚抽提液2，待用；
(3)制备细胞裂解液：在三号1.5mL离心管中配置1mL的裂解液，放入4℃冰箱内保存，待用；其中，细胞裂解液的成分为500μL步骤(1)所得的酚抽提液1，250μL质量浓度为6％的SDS和250μL2mol/L的醋酸钠；
(4)钉螺组织总RNA的粗提取：取5只去除螺壳及消化系统的钉螺腹足肌肉共计40mg，置于玻璃研磨器中加入液氮研磨成粉末，迅速转移到步骤(3)所得的含有细胞裂解液的三号1.5mL离心管中，盖紧盖后上下颠倒离心管混匀，4℃放置5min；
(5)于4℃，12000rpm/min，离心12min，得到第1上清液；
(6)将步骤(5)离心后的第1上清液完全转移至四号2.0ml离心管中，向离心管中依次加入相当于第1上清液9/10体积的摩尔浓度为4mol/L的异硫氰酸胍溶液和相当于第1上清液1/10体积的pH为3.5的醋酸钠缓冲液，然后再加入相当于第1上清液2体积的步骤(2)所得的酚抽提液2，盖紧盖后迅速在振荡器上充分震荡40s；
(7)于4℃，12000rpm/min，离心12min，得到第2上清液，将离心后的第2上清液完全转移至五号2.0mL离心管中，加入等体积异丙醇，盖紧盖后上下颠倒离心管至混匀，放置8min；
(8)于4℃，12000rpm/min，离心10min，弃去第3上清液，用体积浓度为75％的乙醇洗涤沉淀，重复洗涤2次，室温空气干燥5min，溶解在30μLDEPC水中低温保存。
实施例2
一种简单经济钉螺组织总RNA的提取方法，包括以下步骤：
(1)配置酚抽提液1：向一号1.5mL离心管中依次加入250μL水饱和酚、240μL氯仿和10μL异戊醇，上下震荡混合均匀，得到酚抽提液1，待用；
(2)配置酚抽提液2：向二号1.5mL离心管中依次加入1000μL水饱和酚、192μL氯仿和8μL异戊醇，上下震荡混合均匀，得到酚抽提液2，待用；
(3)制备细胞裂解液：在三号1.5mL离心管中配置1mL的裂解液，放入4℃冰箱内保存，待用；其中，细胞裂解液的成分为500μL步骤(1)所得的酚抽提液1，250μL质量浓度为6％的SDS和250μL2mol/L的醋酸钠；
(4)钉螺组织总RNA的粗提取：取6只去除螺壳及消化系统的钉螺腹足肌肉共计45mg，置于玻璃研磨器中加入液氮研磨成粉末，迅速转移到步骤(3)所得的含有细胞裂解液的三号1.5mL离心管中，盖紧盖后上下颠倒离心管混匀，4℃放置5min；
(5)于4℃，12000rpm/min，离心12min，得到第1上清液；
(6)将步骤(5)离心后的第1上清液完全转移至四号2.0ml离心管中，向离心管中依次加入相当于第1上清液9/10体积的摩尔浓度为4mol/L的异硫氰酸胍溶液和相当于第1上清液1/10体积的pH为3.5的醋酸钠缓冲液，然后再加入相当于第1上清液2体积的步骤(2)所得的酚抽提液2，盖紧盖后迅速在振荡器上充分震荡60s；
(7)于4℃，12000rpm/min，离心10min，得到第2上清液，将离心后的第2上清液完全转移至五号2.0mL离心管中，加入等体积异丙醇，盖紧盖后上下颠倒离心管至混匀，放置10min；
(8)于4℃，12000rpm/min，离心10min，弃去第3上清液，用体积浓度为75％的乙醇洗涤沉淀，重复洗涤2次，室温空气干燥5min，溶解在30μLDEPC水中低温保存。
检测例1
利用核酸蛋白分析仪和紫外分光光度计测定分别测定根据实施例1步骤提取的钉螺组织总RNA与传统TRIzol法提取钉螺组织总RNA的产率和纯度，用总RNA的浓度、OD260/OD280、OD260/OD230值表示结果。
结果显示：经紫外分光光度计测定，本发明的方法和传统TRIzol法两种方法进行比较，从表1可知本发明的方法提取总RNA的OD260/OD280的比值为1.98，在理想值1.8-2.0范围内，这说明本发明的方法提取的RNA质量较高，多糖、蛋白等物质残留较少，很少发生降解，传统TRIzol法低于1.80，说明有多糖、蛋白质等物质的污染，后续还需要进行酚氯仿二次抽提等步骤纯化核酸才可以进行后续的试验，而本发明的方法提取的RNA则可直接进行后续试验；本发明的方法与传统TRIzol法所提RNA的OD260/OD230均低于2.0，说明两种方法有不同程度的小分子或盐离子残留，但本发明的方法更接近理想值2.0，因此本发明的方法较传统TRIzol法胍盐残留少；本发明产率虽低于传统TRIzol法，但由于其提取的RNA纯度高、完整性好，因而仍能满足后续RT-PCR等等分子生物学的研究。结果见表1；
表1:本发明的方法与传统TRIzol法提取钉螺组织总RNA的产率和纯度对比图
检测例2
将实施例1步骤提取的钉螺组织总RNA与传统TRIzol法提取钉螺组织总RNA以及SDS法粗提核酸进行琼脂糖凝胶电泳检测。方法：制备1.5％琼脂糖凝胶，取4.5μL的RNA样品与0.5μL的10×Loading buffer(30mMEDTA，50％(v/v)Glycerol，0.25％(w/v)XyleneCyanol FF，0.25％(w/v)BromophenolBlue)进行混匀，150V、200mA电泳20min，凝胶成像仪成像并拍照。
其琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1，如图1所示，泳道A为本发明方法提取的钉螺组织总RNA完整性较好，电泳结果显示28SrRNA、18SrRNA和5SrRNA条带完整清晰，条带之间无明显弥散现象，则说明完整性好；泳道B为传统TRIzol法提取的钉螺组织总RNA，仅可见18SrRNA与5SrRNA两条带，表明完整性不好。泳道M为DNAMarkerVII。
检测例3
将实施例1所提取的总RNA经RT-PCR后扩增出的β-acting基因引物序列(见表2)，检测条带是否单一、整齐和拖带。
方法：采用β-acting基因引物序列，将实施例1所提取的总RNA样本和传统TRIzol法直接抽提的总RNA样本，按RT-PCR试剂盒说明书合成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR。PCR反应体系包含：1.0μL cDNA模板，0.5μL上游引物，0.5μL下游引物，6.25μL2×TaqMasterMix，4.25μL无酶水。PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃变性30s，54.2℃退火30s，72℃延伸30s，循环34次；72℃终末延伸7min；4℃保存。扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，紫外光下分析结果。(β-acting基因引物序列参照文献{刘卫东,罗鸣,鲍相渤,等.用肌动蛋白基因的PCR-RFLP法鉴别4种双壳类面盘幼体[J].水产科学,2006,25(12):616-620.})
表2：β-acting基因引物序列
结果表明：RT-PCR检测结果见图2，如图2所示，泳道A为本发明方法提取的钉螺组织总RNA扩增后的产物，泳道M为DL2000DNAMarker；由此可表明本发明的方法提取的钉螺组织总RNA经RT-PCR后扩增出的β-acting基因片段长度均为700bp左右，与预期结果一致，且条带单一、整齐，没有拖带。

Claims (2)

1.一种简单经济钉螺组织总RNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)配置酚抽提液1：向一号1.5mL离心管中依次加入水饱和酚、氯仿和异戊醇，上下震荡混合均匀，得到酚抽提液1，待用；其中，水饱和酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1；
(2)配置酚抽提液2：向二号1.5mL离心管中依次加入水饱和酚、氯仿和异戊醇，上下震荡混合均匀，得到酚抽提液2，待用；其中，水饱和酚、氯仿和异戊醇的体积比为125:24:1；
(3)制备细胞裂解液：在三号1.5mL离心管中配置1mL的裂解液，放入4℃冰箱内保存，待用；其中，细胞裂解液的成分为按体积比为2:1:1的步骤(1)所得的酚抽提液1、质量浓度为6％的SDS和2mol/L的醋酸钠；
(4)钉螺组织总RNA的粗提取：取多只去除螺壳及消化系统的钉螺腹足肌肉共计40-50mg，洗涤干净后并用滤纸吸去表面水分，置于玻璃研磨器中加入液氮研磨成粉末，迅速转移到步骤(3)所得的含有细胞裂解液的三号1.5mL离心管中，盖紧盖后上下颠倒离心管混匀，4℃放置5-8min；
(5)于4℃，12000rpm/min，离心10-15min，得到第1上清液；
(6)将步骤(5)离心后的第1上清液完全转移至四号2.0mL离心管中，向离心管中依次加入异硫氰酸胍溶液和醋酸钠缓冲液，然后再加入步骤(2)所得的酚抽提液2，盖紧盖后迅速在振荡器上充分震荡30s-60s；其中，第1上清液、异硫氰酸胍溶液、醋酸钠缓冲液和酚抽提液2的体积比为1:0.9:0.1:2；
(7)于4℃，12000rpm/min，离心10-15min，得到第2上清液，将离心后的第2上清液完全转移至五号2.0mL离心管中，加入等体积异丙醇，盖紧盖后上下颠倒离心管至混匀，放置6-10min；
(8)于4℃，12000rpm/min，离心10min，弃去第3上清液，用体积浓度为70％-80％的乙醇洗涤沉淀，重复洗涤2次，室温空气干燥5-8min，溶解在20μL-30μL DEPC水中低温保存。
2.根据权利要求1所述的一种简单经济钉螺组织总RNA的提取方法，其特征在于：在步骤(6)中，所述异硫氰酸胍溶液的摩尔浓度为4mol/L，所述醋酸钠缓冲液的pH为3.4-3.6。
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